Problemas de Enzimologa

Problemas de Enzimologa
Hoja 1
1.
Vol = 0,1 ml
Pm (NR) = 500.000 Da
V
max
= 20 mol/5ml
[E] = 0,5 mg/ml (de ella sola al estar en homogeneidad)
V
final de reaccin
= 1 ml
a)
Para definir la actividad de la reaccin, en este caso para una enzima
purificada a homogeneidad, se parte siempre de un dato de velocidad, V
max
. Este
parmetro es la condicin en la que normalmente se define la cantidad de
enzima que hay en una preparacin, midiendo la velocidad en condiciones de
saturacin por sustrato. Por esto se sobrentiende que el dato que nos da el
problema de velocidad es el de V
max
.
Por lo tanto, para definir la actividad (Act) en U/ml, partimos de la
equivalencia de los apuntes:
min mol en
do transforma
sutrato de 1 1
Lo que nos piden con la actividad es la cantidad de enzima que hay en la
preparacin de NR. Lo que nosotros hacemos es ensayar en un volumen total de
reaccin de 1 ml un volumen de enzima de 0,1 ml, con lo que 1/10 del volumen
ser enzima. Lo que nos piden es la cantidad de enzima en 1ml, que es la misma
que hay en los 0,1 de preparacin de enzima homognea.
Para calcular el dato comenzamos con la V
max
expresada en min

1
:
1 1
4
5
20

min mol V min mol V
max max
Esta velocidad, es la que presentan 0,1
ml de la muestra de enzima. Como nos piden las Unidades por mililitro de la
reaccin, no hay ms que realizar una regla de tres:
1 1 1
1
40 40
1 1 , 0
4

ml min mol ml Act
ml
Act
ml
min mol
U

b)
En este caso nos piden la actividad especfica (Ae), que se trata de la
actividad referida a la cantidad total de protena. La forma habitual de expresar
la Ae es en U/mg de protena. Como ya sabemos la actividad, y nos dan la
concentracin de protena. En este caso, al encontrarse la enzima purificada a
homogeneidad, los mg de protena que nos dan estn referidos nicamente a la
NR. Ya que la Ae nos define un valor de concentracin de enzima, y toda la
protena es ella misma, el dato de Ae que nos da, es el mximo alcanzable.
El valor mximo que obtenemos es:
1
1
1
1
80
5 , 0
40

mg
ml mg
ml
Ae
mg l m mg
l m
U
U U U
c)
1
Los Katales son una medida de actividad, definida por los moles
transformados por segundo. Po lo tanto, no se trata ms que de transformar las
unidades:
( ) ml Kat Act
ml Kat Act
ml s mol
min
s
min ml
mol
mol
mol
Act
s mol Katal
ml
100 10 66 , 6
10 66 , 6
10 66 , 6
60
10 40
1 1
40
5
1 7
1 1 7
6
1
1
en


U

d)
En este apartado se nos pide la actividad molecular de la enzima, o lo que
es lo mismo, K
CAT
. Como ya vimos en teora, la constante cataltica sale de la
expresin de V
max
, siendo la constante de proporcionalidad que multiplica a [E]
T
para darnos V
max
. Ya que tenemos el dato de Ae mxima, podemos calcular
directamente K
CAT
, sin ms que multiplicar por el peso molecular.
[ ]
enzima la de pura enzima la de
Pm Ae
E
V
K
T
max
CAT

Esto se debe al hecho de estar purificada a homogeneidad, de modo, que
la Ae que hemos hallado es velocidad de transformacin por mg de protena, y
como toda la protena es enzima queda en moles al multiplicarlo por el peso
molecular. Hay que tener en cuenta que este dato solo es aplicable en el caso de
tener un dato de Ae de la enzima pura. Esto se demuestra fcilmente, mediante
las unidades.
1
1 1
1
1
1 1
1
1 1 1

,
_

s
mol
gr
gr
s mol
Da
grE
s molS
K
Pm
Ae
grE
s molS
Pm grE
s molS
molE
s molS
l E
s l molesS
M
s M
K
CAT
pura
CAT

Esto puede ser til en muchas ocasiones, pero siempre hay que tener en
cuenta que necesitamos un dato de V
max
obtenido de la enzima purificada. Una
vez sabido esto, calculamos K
CAT
.
1
1
3
1 1 1
6 , 666
60
000 . 40
000 . 40
000 . 500
10 80
80 80

s K
min
s
min
min K
mmol
mg
mg min
mol mmol mol
K
mmol mol mg min mol mg K
CAT
CAT
CAT
a
CAT

U
e)
Si nos confirman que la enzima presenta dos centros activos, sabramos
que la K
CAT
hallada es K
CAT
molecular, al haber utilizado en la expresin del
apartado anterior el peso del oligmero. De modo que, como vimos en teora, lo
nico que hay que hacer para calcular K
CAT C.A.
es dividir por el n de C.A.. En este
caso K
CAT C.A.
= 666,6 S

1
/2 = 333,3 s

1
.
2
f)
El tiempo del ciclo cataltico (t
cc
) no es ms que la inversa de K
CAT
. Ya que
tenemos una K
CAT C.A.
es preferible utilizar este valor, al garantizarnos un tiempo
de catlisis por C.A. t
cc
= 1/333,3 s

1
= 310

3
s = 3 milisegundos.
En esta segunda parte del ejercicio se nos dan unos datos de purificacin, a
travs de los cuales debemos hallar el grado de purificacin alcanzado. En esta
tabla se nos dan los valores de Volumen, Actividad y Cantidad de protena,
suficientes para calcular el resto de la siguiente forma:
1. Actividad Total: Se define como las Unidades totales del
extracto crudo. Para calcularla se multiplica la actividad por el volumen
(U/ml ml totales = unidades totales). Ejemplo: 1,72 U/ml 14,080 ml =
24,217 U totales
2. Actividad especfica: Actividad del extracto crudo. Como ya
hemos mencionado muchas veces, no implica ms que dividir la
actividad entre la cantidad de protena (U/ml mg/ml = U/mg).
Ejemplo: 1,72 U/ml 31,4 mg/ml = 0,0547 U/mg
3. Rendimiento: Se trata de comparar el paso con el extracto
crudo. El parmetro a comparar es la actividad total, de modo que
efectuamos un clculo de tanto por ciento haciendo que la actividad
total del extracto crudo sea el 100%. Ejemplo:
% 3 , 73
% 100
760 . 17

x
x U
U
U
ser
Tpaso
equivale
Tcrudo
T
U;
4. Grado de purificacin: a diferencia del anterior, esta
comparacin se realiza con la actividad especfica y no se da en tanto
por ciento, sino en veces, resultado de dividir Ae
del paso
entre Ae
crudo
.
Ejemplo: Ae (paso II)/Ae (crudo) = 0,3615 Umg

1
/0,0547 Umg

1
= 6,6
veces
El resultado de calcular esto para todos los pasos se presenta en la
siguiente tabla.
Paso de purificacin
I II III IV V
N

Extrac
to
crudo
(NH
4
)
2
S
O
4
(3045
%)
Calentami
ento a 62
C
Filtracin
en gel de
agarosa
Cromatogr
afa DEAE
celulosa
1 Volumen (ml) 14080 1600 163 188 94
2 Actividad (U/ml) 1,72 11,10 52,58 29,60 41,37
3 Protena (mg/ml) 31,40 30,70 7,31 1,43 1,58
4
Actividad
total
12 24217 17760 8570 5564 3888
5
Rendimiento
(%)
U
T
Vs
U
Tcrudo

100 73,3 35,3 22,9 16,05
6 Actividad
especfica
2 3
0,0547 0,3615 7,19 20,7 26,2
3
(U/mg)
7
Grado de
purificacin
(veces)
Ae Vs
Ae
crudo
6,6 131,5 378 478
Si recordamos, la Ae mxima calculada en el extracto puro, era de 80
U/mg, mientras que la calculada para el V paso de esta purificacin es de 26,2
U/mg. Esto no nos indica necesariamente que en este paso la enzima no est
pura, sino que pudiera ser que la enzima se halla degenerado. Esto habra que
confirmarlo con otras pruebas como un gel de electroforesis.
2.
Pm = 29,6 Kda
0.9 gr en 10 ml. Purificada.
a)
Nos piden si se ajusta a una cintica M&M. Para averiguarlo, lo que
hacemos es primero visualizar la grfica V Vs [S], que se presenta en la siguiente
pgina.
[penicilina]
Velocidad [S]/V
0,1 0,11 0,91
0,3 0,25 1,2
0,5 0,34 1,47
1 0,45 2,22
3 0,58 5,17
5 0,61 8,19
Evidentemente, a simple vista parece asemejarse bastante a una hiprbola
cuadrangular, con una V
max
que debe rondar 0,6 nmol min

1
. Para asegurarse, lo
que se hace es representrar la linearizacin de los datos, y si estos se ajustan a
una recta, es que efectivamente estamos ante una cintica M&M.
4
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 1 2 3 4 5 6
[penicilina]
V
e
l
o
c
i
d
a
d
Serie1
Los datos a representar se encuentran en la tabla anterior, ya que
utilizaremos la linearizacin HW.
El Excel no nos representa el corte en el eje X, pero nos da la ecuacin de
la recta, con la que podemos calcular todos los parmetros:
1. Km: Cuando [S]/Vel = 0. Km x x

+
4858 , 1
7418 , 0
7418 , 0 4858 , 1 0
. Km = 0,5 nM; Km = 0,5 10

9
M . Si nos fijamos, este dato encaja con
lo que se obtendra en la grfica anterior.
2. V
max
: Dato que se puede averiguar por el corte en el eje Y,
adems de por la pendiente. Lo haremos por los dos mtodos.
Pendiente: Ya nos la dan en la ecuacin de la recta: tg
= 1,4858. Su inversa ser V
max
. V
max
= 0,673 nmol min

1
.
Ordenada en el origen: Se trata del valor de y cuando x
= 0.
1
674 , 0
7418 , 0
5 , 0
7418 , 0

min nmol V
V
Km
y
max
max
Con estos dos datos, hacemos la media para obtener que V
max
= 0,6735
10

9
mol min

1
.
3. K
CAT
: Definimos esta constante como la constante de
proporcional para [E]
T
de la ecuacin de la velocidad mxima. Por esto,
podemos definirla como
[ ]
T
CAT
E
Vmax
K
. Podemos definir K
CAT
porque
tenemos nuestra protena purificada y podemos hallar la concentracin
total, de otra forma sera imposible. Pero, ya definimos otra forma de
calcular K
CAT
, a travs de la actividad especfica. El clculo de Ae lo
efectuamos dividiendo el valor de V
max
( mol min

1
) por los mg de
protena. Esta actividad ya es la actividad de la enzima pura, por
haberla hallado con el dato de V
max
del extracto puro.
5
Hanes-Woolf
y = 1,4858x + 0,7418
R
2
= 1
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6
[penicilina]
(nM)
[S]/Vel
(nM/nmol min
-1
)
[S]/V
Lineal ([S]/V)
1
3
9
1 9
3 9
1
9
1
93 , 330
10 6 , 29
10
0166 , 0 10 6735 , 0
6 , 29
5 , 0673
10 10
6735 , 0
10
6735 , 0

s K
mol
gr
gr
s mol
K
Pm Ae K
KDa Pm
mg
U
gr
min mol
gr
min nmol
gr
V
Ae
CAT
CAT
CAT protena
max
-3
10
3.
Respuesta Explicacin
a
)
Verdadero
Porque aunque la expresin de Km incluye las concentraciones
(como Ks aparente),
[ ] [ ]
[ ] ES
S E
k
k k
Km

1
2 1
se trata de una razn, con lo
que si aumenta [E] libre, disminuye [ES] y viceversa, manteniendo
a Km constante.. Km slo depende de las constantes cinticas de
los pasos de unin, disociacin y transformacin de sustrato, que
sern funcin de la energa libre que se libere. V
max
si depende de la
cantidad de enzima.
b
)
Falso
Esto se comprueba matemticamente llegando a la misma
expresin de dos formas diferentes. Decamos que la constante de
especificidad es la razn ente Km y K
CAT
, y que se trata la constante
de la unin entre la enzima y el sustrato. Ahora, tratamos de llegar
a la misma expresin partiendo de la ecuacin de Km y de la
velocidad genrica (independiente de [E]). Sustituyendo [ES] en
la ecuacin de velocidad obtenemos la misma ecuacin, ahora con
la certeza de su independencia de [E].
[ ] [ ] ( )
[ ] [ ]
[ ]
[ ]
[ ][ ]
[ ]
[ ][ ]
[ ][ ] S E
Km
K
Km
S E
K V
ES K V
Km
S E
ES
ES
S E
Km
S E Kesp V
Km
K
Kesp
CAT
CAT
CAT
CAT

;
c)
Verdadero
Hablamos de condiciones saturantes, con lo que implica, pero lo
demostramos calculando al porcentaje de V
max
que llegamos con
una [S] de 100 Km. . 99 , 0
100
100

+

Vmax
Km Km
Km V
v
max
Si V/V
max
= 0,99 esta
relacin es igual a K
CAT
[ES]/K
CAT
[E]
T
(recordemos las ecuaciones).
Esto nos dice que [ES]/[E]
T
= 0,99, con lo que la enzima libre tiende
a 0.
d
)
Falso
Ya que definimos K
CAT
como la relacin de las constantes implicadas
en transformacin. En el caso de una reaccin monosustrato K
CAT
sera k
2
, sin incluir
k1
y k
1
, que formaran parte de Km y Ks.
4.
Nos piden la especificidad, y el parmetro que nos da ese dato es la
constante de especificidad K
CAT
/Km. Para determinar K
CAT
en cada caso, de divide
la V
max
entre la concentracin total de enzima, (0,03 M). No es necesario
6
cambiar las unidades ya que las dos estn en M y se irn en la operacin. Los
resultados se muestran en la tabla:
N Gly V
max
(M s

1
) Km (mM) K
CAT
(s

1
) K
CAT
/Km (s

1
/mM)
1 0,093 0,4 3,1 7,75
2 2,154 0,4 7,8 179,5
3 0,135 0,4 4,5 11,25
4 0,063 0,7 2,1 2
En principio no importan las unidades de Kesp ya que, de momento, nos
sirve para compararlas. Segn eta tabla, la especificidad ira (de mayor a menor)
con el siguiente orden: 2 > 3 > 1 > 4.
b)
En esta pregunta hay que utilizar el dato de K
CAT
mximo que se muestra
en los apuntes, este es de 10
8
M

1
s

1
(mximo valor de k
1
obtenido
experimentalmente), mientras el obtenido en este experimento es de 1,755 10

5
M

1
s

1
, evidentemente no es ele mximo.
Esto se corresponde con lo dicho en teora, que las proteasas eran, tal vez
las enzimas menos eficientes.
5.
E + S ES E + P
No se trata ms que de retomar los apuntes:
1. Consideramos la transformacin ms simple, con un complejo ES y la posterior
formacin de producto ms lenta.
2. La concentracin inicial de enzima, debe ser al menos dos rdenes de
magnitud menor que la concentracin de sustrato. La enzima debe estar a
concentracin cataltica.
3. Consideramos la velocidad inicial hasta que se halla consumido un 5%. Hasta
entonces [S]
o
se considera constante. Con estas premisas, k
2
es totalmente
despreciable. Esto, como ya hemos dicho, se debe al escaso producto formado
a tiempos cercanos a 0.
4. Ya que la etapa lenta es la que implica a k
2
, es la que determina la velocidad
de reaccin.
5. Se basa principalmente en considerar k
2
al menos dos rdenes de magnitud
menor que k
1
. Esto implica que despreciamos la formacin de producto a
partir del complejo enzima sustrato, frente a la formacin y disociacin de
dicho complejo.
Se trata de las 4 premisas genricas ms la especfica para el estado
preestacionario.
b)
Sabemos la ecuacin genrica de velocidad, independiente del n de
etapas, que es la que nos muestra el problema, salvo que nos sustituye K
CAT
por
7
k
1
k
2
k
1
k
2
. Entonces se trata de hacer que la constante cataltica sea k
2
. Para ver las
posibilidades acudimos a la relacin de constantes que nos dan K
CAT
. Para el
supuesto k
2
<< k
3
.
2
3
3 2
3 2
3 2
3 2
3 2
3 2
k
k
k k
k k
k k
K k k
k k
k k
K
CAT CAT

+

<<
+

para
Con esta condicin, la suma del denominador es prcticamente k
3
, que se
elimina con el numerador, quedando como resultado que K
CAT
= k
2
. Esto es el
resultado de la limitacin del proceso, k
2
es tan pequea que nos est
condicionando toda la transformacin. Esto nos sirve para diferenciar las etapas
lentas, ya que siempre que veamos una K
CAT
que tiende a una sola etapa,
sabremos que esa es una etapa lenta que nos limita el proceso, ya que la
constante es mucho menor que las dems.
c)
Se ha insistido en numerosas ocasiones en los apuntes, que Km es Ks slo
en el caso sencillo de la aproximacin al equilibrio. Para demostrarlo cogemos la
relacin de constantes para Km y le aplicamos la 5 premisa k
2
<< k
1
(al menos
dos rdenes de magnitud).
Ks
k
k
k
k k
k
k k
Km
+

1
1
1
2 1
1
2 1
Como se ve, al hacerse despreciable k
2
,
queda sola la constante k
1
, que dividida por k
1
es la constante de disociacin.
En un ejemplo numrico como este, lo que se pretende es que sepamos
manejar las diferentes unidades de las constantes, bien sean de 1
er
o 2 orden.
En primer lugar:
1. k
2
y k
1
, al menos con dos rdenes de magnitud de diferencia a
favor de k
1
. k
1
= 10
4
s

1
; k
2
= 10
2
s

1
; ambas son de primer orden.
2. La constante k
1
es de segundo orden, de modo que debe
presentar unas unidades M

1
s

1
. Su valor numrico debe hacer que Km
sea Ks, por ejemplo 10
7
M

1
s

1
.
3. El valor de Km debe estar en M y elevado a una potencia
negativa, nunca puede ser 1M. Esto se debe a que la formacin del
complejo ES en condiciones estndar es favorable (G
o
< 0), lo que hace
que su constante de disociacin Ks deba ser menor que 0.
Con esto,
M
s M
s
k
k
Ks M
s M
s
k
k k
Km
3
1 1 7
1 4
1
1 3
1 1 7
1 2 4
1
2 1
10 1
10
10
10 01 , 1
10
10 10

, con lo que Km
Ks.
6.
Vel (nmolmin-1)
[s]/vel (nM/nmols

1
)
[S] (nM) Xan HpXan Xan HpXan
2500 23,8 15,5 105 161,3
3300 30 19,8 110 166,7
5000 39,2 28,2 127,5 177,3
10000 56,6 46,5 176,6 215,05
8
16700 65,2 64,5 256,13 258,9
Tenemos las ecuaciones, de modo que hallamos Km y V
max
para cada una.
1. Xantina:
Km= 7007,8 nM = 7010

5
M.
V
max
= 654934,54 nmol min

1
= 654,9
mol min

1
.
2. Hipoxantina:
Km = 20843,5 nM = 2,0810

5
M.
V
max
= 3020797 nmol min

1
=
3.021 mol min

1
.
b)
1. Xantina:
1 10
6
1 1
10 5 , 6 120000
10 20
0167 , 0 9 , 654 ) (

s
mol
gr
gr
s mol
Pm
gr
s mol V
K
max
CAT
2. Hipoxantina:
1 11
6
1 1
10 3 120000
10 20
0167 , 0 3021 ) (

s
mol
gr
gr
s mol
Pm
gr
s mol V
K
max
CAT
c)
3. Xantina:
1 1 15
6
1 10
10 3 , 9
10 7
10 5 , 6

s M
M
s
Km
K
Kesp
CAT
4. Hipoxantina:
9
Hanes-Woolf
y = 0,0069x + 143,82
y = 0,0107x + 74,984
0
50
100
150
200
250
300
0 5000 10000 15000 20000
[S] (nM)
[
S
]
/
V
e
l

(
n
M
/
n
m
o
l

s
-
1
)
Xan
HpXan
Lineal (HpXan)
Lineal (Xan)
1 1 16
6
1 11
10 14 , 0
10 208
10 3

s M
M
s
Km
K
Kesp
CAT
Segn estas constantes de especificidad, la xantina oxidasa
prefiere 27 veces ms a la Xantina que a la Hipoxantina.
En respuesta a la
segunda parte de la pregunta,
hay que decir que
Hemos dicho unas 10
n
veces que las enzimas no afectan a la constante de
equilibrio, de modo, que qu importa Kesp, lo nico que se notar es que en una
mezcla de ambos sustratos, primero llegar al equilibrio el de la xantina y
despus la hipoxantina.
d)
En principio el alopurinol no es un inhibidor competitivo, ya que es
transformable por la enzima a aloxantina, pero tampoco es suicida ya que la
unin con la enzima no es lo suficientemente estable (aunque 300 min no estn
mal). No sabemos si el complejo EAloXan es covalente, con lo que tampoco
podemos basarnos en esas pruebas. Por lo tanto se concluye que el alopurinol
no es suicida ni competitivo. S sera competitivo el producto de la reaccin, la
aloxantina, ya que entra en el C.A. y prcticamente lo bloquea (si es que el paso
es igual de lento en una direccin y en la otra).
Podramos pensar que se trata de un inhibidor reversible parcial, pero estos
se caracterizan por unirse al complejo ES, no a la enzima libre.
10