Cromatografa lquida de alto rendimiento determinacin de aflatoxinas en chile man y arroz utilizando columna basada en slice monoltico Resumen

Un simple y rpido cromatogrfico de lquidos de alta eficiencia con deteccin de fluorescencia para la determinacin de la aflatoxina B1, B2, G1 y G2 en cacahuetes, arroz y chile se desarroll. La muestra se extrajo usando acetonitrilo: agua (90:10, v / v%) y despus se purific mediante el uso de ISOLUTE? multimodo extraccin en fase slida. Despus de la derivatizacin pre-columna, los analitos se separaron dentro de 3,7 min utilizando Chromolith? rendimiento RP-18e (100 a 4,6 mm) columna monoltica. Para evaluar los posibles efectos de los componentes endgenos de los artculos alimenticios, con ajuste matricial de calibracin se utiliz para la cuantificacin y validacin. Las recuperaciones de las aflatoxinas que fueron aadidos en muestras de alimentos fueron 86.38-104.5% y RSD fueron <4,4%. El mtodo se aplic para la determinacin de aflatoxinas en man (9), el arroz (5) y el chile (10) muestras. Cromatografa lquida-espectrometra de masas en tndem anlisis utilizando el analizador de triple cudruple y operado en los modos de monitorizacin mltiple de reaccin en las muestras contaminadas se llev a cabo para su confirmacin.

1. Introduccin Especies de hongos tales como Aspergillus (A) A. flavus y en particular A. parasiticus pueden crecer en los productos agrcolas, especialmente en regiones clidas y hmedas y convertirse en objetivo potencial para la produccin de aflatoxinas. Entre las aproximadamente 20 tipos diferentes de las aflatoxinas, slo la aflatoxina B1 (AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1) y G2 (AFG2) estn asociados con el dao heptico agudo y cirrosis (Fig. 1). La aflatoxina M1 (AFM1) es un metabolito hidroxilado de AFB1which se puede encontrar en la leche. Sin embargo, la toxicidad de AFM1 es menor que la AFB1 y se clasific como hepatotxico y carcinognico (Han et al., 2010). Debido a la, teratognicos y mutagnicos efectos cancergenos, hepatotxicos de aflatoxinas, la Internacional Agencia para la Investigacin sobre el Cncer (IARC) han clasificado en

Grupo 1 como carcingeno humano (IARC, 2002). La contaminacin de los alimentos como el arroz, el man y especias especialmente chile por aflatoxinas est muy extendida. El arroz es uno de los ms ampliamente consumida alimentos en el mundo. Es uno de los menos susceptibles a los cultivos micotoxinas contaminacin mientras chile y man pueden ser afectados por aflatoxinas durante la etapa de pre-o post-cosecha (Cho et al., 2008; O'Riordan & Wilkinson, 2008, 2009; Reiter, Vouk, BHM, y Razzazi-Fazeli, 2010). El Reglamento de la Comisin (UE) ha establecido 5,0 ng g 1 para AFB1 y 10,0 ng g 1 para el total de aflatoxinas en las especias?; 2,0 ng g? 1 para AFB1 y 4,0 ng g? 1 para el total de aflatoxinas en el man (Man) y otras semillas oleaginosas y productos elaborados destinados para el consumo humano directo. El lmite fue de 5,0 ng g? 1 y 10,0 ng g? 1 para AFB1 y el total de aflatoxinas, respectivamente, para la tuerca y frutas secas a ser objeto de seleccin, u otro tratamiento fsico, antes del consumo humano o su utilizacin como ingredientes de productos alimenticios (Comisin del Reglamento de 2010). Serie de mtodos analticos han descrito para la determinacin de aflatoxinas en los alimentos; la Los principales son enzima ensayo inmunoenzimtico (O'Riordan y Wilkinson, 2009), la cromatografa en capa fina (Stroka, Otterdijk, y Anklam, 2000) de alto rendimiento de cromatografa lquida (HPLC) (Herzallah, 2009; Khayoon, Saad, Salleh, et al, 2010;. Khayoon, Saad, Yan, et al, 2010;. Quinto, Spadaccino, Palermo, y Centonze, 2009), ultra-alto rendimiento de cromatografa lquida (UPLC) (Fu, Huang, y Min, 2008) y la electroforesis capilar (Pea, Alcaraz, Arce, Ros, y Valcrcel, 2002). Para la tcnica de HPLC, fluorescencia deteccin es til debido a su buena sensibilidad, mientras que la espectrometra de masas

(MS) es excelente para la confirmacin (Frenich, Vidal, RomeroGonzlez, y Aguilera-Luiz, 2009). Hasta la fecha, HPLC de fase inversa utilizando una columna C18 de partcula es la mtodo ms comnmente utilizado (Herzallah de 2009;. Khayoon et al, 2010; Khayoon, Saad, Yan, et al, 2010;. Quinto et al, 2009).. Sin embargo, el uso de columnas monolticas est aumentando constantemente. Columnas monolticas, descrita por primera vez por Tanaka y colaboradores (Minakuchi, Soga, Ishizuka, y Tanaka, 1996), se preparan como una sola pieza porosa hecha de polmero reticulado o slice porosa en diferentes formatos (por ejemplo, barras delgadas membranas porosas, o discos). Las columnas se componen de una varilla porosa continua que proporcionan

Recientemente, se inform de un nuevo mtodo de HPLC para la determinacin de fumonisinas en muestras de alimentos utilizando monoltico basado en slice columna. El tiempo de anlisis se redujo significativamente de 20 min (utilizando una columna C18 de partcula convencional) a aproximadamente 4 min (Khayoon et al., 2010). Estos resultados nos motiv a explorar su utilidad para el determinacin de aflatoxinas. En combinacin con un solo paso ISOLUTE? multimodo extraccin en fase slida (SPE) para la limpieza de los extractos, la reduccin en el tiempo de anlisis sin comprometer el funcionamiento analtico es de esperar que se dio cuenta. muestras que se encontr que contienen las aflatoxinas se confirmaron por lquido cromatografa acoplada a espectrometra de masas de ionizacin electrospary. Las identidades de los analitos separados se confirm por colisiones de baja energa de disociacin espectrometra de masas tndem (CID-MS/MS) usando un instrumento de triple cudruple y operado

en el monitoreo mltiple de reaccin (MRM).

experimental 2,1. Productos qumicos y materiales

Normas de AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 y cido trifluoroactico (TFA) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.).n-hexano y metanol (calidad HPLC) fueron adquiridos de Fisher Cientficas (Loughborough, Leicestershire, Reino Unido), mientras que acetonitrilo (Calidad HPLC) se obtuvo de J. T. Baker (Phillipsburg, Nueva Jersey, EE.UU.). Agua ultrapura (resistividad, 18,2 cm MX? 1) fue producido por una Milli-Q sistema de Thermo Scientific Barnstead (Milford, MA, EE.UU.). ISOLUTE? columnas multimodo SPE (1 ml de capacidad, 100 mg) se obtuvieron de Biotage (Kungsgatan, Suecia).

2,2. Las muestras de alimentos

Veinticuatro muestras incluyendo el arroz (5), man (9) y chile (10) se recogieron al azar de los supermercados y mercados nocturnos desde diferentes lugares en Penang, Malasia. Todas las muestras fueron mantenido en contenedores adecuados y almacenado a temperatura ambiente antes de el anlisis.

2,3. Las soluciones estndar Soluciones de aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 estndares (1,0 mg) fueron preparado mediante la inyeccin de 1 ml de acetonitrilo (grado HPLC) en cada uno

K, factor de retencin; Rs, pico resolucin (calculado entre picos vecinos), N nmero de platos tericos.

Las consideraciones de seguridad

Debido a la toxicidad potencial y la naturaleza cancergena de las aflatoxinas, las precauciones de seguridad se han tenido en cuenta durante la manipulacin por el uso de guantes, gafas de seguridad y la cara desechable mscara. Normas de aflatoxinas y soluciones de trabajo fueron protegidos de la luz. La descontaminacin de las aflatoxinas posibles a partir de material de vidrio, viales y tubos se efecta por inmersin de todo el material de vidrio en estos de hipoclorito de sodio (5,25%) solucin durante 72 h antes de lavar y volver a utilizar.

2,5. Preparacin de las muestras y el procedimiento de limpieza El mtodo como se describe por Akiyama y compaeros de trabajo utilizado fue con modificaciones menores (Akiyama, Chen, Miyahara, Toyoda, & Saito, 1996). Las aflatoxinas se obtuvieron mediante la mezcla de 40 ml de acetonitrilo: agua (90:10, v / v%) con las muestras de alimentos (10,0 g) y se agit vigorosamente durante 30 min. Despus de la filtracin usando un Whatman No. 4 papel de filtro, una porcin del filtrado (1 ml) fue Pas a travs de la ISOLUTE? Multimodo SPE limpieza en columna una velocidad de flujo de 2 mL min? 1 que haba Beens Anteriormente preacondicionado

con metanol (5 ml) y 5 ml de acetonitrilo: agua (90:10, v / v%). El eluato se evapor a sequedad bajo nitrgeno en mbar botellas (5 ml) y los residuos secos derivatizados mediante la adicin Fueron TFA (100 Fl) y n-hexano (300 LL), se agit durante 30 s y era dej en reposo (15 min) en un lugar oscuro a temperatura ambiente. La mezcla se diluy con 900 lL siguiente de acetonitrilo: agua (10:90, v / v%) y la muestra derivatizada se agita en vrtex durante 30 s. Las dos capas se permiti que se separaron, y la capa inferior introdujo en viales de HPLC, era de auto-inyeccin

Preparacin de la matriz correspondi calibracin Soluciones para la matriz calibraciones emparejados fueron preparados por al spiking de extracto blanco de muestra de alimentos (aj, man y arroz) Las cantidades de aflatoxinas con las soluciones de trabajo y Siguiendo el procedimiento de limpieza y derivatizacin.

HPLC aparato y las condiciones cromatogrficas El anlisis cromatogrfico se llev a cabo mediante el uso de un equipo Waters Alianza sistema de HPLC (Milford, MA, EE.UU.) con auto muestreador aos utilizando un detector de fluorescencia (fluorescencia del detector de mltiples k En 2475). La columna analtica fue un Chromolith? rendimiento RP-18e (100 a 4,6 mm) de Merck (Darmstadt, Alemania). la Supelco C18 (Bellefonte, PA, EE.UU.) (250 mm? 4,6 mm de dimetro, 5 lm tamao de partculas) columna se utiliz como comparacin aussi. El mvil etapa fue acetonitrilo: metanol: agua (15:25:60, v / v%) con flujo tasa de 1 ml por minuto a? 1 bajo condicin isocrtica. Quince litros micro

volumen de inyeccin y 30? C temperatura de la columna se utilizaron. la Las longitudes de onda de deteccin se fij en 360nm and 440 nm for the excitation and emission, respectively.

Condiciones LC-MS/MS Agilent 6410A triple cuadrupolo Agilent (LC-MS/MS aos Technologies, Waldbronn, Alemania) equipado con Agilent LC 1200 series inyector automtico, bomba binaria, termostatizado de columna y compartimiento, operado por Mass Hunter versin B.01.04 del software se utiliz. LC separacin se llev a cabo en 50 mm? 2,1 mm ID, 1,7 lm columna de tamao de partcula Comprado de Waters (Milford, MA, EE.UU.) a 35? C. Un gradiente de elucin de acetato de amonio (10 mM) y metanol (100%) como fases mviles A y B, se utiliz respectivement. despus paso aos isocrtico a 10% de B durante 2 min, B era hasta un 45% mayor en 6 min, luego a 100% controladas 6,1 a 7,1 min. La velocidad de flujo fue 200 min lL? 1. El volumen de inyeccin fue de 20 l. Bajo el electrospray ionizacin (ESI +) modo, los parmetros del espectrmetro de masas fueron: voltaje capilar de 4000 V, temperatura y flujo de gas, 350 C min y 10 l? Respectivement 1. Gas nitrgeno (99,99% de pureza) se utiliza para el secado y colisiones Ambos.

3. Resultados y discusin 3,1. Condiciones cromatogrficas El efecto de diferentes proporciones de acetonitrilo (8-29%), metanol (0-40%) y agua (50-75%) como fase mvil en la separacin

de las aflatoxinas mediante la columna monoltica fueron examinados. Lo Se encontr que la separacin rpida (? 2,5 min) se produjo por todo el Cuando las aflatoxinas acetonitrilo se increment hasta 29% de metanol y hasta el 40% el objetivo de la resolucin era pobre. Sin embargo, una composicin de acetonitrilo: metanol: agua (15:25:60, v / v%) dio separacin rpida veces (aproximadamente 3,7 min) con buena resolucin. El efecto de la temperatura de la columna (25-38 C) en la separacin se estudi. Un poco cambio en los tiempos de retencin Cuando el temperatura se elev a ms de 32? C mientras que se encontr la reas de los picos no fueron significativamente afectados. Fase mvil diferente caudales (0.5 a 3.0 mL min? 1) fueron investigados aussi. La retencin horas punta y reas Especialmente efectivo disminuy gradualmente 1 ml min? 1, y la presin de la columna de vuelta era aceptable. El efecto de volumen de inyeccin (5-25 LL) en los tiempos de retencin y pico reas de aflatoxinas fueron investigados aussi. Se encontr Que le tiempo de retencin no aumentar el rea de mayor vigencia mientras que el pico 15 SD de la muestra se inyect. Las condiciones ptimas para la separacin de las aflatoxinas utilizando la columna monoltica fueron: composicin de la fase mvil de acetonitrilo: metanol: agua (15:25:60, v / v%), temperatura de la columna, 32? C, velocidad de flujo, 1 ml por minuto a? 1 y el volumen de inyeccin, 15 LL. La figura. 2A y B en comparacin del cromatograma de aflatoxinas estndar utilizando la columna C18 convencional y la partcula columna monoltica bajo las condiciones ptimas. La retencin Se redujeron significativamente desde los tiempos 17 min (columna convencional) a alrededor de 3,7 min (columna monoltica). El cromatogrfica

optimizar el uso de los requisitos de datos se muestra en la Tabla 1. Separacin Ambos parmetros de las columnas puede ser obtenues desde el pico resolucin (Rs) y el nmero de platos tericos (N). El Rs

Conclusiones El uso de una columna monoltica para la separacin por HPLC de aflatoxinas es por primera vez informado. La limpieza de las muestras se vio afectada por el uso de un solo paso ISOLUTE? multimodo slido fase de extraccin. El mtodo es rpido adelantados, precisa y reproducible. Los parmetros de validacin del alimento es decir, muestras, linealidad, lmites de deteccin y lmite de cuantificacin, precisin y exactitud se realizaron utilizando estndares ajustados a la matriz y mtodos. En el marco del optimizada condiciones, la separacin de las aflatoxinas se redujo de 17 min (columna C18 de partcula convencional) a aproximadamente 3,7 min (columna monoltica). El tiempo de separacin es casi similar a la inform sobre el mtodo UPLC (Fu, Huang, y Min, 2008). La resolucin y rangos tericos de la plataforma 2.70 a 6.03 y 5039-9361, respectivement. El mtodo fue desarrollado aplicado a la determinacin de las aflatoxinas (AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2) en el man, arroz y chile. El uso del anlisis LC-MS/MS usando el QqQ y operacin en el mtodo MRM permite la monitorizacin de un nmero seleccionado de transiciones, proporcionar la identificacin positiva de la aflatoxinas en las muestras contaminadas.