ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA. Introduccin.

La electroforesis en gel puede proporcionar informacin acerca de los pesos moleculares y cargas de protenas, las estructuras de las subunidades de protenas, y la pureza de una determinada muestra de protena. Es relativamente fcil de usar y es altamente reproducible. El uso ms comn de la electroforesis en gel es el anlisis cualitativo de mezclas complejas de protenas. Esta tcnica proporciona la resolucin ms alta de todos los mtodos disponibles para la separacin de protenas. Los polipptidos que difieren en peso molecular por tan poco como unos pocos cientos de daltones y protenas diferentes a un pH inferior a 0,1 en sus puntos isoelctricos son determinados en este tipo de geles. SDS-PAGE es el acronimo de sodio dodecil (lauril) sulfato de electroforesis en gel de poliacrilamida. La porcin de SDS es un detergente. El propsito del detergente SDS es tomar la protena a partir de su forma nativa, que es bsicamente un pegote grande, y se abre en una pieza lineal. Esto permitir que se ejecute de manera ms eficiente por el gel y se obtienen mejores resultados, ya que es ms fcil comparar dos piezas lineales de algo ms que dos fajos de lo mismo. En trminos ms cientficos, es un detergente aninico que se une cuantitativamente a las protenas, dndoles la linealidad y la carga uniforme, de manera que se pueden separar nicamente sobre la base de su tamao. La SDS tiene una carga negativa alta que sobrepasa cualquier carga de la protena puede tener, impartiendo todas las protenas con una carga negativa relativamente igual. La SDS tiene una cola hidrfoba que interacta fuertemente con la protena (cadenas de polipptidos). El nmero de molculas de SDS que se unen a una protena es proporcional al nmero de aminocidos que componen la protena. Cada molcula de SDS aporta dos cargas negativas, eliminando cualquier carga que la protena puede tener. SDS tambin altera las fuerzas que contribuyen al plegamiento de la protena (estructura terciaria), asegurndose de que la protena no es slo uniformemente cargada negativamente, pero lineal tambin. SDS-PAGE tiene un nmero de usos, que incluyen: El establecimiento del tamao de la protena. Identificacin de protenas. Determinacin de pureza de la muestra. La identificacin de enlaces de disulfuro. Cuantificacin de las protenas.

Cuestionario. 1.- Adems de la agarosa que otro soporte se usa para la electroforesis de cidos nucleicos y en qu se diferencia de la agarosa. El gel de poliacrilamida permite separar los componentes de un especimen en funcin de su carga elctrica y del tamao de las molculas. Sin embargo, en el caso del isolectroenfoque, la separacin solo se debe realizar en base a las diferencias en los puntos isoelctricos, por lo que siempre se tiene que utilizar geles de poliacrilamida con un tamao superior al de las molculas que se quieren separar . Esto a la larga supone una limitacin, ya que habr molculas que por su tamao no se puedan separar por isoelectroenfoque si se utilizan este tipo de geles. La diferencia con el gel de agarosa es el tamao del poro, en el gel de poliacrilamida es de menor tamao. 2.-Mencione dos tipos diferentes de agarosa y cul es su funcin en el laboratorio de biologa molecular. Agarosa estndar: D1 Baja EEO (0.05-0.13) Agarosa estndar para anlisis rutinarios de fragmentos de acidos nucleicos. Adecuada para electroforesis de cidos nucleicos, blotting e inmunodifusin radial de protenas. Agarosas bajo punto de fusin: agarosa LM Sieve Aplicaciones: electroforesis de fragmentos de ADN 1000 pb; procesos enzimticos in gel (digestin, ligacin, PCR). Anlisis y recuperacin de fragmentos de ADN pequeos para aplicaciones posteriores. Agarosas alta resolucin ADN: MS-6 Metagel se utilizan para obtener resoluciones mejoradas para fragmentos de ADN de 500 pb, especialmente fragmentos sized-primer. 3.- Que otros compuestos se pueden utilizar para la tincin de acidos nucleicos despus de la electroforesis. Azul de Coomasie, nitrato de plata, bromuro de etidio. 4.- Describa un mtodo de purificacin para ADN a partir de un gel de agarosa. 1. Obtencin de la banda del gel. Corte el taco del gel con ayuda de un bistur o una cuchilla estril, e introdzcalo en un tubo de 1,5 ml (no incluido). Minimice al mximo el tamao del taco de agarosa. Determine el peso del taco obtenido. 2. Disolucin del gel geles de porcentaje de agarosa > 2%, duplique el volumen de BUFFER A. Incube a 55 C hasta que no visualice restos del gel (5-10 min). Utilice vortex cada 2-3 min para optimizar la disolucin completa del gel.

3. Unin del ADN: Coloque la columna en un tubo colector de 2 ml. Cargue la columna con la solucin obtenida en el paso 2. Centrifugue 1 min a 11000 x g, y deseche el filtrado. Coloque la columna nuevamente en su tubo colector. En algunos casos ser necesario realizar este paso dos veces para cargar el volumen total obtenido en el paso 2. 4. Lavado descarte el filtrado. Coloque la columna nuevamente en el Tubo Colector 5. Secado de la membrana Para eliminar los restos del buffer B centrifugue la columna 2 min a 11000 x g. Asegrese que no queden restos del buffer. 6. Elucin Coloque la columna en un tubo de 1,5 ml estril. Agregue 15 directamente sobre la membrana de la columna. Incube 1 min a temperatura ambiente. Centrifugue 1 min a 11000 x g. El eluato contiene el ADN purificado. El rendimiento de fragmentos de ADN > 5 kpb incrementa utilizando el BUFFER C previamente calentado a 70 C. Bibliografa. Guruatma; Khalsa. (2010, April 12). Mama Ji's Molecular Kitchen. ASU - Ask A Biologist. Retrieved April 5, 2013 from http://askabiologist.asu.edu/sds-page
http://www.condalab.com/pdf/folleto_agarosas09.pdf http://www.embiotec.com.ar/pdf/SA00201-2.pdf

Fuentes Arderiu. Bioquimica Clnica y Patologa Molecular. Ed. Revert. Espaa. 1998. pp.179.