ESTANDARIZACIN DE UN PROTOCLO DE CARACTERIZACIN MOLECULAR DE Mycobacterium tuberculosis A PARTIR DE MUESTRAS DE ESPUTO DE PACIENTES CON DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS DE LA POBLACIN INDGENA

WIWAS Y KOGUIS DE LA SIERRA NEVADA DE SANTA MARTA

JORGE FUENTES RIVEIRA SANDY ROMERO MOLINA

DIRECTOR ANDERSON RAMIREZ AYALA LIC. EN BIOLOGA MAGISTER EN GENETICA HUMANA

ASESORA MARIA CECILIA YANETH GIOVANETTY BACTERIOLOGA MAGISTER EN CIENCIAS BASICAS

UNIVERSIDAD DE SANTANDER BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO VALLEDUPAR-CESAR 2013

ESTANDARIZACIN DE UN PROTOCLO DE CARACTERIZACIN MOLECULAR DE Mycobacterium tuberculosis A PARTIR DE MUESTRAS DE ESPUTO DE PACIENTES CON DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS DE LA POBLACIN INDGENA WIWAS Y KOGUIS DE LA SIERRA NEVADA DE SANTA MARTA

JORGE FUENTES RIVEIRA SANDY ROMERO MOLINA

DIRECTOR ANDERSON RAMIREZ AYALA LIC. EN BIOLOGA MAGISTER EN GENETICA HUMANA

ASESORA MARIA CECILIA YANETH GIOVANETTY BACTERIOLOGA MAGISTER EN CIENCIAS BASICAS

DOCENTE TANNIA DAVID VENEGAS

UNIVERSIDAD DE SANTANDER BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO VALLEDUPAR-CESAR 2013

1. PLANTEAMIENTO DE PROBLEMA 1.1 FORMULACIN Durante toda su historia, la especie humana ha sido peridicamente atacada por diferentes agentes biolgicos que han puesto en peligro su propia existencia. Uno de estos microorganismos es el Mycobacterium tuberculosis, causante de la enfermedad infecciosa denominada tuberculosis; la cual se transmite de persona a persona por inhalacin de aerosoles contaminados por el microorganismo, que ha sido eliminado por los individuos enfermos al toser, hablar o estornudar. (Fernndez, H; et al. 2009). Investigaciones realizadas indican que desde el ao 2003 fallecen anualmente aproximadamente 2 millones de personas a causa de esta enfermedad, fundamentalmente en pases en vas de desarrollo, para este mismo ao, de acuerdo a estimaciones de la OMS, hubo 502.605 casos prevalentes, 370.107 casos nuevos de tuberculosis en todas las formas (Pulmonar y Extrapulmonar) y 53.803 muertes; con tasa de incidencia estimada para tuberculosis en todas las formas (Pulmonar y Extrapulmonar) de 43 por 100.000 habitantes, con variaciones de 323 para Hait y menos de 5 por 100.000 habitantes, para Estados Unidos. Diecisiete pases presentaron tasas de incidencia estimada de TBC todas las formas superiores al promedio de la Regin Latinoamericana, concentrando el 82% de los casos nuevos estimados y en el 43% de la poblacin. Finalmente en Espaa, se produjeron en 2004, 25 casos de tuberculosis por cada 100.000 habitantes (es decir una incidencia de 25/100.000). (Plan regional De tuberculosis, 2006). Se ha estimado que la tercera parte de la poblacin mundial, en su mayora pertenecientes a los pases del tercer mundo se encuentra infectada por esta bacteria. Sin embargo, solamente entre el 5-10% de esta poblacin desarrolla la enfermedad en su forma activa, mostrando sntomas clnicos en los primeros 2 aos (TBC primaria) o ms tarde (reactivacin) (Santiago et al., 2005; Al-Attiyah et al., 2006). La TBC es considerada en la actualidad por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) como emergencia mundial, la cual ha reportado la existencia de 8 millones de nuevos casos, con una mortalidad estimada de 3 millones de personas por ao. Esta entidad estim que para el ao 2007 que en el mundo se presentaron 9,27 millones de casos nuevos de TB, es decir, 139 casos por 100.000 habitantes, mostrando un incremento en el nmero de casos con relacin a los presentados en el ao 2006 (9,24 millones de casos nuevos). Regiones como Asia (55% de los casos) y frica (31% de los casos) registran la mayor concentracin de casos. India (2,0 millones casos), China (1,3 millones casos). (Jimnez et al., 2001; Castro et al, 2005).

As mismo, en el reporte publicado en el 2008 por esta misma organizacin, frica, fue el continente que mostro mayor tasa de incidencia mientras que en las Amricas, el ndice de mortalidad fue de 5 casos por cada 100 000 habitantes, siendo Brasil, Hait, y Per los pases con ms alto ndices de fallecidos. En Cuba, la tasa registrada en el 2007 fue de 6.7 x 100 000 habitantes, la mortalidad en los ltimos 7 aos no ha tenido variaciones significativas y se ha mantenido por debajo de 1 x 100 000 habitantes. (Organizacin Mundial de la Salud; 2008). En Colombia se reportan anualmente ms de 11.000 casos nuevos de tuberculosis, lo que indica que an sigue siendo un serio problema de salud pblica. Durante el ao 2008 se notificaron 11.342 casos nuevos, para una incidencia de 25,6 casos por 100.000 habitantes, de los cuales 6.815 (60,08%) ocurrieron en hombres y 4.527 en mujeres (39,91%); en cuanto a la TB infantil, se identificaron 719 casos (6,3%) los cuales ocurrieron en poblacin menor de 15 aos, para una incidencia de 5,47 casos por 100.000 menores de 15 aos. (Luque, R; et al; 2009). A pesar de los avances tecnolgicos, el mejoramiento de la calidad de vida y el mayor acceso a los servicios de salud, la Tuberculosis contina siendo un gran problema de salud pblica a nivel global, con cerca de 9 millones de casos nuevos y ms de un milln y medio de muertos cada ao. Cabe resaltar que para el ao 2007 en Colombia la incidencia de esta enfermedad en todas sus formas fue de aproximadamente 35 casos por 100.000 habitantes; y en el ao 2006 se reportaron 11.122 casos de tuberculosis, de los cuales 10.696 fueron nuevos, para una tasa de incidencia de 24 por 100.000 habitantes. (Luque, R; et al; 2009). La incidencia de esta patologa en el departamento del Cesar en los ltimos aos present cifras que oscilaron entre 28.3 casos por 100.000 habitantes; en 1999 paso a 23 por 100.000 habitantes, en el 2000 ocasionado por el incremento en los casos reportados por las comunidades indgenas del departamento y en el ao 2005 con una incidencia mayor de 37.1 casos por 100.000 Habitantes, (Organizacin Panamericana de la Salud, 2007).

1.2 JUSTIFICACIN

Hace aproximadamente dos dcadas, la irrupcin y el posterior desarrollo de las tcnicas de biologa molecular en el mundo de la microbiologa clnica han supuesto un gran avance en el diagnstico y el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Uno de los campos ms notables de aplicacin han sido las infecciones por micobacterias; destaca la tuberculosis (TB) que es, con mucho, una de las enfermedades infecciosas ms importantes que asolan a la humanidad. (Alcaide, F; 2009). Contextualizando un pco acerca de la importancia del diagnstico de Mycobacterium tuberculosis, es importante mencionar que tradicionalmente, el diagnostico microbiolgico de la TB se ha fundamentado en la baciloscopia, el cultivo y la identificacin fenotpica. Si bien el mtodo ms rpido, sencillo, econmico y disponible es la baciloscopia, su escasa sensibilidad (del 45 al 80% de los cultivos positivos) ha limitado su utilidad, especialmente en las zonas geogrficas de menor incidencia de la enfermedad y en las formas extrapulmonares (paucibacilares) de esta. Adems, hay que tener en cuenta que un porcentaje nada despreciable (17%) de la transmisin tuberculosa se debe a pacientes con baciloscopia negativa y cultivo positivo. Hoy en da el cultivo contina siendo el mtodo de referencia por su sensibilidad y por permitir acceder a estudios posteriores con el aislado micobacteriano (identificacin, sensibilidad y tipificacin epidemiolgica). Sin embargo, la lentitud de crecimiento del bacilo tuberculoso representa el mayor inconveniente para un diagnstico rpido de la enfermedad. (Alcaide, F; 2009). A pesar de que es cierto que el cultivo ha tenido un desarrollo espectacular mediante los nuevos medios y sistemas ms o menos automatizados para la deteccin de Mycobacterium tuberculosis; para la ejecucin de estos sistemas de cultivo, an se requieren varias semanas para alcanzarla confirmacin microbiolgica definitiva, y ms an con los procedimientos de identificacin fenotpicos. Por todo esto, en los ltimos aos se han desarrollado nuevos mtodos para el diagnstico rpido de la TB activa, y los moleculares o genotpicos son la mejor alternativa. (Oyola; A; et al; 2012). De igual forma, es de vital importancia mencionar que uno de los aspectos ms relevantes y controvertidos sobre la aportacin de la biologa molecular en el diagnstico de la TB es la deteccin directa de Mycobacterium tuberculosis de la muestra clnica. Es indudable que el diagnstico rpido (de 24 a 48 horas) de la TB activa representa uno de los mayores retos en el control de la enfermedad, ya que posibilita una intervencin epidemiolgica (aislamiento y estudio de contactos) y tratamiento precoz, que incrementa las posibilidades de interrupcin de la transmisin infecciosa. (Garca, G; et al; 2010).

En los ltimos 15 aos se han desarrollado muchas tcnicas moleculares (comerciales y caseras), si bien todas se fundamentan en la amplificacin de secuencias genticas (ADN o ARN) especficas del complejo Mycobacterium tuberculosis y su posterior deteccin, lo que no implica necesariamente la viabilidad de la micobacteria. A pesar del ingente nmero de trabajos publicados hasta la fecha, no hay evidencia cientfica slida, unnime y concluyente sobre el tema. Pese a todo esto, cabe resaltar que los mtodos moleculares son capaces de detectarla presencia de Mycobacterium tuberculosis en el 80 al 90% de los pacientes con sospecha clnica de tuberculosis pulmonar, varias semanas antes que el cultivo convirtindose esto en una ventaja de gran importancia en comparacin con el diagnostico tradicional. (Barrera, L; 2007). En resumen, si bien las tcnicas de biologa molecular no pueden hoy por hoy sustituir completamente a la metodologa tradicional en el diagnstico de la TB, son un pilar fundamental en el diagnstico rpido de esta. La gran variedad de mtodos disponibles y en constante evolucin, as como los diferentes grados de aplicacin, ha conllevado la instauracin progresiva e imprescindible de esta tecnologa, en la mayora de los laboratorios de microbiologa clnica de los pases desarrollados. (Esparcia, O; et al; 2012). De acuerdo a lo antes mencionado, con este proyecto se pretende estandarizar un protoclo de caracterizacin molecular de Mycobacterium tuberculosis a partir de muestras de esputo provenientes de pacientes con sospecha clnica de tuberculosis; debido a que el aislamiento en cultivo del microorganismo es lento parmetro que atrasa el diagnstico oportuno de la tuberculosis, as mismo se hace necesario realizar el presente estudio porque hasta la fecha en la regin son pocas las investigaciones basados en diagnstico molecular de la patologa como tal .

2. OBJETIVOS

2.1.

GENERAL

Estandarizar un protoclo de caracterizacin molecular de Mycobacterium tuberculosis a partir de muestras de esputo de pacientes con diagnostico de tuberculosis de la poblacin indgena Wiwas y Koguis de la sierra nevada de Santa Marta

2.2.

ESPECIFICOS

Realizar la extraccin de ADN de Mycobacterium tuberculosis a partir de muestras de esputo provenientes de pacientes con diagnostico de tuberculosis, para su posterior amplificacin por Reaccin en Cadena de la Polimerasa. A. Obtencin de muestras a partir del laboratorio de salud publica departamental. B. Cultivo de las muestras C. Extraccin de ADN por medio del kit comercial wisar genomics de promega

Cuantificar la concentracin de ADN extrado de las muestras de esputo analizadas, con el fin de que se garantice una mejor amplificacin del Gen de inters A. Realizar un corrido electrofortico en gel de Agarosa 6% para evidenciar y cuantificar el ADN extrado de las muestras.

Amplificar el Gen IS6110 presente en las muestras de esputo mediante la tcnica de Reaccin en cadena de la Polimerasa con el fin de que se identifiquen los pacientes positivos para Mycobacterium tuberculosis

B. Probar tiempos y temperaturas en el procedimiento de extraccin de ADN. C. Probar las concentraciones y las cantidades de las enzimas que participan en el proceso. D. Realizar electroforesis en gel de agarosa para verificar que el fragmento amplificado corresponda al marcador de peso |molecular.

3. MATERIALES Y METODOS 3.1 CLASIFICACIN DE LA INVESTIGACIN Estudio de tipo descriptivo 3.2 POBLACIN DE ESTUDIO Y MUESTRA Debido a que es un estudio en el cual se pretende estandarizar un protocolo de caracterizacin molecular del Mycobacterium tuberculosis se trabajar con 30 muestras de esputo (15 de pacientes wiwas y 15 de pacientes koguis) proveniente de pacientes con diagnostico de tuberculosis pulmonar, dichas muestras sern suministradas por el laboratorio de salud pblica departamental. 3.3 DISEO METODOLGICO Este proyecto de investigacin se dividir en tres etapas: PRIMERA ETAPA: OBTENCIN DE LAS MUESTRAS El trabajo incluir 30 muestras correspondientes a pacientes con diagnostico de tuberculosis pulmonar pertenecientes a la poblacin indgena Wiwas y Koguis en la sierra nevada de Santa Marta; de cada uno de ellos se obtendr igual nmero de muestras clnicas correspondientes a esputo (1 muestra por pacientes); las cuales sern obtenidas a travs del laboratorio de la secretaria de salud departamental. En lo correspondiente al manejo de las muestras tras su obtencin cabe aclarar que estas deben venir en frascos tapa rosca en material de polipropileno, previamente rotuladas con su respectivo cdigo de identificacin del paciente, su transporte ser en cavas de icopor con pilas de hielo manteniendo la cadena de frio para garantizar as su conservacin hasta llegar al lugar de destino que ser el laboratorio de investigacin de Gentica y Biologa molecular de la Universidad de Santander sede Valledupar; dichas muestras sern procesadas de forma inmediata tras su llegada. SEGUNDA ETAPA: PROCESAMIENTO DE MUESTRAS, EXTRACCIN DE ADN, PURIFICACIN DE ADN Y AMPLIFICACIN DE LA SECUENCIA IS6110

Para concentrar y neutralizar las muestras, se agregara un volumen igual de Hidrxido de Sodio (NaOH) al 4%, se mezclara en vrtex y, posteriormente se centrifugara durante 15 min a 3,500 rpm. El sobrenadante se descartara y al precipitado se le agregara 20 ml de agua destilada estril, mezclando en vrtex y se centrifugara a 3,500 rpm durante 15 min. Se repite este paso hasta que el botn de clulas se observe limpio, se diluir el botn en 750 ul de solucin amortiguadora TE pH 8.0 (Tris HCl 100mM y EDTA 1mM). Para obtener el ADN de la muestra, el botn del paso anterior se inactivara por ebullicin durante 20 minutos. Luego, se adicion aran 50 l de lisozima, 10 mg/ml (SIGMA) y se incubara a 37 C durante 2 horas; posteriormente, se adicionara 70 l de SDS 10% y 10 l de proteinasa K de 10 mg/ml y se incubara a 65 C por 10 minutos; y posteriormente, se agregara 100 l de NaCl 5M y CTABN aCl para incubar a 65 C por 10 minutos. Se confirmara la concentracin y pureza del ADN obtenido mediante espectrofotometra. La reaccin de amplificacin se llevara a cabo en un volumen final de 25 ul usando 100 ng de ADN genmico, 1.5 U de enzima Taq Polimerasa y 160 uM de cada iniciador, cuya secuencia es: TB1: CCTGTCCGGGACCACCCGCGGCAA y TB2: GGATCCTGCGAGCGTAGGCGTCGG, que generan un producto de 200 pares de bases (pb) de la secuencia de insercin IS6110 del Mycobacterium tuberculosis, bajo las condiciones siguientes: desnaturalizacin inicial de 95C durante 5 min, seguido por 40 ciclos a 95 C durante 1 min, 60C durante 1 min, y 72C durante 1 min. Los fragmentos amplificados se separaran mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% y teidos con nitrato de plata.

Cada ensayo de amplificacin incluir un control positivo (ADN de la cepa referencia de M. tuberculosis y un control negativo (mezcla de reaccin y agua). Para descartar falsos negativos, se repetir el ensayo aadindole al tubo de reaccin con la muestra problema 50ng de ADN de la cepa referencia. Los especmenes se consideraran positivos cuando se observe en el gel un fragmento de 200 pb y negativos al no encontrar ste resultado. TERCERA ETAPA: PRESENTACION DEL PROTOCOLO CARACTERIZACION MOLECIULAR DE Mycobacterium tuberculosis DE

Tras obtener los resultados de los procedimientos realizados y descritos en la segunda etapa de la presente investigacin, se proceder a la elaboracin del protoclo de caracterizacin molecular del microrganismo causante de la tuberculosis pulmonar; dicho protocolo se basara en cada uno de los pasos que que se llevaron a cabo al momento de la obtencin de las muestras y su procesamiento que va desde la extraccin, purificacin de ADN y amplificacin de la secuencia del gen IS6110.

3.4 VARIABLES DE ANALISIS Tiempo de duracin del procedimiento, concentracin y cantidad de los reactivos, temperaturas utilizadas.

3.5 SISTEMA DE HIPOTESIS Debido a que la presente investigacin es de carcter descriptivo ms no experimental se ha establecido que no aplica sistema de hiptesis.