Autovacunas y diagnstico Rumiantes

Exopol Autovacunas y Diagnstico

Pol. Ro Gallego D8 50840 San Mateo, Zaragoza. Tel 976 694 525 Fax 976 683 017 www.exopol.com exopol@exopol.com

Abreviaturas
PCR Polymerase Chain Reaction. Microbiologa Incluye la microbiologa y antibiograma (aerobios y/o anaerobios segn los casos). ELISA (Enzyme Linked Inmunosorbent Assay). IPX Inmunoperoxidasa. IC Inmunocromatografia.

Fotografas
Todas las fotografas empleadas en este folleto son propiedad de Exopol y estn disponibles en nuestra web.

Precios
Los precios de este folleto pueden ser modificados. Consulta los de las hojas de Toma de Muestras. Adems estamos cambiando muchas de las tcnicas empleadas

SI LA AUTOVACUNA NO TE FUNCIONA TE DEVOLVEMOS EL DINERO*

T DECIDES // SIN PREGUNTAS

No siempre podemos estar seguros de que nuestras autovacunas van a ayudarte con tu problema, pero haremos todo lo posible, y nuestro compromiso es devolverte el dinero si no lo conseguimos. Necesitas algo ms para confiar en nosotros? * Se aplica a cualquier autovacuna. Tienes 9 meses para solicitarlo desde la fecha de envo. No se aplica al diagnstico.

Efectividad de los antiparasitarios Presentacin Toma de Muestras Material de Toma de Muestras Notas a las tcnicas Tcnicas Microbiologa Serologa IPX (Inmunoperoxidasa o Inmunofluorescencia) Abortos Infertilidad Perfil serolgico en reproductivo PCR en leche de tanque Trichomonas Campylobacter Leptospiras IBR BVD/Border. Portadores asintomticos Coxiella Clamidia Diagnstico en campo de Clamidia Toxoplasma Neospora Respiratorio 1 Bajas sbitas 2 4 5 6 6 6 Problemas Nerviosos 7 10 11 12 13 14 15 16 17 18 20 21 21 21 22 23 24 Cutneo y Linfoadenitis Hemoparsitos Fabricacin de Autovacunas Clostridiasis Mamitis-Agalaxia Articular Ocular Problemas podales

33 34 35 36 37 40 41 42 43 44 46

Lavado traqueobronquial en Ovino y Caprino 25 Pasteurellas y Mycoplasmas respiratorios 26 Digestivo 28

Dendogramas. Comparacin de Escherichia coli 29 Diagnstico en campo de Cryptosporidium 30 Autovacuna frente a Cryptosporidium Paratuberculosis 31 32

Presentacin
Exopol se dedica al diagnstico y la elaboracin de autovacunas veterinarias desde 1993. Trabajamos fundamentalmente con especies ganaderas. Trabajamos en toda Espaa y aunque el marco legal lo dificulta mucho, tambin en Francia, Irlanda, Italia, Polonia, Rumania y Portugal. Trabajamos regularmente con la integradora porcina ms grande del mundo (Smithfield Europa) y con algunos de los mayores grupos veterinarios franceses (Rseau Cristal, Labovet, Anilab, Coop Hunaudaye). Nuestra formacin tcnica es muy competitiva: 7 veterinarios (4 doctores), 2 licenciados no veterinarios y 3 tcnicos. Podemos presumir de nuestra capacidad de trabajar en equipo. Hemos incluido en nuestro catlogo de diagnstico a un gran nmero de patgenos con muchas tcnicas diferentes, con el objetivo de permitirte que puedas profundizar en algunos casos.(si as lo deseas) Consulta nuestra hoja de Toma de Muestras. En algunos casos podemos presumir de ser de los primeros laboratorios en incluir como rutina en el diagnstico de problemas reproductivos a Border (1997), Coxiella y Campylobacter (1998), Leptospiras (2000) o de hacer autovacunas de Cryptosporidium (2008), de Coxiella (2009) o de Leptospiras (2010). En las autovacunas utilizamos liposomas para inmunopotenciar los exopolisacridos bacterianos (Amorena B., Baselga, R. y Albizu, I. 1994. Use of liposome-immunopotentiated exopolysaccharide as a component of an ovine mastitis staphylococcal vaccine. Vaccine. 12, 3: 243-249). Los liposomas se emplean en algunas vacunas frente a hepatitis e influenza en medicina humana y en algunos tratamientos anticancerosos y antifngicos (Felnerova y cols. Liposomes and virosomes as delivery systems for antigens, nucleic acids and drugs. Curr Opin Biotechnol. 2004 Dec;15(6):518-29). Nosotros empleamos los liposomas en autovacunas veterinarias. Desde 1993 hemos fabricado ms de 25.000 autovacunas diferentes (ms de 30.000.000 dosis) y realizado ms de 80.000 analticas. Nuestra autovacuna de Agalaxia no se detecta en la serologa convencional, lo que facilita los programas de erradicacin y la podemos combinar con S. aureus, C. pseudotuberculosis, etc. Dedicamos un importante esfuerzo a la investigacin. Ahora tenemos un proyecto CDTI IDI20090420. Criptosporidiasis. Diagnstico y Elaboracin de Autovacunas. Presupuesto: 758.453,00. Otros han sido CDTI 00-0078, 477.800 y CDTI 050484, 450.000. Al menos el 35% (y creciendo) de nuestra actividad y presupuesto es I+D. Tenemos colaboraciones cientficas con diferentes Universidades y Centros de Investigacin: Peter Kirkland, Australia. Juan Jose Ramos y Luis Miguel Ferrer. Univ. Zaragoza. Andrew Waller, Reino Unido. Pat Blackwall, Australia. Vito Martella y Laura Grazia, Bari , Italia. Jos Garayzabal, Ana Isabel Vela y Lucas Domnguez, Complutense de Madrid. Jos Penads, CSIC Len. Luis Miguel Ortega Mora y Esther Collantes, Complutense de Madrid. Daniel Villalba, Univ. de Lleida.

Toma de Muestras
La utilidad de la informacin que el laboratorio da al clnico est limitada por la calidad de las muestras analizadas (adecuacin de la muestra a las enfermedades sospechadas, nmero y cantidad de las muestras, condiciones y material de recogida, conservacin y envo, identificacin, anamnesis, etc.) Sangre Sangre entera con anticoagulante. Refrigerada. Debe llegar al laboratorio antes de las 24 horas tras su extraccin. Proteger los tubos frente a los golpes. Para PCR y tincin de hemoparsitos: EDTA. Para cultivos bacterianos o de hemoparsitos (autovacunas): Heparina. Suero En tubos sin anticoagulante. Refrigerada. Los anticuerpos se pierden con el paso del tiempo por lo que hay que congelar el suero sin coagulo, si se van a guardar ms de una semana. Nunca congelar los sueros con cogulo. Para maximizar el volumen de suero deja el tubo inclinado o invertido a temperatura ambiente unos 30 minutos tras la extraccin de la sangre. Heces Para el anlisis coprolgico. No precisa refrigeracin. No congelar. Emplear un recipiente hermtico, bolsa o frasco. Recoger directamente del recto con guante o bolsa de plstico. Para cultivos bacteriolgicos es mejor utilizar un hisopo rectal (tras limpiar el exterior del recto) con medio de transporte. Raspado Cutneo Enviar en botes o tubos estriles. Para diagnstico de ectoparsitos, infecciones bacterianas o fngicas. No precisan refrigeracin. Raspar con una hoja estril de bistur los bordes del rea afectada tomando pelo y piel y profundizando hasta que sangre. En caso de infecciones bacterianas utiliza un hisopo tras quitar la costra o limpiar la piel. En linfoadenitis, abre el absceso y raspa la pared de la lesin con el hisopo (el pus frecuentemente es estril). Lquido Cefalorraqudeo o Sinovial Refrigerado y en tubos con anticoagulante (heparina). Tomar la muestra con una jeringa estril. Orina En frasco hermtico y estril. Refrigerada nunca congelada. Recoger con la mxima esterilidad, idealmente con sonda o al final de la miccin. Leche No precisan refrigeracin si se ha tomado correctamente de forma estril. Utiliza un tubo estril de boca estrecha (los venojet de 5ml son
Muestras leche. Envo correcto, tubos hermticos, identificados y protegidos de la rotura.

ideales), los botes de orina se contaminan fcilmente por tener la boca muy grande. Selecciona animales positivos al Test California, toma la muestra previa al ordeo, limpia el pezn, desecha los primeros chorros de leche, 2-4 ml de leche son suficientes. No aadir ningn conservante. Hisopos o Escobillones Deben de llevar medio de transporte tipo Amies o Stuart. Se pueden conservar refrigerados, pero conviene enviarlos lo antes posible al laboratorio. Los hisopos permiten recoger muestras de exudados con alto contenido en bacterias, clulas y ADN en las cavidades nasal, traqueobronquial, cervical, rectal y conjuntival. Introduce el hisopo tan profundamente como sea posible en la cavidad y girarlo suavemente contra las paredes. Limpia siempre el exterior antes de introducir el hisopo. En cadveres de necropsia, pueden tomarse las muestras con hisopos de rganos (es ms econmico en el anlisis, pero la sensibilidad puede ser peor y se pueden contaminar). rganos procedentes de necropsias y cadveres Es imprescindible la refrigeracin. Mejor no congelar si se solicita anlisis bacteriolgico. Hacer la necropsia inmediatamente tras la muerte o mximo 2 horas despus. Guarde las mayores condiciones de asepsia posibles. Enve rganos afectados enteros o trozos grandes con zonas afectadas y no afectadas, cada uno en un recipiente o bolsa independiente. El intestino se debe ligar en los extremos para evitar prdidas de contenido y contaminaciones. Utiliza una bolsa hermtica para cada rgano. Recuerda que los animales muertos muchas veces no son la muestra ms significativa ni la mejor. Si es posible, sacrifica animales con sntomas y que respondan al cuadro observado en la explotacin. Evita en lo posible el envo de cadveres enteros especialmente en verano. Fetos No hay problema con los fetos pequeos. Envalos dentro de una bolsa con suero de la hembra y la placenta (en otra bolsa). Los fetos grandes (terneros) se descomponen y conviene enviar los rganos en bolsas independientes: cabeza, pulmn, hgado, bazo, rin, cuajar y suero de la hembra. Animales vivos Utiliza una caja resistente. Haz numerosos orificios de aireacin en la caja, especialmente en verano. No ponga agua ni comida. Coloqua en el fondo material absorbente para los excrementos. Envelo a ltima hora de la tarde.

Caja con muestra refrigerada. Envo correcto, el feto est envuelto en plstico hermtico y acompaado de la refrigeracin adecuada.

Material de Toma de Muestras

PODEMOS SUMINISTRARTE ESTE MATERIAL: Hisopos Utilzalos con medio Amies (es el gel que lleva). El gel conserva las bacterias para hacer la microbiologa, y las clulas descamadas para los estudios inmunocitoqumicos (IPX) y el ADN del patgeno para el PCR. Bolsas hermticas Para el envo de rganos o fetos. Tienen un cierre hermtico, muy fcil de utilizar y son altamente resistentes. Evitan que se derramen lquidos durante el transporte. PARA HACER LA MICROBIOLOGIA HAY QUE ENVIAR TROZOS GRANDES DE RGANOS. Los trozos pequeos se contaminan con facilidad. Tubos de leche Enva leche de animales infectados ms una muestra del tanque. 9+1. Basta con 2ml de leche en los tubos que se emplean para sacar sangre. Tubos de sangre Tapn rojo sin anticoagulante. Tapn morado con Edta. Tapn verde con Heparina. Normalmente te pediremos un tubo de cada. En el rojo podemos hacer serologa, en el morado PCR y tinciones y el verde lo empleamos para aislar por cultivo hemoparsitos y bacterias. Botes Para recoger orina u otras muestras de poco volumen. Sondas Para sacar la orina o para lavados traqueobronquiales (ver ms adelante). Tubos con medio para Trichomonas Solictalos previamente (hay que prepararlos frescos) y te indicaremos el modo de tomar la muestra (se inoculan inmediatamente despus de recoger la muestra y se envan al laboratorio). Kits de diagnstico en campo Puedes hacer en el campo el diagnstico de Clamidias, Rotavirus y Cryptosporidium. Ganas tiempo y ahorras dinero.

Notas a las tcnicas

Diagnstico directo En los diagnsticos directos encontramos el patgeno directamente: lo aislamos por cultivo en microbiologa, evidenciamos su ADN/ARN en PCR, lo vemos al microscopio despus de marcarlo con un anticuerpo mediante IPX, lo vemos en microscopia tras una tincin, etc. Este diagnstico es definitivo. Si, por ejemplo, encontramos ARN de BVD por PCR sin ninguna duda hay BVD. Ojo, adems de BVD podemos encontrar un segundo patgeno y te corresponde a ti interpretarlo. Diagnstico indirecto No vemos el patgeno pero encontramos los anticuerpos que ha producido. El problema est en la interpretacin. Por ejemplo un animal vacunado con Clamidia inactivada es seropositivo y un animal infectado tambin. Si tienes abortos no sabes si la seropositividad corresponde a la vacuna o a infeccin. Si un animal abortado es seropositivo a Neospora, no hay vacuna, slo puede ser infeccin pero, los anticuerpos son de una infeccin reciente (estos abortos) o a una antigua? Para contestar a estas preguntas en los diagnsticos serolgicos (indirectos) hay que hacer comparaciones: - Sano con enfermos. - Antes y despus del problema. - Utilizar perfiles serolgicos, -.. Tablas y tcnicas Los datos que incluimos en el texto y tablas los hemos adaptado a las tcnicas y capacidades que tenemos en nuestro laboratorio. Si envas muestras a otros laboratorios consulta con ellos. Por ejemplo, algunos laboratorios hacen una tincin de Stamp para Clamidias y Coxiella, nosotros empleamos el PCR.

Tcnicas
Microbiologa
La muestra la sembramos en diferentes medios de crecimiento y la incubamos (incluso durante varios das, eg. los Mycoplasmas). Una bacteria en el medio se multiplica exponencialmente y llega a formar una colonia visible. La especie que forma cada colonia la identificamos con pruebas bioqumicas (ahora tambin con PCR). Es frecuente que en una muestra aparezca ms de una especie de bacterias. A las especies de inters se les hace un antibiograma.
Las bacterias depositadas en las placas se extienden (diluyen) con un asa en toda la superficie de crecimiento

Serologa
Buscamos anticuerpos. Los anticuerpos se producen tras el contacto con el patgeno, pero no indican que el patgenos est presente en ese momento (un animal que se infect y elimino la infeccin hace aos, normalmente tiene anticuerpos durante aos). Hay muchas tcnicas diferentes para buscar anticuerpos: ELISA (Enzyme Linked Inmunosorbent Assay), Inmunofluorescencia, Aglutinacin, Inmunocromatografia, Fijacin del complemento, Seroneutralizacin, etc. El ELISA es la ms frecuente y la que se emplea en casi todas las campaas. Existen muchos tipos de ELISA.

En estas placas, que aportan todos los factores de crecimiento, las bacterias se multiplican durante 24-48 horas (o varios das) en estufas de incubacin a 37C

ELISA (ejemplo simplificado) Aadimos al pocillo el antgeno (rojo, normalmente se compra la placa preparada). Aadimos un suero problema. Si hay anticuerpos (naranja), se pegarn al antgeno (rojo). Aadimos un segundo anticuerpo (azul, antianticuerpo) con un enzima (* como la inmunoperoxidasa) que se pegara al primero anticuerpo (naranja). Aadimos un sustrato. Si nuestro suero problema se ha pegado al antgeno, el segundo anticuerpo tambin se habr pegado y al aadir el sustrato, la enzima (*) produce un cambio de color (vira a azul) que es lo que se ve en el pocillo.

PCR Real Time

En el PCR multiplicamos un trozo del ADN/ARN del patgeno por eso podemos detectar al patgeno aunque haya cantidades muy pequeas y este muerto. Que muestra tiene De la muestra (hisopo, ms o y cual menos rgano, leche, sangre, suero, ADN del patgeno? heces, etc.) extraemos el ADN/ARN. Aadimos una sonda para un gen que es exclusivo de un patgeno y aadimos las enzimas para que empiecen a multiplicar ese ADN/ARN. Ciclo nmero Los reactivos llevan fluorescencia que se revela cuando se incorpora a las fibras de ADN. En cada ciclo una hebra de ADN da lugar a 2 (1, 2, 4, 8, 16, .) y cada vez aparece ms fluorescencia que es lo que lee el equipo (ver las curvas de arriba, en cada ciclo de la mquina aparece ms fluorescencia en las muestras positivas, ms copias del ADN). En la grfica cada color pertenece a una muestra diferente. En este caso la muestra roja es la que ms patgenos contiene (eg Coxiella), por eso la respuesta positiva aparece antes (en un ciclo de replicacin anterior). LA PCR ES LA TCNICA DE ELECCIN pero puede dar falsos positivos (eg. si las sondas se eligen mal o no estn bien validadas) y falsos negativos (eg. inhibidores en heces). Como siempre nosotros validamos nuestros PCR con otras tcnicas y/o con otros laboratorios especializados.
replicadas del ADN Nmero de copias

Curva de amplificacin del PCR

IPX (Inmunoperoxidasa o Inmunofluorescencia)

Buscamos un antgeno determinado marcandolo con un anticuerpo (100% especfico, monoclonal). El antgeno son las protenas del virus, lipopolisacrido de las bacterias, la pared de los parsitos, etc. Ponemos un poco de la muestra (clulas aisladas de la muestra) en un porta. Aadimos un anticuerpo monoclonal especfico para el agente buscado (BVD/Border, Clamidia, Mycoplasma, Coxiella, etc.) Aadimos un anticuerpo que se une al primer anticuerpo (si ha reconocido el antgeno) y que lleva una enzima. Aadimos el sustrato (Como ves es parecido al ELISA). Si hay cambio de color es positivo. En BVD/Border+ la foto se ve el citoplasma marrn. La BVD/Border causa es que en el citoplasma hay virus BVD o Border. El control negativo no se marca (azul).

patgeno

PAQUETES DE DIAGNSTICO

PRECIOS FIJOS MAS ECONMICO MAYOR SENSIBILIDAD

Ahorra enviando muestras de varios animales

Al trabajar con PCR podemos hacer pooles de varias muestras, por eso la segunda y las siguientes son mucho ms econmicas (no se aplica cuando se necesitan resultados individualizados de cada muestra). Al trabajar con muchas muestras mejoramos considerablemente el resultado. Mayor nmero de muestras estudiadas = Mayor sensibilidad

PANELES DIAGNSTICOS
Aborto Bsico (primer aborto 90 , 2-5 Siguientes 10 ): BVD, IBR, Coxiella, Campy. f. veneralis, Leptospira, Neospora. Infertilidad Bsico (primera muestra 90 , 2-5 Siguientes 10 ): BVD, IBR, Coxiella, Campy. f. veneralis, Leptospira, Trichomonas. Reproductivo Plus (90/pool , tras hacer el bsico): Listeria, Clamidia, Salmonella, Campy. f. fetus, Trichomonas (en abortos), Neospora (en infertilidad). Respiratorio (primera muestra 90 , 2-5 Siguientes 10 ): Micro*, BVD, IBR, BRSV, PI3, Mycoplasma bovis. Digestivo lactante : Micro*, BVD, Coronavirus, Rotavirus, Clostridios, Cryptosporidios. Digestivo adultos: Micro*, Paratuberculosis, Coprologa. Control en Leche de Tanque PCR (90): BVD, Clamidia, Coxiella, Leptospira, IBR. Hemoparsitos (primera muestra 90, 2-5 Siguientes 10 ): Anaplasma marginale, Anaplasma phagocytophilum, Babesia bovis, Babesia bigemina, Theilera annulata. Ocular (primera muestra 60 , 2-5 Siguientes 10 ): Micro*, Clamidias, Mycoplasma bovis, IBR. Fetos: + 25 euros en concepto de necropsia, toma de muestra y eliminacin. Reproductivo Bsico (primer aborto 90 , 2-5 Siguientes 10 ): Toxoplasma, Campy. f. fetus, Coxiella, Clamidia, Leptospira, Salmonella. Reproductivo Plus *(90 /pool, tras hacer el bsico): Border, Listeria, Myc. agalactiae, Neospora, Campy. f. veneralis. Respiratorio: Micro*, Clamidia, Mycoplasma, PI3, Visna-maedi Digestivo lactantes: Micro*, Clostridios, Cryptosporidios, Coronavirus, Rotavirus. Digestivo adultos: Micro*, Paratuberculosis, Coprologa. Articular/Ocular (primera muestra 60 , 2-5 Siguientes 10 ): Micro*, Clamidia, Mycoplasma agalactiae. Nervioso: Micro*, Listeria, Visna, Cenuro. Mamitis 9 leches + Tanque (60 ): Micro*, Mycoplasma agalactiae. Animales/Fetos: + 25 euros en concepto de necropsia, toma de muestra y eliminacin. Reproductivo (primer aborto 90 , 2-5 Siguientes 10 ): PRRS, Leptospira, Clamidia, Parvovirus, Circovirus. Respiratorio (primera muestra 90 , 2-5 Siguientes 10 ): Micro*, PRRS, Influenza, Circovirus, Mycoplasmas. Digestivo lactante: Micro*, Clostridios, PDEV, Rotavirus, Coccidios. Digestivo cebo y adulto (60 /muestra): Micro*, Clostridios, Brachyspiras, Lawsonia. Animales/Fetos: + 25 euros en concepto de necropsia, toma de muestra y eliminacin.

Reproductivo (primera muestra 90 , 2-5 Siguientes 10 ): Micro*, Clamidia, Mixomatosis, Leptospira, Toxoplasma, RHD. Control Semen (90 /pool): Micro*, Toxoplasma, Leptospira, Clamidia, RHD, Mixomatosis, Encefalitozoon. Respiratorio: Micro*, Clamidias, Mixomatosis. Digestivo: Micro*, Clostridios, Coprologa. Animales: + 15 euros en concepto de necropsia, toma de muestra y eliminacin. Microbiologa*: incluye la identificacin bacteriana (incluido salmonella) y antibiograma.

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Abortos
Brucilla (1) BVD Border Campylobacter fetus veneralis, C. fetus fetus Coxiella burnetti Chlamydia IBR Leptospira (2) Listeria Neospora Pulmn, Rin Pulmn, Cuajar, Hgado + + Pulmn, Hgado + + Pulmn, Cuajar, + + Pulmn, Hgado + + Hgado, Rin + + + + + Encfalo, Corazn Salmonela spp + + Pulmn, Hgado +++ +++ Toxoplasma + + Encfalo, + Corazn Trichomona foetus + + Infertilidad (1) Oficial, (2) Serologa frente a Leptospira automnalis, hardjo, bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohemorrgiae y pomona (3) Siempre por duplicado. PCR + + Tcnica Cultivo Serologa + + + rganos feto Muestra Placenta Hisopo cervical (3) Slo por serologa ++ ++ ++ Lavados prepuciales y vaginales +++ +++ +++ +++ ++ + ++ + + + + -

Observa y Apunta: Si slo abortan primerizas y animales jvenes el problema ya estaba en la explotacin. Si abortan animales de todas las edades el problema probablemente es nuevo en la explotacin y seguramente es ms grave.

Paneles diagnsticos Aborto e Infertilidad

En reproductivo y fertilidad consulta los paneles de diagnstico en primera y segunda opcin. MANDA SIEMPRE MUESTRAS DE VARIOS ANIMALES. PUEDES COMBINAR FETOS E HISOPOS DE DIFERENTES ANIMALES. Muestras Abortos Feto (rganos si el ternero es muy grande), placenta y suero de la hembra. Cada patgeno tiene un rgano diana y por eso esta es la mejor muestra. Nosotros trabajamos siempre con dos rganos diana por patgeno. Hisopo cervical. Toxoplasma y Neospora pueden dar falsos negativos en el hisopo. El aislamiento para autovacunas es ms difcil. Enva siempre los hisopos por duplicado, en uno hacemos el diagnstico, en el otro hacemos el aislamiento si se necesitan autovacunas. Adjunta siempre suero de los animales abortados. Anticuerpo vs. Antgeno En el feto, placenta e hisopos localizamos el agente (antgenos o ADN). En el suero, y en lquidos fetales, localizamos anticuerpos. Los anticuerpos indican contacto con el patgeno, pero salvo con los anticuerpos en lquidos fetales que corresponden a infeccin del feto, la serologa normalmente no indica cuando se infect la

Aborto ovino con hemorragias y edema generalizados. Microscpicamente, se observ un infiltrado mononuclear de moderado a intenso en todos los rganos, incluido el encfalo, siendo especialmente marcado en corazn. La sospecha fue infeccin viral, especialmente border, confirmado mediante inmunoperoxidasa.

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hembra, por eso la interpretacin es difcil. Los sueros se pueden parear (antes y despus del aborto o, en el momento del aborto y 15 das despus). Algunas notas sobre Serologa. Los animales vacunados con IBR no marcada son seropositivos durante aos. Con vacuna de BVD inactivada se puede distinguir animales vacunados de infectados. La vacuna viva de Clamidia no seroconvierte (los seropositivos son infectados). La serologa de Leptospiras se debe hacer frente a cada serovar (Leptospira automnalis, hardjo, bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohemorrgiae y pomona).

Infertilidad
Separamos el aborto de la infertilidad porque el abordaje del problema es diferente. Los patgenos incluidos en la tabla son con los que ms trabajamos en los casos de infertilidad. Las seroprevalencias elevadas de BVD/Border, Neospora, Toxoplasma, y muchos otros patgenos tambin se han asociado con una menor fertilidad.

Tcnica Muestra PCR Cultivo Serologa Campylobacter + + tero matadero, lavado uterino Chlamydia + + Hisopo cervical (por duplicado) Coxiella + + Leche tanque Leptospira + + Salmonela + + Tritrichomonas foetus + + Lavados prepuciales y uterinos Serologa frente a Leptospira automnalis, hardjo, bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohemorrgiae y pomona.

Paneles diagnsticos Aborto e Infertilidad

En reproductivo y fertilidad consulta los paneles de diagnstico en primera y segunda opcin. MANDA SIEMPRE MUESTRAS DE VARIOS ANIMALES. PUEDES COMBINAR FETOS E HISOPOS DE DIFERENTES ANIMALES. Muestras Infertilidad teros de matadero, lavados uterinos o prepuciales, y/o hisopos cervicales profundos SIEMPRE POR DUPLICADO. Para Leptospiras enva tambin orina y suero. Para hacer autovacunas de Tritrichomonas foetus tienes que tomar la muestra y llevarla directamente a un medio especial que te podemos enviar. Leche de tanque. Muy til para hacer el seguimiento de una explotacin (no para el diagnstico de problemas clnicos). Resultados Si no encontramos ningn patgeno podemos pensar que la causa no es infecciosa y habr que investigar ms en el manejo.

Autovacunas en Abortos e Infertilidad

Ovino y Caprino Bovino Campylobacter sp., Coxiella, Leptospira, Salmonella, Toxoplasma Campylobacter fetus veneralis, Clamidia, Leptospira, Coxiella, Salmonella, Trichomonas

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Perfil serolgico en reproductivo

Ponemos un ejemplo muy sencillo con un problema reproductivo en ovino o caprino. Sangramos a 10 ovejas de 1, 2 y 3 ms partos (30 animales en total) y cogidas al azar.

Seroperfil Reproductivo
100

Interpretacin Slo un animal (10%) de los grupos 2 y 3 son seropositivos a Toxoplasma (amarillo), por lo que no es un problema presente. El riesgo est en que no hay animales protegidos frente a Toxoplasma. Si entra en la explotacin podemos tener una tormenta de abortos.

Porcentaje de animales seropositivos

90 80 70 60 50 40 30 20 10
Clamidia Border Toxoplasma

Clamidia (morado) circul e infect a varios animales hace 2 0 1 2 3 ms aos (partos), mientras que los animales de 1 parto son Aos o parto del reproductor seronegativos (no infectados). Recuerda que la vacuna viva de Clamidia protege, pero no seroconvierte. La inactivada s seroconvierte. En este caso no sabemos si los animales de un ao han sido vacunados con viva, pero seguro que no estn infectados ni han sido vacunados con muerta. El virus Border (granate) ha infectado a animales de todas las edades. Probablemente los problemas reproductivos cercanos se deben a Border. Adems, con esta seroprevalencia es muy posible que exista un PI (portador asintomtico).

Estudios retrospectivos Nosotros conservamos congelados los sueros de todos los anlisis y podemos recuperarlos para hacer estudios retrospectivos. Saca sangre tras la aparicin de un problema y podemos comparar con los sueros de hace unos meses. Serologa empleada Saca sangre en el momento en que se producen los problemas y 15 das despus. Cuando un proceso es agudo (acaba de entrar y acta de forma fulminante) los animales seroconvierten elevndose los ttulos de anticuerpos frente a ese patgeno 15 das despus. Cuando la infeccin ha sido hace tiempo, aunque el animal sea positivo no se observa seroconversin. Otra alternativa es comparar los resultados de animales con y sin problemas. En este caso muestrea al menos 10 animales abortados y 10 sin abortar de similares grupos de edad (mejor hembras jvenes que sern seropositivas a menos enfermedades).

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PCR en leche de tanque

En leche de tanque podemos hacer el PCR para buscar BVD/Border, Campylobacter, Coxiella, Clamidia, IBR, Leptospira, Paratuberculosis, Salmonella, etc. Algunos patgenos se excretan en la leche. La PCR permite valorar la presencia en la explotacin de ciertos patgenos causantes de problemas reproductivos o peligrosos para la salud humana en leche de tanque. Nunca se puede considerar esta analtica como un diagnstico clnico.

Paneles diagnsticos
Consulta los paneles de diagnstico.

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Trichomonas
Tritrichomonas foetus produce infertilidad en bovino.

Muestras Para su aislamiento necesitamos que nos enves muestras de mucus vaginal de vacas o de smegma prepucial de sementales. Es importante una adecuada toma de muestras (consultanos antes) y su envo en el mismo da en que han sido tomadas.

Antes de tomar la muestra hay que lavar bien con agua el prepucio o la zona de la vulva y secar con papel. En el caso de los toros, si no se dispone de raspador para tomar smegma prepucial, puede hacerse un lavado introduciendo PBS dentro del prepucio con una pipeta de inseminacin artificial a la que se le conecta un tubo de ltex. Con una jeringa se introduce PBS, se efectan vigorosos masajes en sentido crneo-caudal y se recoge el lquido en un frasco, dejndolo caer por gravedad a travs de la goma. Utilizar material estril. No introducir demasiado lquido porque diluye mucho la muestra. Enviarlo siempre REFRIGERADO. Aunque los toros que estn infectados lo estn permanentemente, el parsito generalmente se encuentra en mayor cantidad en las hembras que han abortado recientemente, han vuelto a celo o muestran signos de piometra. Para las trichomonas, podemos suministrarte tubos con medio de cultivo para que t introduzcas directamente la muestra en ellos. Diagnstico PCR Real time. Podemos hacerlo en hisopos, lavados, etc. Cultivo. Llmanos antes y te mandaremos los medios para su aislamiento. No se puede hacer serologa frente a Trichomonas. Autovacunas Las autovacunas son una solucin de eficacia contrastada y de uso internacional.

Cultivo de Trichomonas aislado de un toro. Observacin en fresco. Microscopio de campo claro 63X.

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Campylobacter
Campylobacter fetus fetus produce abortos en ovino y caprino y Campylobacter fetus venerealis infertilidad en bovino. En realidad ambos estn implicados en abortos e infertilidad. Campylobacter coli y jejuni tambin han sido descritos como causantes de abortos, pero a veces pueden ser contaminantes (a partir de las heces), especialmente en los hisopos. Campylobacter fetus veneralis, muestras Para su aislamiento necesitamos que nos enves muestras de mucus vaginal de vacas o de smegma prepucial de sementales. Es importante una adecuada toma de muestras (consultanos antes por telfono) y su envo en el mismo da en que han sido tomadas.
Cepa de Campylobacter fetus fetus aislada de hisopo endocervical de oveja abortada. En la placa de Columbia Blood Agar se depositaron 25 microlitros de suplemento antibitico Preston y se extendieron. En la placa as preparada se sembr el hisopo y se incub hasta 6 das en condiciones de microaerofilia. Obsrvese las colonias de Campylobacter muy pequeas, no hemoflicas, con aspecto de gota de agua que se extienden por la placa.

Antes de tomar la muestra hay que lavar bien con agua el prepucio o la zona de la vulva y secar con papel. En el caso de los toros, si no se dispone de raspador para tomar smegma prepucial, puede hacerse un lavado introduciendo PBS dentro del prepucio con una pipeta de inseminacin artificial a la que se le conecta un tubo de ltex. Con una jeringa se introduce PBS, se efectan vigorosos masajes en sentido crneo-caudal y se recoge el lquido en un frasco, dejndolo caer por gravedad a travs de la goma. Utilizar material estril. No introducir demasiado lquido porque diluye mucho la muestra. Enviarlo siempre REFRIGERADO. Campylobacter fetus fetus, muestras Para su aislamiento es preferible trabajar con fetos ovinos o caprinos. La principal dificultad del aislamiento es que las muestras estn en perfectas condiciones (aborto reciente, sin abrir, seco y limpio externamente con papel y refrigerado). Diagnstico PCR Real time. Podemos hacerlo en hisopos, lavados, fetos, etc. Cultivo a partir de rganos fetales, hisopos, lavados, etc. IPX. Inmunomarcaje. Podemos hacerlo en hisopos, lavados y fetos. No se puede hacer serologa frente a Campylobacter. Autovacunas de Campylobacter fetus
Campylobacter en contenido de estmago de feto bovino. Tincin de plata. Microscopa de campo claro 1000x.

Las autovacunas son una solucin de eficacia contrastada y de uso internacional.

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Leptospiras
La Leptospira es frecuente en abortos e infertilidad. Tambin la vemos en casos con cuadros inespecficos, perdidas de produccin lechera, bajas sbitas. A veces aparece con anemia y/o ictericia, pero esto es menos frecuente de lo que comnmente se cree. En ocasiones la mortalidad que asociamos a otros patgenos son inducidas por una una inmunodepresin por Hemoparsitos o Leptospiras. Hay diferentes serovares. Nosotros trabajamos con los ms importantes (automnalis, hardjo, bratislava, canicola, grippotyphosa, icterohemorragiae y pomona). La inmunidad es especfica de serovar. Muestras Suero para hacer microaglutinacin. En abortos/infertilidad fetos (rin), placenta, teros de matadero, hisopos cervicales (por duplicado), lavados cervicales, etc. Leche de tanque para buscarla dentro de una explotacin. Orina del final de la miccin o mejor obtenida con sonda (disponemos de sondas para ovino y caprino). Diagnstico PCR Real time en orina, leche, fetos, placentas, hisopos cervicales, etc. Serologa. Microaglutinacin. Frente a cada uno de los serovares de Leptospira. Los anticuerpos aglutinan a Leptospiras de diferentes serovares de Leptospiras a diferentes diluciones. La reaccin se observa en el microscopio. La Microaglutinacin se hace con Leptospiras vivas y por eso no es un diagnstico rpido. IPX. Inmunomarcaje (fetos, orina, hisopos), permite identificar incluso el serovar de Leptospira porque emplea anticuerpos monoclonales totalmente especficos. Cultivo (fetos, orina, hisopos). Slo tiene inters cuando se solicitan autovacunas y no se hace en el diagnstico rutinario. Enva siempre los hisopos por duplicado (en uno hacemos el diagnstico, en el otro cultivamos para autovacunas). Control Controla a los roedores (portadores) y potabiliza el agua. Utiliza autovacunas. Autovacunas Podemos hacer autovacunas frente a uno o varios serovares a la vez. La inmunidad es especfica de serovar. No hay vacunas comerciales para ovino, caprino o porcino. En bovino existe una vacuna slo frente a hardjo y otra que combina 5 serovares de Leptospira con IBR no marcada por lo que no se puede utilizar donde haya campaas de control de IBR.

Leptospira en orina. Tincin de plata.

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IBR
IBR es un problema cada vez menos frecuente, al menos en rebaos lecheros. Muestras Suero. Si se ha vacunado con vacuna inactivada la serologa no tiene ningn inters. Fetos, hisopos o lavados cervicales, etc. Pulmn y traquea cuando hay problemas respiratorios o lavados traqueobronquiales. Diagnstico Serologa. PCR en fetos, rganos o hisopos. IPX. Inmunomarcaje en feto, rganos o hispos. Serologa frente a IBR -Todos los animales infectados con IBR y todos los animales vacunados con vacuna sin marcar son positivos en el ELISA frente a IBRgB e IBRgE. - La vacuna marcada no incluye la protena gE. Los animales vacunados con vacuna marcada son seronegativos frente a IBRgE, pero seropositivos frente a IBRgB. Si un animal vacunado con vacuna marcada es seropositivo es porque se ha infectado, o porque en algn momento anterior de su vida fue vacunado con vacuna sin marcar. IBRgB IBRgE Ni infectado ni vacunado. + Vacunado con vacuna marcada + Error. Todos los IBRgE positivos deben positivos a IBRgB + + Vacunado con vacuna sin marcar o infectado. No se puede distinguir.

Ternero de cebo con bronconeumona y traqueitis fibrinonecrticas. En microbiologa se aislaron cultivos masivos de M. haemolytica y Pseudomona aeruginosa. Mediante inmunoperoxidasa se detect la presencia tambin de Mycoplasma bovis, no encontrando positividad frente BRSV, PI-3, BVD, IBR y Adenovirus.

Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4

Notas: - En todos los laboratorios hacemos mucha serologa frente a IBRgB de animales vacunados. Sistemticamente los animales son seropositivos y lo nico que se puede concluir es que han sido vacunados. NO SOLICITES ESE ANALISIS, NO TIENE UTILIDAD (salvo confirmar que los animales han sido vacunados).

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BVD/Border. Portadores asintomticos

Si un animal a principio de gestacin se infecta con el virus BVD o Border y no se produce aborto, el feto puede reconocer el virus como parte de su organismo y nacer como un PERSISTENTEMENTE INFECTADO (que excretar grandes cantidades de virus que infectarn al resto del rebao), pero ser seronegativo durante toda su vida. Ojo, un PERSISTENTEMENTE INFECTADO puede tener inicialmente anticuerpos maternales. Muestras Suero: Las vacunas estn marcadas, la serologa tiene mucho inters. En el suero podemos buscar anticuerpos frente a la protena p80 y antgeno viral circulante (viremia). Piel de la oreja: El virus se localiza en la piel y aqu lo podemos buscar con mayor sensibilidad. Interpretacin de la serologa La vacuna inactivada, la viva no, pierde la protena p80 y no genera anticuerpos contra la p80. Cuando la serologa es positiva a p80 ha habido infeccin con virus campo o se ha vacunado con vacuna viva. Si los animales jvenes son seropositivos, el virus ha circulado recientemente. Si slo los viejos son seropositivos, circul hace algunos aos, pero no ahora (ver perfil serolgico). Si la seroprevalencia esta por encima del 50-60% y estn infectados los animales jvenes, probablemente existir un Persistentemente Infectado.
Substrato Cromgrafo Soluble LECTURA A 450 mm. FRENAR LA REACCIN O-Phenylene diamine (OPD)

BVD

BVD

PI

BVD

BVD

ELISA de bloqueo de BVD p80 En el ELISA de bloqueo, los anticuerpos del animal impiden que los anticuerpos del kit se unan a la placa antigenada con el virus. Cuantos ms anticuerpos tenga un animal, mayor ser el porcentaje de bloqueo. Un animal que bloquea ms del 50% es positivo. Entre un 30 y el 50% es dudoso y por debajo del 30% es negativo. Un dudoso puede pasar a positivo si est seroconviritiendo y a negativo si est perdiendo la inmunidad (calostral o propia).

Anti IgG de ratn HRPO Anticuerpo monoclonal anti p80 BVDV

Permite diferenciar anticuerpos post-infeccin de anticuerpos postvacunales:(Vacunas inactivadas) No es posible discriminar anticuerpos post-infeccin de aquellos inducidos por vacunas vivas o atenuadas

Muestra positiva

Microplaca antigenada BVDV

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El proceso de bsqueda en BVD y en Border - Sangramos a todos los animales para vida de ms de 6 meses. Los animales seropositivos de ms de 6 meses no pueden ser un PI. Los de menos de 6 meses pueden tener anticuerpos calostrales. En todos los animales seronegativos, y empleando el mismo suero, buscamos antgeno circulante, viremia. Un PERSISTENTEMENTE INFECTADO es virmico persistente y seronegativo, mientras que los animales infectados la viremia es transitoria, por lo que es necesario sacar suero de todos los animales virmicos a los 30 das de la primera sangra. Toda la reposicin se puede estudiar a partir de los 12 meses.

BVD -

BVD -

BVD -

BVD BVD ++

30 DAS

ELIMINAR
BVD + PI

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Coxiella
Coxiella, produce abortos e infertilidad y es una zoonosis importante. Esta mucho ms extendida de lo que se pensaba.

Muestras Suero. De poco inters. En abortos/infertilidad placenta, teros de matadero, hisopos cervicales (por duplicado), lavados cervicales. Leche de tanque para buscarla dentro de una explotacin.
Placenta de cabra en un caso de aborto por Coxiella, en la que puede observarse la presencia masiva de Coxiella ocupando las clulas trofoblsticas. En la zona superior de la imagen puede observarse una ligera vasculitis y en la inferior necrosis. Coxiella fue demostrada por Inmunofluorescencia y mediante serologa se detect una infeccin activa. Asimismo, se investig la presencia de otros agentes habitualmente relacionados con abortos en cabras, tales como Salmonella sp., Chlamydophila, Toxoplasma, Campylobacter sp., Border o Leptospira sp., todos ellos con resultados negativos.

Diagnstico Serologa. Como el proceso es muy prevalente conviene hacer seroprfiles o comparar sanos y enfermos. PCR Real time en leche, feto, placenta, hisopo cervical, etc.

IPX. Inmunomarcaje (placenta, hisopos, lavados). Cultivo (placenta, hisopos cervicales). Enva siempre los hisopos por duplicado (en uno hacemos el diagnstico, en el otro hacemos el aislamiento para autovacunas).

Autovacunas Hacemos autovacunas con excelentes resultados tanto en abortos como en infertilidad.

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Clamidia
Chlamydophila abortus es la principal causa de abortos en pequeos rumiantes, pero tambin es importante en bovino. Produce infertilidad, artritis y conjuntivitis. Muestras Suero. Tiene poco inters. En abortos/infertilidad feto, placenta, teros de matadero, hisopos cervicales (por duplicado), lavados cervicales. Leche de tanque para buscarla dentro de una explotacin. Diagnstico
Placenta de oveja en un caso de aborto por Chlamydophila. Se observa una placentitis necrtica con trombosis y hemorragias.

Serologa. Las vacunas vivas de Clamidia no seroconvierten, las inactivadas s. Los animales vacunados y los viejos (la prevalencia es elevada) son seropositivos. PCR Real time en leche, feto, placenta, hisopo cervical, conjuntival, lquido articular, etc. Cultivo (placenta, hisopos cervicales). Enva siempre los hisopos por duplicado (en uno hacemos el diagnstico, en el otro hacemos el aislamiento para autovacunas). Tincin. Muchos laboratorios hacen el diagnstico utilizando una tincin de Stamp y utilizando su experiencia para distinguir Coxiella de Clamidia e incluso Brucela. Autovacunas Hacemos autovacunas Clamidia en Bovino. de
Hisopo 18 gotas

Diagnstico en campo de Clamidia

Revolver

El test rpido de Exopol para Chlamydophila abortus, se emplea en campo (cajas de 20 kits, 3,5 por kit) para la deteccin de antgeno. Puedes mantener el hisopo refrigerado, no congelado, durante un mximo de 72 horas.

Liq. de extraccin

Tubo de extraccin

Negativo: Slo aparece una banda rosa en la zona control mostrando que todo se ha realizado correctamente. No hay lnea en la zona test porqu no e hay antgeno de Chlamydophila.Si no aparece ninguna lnea en la zona control el test no es vlido.

4 gotas Esperar 10 min.

Introduce el hisopo del kit hasta el cervix sin tocar las paredes de la vagina. Puedes tomar la muestra incluso 7 das despus del aborto. Resultado en 20 minutos.

P ositivo: Adems de la banda rosa en la zona control aparecer una banda en la zona test. Incluso una banda dbil en esta zona debe interpretarse como resultado positivo. P ueden aparecer diferencias en la intensidad de las bandas de las zonas control y test, pero no afectan a la interpretacin de los resultados.

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Toxoplasma
El problema del Toxoplasma es la infeccin de hembras gestantes. Si la infeccin se produce fuera de la gestacin no hay problema clnico. Toxoplasma es muy prevalente en ovino y caprino y mucho menos en bovino. Muestras Suero. De mucho inters. Fetos. Toxoplasma se encuentra principalmente en el cerebro y otros rganos del feto (corazn). Los hisopos y la placenta no son la muestra ms adecuada y dan falsos negativos. Diagnstico Serologa. Ttulos altos de aglutinacin indican infeccin reciente. Al principio de la infeccin hay IgM que aglutinan mejor, luego slo hay IgG y los ttulos son ms bajos. La serologa se puede hacer en el feto. PCR en feto. El PCR adems permite buscar Toxoplasma en las heces de los gatos, que son la fuente de la infeccin. IPX. Inmunomarcaje en feto. Autovacunas Podemos hacer autovacunas.

Toxoplasma gondii en cultivo (Lnea celular COE)

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Neospora
Neospora se transmite verticalmente de madres a hijos y horizontalmente a travs de las heces de los perros. Tambin produce abortos en ovino y caprino. Muestras Suero. De mucho inters. Fetos. Neospora y Toxoplasma se localizan en encfalo y menos en corazn, por lo que se necesita el feto. Los hisopos no son validos por eso determinamos anticuerpos en el suero que acompaa el hisopo. Diagnstico

Encfalo de un feto de cabra en un caso de aborto por Neospora. Puede observarse la presencia de dos quistes de protozoo, los cuales, mediante inmunoperoxidasa, se correspondieron con Neospora, siendo negativos frente Toxoplasma.

Serologa. Extremadamente til en el diagnstico y en el control. PCR en fetos. El PCR adems permite buscar Neospora en las heces de los perros. IPX. Inmunomarcaje en feto. Control No guardes descendencia de los animales seropositivos. Elimina los seropositivos. Los perros de la explotacin deben ser seronegativos. Consulta precios para ms de 50 sueros.

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Respiratorio
PCR Adenovirus Arcanobacterium pyogenes Aspergillus spp BVD/ Border Corynebacterium pseudotuberculosis Histophilus somni IBR/ Herpesvirus caprino Mycoplasma sp (bovis, agalactiae, ovipneumoniae, arginini, etc.) Pasteurella (haemolytica, multocida, trehalosi) PI-3 BRSV Visna-Maedi CAE Adenomatosis Parsitos Cultivo + + + + + Tcnica IPX + + + + Muestra Serologa + + M. bovis y agalactiae + + + Pulmn, Lavado bronquial, Hisopo nasal profundo (se contamina con facilidad y puede no ser representativo.

+ -

+ + + -

Pulmn Histopatologa Heces Coprologa

Muestras Enva siempre un trozo de pulmn muy grande (los trozos pequeos se contaminan) con traquea y corazn si hay fibrina o lesiones, dentro de una bolsa y refrigerado. Selecciona un TROZO MUY GRANDE (para evitar contaminaciones) con lesin y sin lesin (los patgenos se aslan mejor en la zona frontera). SELECCIONAR EL ANIMAL ENFERMO es muy importante. Los animales que causan baja no tienen porque ser buenas muestras, especialmente si el proceso ha sido largo y han sido muy tratados. Lo ideal es tomar muestras de un animal con fiebre al inicio del proceso y representativo del mismo. Puedes trabajar con animales vivos con sondas traqueales (son muy fciles de usar). La ventaja es que muestreas animales febriles al comienzo del proceso y no los que causan baja. Hisopos nasales. Limpia la nariz con un guante y papel, introduce el hisopo tan atrs como puedas y giralo sobre la pared. En las clulas descamadas estudiamos la presencia de virus. Sobre los restos de moco hacemos la microbiologa. Recuerda que estas muestras se contaminan fcilmente y que los aislados pueden ser colonizadores de la nariz pero quiz no estar produciendo lesiones en el pulmn.

Paneles diagnsticos
Consulta los paneles de diagnstico. MANDA SIEMPRE MUESTRAS DE VARIOS ANIMALES. AL TRABAJAR CON POOLES NO ES MAS CARO Y AUMENTAMOS LA SENSIBILIDAD. Autovacunas en respiratorio
Ovino Caprino Bovino Pasteurella multocida, Mannheimina haemolytica, Birbesteinia trehalosi, Mycoplasma Corynebacterium pseudotuberculosis, Arcanobacterium pyogenes, etc. Pasteurella multocida, Mannheimina haemolytica, Histophilus somni, Mycoplasma Arcanobacterium pyogenes, etc. sp, sp,

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Lavado traqueobronquial en Ovino y Caprino

1. Cargar una jeringa con suero fisiolgico estril. 2- Sujetar el animal e introducir la sonda traqueobronquial por un orificio nasal, entrando cerca del tabique nasal y en direccin dorsal. 3. Una vez introducida la sonda (30-40 cm), inyectar suero fisiolgico estril (0,5cc por Kg de peso vivo). 4. Inmediatamente despus, aspirar con la misma jeringa moviendo suavemente la sonda hacia adentro y hacia fuera. (Se recogen de 1 a 5 cc de suero mezclado con mucosidades). 5. Extraer la sonda. 6. Trasvasar el lquido a un tubo esteril (tubo de suero, tapn rojo). Cada sonda cuesta 1 y te podemos suministrar todas las que necesites.

NUESTRO COMPROMISO Mientras aprendes no te facturaremos la analtica de las que se contaminen (recuerdanoslo cuando mandes las muestras).

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Pasteurellas y Mycoplasmas respiratorios

Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica y Pasteurella trehalosi ahora son Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica y Bibersteinia trehalosi. En bovino Mycoplasma bovis y en Ovino y Caprino M. ovipneumoniae, M.agalactiae, M. mycoides capri y M. capricolum son causas predisponentes de los problemas respiratorios en animales jvenes. Muestras Suero. Slo existe serologa para M. agalactiae y M. bovis. rganos, hisopos o Lavados traqueobronquiales. Diagnstico IPX para Mycoplasmas (pulmn, lavados traqueobronquiales). Cultivo (pulmn, lavados traqueobronquiales). El aislamiento de Pasteurellas y de los Mycoplasmas de rumiantes es bastante ms sencillo de lo que se piensa. Autovacunas Normalmente las hacemos combinadas Mycoplasma con Pasteurella y/o Mannheimia. No existen vacunas comerciales frente a Mycoplasmas respiratorios. Una autovacuna se elabora en slo 15 das (incluyendo los Mycoplasmas).
Cepa de Pasteurella multocida teida mediante tincin de Gram. Observacin en microscopio 1000X.

Cepa de Mycoplasma mycoides mycoides LC en agar Hayflick. Aislado de un pulmn caprino. Crecimiento en caldo Hayflick y H25P en 5 das (aislamiento primario) y 2 das en resiembras. Crecimiento en agar Hayflick en 3 das procedente del caldo.

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AUTOVACUNAS MLTIPLES

MS ECONMICO MS SENCILLO

Diseamos las autovacunas para cada explotacin y por ello es posible vacunar frente a varios patgenos con una sola aplicacin. Podemos preparar viales de distintas autovacunas que se resuspenden juntas y se aplican a la vez o incluir varios patgenos en la misma autovacuna. Por ejemplo: Staphylococcus y Mycoplasmas (agalaxia) + Pasteurellas y Mycoplasmas respiratorios. Consulta con nuestros expertos.

TODAS LAS AUTOVACUNAS QUE NECESITES EN UNA SOLA APLICACIN MODIFICA SU COMPOSICIN CUANDO LO NECESITES MISMO PLAZO DE ENTREGA

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Digestivo
BVD Border Clostridium perfringens(1) Coccidios(2) Coronavirus Criptosporidios(1) Escherichia coli Parsitos(2) Paratuberculosis PCR + + + Tcnica Cultivo IPX + + + + + + + Serologa +++ +++ I. delg. I.grueso +++ ++ +++ + + + +++ ++ +++ +++ +++ + Vlvula ileocecal G. mesentricos +++ + ++ +++ Muestra Hisopo rectal ++ + ++ ++ +++ +++ +++ +++ Heces +++ + +++ +++ ++ +++ ++ +++ ++

Rotavirus Salmonella + (1) Frotis y tincin. (2) Coprologa

Muestras Heces de varios animales, cogidas directamente del recto, en un bote. Sobre las heces se pueden hacer PCR (BVD/Border) e inmunocromatografia (Cryptosporidium, y Rotavirus y Coronavirus bovinos) y la coprologa. Si las heces estn cogidas del recto y vienen en un bote estril se puede hacer la microbiologa. Hisopos rectales. Limpia el recto con un guante y papel, introduce el hisopo y giralo sobre la pared. En las clulas descamadas estudiamos la presencia de virus por inmunocitoqumica. Sobre los restos de heces hacemos la microbiologa. Intestino. Es importante la fraccin del intestino porque los patgenos actan en diferentes zonas. Si es posible envalo entero. En bovino adulto selecciona la zona lesionada (hemorragias clostridiales) e incluye la vlvula ileocecal en Paratuberculosis. El envo de intestino permite valorar las lesiones por histopatologa. Sueros. No existe serologa para los problemas digestivos (salvo en paratuberculosis).

Paneles diagnsticos
Consulta los paneles de diagnstico. MANDA SIEMPRE MUESTRAS DE VARIOS ANIMALES. AL TRABAJAR CON POOLES NO ES MAS CARO Y AUMENTAMOS LA SENSIBILIDAD. Autovacunas en Digestivo
Ovino Caprino Bovino Salmonella sp, Escherichia coli, Cryptosporidium parvum

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Dendogramas. Comparacin de Escherichia coli

La tipificacin de diferentes aislamientos de Escherichia coli, obtenidos de distintas muestras, nos permite identificar cuntas cepas hay dentro de una explotacin y, nos permite comparar los aislamientos obtenidos en diferentes fechas, en diferentes momentos productivos (p.e. lactacin, destete) o en diferentes localizaciones (p.e. naves o parques). La tipificacin fenotpica nos ayuda a seleccionar las cepas en las que posteriormente podemos determinar los factores de virulencia, valorar la sensibilidad antibitica y elaborar autovacunas incluyendo la o las cepas responsables y, as, comprender la epidemiologa de muchos procesos causados por E. coli. Para la tipificacin comparamos las caractersticas fenotpicas de las cepas y exigimos una homologa superior al 98% (punto de corte vertical en la grfica) para considerar dos cepas iguales. En la grfica inferior vemos 3 cepas diferentes: La 3_6/2008 separada de la 2_6/2008 y 4_7/2007 que son la misma cepa y separada tambin de la tercera cepa a la que pertenecen los 4 aislados de arriba. Ejemplo de tipificacin Se trata de una explotacin con diarreas recurrentes en animales lactantes y asociadas a E. coli. Se quiere comprobar si el E. coli aislado en diferentes parideras es el mismo o no. En el dendograma se ve que uno de los aislamientos de la primera fecha (1_6/2008) es anlogo a 3 aislamientos de la segunda fecha (7/2007) es la cepa 1. Otro aislamiento de la segunda fecha se aisl tambin en la primera fecha (cepa 2). De la cepa 3 slo hay un aislamiento. Los resultados indican que probablemente existen dos cepas implicadas en el problema. Es este caso sera interesante estudiar la presencia de factores de patogenicidad y el antibiograma en ambas cepas. En su caso haramos la autovacuna con estas cepas.

Cepa 1

Cepa 2

Cepa 3

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Diagnstico en campo de Cryptosporidium

Exopol Cryptosporidium IC detecta antgenos de Cryptosporidium spp. en heces Exopol Rotavirus IC detecta antgenos de rotavirus en heces de bovino. Las muestras se deben conservar en fro (slo 1 2 das) hasta el momento de utilizarlas. Previamente el dispositivo y las muestras de heces se deben acondicionar a la temperatura ambiente (15-30C). No abrir el envase hasta el momento de la prueba. Preparacin de la muestra (ver dibujo): 1. Sacar el palito que viene en el vial (1) para recoger la muestra. 2. Con ayuda del palito se toma una muestra de las heces recogidas. Para ello se pasa el palito por la muestra recogiendo una pequea cantidad de heces, si la muestra fuera lquida se tomarn 100 l de la misma con una pipeta. Se introduce en el tampn cerrando el tubo. (3) Agitar para facilitar la dispersin de la muestra. 3. Agitar el tubo de dilucin de la muestra para asegurar una buena dispersin. Cortar la punta del tapn (4). 4. Sacar el dispositivo de reaccin Exopol Cryptosporidium IC/ Exopol Rotavirus IC de su envase para utilizarlo inmediatamente. 5. Para cada muestra o control se debe usar un tubo de dilucin de la muestra y un dispositivo diferente. Tomar 4 gotas o 100 L del lquido y depositarlas en la ventana circular marcada con una flecha o una S en el dispositivo, evitando aadir partculas slidas con el lquido (5). Si se da el caso de que el test no funciona debido a la presencia de partculas slidas en la ventana circular, retirarlas y aadir una gota de tampn hasta que se vea avanzar al lquido (zona de reaccin y de control). 6. Leer el resultado a los 10 minutos (las lneas coloreadas aparecen).

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Autovacuna frente a Cryptosporidium

Hacemos autovacunas mixtas de Cryptosporidium con Escherichia coli. Estas autovacunas las hemos desarrollado con el Proyecto CDTI (Centro para el Desarrollo Tecnolgico Industrial) IDI-20090420. Criptosporidiasis. Diagnstico y Elaboracin de Autovacunas. Presupuesto del proyecto: 758.453,00 Muestras Heces de animales con diarrea. Hisopos siempre por duplicado (en uno hacemos el diagnstico, en el otro el cultivo).

Ooquistes de Cryptosporidium parvum.

Multiplicamos los Cryptosporidium en clulas donde conseguimos que expresen todas sus fases, de modo que en las autovacunas tengamos antgenos de todas ellas y no solo de los ooquistes.

Cultivo in vitro de Cryptosporidium parvum en clulas cordn umbilical ovino fetal (COE). Tincin de Kinyoun 1000 x. Localizacin intracitoplasmtica de diferentes estadios del parsito > 5 x campo

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Paratuberculosis
Mycobacterium paratuberculosis crnicos en las explotaciones. Animales individuales Cuando existe la sospecha en una animal individual enva suero e hisopos rectales o heces En el suero se buscan anticuerpos y en los hisopos el antgeno o el ADN de la Mycobacteria (PCR).
Mycobacterium paratuberculosis. Frotis a partir de una vlvula ileocecal de bovino Recuerda que los animales infectados pueden tardar adulto. Se realiz una tincin de Ziehl aos en seroconvertir, por eso ante una sospecha clnica Neelsen. Observacin en microscopa de recomendamos hacer la PCR y la serologa. Si alguna campo claro 1000X. Se observan los bacilos de las pruebas da positivo conviene eliminar el animal. teidos de color rojo intenso acido alcohol En Exopol comenzamos con la serologa (ms resistentes sobre fondo azul. econmico) si es positiva no seguimos, si es negativa confirmamos con el PCR buscando ADN de la Mycobacteria.

crea

problemas

Rebaos Sangra a todo el efectivo cada 6-9 meses hasta que todo el rebao sea seronegativo. Consulta precios para ms de 50 sueros. Propuestas de diagnstico y precios aproximados
Heces o hisopo u rganos Suero PCR Real Time (podemos trabajar pooles de heces) ELISA 30 4,7

Cuando mandes muestra de un animal con sospecha clnica enva el suero y las heces (o hisopo). - Primero hacemos el ELISA en suero si es positivo el animal esta infectado y no hacemos el PCR y slo cuesta 4,7. - Si es seronegativo puede ser que no haya seroconvertido y entonces hacemos la PCR.

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Efectividad de los antiparasitarios

En este protocolo (caso real) se valor la efectividad de tres tratamientos en 3 grupos de 10 ovejas a las que se tom muestras directamente del recto antes del tratamiento y 11 das despus. Aunque el nmero de animales es poco relevante para extraer conclusiones cientficas s es vlido para tomar decisiones dentro de una explotacin. En la tabla se ve que el tratamiento 1 fue el ms eficiente. Una propuesta que permite reducir el costo de la analtica podra ser hacer 3 pooles de 3 animales cada uno y compararlos antes y despus del tratamiento. De este modo el nmero total de anlisis sera de 6 frente a 20 en el caso estudiado.

Ooquiste del gnero esporulado. Heces de

Eimeria ternero.

Animales positivos antes y despus de los 3 tratamientos diferentes. Antes del tratamiento Despus del tratamiento Grupo 1 2 3 1 2 3 Protozoarios Eimeria 4 2 4 2 Giardia 1 Nematodos digestivos Trichostrongilidos 9 6 9 1 2 3 Nematodirus 3 3 5 1 1 Trichuris Strongyloides 3 4 6 1 Nematodos pulmonares 3 1 1 Cestodos Moniezia (expanda/benedeni) 1 Trematodos Fasciola hepatica Dicrocoelium dendriticum (Paramphistomum/ Cotilophorum) -

Hgado de oveja adulta con cisticercosis visceral ovina caracterizada por la presencia de trayectos parasitarios provocados por la migracin de la fase larvaria de la Taenia hydatigena.

Verme adulto del gnero Dictyocaulus en traquea de ovino

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Bajas sbitas
Bacillus anthracis BVD Clostridium novyi, septicum, sordellii, chauvoei Clostridium perfringens Hemoparsitos(1) Leptospira Pasteurella (haemolytica, multocida, trehalosi) Salmonella (1) Bajas continuas, no sbitas. PCR + + + + Tcnica Cultivo IPX + + + + + + + + Muestras Tincin +++ ++ + + + -

rganos
Hgado, Bazo, Pulmn Pulmn, Intestino Pulmn, Hgado, Bazo, Msculo Intestino delgado Sangre de vena marginal con edta y con heparina Rin Pulmn, Hgado, Bazo Pulmn, Hgado, Bazo, Intestino

Muestras En las bajas sbitas los animales no tienen tiempo a producir anticuerpos. Enva los rganos que veas con lesiones, normalmente hemorragias, dentro de una bolsa y refrigerado. SI SOSPECHAS CARBUNCO BACTERIDIANO (Bacillus anthracis) AVISA SIEMPRE AL LABORATORIO. Cuando sospeches Clostridium perfringens enva siempre el intestino. Para hemoparsitos siempre sangre marginal con Edta y Heparina. Pueden verse en Bazo o Hgado. Sueros. No existe serologa para las bajas sbitas.

Riones ovinos de color muy oscuro con sospecha de intoxicacin por cobre. Se diagnostic por IPX Leptospira interrogans. El diagnstico diferencial incluira hemoparsitos, intoxicacin por cobre, enterotoxemia por Clostridium perfringens y carbunco sintomtico y bacteridiano.

Propuestas de diagnstico y precios aproximados

rganos rganos Microbiologa*, Toxinotipo Clostridium perfringens Microbiologa*, Toxinotipo Clostridium perfringens, Clostridium novyi, septicum, sordellii, chauvoei, BVD, Leptospiras 40 120

Autovacunas
Ovino y Caprino Bovino Pasteurella multocida, Mannheimina haemolytica, Birbesteinia trehalosi, Leptospiras, Hemoparsitos, Pasteurella multocida, Mannheimina haemolytica, Leptospiras, Hemoparsitos,

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Clostridiasis
Los clostridios viven en el suelo descomponiendo la materia orgnica y pueblan el aparato digestivo de los vertebrados. Muestras Cuando se sospecha una clostridiasis en la baja sbita es importante tomar las muestras de animales recin muertos, y enviarlas refrigeradas ya que la autolisis hace que todos los rganos sean invadidos post-mortem por clostridios que habitualmente habitan en el intestino. Enva los rganos que veas con lesiones, normalmente congestin o hemorragias, dentro de una bolsa y refrigerado. Cuando sospeches Clostridium perfringens enva siempre el intestino delgado. C. perfringens se multiplica all, aunque sus toxinas produzcan lesiones en otros rganos (eg. rin pulposo). Sueros. No existe serologa para las clostridiasis. Diagnstico Cultivo. En el intestino siempre hay Clostridios, por eso la cuantificacin es importante para valorarlos. Toxinotipado para C. perfringens. IPX. Inmunomarcaje de Clostridium novyi, septicum, sordelli y chauvoei. No existe serologa frente a Clostridium. Toxinotipado Clostridium perfringens Los toxinotipos se basan en la produccin de las toxinas mayores: alfa, beta, epsilon y iota.
Clasificacin de toxinotipos de Cl. perfringens Toxinas Toxinotipos alfa beta epsilon iota

Abomasitis hemorrgica en un ternero de 2 das con muerte sbita. Se observan hemorragias masivas con intenso edema de los pliegues abomasales. Microscpicamente, se observaron intensas hemorragias y edema, especialmente en la submucosa, necrosis epitelial, focos de inflamacin neutroflica en la submucosa y presencia de bacterias bacilares y cocoides. En cultivo microbiolgico se aisl Clostridium perfringens y E. coli, resultando negativo a BVD mediante inmunocitoqumica.

Tipo A Tipo B Tipo C Tipo D Tipo E

++ + + + + ++ ++ ++ ++ +

Autovacunas No se pueden hacer autovacunas frente a Clostridium porque implican muchos antgenos diferentes. Adems, las vacunas comerciales funcionan muy bien.

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Mamitis-Agalaxia
PCR Cultivo IPX Serologa Arcanobacterium pyogenes + Corynebacterium pseudotuberculosis + Levaduras + Mycoplasma sp (bovis, agalactiae, M. agalactiae, + + M. agalactiae, M. capricolum, putrefaciens, mycoides, etc.) M. mycoides bovis Pasteurella, Mannheimia + Prototheca zopfii + Pseudomonas + Staphylococcus aureus + Staphylococcus coagulasa negativo + Streptococcus agalactiae + Streptococcus equi + Streptococcus dysgalactiae, uberis, etc. + Visna-Maedi, CAE + + En leche tambin se puede hacer PCR de Coxiella, Leptospiras, Clamidias, BVD, Salmonella, Listeria, Visna, etc. En leche se puede buscar anticuerpos frente a BVD, IBR, etc.

Muestras Leche de animales positivos al test de california o con sntomas clnicos. La leche se puede congelar. Si se enva antes de una semana es preferible mantenerla refrigerada. Normalmente se acompaan las muestras con una de tanque. En gangrenas o bajas se puede enviar una muestra de mama (trozo grande). Sueros. Slo existe serologa frente a Mycoplasma agalactiae y M. bovis. Propuestas de diagnstico y precios aproximados
Leche (10 muestras) Leche (10 muestras) Leche tanque Microbiologa, PCR M. agalactiae, M. mycoides (cabras) Microbiologa Cultivo especfico: S. aureus, S. agalactiae, E. coli, Klebsiella, Pseudomonas sp. y Prothoteca 90 60 50

Autovacunas en Mamitis
Ovino y Caprino Bovino Mycoplasma sp, Staphylococcus aureus y coagulasa negativo, Streptococcus sp., etc. Mycoplasma bovis, Staphylococcus aureus, Streptococcus sp., etc.

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Articular
Septicemias bacterianas (Erisipella, A. pyogenes Staphylococcus, Streptococcus etc.) Chlamydia Mycoplasma sp (bovis, agalactiae, capricolum, putrefaciens, mycoides, etc.) Visna CAE (Ovino y Caprino). PCR + M. agalactiae, M. mycoides +++ Cultivo + + Serologa + + + Lquido articular

Muestras Lquido articular. Si no se puede extraer introduce solucin salina estril y sacala. Si la muestra coagula es necesario utilizar heparina como anticoagulante (introducelo en un tubo de sangre de tapn verde). Sueros. Slo existe serologa frente a Mycoplasma agalactiae y bovis.

Paneles diagnsticos
Consulta los paneles de diagnstico. ENVA SIEMPRE MUESTRAS DE VARIOS ANIMALES. AL TRABAJAR CON POOLES NO ES MAS CARO Y AUMENTAMOS LA SENSIBILIDAD. Autovacunas en Articular
Ovino Caprino Bovino Mycoplasma sp, Staphylococcus aureus y coagulasa negativo, Streptococcus sp., etc.

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AUTOVACUNAS DE MYCOPLASMAS

PROTECCIN SIN SEROCONVERSIN

Nuestras autovacunas emplean los exopolisacridos, no los cuerpos de los Mycoplasmas. Los animales estn protegidos aunque no se detectan anticuerpos. Es similar a las vacunas vivas de Clamidia que protegen pero no seroconvierten, no se detectan en los ELISA
CON AUTOVACUNA: SERONEGATIVO Y PROTEGIDO CON VACUNA COMERCIAL: SEROPOSITIVO INFECTADO: SEROPOSITIVO

CON NUESTRAS AUTOVACUNAS SE PUEDEN VENDER ANIMALES SERONEGATIVOS PROTEGIDOS E INICIAR PROGRAMAS DE ERRADICACION Y CONTROL DE LA AGALAXIA

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CONTROL
Utiliza nuestras autovacunas que no seroconvierten. Si utilizas vacunas comerciales, deja cada ao un grupo de corderas sin vacunar. Identificalas y no las vacunes en toda su vida. Saca suero de los animales centinelas cada 6-9 meses para comprobar que los Mycoplasmas no se han movido. El PCR Real time de la leche de tanque permite cuantificar la cantidad de Mycoplasma agalactiae y/o M. mycoides por mililitro de leche. Haz cultivos de Mycoplasmas de los animales sospechosos.

ERRADICACIN
Sangra a todos los animales y elimina los seropositivos. Si optas por la erradicacin no vacunes o utiliza nuestras autovacunas frente a Mycoplasmas. Aunque no tengas casos clnicos, ni animales seropositivos por alguna de las tcnicas, nunca dejes de utilizar las autovacunas porque las medidas de bioseguridad pueden no ser suficientes.

COMPRA/VENTA DE ANIMALES
Compra animales seronegativos. Nunca puedes saber si un animal es seropositivo por vacunacin o por infeccin. Si vendes animales puedes ofertar el control si has empleado nuestras autovacunas o no has vacunado.

PCR CUANTITATIVO PARA MICOPLASMA AGALACTIAE y MYCOIDES

Dentro del programa de control de Agalaxia podemos cuantificar cuanto M. agalactiae y M. mycoides existe en la explotacin.

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Ocular
En bovino Moraxella bovis y en Ovino y Caprino Moraxella ovis son los patgenos ms importantes en problemas oculares. Muestras Suero. Slo existe serologa para Mycoplasma agalactiae y M. bovis. Hisopos conjuntivales. Diagnstico IPX para Mycoplasmas y Clamidias. PCR para Mycoplasma agalactiae y Clamidias. Cultivo (pulmn, lavados traqueobronquiales).
Imagen microscpica de una cepa de Moraxella bovis con morfologa tpica de coco Gram negativo. Observacin en microscopio 1000X.

OVINO CAPRINO BOVINO Problemas oculares PCR Cultivo Chlamydia +++ Moraxella bovis, Moraxella ovis +++ Mycoplasma bovis, agalactiae, conjuntivae, etc. M. agalactiae +++ IBR +++ -

IPX +++ +++ +++

Hisopo +++ +++ +++ +++

Paneles diagnsticos
Consulta los paneles de diagnstico. ENVA SIEMPRE MUESTRAS DE VARIOS ANIMALES. AL TRABAJAR CON POOLES NO ES MAS CARO Y AUMENTAMOS LA SENSIBILIDAD. Bovino. Propuestas de diagnstico y precios aproximados Hisopo Microbiologia, Mycoplasma bovis (IPX), Clamidia (PCR) 45

Autovacunas No existen vacunas comerciales frente a Moraxella. Ovino y Caprino Moraxella ovis Bovino Moraxella bovis

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Problemas podales
Frecuencia Fusobacterium necrophorum Dichelobacter nodosus Espiroquetas +++ +++ + Diagnstico Cultivo + + + Muestra rganos Extremidades Extremidades Extremidades

El aislamiento de Fusobacterium, Dichelobacter y las Espiroquetas es especialmente difcil. Muestras Antes de tomar las muestras ponte en contacto con el laboratorio. Sueros. No existe serologa. Autovacunas Pueden hacerse si se consigue aislar la bacteria/s responsable.

Frotis de lesin de pododermatitis bovina. Espiroqueta. Tincin de plata 100x.

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Problemas Nerviosos
Listeria Aujeszky Toxoplasma BVD, Border EEB1, Scrapie(1) Bacterias (Streptococcus, Escherichia coli, Pasteurella, etc.) Cenurosis (2) Oestrus (2) Sarcocistosis (2) Visna-Maedi, CAE (1) Slo laboratorios oficiales. (2) Diagnstico clnico PCR + + + Cultivo + + IPX + + + + + Serologa + + +

Muestras Enva siempre la cabeza entera del animal. El laboratorio realizar la extraccin del encfalo. En bovino no puedes enviar estas muestras. Sueros. No se puede hacer serologa. En Aujeszky los animales mueren muy rpidamente y no seroconvierten. Propuestas de diagnstico y precios aproximados
Cabeza Microbiologa, Listeria, Cenuros 40

Autovacunas en Problemas Nerviosos

Ovino Caprino y Bovino Listeria.

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Cutneo y Linfoadenitis
Arcanobacterium pyogenes Besnoitia Corynebacterium pseudotuberculosis Dermatofitos (Tia) Ectima(1) Hypoderma Boris(1) Sarna Staphylococcus aureus anaerobius (1) Diagnstico clnico. PCR Diagnstico Cultivo Serologia + + + + + + Absceso + + + + Muestra Raspado + + Hisopo + + +

Muestras Hisopos abscesos. Abre el absceso, vacialo y raspa la pared con el hisopo. Las bacterias se concentran en la zona frontera. Para Besnoitia envianos una biopsia cutnea. Cuando sospeches sarna o tia envianos un raspado profundo (hasta que sangre un poco). Sueros. No se puede hacer serologa. Autovacunas
Ovino y Caprino Bovino Staphylococcus aureus anaerobius, Corynebacterium pseudotuberculosis, Arcanobacterium pyogenes, etc. Besnoitia

Quistes de Besnoitia en la esclertica y crnea del ojo de un semental bovino. Besnoitia cultivo. Tincin de PASS 63x. Cepa en cultivo para autovacuna. Quistes de Besnoitia observados mediante microscopa de campo claro 100x en un raspado de piel de un semental bovino.

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Hemoparsitos
Anaplasma marginale, Babesia bovis y bigeminas y Theileria parva y annulata son los principales hemoparsitos de los bovinos. Estamos diagnosticando Hemoparsitos con casos clnicos (anema, ictericia, delgadez, mal pelo, etc.), y en casos subclnicos con ligeras perdidas de produccin o de fertilidad. Muestras Para su aislamiento necesitamos sangre con heparina (verde) y para el diagnstico sangre con edta (morado). Incluye orina para el diferencial con Leptospira. Enviarlo siempre refrigerado. Sueros. No se puede hacer serologa. Diagnstico
Multiplicacin de Theileria spp obtenidas de un bovino naturalmente infectado en la lnea de cultivo celular COE (cordn umbilical ovino). Tincin fluorescente del DNA con Hoeschst 400x

Cultivo. Siempre sangre con Heparina, el Edta inactiva los hemoparsitos. PCR (slo en bovino). Para Babesia bigemina, Babesia bovis, Anaplasma marginale, Theileria annulata y Theileria parva Propuestas de diagnstico y precios aproximados
Sangre Ovino y Caprino Sangre bovino Tincin de Hemoparsitos PCR Real Time Babesia bigemina, Babesia bovis, Anaplasma marginale, Theileria annulata y Theileria parva (podemos trabajar pooles de sangres) 10 90

Autovacunas en Hemoparsitos
Ovino Caprino Bovino Anaplasma, Babesia y Theileria.

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SI LA AUTOVACUNA NO TE FUNCIONA TE DEVOLVEMOS EL DINERO*

T DECIDES // SIN PREGUNTAS

No siempre podemos estar seguros de que nuestras autovacunas van a ayudarte con tu problema, pero haremos todo lo posible, y nuestro compromiso es devolverte el dinero si no lo conseguimos. Necesitas algo ms para confiar en nosotros? * Se aplica a cualquier autovacuna. Tienes 9 meses para solicitarlo desde la fecha de envo. No se aplica al diagnstico.

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Fabricacin de Autovacunas
Paso previo: Envo de Muestras Antes de hacer una autovacuna hay que hacer el aislamiento del patgeno. Despus, podemos emplear la/s bacteria/s durante aos. Conviene repetir los anlisis cuando veamos que la autovacuna no funciona tan bien como se esperaba. Esta prohibido hacer autovacunas de virus. Nota: Los tiempos y los protocolos indicados abajo son un ejemplo porque los tiempos y el modo de multiplicacin de las diferentes patgenos es diferente.
Vial de congelacin. Las cepas se guardan congeladas e identificadas en viales de congelacin durante al menos 5 aos.

Da 1 Descongelamos la bacteria congelada y la sembramos en medios de crecimiento slidos. Muchas veces las bacterias acaban de ser aisladas porque las muestras se han enviado con el propsito de elaborar una autovacuna y evitamos el tiempo empleado en descongelar las cepas. La gran mayora de las bacterias congeladas crecen en 24-48 horas. El mismo da preparamos y esterilizamos un pequeo volumen de crecimiento, el cultivo iniciador, que servir para sembrar el cultivo final y un volumen de medio de crecimiento suficiente para fabricar las dosis solicitadas. Da 2 Se inocula una suspensin del cultivo original en slido al cultivo iniciador. Para ello una masa de bacterias del cultivo inicial en agar sangre se siembra en el medio lquido. El medio se incubar en las condiciones y medios especficos para cada patgeno. Algunas bacterias crecen slo en anaerobiosis (ausencia de oxgeno) y tenemos que eliminar el oxgeno del ambiente donde multiplicamos la bacteria y del medio lquido en el que crecer.
Inoculacin del caldo de cultivo con la bacteria recogida de la placa de agar sangre.

Para iniciar la autovacuna se utiliza el crecimiento de una bacteria en agar (placa redonda) y un caldo de cultivo especialmente diseado para su crecimiento

Las botellas se inoculadas se incuban normalmente a 37-42C durante 24-48 horas.

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Da 4 El cultivo iniciador se utiliza para iniciar el cultivo final en el volumen total necesario. En las primeras horas despus de la siembra las bacterias se multiplican de un modo exponencial cada pocas horas, justo hasta que consumen la mayora de los nutrientes del medio. En la grfica se ve como el nmero de bacterias aumenta muy rpidamente (rosa). Cuando la mayora de los nutrientes se han agotado la velocidad de multiplicacin es mucho menor, pero es ahora cuando en muchas especies bacterianas aumenta la produccin de los exopolisacridos que empleamos en nuestras autovacunas. Es importante determinar el momento en el que se inactiva el cultivo porque tenemos que maximizar el crecimiento de las bacterias y al mismo tiempo impedir que las bacterias que comienzan a degradarse contaminen el medio con ADN y protenas intracelulares.

L as botellas se inoculadas se incuban normalmente a 37-42C durante 24-48 horas.

Botellas de crecimiento. La de la izquierda est sin inocular. En las otras dos (de diferentes medios) hay turbidez y crecimiento bacteriano.

1400000000 1200000000 1000000000 800000000 600000000 400000000 200000000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Serie1 Serie2 Serie3

Grfica: Crecimiento de bacterias (rosa) y produccin de exopolisacridos (amarillo).

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Da 6 Inactivamos las bacterias aadiendo formol al medio de crecimiento y dejamos que el formol acte durante 18-24 horas antes de comenzar con la purificacin de los antgenos. Antes de inactivar el cultivo nos aseguramos de la pureza del cultivo. Despus de la inactivacin hacemos el recuento total de las bacterias. Esto nos permite ajustar las concentraciones bacterianas de modo que en las autovacunas utilizamos cantidades anlogas y reproducibles de antgeno. Este mismo da comienzan los protocolos de esterilidad. En nuestros protocolos separamos parcialmente los exopolisacridos de los cuerpos bacterianos. Por un lado concentramos los cuerpos bacterianos mediante filtracin tangencial y lavamos las clulas descartando protenas, restos de ADN, restos metablicos, etc. Por otro lado procesamos los exopolisacridos bacterianos siguiendo los protocolos ya descritos ( Vet Microbiol 1994 Apr;39, 3-4:195-204). Liposomas Los liposomas de la autovacuna se fabrican independientemente. Los liposomas son pequeas vesculas de lpidos que despus de la liofilizacin encerraran en su interior el exopolisacrido purificado de las bacterias. Antes de la liofilizacin mezclamos los liposomas con una suspensin de antgeno, que liofilizamos. En la liofilizacin congelamos la muestra y extraemos el agua, de modo que los liposomas se rompen. Al resuspender la autovacuna, los liposomas se cierran de nuevo incorporando el antgeno en su interior.
Recuento de bacterias en citmetro.

Observacin en microscopa de campo claro del cultivo de Staphylococcus. Permite verificar la ausencia de otras bacterias y la pureza.

Liofilizador trabajando. En su interior se observan viales con liposomas liofilizndose

El proceso de elaboracin de los liposomas se ejemplifica en la ilustracin. Las vesculas de lpido se rompen en la liofilizacin y al reconstituirlas con agua atrapan al antgeno (exopolisacrido).

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Da 10 Los viales se retiran del liofilizador y se confirma que estn bien. Se hacen los ensayos para confirmar la ausencia de contaminacin.

El producto final se ensaya en diferentes medios para confirmar la total ausencia de contaminacin.

La autovacuna se enva liofilizada, lo que facilita su conservacin.

Diferencias entre Autovacunas y Vacunas

Autovacuna Hay que fabricarla en cada ocasin. Utiliza las bacterias aisladas de la explotacin. No tienen perodo de retirada en leche o carne. La autovacuna se modifica (evoluciona) con los problemas de la explotacin, no es esttica. Puede elaborarse para ms de una enfermedad: Mamitis + Agalaxia. Para hacer la autovacuna necesitas hacer previamente un diagnstico. Vacuna estndar Est disponible en cualquier momento. Normalmente es ms barata. Algunas son muy efectivas y la autovacuna no las supera. Por ejemplo en Clostridiasis. No tienen periodo de retirada en leche o carne.

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Esquema del proceso de elaboracin de una autovacuna

Preparacin estril de liposomas Descongelacin de cepas

Recepcin del pedido (telefono, web)

Receta Veterinaria Preparacin del medio de crecimiento en volmenes adecuados Da 1 Da 2

Multiplicacin bacteriana, inicial

Da 3 Da 4

Multiplicacin bacteriana final

Da 5 Da 6

Control de calidad

Inactivacin

Da 7

Recuento de bacterias Citometra de Flujo. Estimacin de la carga antignica. Ajuste al nmero de dosis. Mezcla de los liposomas con los exopolisacridos capsulares Separacin de los cuerpos bacterianos

Da 8

Separacin de los exopolisacridos capsulares

Liofilizacin de la mezcla

Envasado bacterina

Da 9

Producto acabado

Da 10

Fin Control Calidad

Da 11 . Da 15