Resistencia a los antimicrobianos y la PCR-ribotipificacin de Shigella responsables de brotes de origen alimentario se produjeron en el sur de Brasil Cheila Minia Daniel

de Paula I Cesar Tondo

I I, *

, Mercedes Passos Geimba ; Patrcia Heidrich do Amaral , Eduardo

II

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil Universidade Catlica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil

II

RESUMEN Hay poca informacin acerca de Shigella responsable de shigelosis transmitida por los alimentos est disponible en Brasil. El presente estudio tuvo como objetivo investigar la resistencia antimicrobiana y patrones de PCR-ribotipo de Shigella aislados responsables de brotes de origen alimentario ocurrido en Rio Grande do Sul (RS), el sur de Brasil, en el perodo comprendido entre 2003 y 2007. Shigella cepas (n = 152) fueron aislado en alimentos y muestras fecales de las vctimas de brotes de shigelosis investigados por el Servicio de Vigilancia. La identificacin de las cepas a nivel de especie indic que 71,1% de ellos eran S. flexneri, 21,5% S. sonnei, y 0,7%S. dysenteriae . Diez cepas (6,7%) fueron identificados slo como Shigella spp. Una ocurrencia creciente de S.sonnei fue observado despus de 2004. La mayora de las cepas fueron resistentes a la estreptomicina (88,6%), seguido de ampicilina (84,6%), y sulfametoxazol / trimetoprim (80,5%). Las cepas resistentes pertenecan a 73 patrones, y el patrn A (resistencia a la ampicilina, sulfametoxazol / trimetoprim, tetraciclina, estreptomicina, cloranfenicol, y resistencia intermedia a la kanamicina) agrupa el mayor nmero de los aislados (n = 36). PCR-ribotipificacin identific tres patrones de bandas (SH1, SH2 y SH3). SH1 agrupadas, todas S. flexneri y SH2 agrupan todas S. sonnei. El S. dysenteriae cepa perteneca al grupo SH3. De acuerdo con los resultados, variosShigella asla comparte la misma PCRribotipificacin patrn de bandas y el mismo perfil de resistencia, lo que sugiere que otras cepas estrechamente relacionadas fueron responsables de los brotes. Sin embargo, otros mtodos de tipificacin molecular necesitan ser aplicados para confirmar la relacin clonal de estas cepas. Palabras clave: shigelosis, Shigella, antimicrobiano, PCR-Ribotipo, RS / Brasil.

INTRODUCCIN Muchos microorganismos pueden causar enfermedades transmitidas por los alimentos, sin embargo, Shigella ha sido identificado como uno de los agentes ms importante de la diarrea por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) (44). Kotloff et al. (22) informaron que los casos anuales de shigelosis es de alrededor de 165 millones de dlares, con ms de 1,1 millones de muertes. De acuerdo con Silva et al. (40), la shigelosis es actualmente un importante problema de salud en todo el mundo, que se produce principalmente en nios menores de cinco aos, principalmente en los pases en desarrollo. La shigelosis es causada por Shigella spp., incluyendo Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii y Shigella sonnei (23). Entre Shigella especies, S. flexneri y S. sonneison los ms frecuentes en los pases en desarrollo e industrializados, respectivamente (33, 38). Shigella generalmente se transmite por el agua contaminada, alimentos crudos, y por contacto con personas infectadas (26, 44). La baja dosis infectiva, tan slo 200 organismos viables, facilita la transmisin directa (persona a persona propagacin). Los seres humanos y algunos primates son los nicos reservorios conocidos deShigella (37, 44), y la transmisin entre los seres humanos son comunes. Segn Navia y Gascn (26) los brotes de origen alimentario se producen debido a la propagacin clonal de una o pocas Shigella cepas. Shigella invaden el epitelio local del colon (intestino grueso) en un formato paso a paso: entrar en las clulas epiteliales, multiplicacin intracelular, intra e intercelular propagacin, y la muerte de la clula husped (32). La gastroenteritis causada por Shigella spp. suele ser autolimitada, aunque shigelosis es una de las pocas infecciones entricas en la que los agentes antimicrobianos se prescriben para reducir la duracin de la

enfermedad y el perodo de Shigella excrecin despus de que desaparezcan los sntomas. Por consiguiente, el aumento de la resistencia contra los agentes antimicrobianos ms utilizados se ha observado (18). En Brasil existen pocos informes sobre la shigelosis transmitida por los alimentos, probablemente atribuido al hecho de que hay una regulacin actual requiere la investigacin de Shigella en el agua o los alimentos. Sin embargo, de acuerdo con la Salud de Brasil Laboratorio Central ministro en Rio Grande do Sul (RS) Estado (FEPPS / LACEN / RS), este microorganismo se asla con frecuencia de heces de pacientes con diarrea en brotes de origen alimentario en el sur de Brasil. Shigella se ha caracterizado por diversos mtodos, incluyendo resistencia a los antibiticos y mtodos de genotipado en Brasil (35) y en otros pases como Chile (16), Irn (37), y Espaa (15). La determinacin de la resistencia a los antibiticos de Shigella ha sido llevado a cabo, ya que puede proporcionar rpidamente informacin acerca de las cepas resistentes (3) y tambin puede servir como un mtodo de caracterizacin preliminar. Sin embargo, debido al bajo poder de discriminacin de la tipificacin resistencia a los antimicrobianos, los mtodos basados en el ADN ha sido recomendado. Entre ellos, la PCR-ribotipificacin se ha aplicado con xito, ya que es rpido de realizar, presenta un coste relativamente bajo y tambin se ha utilizado para escribir los agentes patgenos entricos, tales como Salmonella (19, 27, 28). Sobre esta base, el objetivo del presente estudio fue caracterizar Shigella aislados responsables de brotes de origen alimentario ocurrido en el sur de Brasil por sus patrones de resistencia a los antimicrobianos y PCR ribotypes. MATERIAL Y MTODOS Identificacin y serotipificacin cepas bacterianas Shigella asla: Shigella aislamientos utilizados en este estudio se obtuvieron a partir de muestras de heces de pacientes con shigelosis y de los alimentos implicados en los brotes ocurridos en diferentes localidades de Rio Grande do Sul, sur de Brasil. Shigella aisladas de alimentos fueron recolectados en un perodo de 12 meses, entre agosto de 2007 y agosto de 2008. Las muestras de los alimentos sospechosos fueron recogidos durante la investigacin epidemiolgica de los brotes transmitidos por los alimentos llevadas a cabo por la Divisin de Vigilancia Sanitaria de Ro Grande do Sul. Con base en los sntomas y los datos epidemiolgicos, los brotes de origen alimentario se sospecha que la salmonelosis o la shigelosis. Las muestras fueron analizadas por el cumplimiento con el Reglamento Federal de Brasil RDC 12/2001 (2), en el Laboratorio Central de Rio Grande do Sul (FEPPS / IPB / LACEN / RS) siguiendo los mtodos de APHA (1). Antes de su eliminacin, 1200 placas de agar XLD (Oxoid Ltd., Hampshire, Inglaterra) y SS Agar (Oxoid Ltd., Hampshire, Inglaterra) que se utiliza para la deteccin de Salmonella, se enviaron al Laboratorio de Microbiologa de Alimentos de la Ciencia de los Alimentos y el Instituto de Tecnologa de Universidad Federal de Rio Grande do Sul (ICTA / UFRGS) para la investigacin deShigella spp. Las colonias tpicas de Shigella fueron seleccionados (217), se transfirieron a agar BHI (Oxoid Ltd., Hampshire, Inglaterra), y sometido a las siguientes pruebas para la identificacin: la motilidad, la produccin de sulfuro de hidrgeno, la produccin de indol, el uso de citrato, glucosa, sacarosa, y la fermentacin de la lactosa en agar TSI (Oxoid Ltd., Hampshire, Inglaterra), y de la lisina descarboxilasa en el LIA (Difco, Detroit, Michigan).Tras la identificacin, Shigella aislados fueron confirmados por pruebas serolgicas (14), utilizando antisueros suministrada por Probac do Brasil (Sao Paulo, Brasil). Otros 149 Shigella aislamientos fueron obtenidos a partir de muestras fecales de pacientes que se presentan nuseas, vmitos y diarrea, entre enero de 2003 y diciembre de 2007 ( Tabla 1 ). Despus de la identificacin de las cepas de la Seccin de Bacteriologa de FEPPS / IPB / LACEN / RS, fueron enviados al Laboratorio de Microbiologa de Alimentos de ICTA / UFRGS para la evaluacin de la resistencia a los antimicrobianos y PCRribotipificacin.

Las pruebas de resistencia a los antimicrobianos Shigella aislados se analizaron para la susceptibilidad a nueve agentes antimicrobianos por el mtodo de difusin en disco de acuerdo con la Estndares Clnicos y de Laboratorio (7). Los antimicrobianos y sus respectivas concentraciones ( g / disco) fueron: ampicilina (AMP), 10; tetraciclina (T), 30; gentamicina (GEN), 10; cido nalidxico (NAL), 30; cloranfenicol (C), 30; estreptomicina (S), 10; ciprofloxacina (CIP), 5; suministrado por Laborclin (Parana, Pinhais, Brasil) y sulfametoxazol / trimetoprim (SXT), 25; kanamicina (K), 30. Los discos fueron suministrados por Oxoid (Hampshire, Reino Unido), y Escherichia coli ATCC 25922 utilizado como cepa de referencia para el control interno. Para el propsito de escribir, se determinaron los patrones de resistencia, la creacin de un cdigo numrico basado en la resistencia a los antibiticos de cada aislamiento. La resistencia se clasifica como 1, la resistencia intermedia, tal como 2, y la sensibilidad completa como 3 (42). PCR-Ribotipo Extraccin de ADN: se inocul una colonia de cada aislado en 3 ml de caldo BHI (Oxoid Ltd., Hampshire, Inglaterra) y se incub durante la noche a 37 C. Despus de la incubacin, 1: el ADN genmico fue extrado mediante un tratamiento trmico, tal como se describe a continuacin ml suspensiones de clulas bacterianas se centrifugaron a 5000xg durante 4 minutos en una microcentrfuga Eppendorf modelo 5415C, a temperatura ambiente. El sobrenadante se desech y el sedimento se suspendi en 1 ml de TE (10 mM de Tris HCl, pH 8,0, 1 mM de EDA pH 8,0). Este paso se repiti dos veces. El sedimento se suspendi en 100 l de TE, mantenido en un bloque trmico durante 10 minutos a 95 C, y despus se centrifug a 14000xg durante 20 segundos. El sobrenadante se utiliz en las reacciones de PCR, tal como se describe a continuacin. Amplificacin por PCR: los cebadores utilizados en la prueba fueron propuestos por Jensen y Hubner (20) y eran especficos para la amplificacin de la regin espaciadora entre los genes 16S y 23S rRNA. Las secuencias de los cebadores fueron los siguientes: 5 'CAA GGC ATC CAC CGT GT 3' y 5 'GTG AAG TCG TAA CAA GG 3'. Cada conjunto de reacciones de PCR incluy un control sin molde de ADN. La mezcla de PCR-1 -1 Ribotipo (25 l) se compona de 2,5 l de tampn de reaccin (100 mmol l HCl Tris, 750 mmol l KCl pH -1 -1 8,8), 0,4 l de 10 mmol l dNTPs (5 mmol l de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP), 1 l de 50 mmol l 1 MgCl 2 , 2 l de cada cebador (20 moles), 0,4 U de Taq ADN polimerasa 2 U / l (Invitrogen, Sao Paulo, Brasil), el 14,9 l de agua ultrapura estril y 2 l de ADN. El programa utilizado para la amplificacin fue como sigue: un ciclo inicial de 94 C durante 2 minutos, seguido por 25 ciclos de 94 C durante 15 s, 55 C durante 4 minutos y 72 C durante 1 minuto, y un paso de extensin final de 72 C durante 30 minutos. Las amplificaciones se llevaron a cabo en un Minicycler (MJ Research, Watertown, MA, EE.UU.) y 10 l de los productos amplificados se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa al 2,0% en tampn TBE. Los geles se tieron con bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV.

Las cepas con diferentes patrones de bandas electroforticas de ADN se ensayaron al menos dos veces para evaluar la reproducibilidad del mtodo. E . coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923, E . coli O157: H7, S.cholerasuis ATCC 10708, y S. Enteritidis 3091/05 cepas se utilizaron para evaluar el poder discriminatorio del mtodo. S. Enteritidis 3091/05 se utiliz como una cepa de control en todas las amplificaciones de PCRribotipificacin. Los patrones de bandas amplificadas se compararon visualmente y se atribuyen a la misma PCR-Ribotipo cuando sus patrones eran idnticos. RESULTADOS Y DISCUSIN Aislamiento de Shigella Tres Shigella cepas fueron aisladas de muestras de alimentos implicados en brotes de origen alimentario ocurrido en RS. Las cepas se identificaron como S. flexneri (n = 2) y S. sonnei (n = 1), y se aislaron a partir de placas considerados negativos para la presencia de Salmonella por el Laboratorio Oficial de la RS (FEPPS / IPB / LACEN / RS). Como la investigacin de Shigella en los alimentos no es obligatorio en Brasil y sin Salmonella se encontr en estas muestras de alimentos, el agente etiolgico de esos brotes podra haber sido considerado no identificado.De acuerdo con Carmen et al. (4), el agente etiolgico del 80% de los 3.737 brotes de origen alimentario notificados se produjo en Brasil no pudieron ser identificados. Este alto porcentaje de agentes causales no identificados se puede atribuir a diversos factores como: la falta de muestras de alimentos para ser analizados, insuficiente sensibilidad de los mtodos analticos, los patgenos emergentes no investigados, y la falta de regulacin oficial obligatoria para ciertos patgenos alimenticios, incluyendo Shigella . Shigella es filogenticamente relacionado con Salmonella, y ambos estn relacionados con la Escherichia coli (17).Basndose en este hecho y en la falta de mtodos de deteccin apropiados, el diagnstico de la shigelosis es muy difcil. Actualmente, no hay medios selectivos especficos para el aislamiento de Shigella a partir de muestras de alimentos. En el presente trabajo, el aislamiento de Shigella fue posible con mtodos para Salmonellarecomendado por la Asociacin Americana de Salud Pblica (24) y la FDA (14). Recientemente Warren et al. (43) public una revisin sobre los mtodos para la deteccin de Shigella en los alimentos, y la citada tales metodologas. Los autores tambin hicieron hincapi en la necesidad de un protocolo de cultivo convencional apropiado diseado especficamente para la deteccin de Shigella en los alimentos. Muestras fecales humanas La Shigella aislados obtenidos a partir de muestras fecales humanas (149) perteneca a especie S. flexneri(71,1%), seguido de S. sonnei (21,5%). Slo uno de los aislamientos (0,7%) fue identificado como S. dysenteriae. Diez cepas (6,7%) fueron identificados slo como Shigella spp. Estos resultados son similares a los obtenidos en Brasil por Peirano et al. (35), que estudi 296 Shigella cepas aisladas de muestras fecales humanas en el Laboratorio de Clera y Enfermedades entricas (NRLCED) de la Fundacin Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil, durante el perodo de 1999 a 2004. La mayora de las cepas (52,7%) eran S. flexneri , y 44.2% eran S.sonnei , 2,3% fueron S. boydii , y slo dos (0,6%) fueron S. dysenteriae . Silva et al. (40) reportaron que Shigellafue el cuarto agente causal de la diarrea en 877 nios atendidos por un hospital pblico de Rondonia, en la Amazonia occidental, Brasil, y entre los 25 aislamientos identificados a nivel de especie, el 72% fueron S. flexneri, 12% S. sonnei , 12% S. boydii, y 4% S. dysenteriae. Resultados similares fueron reportados en otros pases. Savadkoohi y Kacho (38), en Irn, observaron que entre 260 Shigella cepas aisladas de muestras de heces, el 70% fueron S. flexneri y 30% eran S. sonnei . En contraparte, en los Estados Unidos, segn el CDC, hay una prevalencia de S. sonnei. Entre 1999 y 2002, entre 1598 aislamientos obtenidos en el Sistema de Monitoreo de Resistencia Antimicrobiana Nacional de bacterias entricas (NARMS), e identificados a nivel de especie, 1.278 (80%) fueron S. sonnei , 295 (18%) fueron S.flexneri (16%), 18 (1%) fueron S. boydii , y 7 (0,4%) fueron S. dysenteriae (41). Adems de variar de acuerdo con el rea geogrfica, siendo S. sonnei la especie predominante (> 80%) en los pases desarrollados y S. flexneri la especie ms comn en los pases en desarrollo (23), la prevalencia de Shigellaespecies vara con el tiempo. De acuerdo con los resultados del presente estudio, en 2003 slo el S. flexneri fue aislado en RS. Sin embargo, entre 2004 y 2007, la incidencia de S. sonnei aument de 17,9% en 2004 al 43,5% en 2007. Por consiguiente, la incidencia de S. flexneri disminuy expresivamente: en 2003 se identificaron todos los aislamientos como S. flexneri, pero en 2007 slo representaban el 47,8% de los brotes ( Cuadro 1 ).

De acuerdo con Chuang, et al. (8), entre 250 y 500 casos / ao de la shigelosis fueron identificados en Taiwn desde 1995 a 2000. La mayora fueron causadas por S. flexneri y S. sonnei , que representaron el 73,3% y el 26,5% del total de cepas aisladas, respectivamente. Sin embargo, de 2001 a 2003, S. sonnei reemplazado S.flexneri como la especie predominante en el centro de Taiwn (44). De acuerdo con la Tabla 2 , Shigella se aisl con mayor frecuencia en nios menores de 5 aos de edad, que representan el 40,7% de los aislamientos. Las personas de 5-19 aos participaron en aproximadamente el 19,0% de los casos, y los mayores de 20-59 aos se identificaron en 16.1% de los casos. La distribucin general deShigella asla por sexos fue similar, con las mujeres representan el 44,3% de los aislamientos y los hombres el 49,0%.

En Estados Unidos, la vigilancia de Shigella: Resumen Anual 2005 (5), inform que el 30,0% de los casos de nios afectados shigelosis menores de 5 aos de edad, el 34,3% de ellos personas de 5 a 19 aos, y el 26,6% de personas de 20-59 aos de edad . Las diferencias de gnero no fueron verificadas. Las pruebas de resistencia a los antimicrobianos La resistencia antimicrobiana de 152 aislamientos de Shigella se muestra en la Tabla 3 . Los porcentajes ms altos de resistencia se produjeron contra estreptomicina (88,6%), ampicilina (84,6%), y sulfametoxazol / trimetoprim (80,5%), y la frecuencia ms alta de la resistencia intermedia se muestra en contra de la kanamicina (61,7%). La mayora de los aislamientos fue sensible a la ciprofloxacina (96,6%), cido nalidxico (89,3%), y gentamicina (83,2%). Savadkoohi y Kacho (38) tambin reportaron altas tasas de resistencia a

sulfamethaxazole / trimetoprim (73,8%) y ampicilina (73,8%) de Shigella aisladas de nios con diarrea aguda en el norte de Irn. La sensibilidad a la ciprofloxacina fue similar a nuestros resultados (97,3%). Silva et al. (40) estudiaron Shigella spp. aislado de un hospital pblico de Rondonia / Brasil, y ha demostrado un alto nivel de resistencia a sulfametoxazol / trimetoprima y ampicilina. En un estudio llevado a cabo en el noreste de Brasil, Sidrim et al. (39) inform que 26 cepas de S. flexneri eran resistentes a sulfametoxazol / trimetoprim, ampicilina y tetraciclina. Resistencias a cloranfenicol y gentamicina fueron verificadas en el 84,6% y el 7,6% de los aislados, respectivamente, y todas las cepas fueron sensibles al cido nalidxico y ciprofloxacina. Tanto S. flexneri y S. sonnei mostraron altos porcentajes de resistencia a la ampicilina, estreptomicina, sulfametoxazol / trimetoprim, pero no hubo diferencias en la resistencia a otros antimicrobianos. Ms cepas de S.flexneri eran resistentes a la tetraciclina (79,2%) y cloranfenicol (73,6%) de S. sonnei (3,13% y 6,25%) (datos no mostrados). En Estados Unidos, el Sistema de Monitoreo de Resistencia Antimicrobiana Nacional de bacterias entricas (NARMS), tambin inform de que S. flexneri y S. sonnei present diferencias en la resistencia frente a los agentes antimicrobianos. En los NARMS Humanos Asla Informe final de 2005, la resistencia a la tetraciclina y cloranfenicol fue mayor entre S. flexneri , mientras que S. sonnei aislados mostraron una mayor resistencia a la estreptomicina y sulfametoxazol / trimetoprim. El porcentaje de aislamientos sin resistencia detectada fue baja enS . sonnei (4,4%) y S . flexneri (5,8%) (6). En base a la resistencia a los antimicrobianos de los aislamientos, se agruparon en 73 patrones ( Tabla 4 ). Nueve patrones agrupan 44,1% de los aislamientos.

Los resultados indicaron que el 96,7% de las cepas (147 cepas) fueron resistentes a al menos un frmaco y slo dos aislamientos fueron sensibles a todos los frmacos probados. Resistencia mltiple, es decir, la resistencia a dos o ms frmacos, se observ en 137 aislamientos (90,2%) y, entre ellos, 82.2% fueron resistentes a tres o ms antibiticos. Aislamientos de alimentos eran resistentes a la gentamicina y slo presentan resistencia intermedia a cloranfenicol, tetraciclina y sulfametoxazol / trimetoprim, que pertenece a la patrones de G, H e I (Tabla 4 ). Los tres aislamientos de alimentos pertenecan a tres patrones diferentes y nicos, lo que sugiere que se diferencian de los aislados de heces fecales. Perfil de Resistencia A contena 36 S. flexneri aislamientos, todos resistentes a la ampicilina, sulfametoxazol / trimetoprim, tetraciclina, estreptomicina, cloranfenicol, y resistencia intermedia a la kanamicina. Perfil B agrupa nueve S. flexneri aislamientos (5,9%), que difieren del perfil A slo por la sensibilidad a cloranfenicol. Perfil C y D agrupan cinco S. flexneri asla cada uno, y el perfil de E agrupa cinco S. sonnei asla. Los aislamientos restantes (n = 85) se agruparon en ms de 65 patrones, y representaron el 55,9% de las cepas analizadas. La mayora de los multi-resistentes eran uno S. flexneri aislado que presenta resistencia a la ampicilina, sulfametoxazol / trimetoprim, tetraciclina, estreptomicina, cloranfenicol, y kanamicina (perfil de M), y dos S. flexneri asla que presenta resistencia a la ampicilina, sulfametoxazol / trimetoprim, tetraciclina, estreptomicina, cloranfenicol, kanamicina, gentamicina y (perfil N). Varios estudios han informado de la participacin de los resistentes a los frmacos S. sonnei y S. flexneri en las enfermedades transmitidas por los alimentos. Por ejemplo, entre 392 Shigella aislados obtenidos a partir de muestras de heces de personas con diarrea aguda en el sur de Trinidad, durante 1997-2006, 75% de la S. sonneiaislamientos eran resistentes a todos los antibiticos probados (ampicilina, tetraciclina, sulphamethoxazole/trimethoprim, amoxicilina-cido clavulnico, cefuroxima, cloranfenicol, ciprofloxacina, aztreonam, y gentamicina) (30). En Calcuta, durante un perodo de 4 aos (2001 a 2004), todos los S. flexneri aislamientos obtenidos de nios hospitalizados con diarrea entre 2001 y 2004, fueron resistentes a la ampicilina, cotrimoxazol, tetraciclina, cido nalidxico y fluoroquinolonas (33). Durante un perodo de 12 aos, 68 Shigella aislamientos (31 S. sonnei , 30 S. flexneri , 4 S. dysenteriae , y 3 S. boydii fueron recolectados) en un Hospital de la Universidad francesa de las heces de los pacientes con historia reciente de viaje a diversas partes del mundo, especialmente en frica y la prueba de resistencia a los medicamentos. Estos aislados eran a menudo resistente a la estreptomicina, espectinomicina, trimetoprima, tetraciclina, sulfonamidas y, resistentes a la ampicilina y cloranfenicol (66 al 84%), o resistentes al cido nalidxico. Multi-resistencia se verific en el 87% de los aislados, y se identificaron un total de 13 patrones de resistencia a los antibiticos (13). En Brasil, un estudio llevado a cabo durante un perodo de 24 meses con el objetivo de evaluar la resistencia de los enteropatgenos aislados de nios con diarrea en Rondonia (Amazona occidental, Brasil) indic una alta frecuencia de cepas resistentes a sulfametoxazol / trimetoprima, ampicilina, amicacin, penicilina y cotrimoxazol.Dieciocho S. flexneri asla resistencia est representada a mltiples antibiticos, as como una baja frecuencia de la resistencia al cido nalidxico y quinolonas (ciprofloxacina y norfloxacina) (40). Otro estudio, que comprende 62Shigella (47 S. flexneri y 15 S. sonnei ) aislados seleccionados a partir de muestras fecales y probado en Laboratorio de Clera y Enfermedades entricas (NRLCED) de la Fundacin Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil, en 1999 - 2003, indic que todos los aislamientos fueron sensibles al cido nalidxico, ciprofloxacino y gentamicina. Todos menos uno (cefalothin resistente) era cefalosporinas susceptible. Se identificaron un total de ocho perfiles de resistencia bacteriana. La AMP perfil, SMX, TMP, SPT, STR, TET, CHL fue la ms comn y se agrupan 38 S. flexneri asla. Perfil SMX, TMP, SPT, STR, TET contena 12 S. sonnei aislamientos (34). Nuevos patrones de resistencia antimicrobiana de Salmonella y Shigella especies son motivo de grave preocupacin en varias partes del mundo donde la fiebre tifoidea y la fiebre tifoidea y otras formas de salmonelosis y shigelosis son endmicas. La aparicin de cepas multirresistentes tiene importantes implicaciones clnicas y de salud pblica para la poblacin en situacin de riesgo, para continuamente necesaria esta vigilancia razn (25). La aparicin de resistencia de Shigella spp. cepas, lo que resulta en un aumento de la mortalidad, presenta una amenaza importante para el control de enfermedades, especialmente en los pases menos desarrollados, donde los antibiticos se prescriben con frecuencia sobre una base emprica. De acuerdo con Dromigny et al. (12) Los estudios regulares deben llevarse a cabo con el fin de vigilar la farmacorresistencia y contribuir a los esfuerzos de control de diarreas bacterianas.

PCR-ribotipificacin La PCR-ribotipificacin utilizada en el estudio fue capaz de discriminar Shigella especies y otros gneros bacterianos ya que las muestras que contienen ADN de S. flexneri , S. sonnei , S. aureus ATCC 25923, S.cholerasuis ATCC 10708 y S. Enteritidis 3091/05 produjo patrones de bandas distintas. Curiosamente, Shigellaespecies presentan la misma bandas como E. coli ATCC 25922 y E. coli O157: H7. De acuerdo a Coimbra et al. (9)Shigella spp. (Excepto S. boydii serotipo 13) y Escherichia coli constituyen un nico grupo de afinidad de ADN, y en una estricta base cientfica, los Shigella especies deben ser consideradas como E. coli clones. Corroborando esta similitud, Shigella spp. y enteroinvasivos E. coli (EIEC) se han considerado responsable de la shigelosis en los seres humanos (32). En este estudio, los 152 Shigella aislamientos (149 fecales taburetes aislamientos + 3 aislamientos de alimentos) se sometieron a anlisis de PCR-Ribotipo, presentado tres patrones de bandas, designado SH1, SH2, SH3 y ( . Fig. 1 ). Perfil SH1 fue compuesta por 116 S. flexneri asla, y el patrn de bandas fue constituida por dos bandas (480 y 570bp). Perfil SH2 fue compuesta por 35 S. sonnei asla, la presentacin de un patrn de bandas de tres bandas (350, 480, y 570bp). El perfil SH3 contena el S. dysinteriae aislar, presentando un patrn de bandas de dos bandas (570, y 700 pb), pero sus pesos moleculares no eran los mismos que de SH1. Una banda de aproximadamente 570bp se detect en todos los Shigella aislados.

En el presente estudio, la PCR-ribotipificacin era capaz de diferenciar Shigella especies involucradas en la shigelosis transmitida por los alimentos de S. Enteritidis 3091/05. Este Salmonella cepa present el mismo patrn genotpico (por PFGE y secuenciacin del ADN) como S. Enteritidis SE86, el principal agente causal de las enfermedades transmitidas por los alimentos investigadas en el Estado de RS, en los ltimos aos (29). Teniendo en cuenta la dificultad de diferenciar Salmonella a partir de Shigella por mtodos

convencionales, el mtodo de PCR-ribotipificacin utilizado en este estudio ha demostrado ser adecuado para la investigacin de rutina de brotes de origen alimentario en RS. Adems, la amplificacin de las secuencias espaciadoras intergnicas utilizando rRNA genes es bien conocido como una buena herramienta para la tipificacin de bacterias (10). Estas regiones espaciadoras demuestran extensa secuencia y variacin de la longitud que se puede utilizar para introducir bacterias en el gnero, las especies y subespecies niveles (11, 20, 21). PCR-ribotipificacin tiene algunas ventajas en comparacin con otros mtodos moleculares, principalmente debido a que no consume mucho tiempo y de bajo costo. Por ejemplo, muchos informes han utilizado PFGE para escribir Shigella porque es muy discriminatoria y considerado el "estndar de oro" para los microorganismos escribir (15, 26, 36), pero esta tcnica es engorroso y costoso, lo que dificulta su aplicacin en los laboratorios de salud pblica. Los patrones de bandas de diez cepas que no pudieron ser identificados a nivel de especie, aparecen como PCR-ribotipo Shigella spp, fueron similares a los presentados por S. sonnei (n = 2) y S. flexneri (n = 8), lo que sugiere que los diez aislamientos pertenecan a estas dos especies. Experimentos serolgicos confirmaron estos resultados. Los resultados de este estudio indican que los varios Shigella cepas implicadas en diferentes brotes Shigelosis presentan el mismo PCR-ribotipificacin patrn de bandas y tambin el mismo perfil de resistencia, lo que sugiere que otras cepas estrechamente relacionadas pueden haber sido el agente causante de los brotes. Segn Navia y Gascn (26), ms a menudo los casos o brotes de shigelosis se producen debido a la propagacin clonal de una o unas pocas cepas. Cabe sealar que la PCR en ribotipificacin result en un menor nmero de los patrones de bandas que hacan la prueba de resistencia a los antibiticos. A pesar de que la resistencia antimicrobiana en microorganismos podra estar mediada por plsmidos u otros elementos de ADN transmisibles, no modificando el ADN cromosmico, se requieren otros mtodos de tipificacin molecular para asegurar la relacin clonal de la Shigella cepas. CONCLUSIN Varios Shigella cepas demostraron PCR-ribotipificacin patrones de bandas similares y tambin del perfil de resistencia a antibiticos, lo que sugiere que las cepas estrechamente relacionadas son responsables de los brotes de shigelosis transmitidos por los alimentos estudiados se produjo en el Estado de Rio Grande do Sul. PCR-ribotipificacin era capaz de diferenciar correctamente las especies de Shigella, lo que demuestra que es til para la investigacin de brotes de origen alimentario. AGRADECIMIENTOS Nos gustara expresar nuestro sincero agradecimiento al personal del Laboratorio Central de Rio Grande do Sul (FEPPS / IPB / LACEN / RS), proporcionando las muestras, especialmente de Solange Mendes Longaray y Juana Mari Correa Ambos, de la Seccin de Alimentos y a Silvia da Silva Ros, de la Seccin de Bacteriologa. REFERENCIAS 1. Andrews, WH; Flores, RS; Silliker, J.; Bailey JS (2001). Salmonella. En: . Downes, FP, Ito, K. (eds) Compendio de mtodos de anlisis microbiolgico de alimentos, 4 ed. Asociacin Americana de Salud Pblica. Washington, DC, p. 357-380. [ Links ] 2. Brasil (2001). Resoluo RDC 12 de 02 de janeiro de 2001. Regulamento Tcnico Principios gerais para o Estabelecimento de Criterios e Padroes microbiolgicos Alimentos prr. Dirio Oficial da Repblica Federativa do Brasil, Brasilia, 02 de enero 2001. Seo 1. Disponible en: http://www.anvisa.gov.br [ Links ] 3. Brasil (2005). Ministrio da Sade. Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria. Lanado Projeto prrafo Prevenir Resistencia Antibiticos aos. Notcias da Anvisa: Dirio e Mensal, Brasilia, 22 de junio Disponible en:http://www.anvisa.gov.br/divulga/noticias/2005/220705.htm consultado el 17 de mayo de 2007. [ Links ]

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Enviado: 08 de abril 2009; devuelto a los autores para correcciones: 04 de abril 2010, Aprobado: 21 de junio de 2010.