Clase III Enzimas Son catalizadores biolgicos de naturaleza proteica, ver figura 1, 2 y 3.

Cmo se realizan todas las actividades celulares? Mediante las enzimas, sustancias presentes en las clulas en cantidades muy bajas y capaces de efectuar cambios propios de los procesos celulares. Responsables de todas las reacciones qumicas de la clula.

reacciones catalizadas por enzimas tienen lugar con velocidades de 1.000 a 1000.000 de veces ms rpidas que si no esta catalizada la reaccin por la enzima. Se calcula que la ruptura de las protenas en el proceso digestivo tardara ms de 50 aos, en lugar de pocas horas sin la accin enzimtica. Pueden ser: -Enzimas extracelulares o exoenzimas (funcionan fuera de la clula) -Enzimas intracelulares o endoenzimas (funcionan dentro de la clula) Propiedades Fsicas y Qumicas de los enzimas Son protenas (secuencias de aminocidos) que pueden tener unidos otros grupos qumicos, se desnaturalizan con calor al igual que las protenas, se precipitan en presencia de etanol o de aumento en la concentracin de sales inorgnicas como sulfato amnico, no se difunden a travs de membranas semipermeables o selectivas, ver figura 2 y 3.

Figura 1. Transcripcin, transduccin y sntesis de protenas (1).

El comercio de enzimas para uso industrial y domstico asciende a centeneres de millones de dolares anualmente. Los enzimas industriales se utilizan en la produccin de productos qumicos y farmacuticos. Recientemente su aplicacin de enzimas inmovilizadas esta creciendo. Propiedades generales de los enzimas Tienen la especial capacidad de acelerar las reacciones qumicas, sin alterarse como consecuencia de la reaccin, son especficos y solo actan en un determinado tipo de reaccin. Como todos los catalizadores funcionan en una concentracin molar mucho menor que la del reactivo sobre el cual funciona. Un mol de enzima facilita la conversin de muchos moles de reactivo en producto. Una molcula enzimtica generalmente cataliza la conversin de 10 a 1.000 molculas de sustrato/s. Con frecuencia estas LEOQ
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Figura 2. Naturaleza de los enzimas (1).

a) c) b) Figura 3. a) Estructura secundaria b) Estructura terciaria c)Estructura cuaternaria o funcional.

Son molculas muy grandes, su peso molecular oscila entre 10.000 y 1000.000. Muchas estn integradas a otra molcula orgnica de menor tamao llamada coenzima, algunas coenzimas estn integradas por una vitamina ejemplo las del grupo B, la parte proteca se denomina apoenzima , unidas forman una haloenzima. A veces el grupo no proteico de un enzima es un metal, ejemplo el hierro de la catalasa, requiere de su adicin para que se active. Estos iones constituyen coenzimas inorgnicas o cofactores. A veces se requiere de un cofactor y una coenzima para que actu un enzima. Se han extrado de la clula un buen nmero, son de eficiencia extrema al acelerar la transformacin del sustrato en producto final, ver figuras 2,3,4 y 5. Figura 5. Catlisis (1)

Figura 3. Sustrato entrando en la enzima (1).

Figura 6. Formacin del producto (1).

1.000 molculas de sustrato / s pueden transformarse por la accin de una molcula de enzima. Actividad molecular: nmero de molculas de sustrato transformadas por molcula de enzima por minuto. Unidad de enzima: Cantidad de enzima g, mg, g, capaz de catalizar la transformacin de una cantidad de sustrato por minuto, a unas condiciones dadas de temperatura, pH, fuerza inica. Katal: cantidad de enzima capaz de convertir una mol de sustrato en un segundo a unas condiciones dadas. No se gastan ni se alteran como consecuencia de la reaccin, ver figura 6. Son inestables su actividad puede reducirse o desaparecer, dependiendo de
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Figura 4. Complejo enzima-sustrato (1).

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diferentes condiciones fsico-qumicas, algunas se inactivan por pequeos cambios como la exposicin a temperatura ambiente por corto tiempo. Caractersticas 1. Su alta eficiencia como catalizadores 2. Su alto grado de especificidad al sustrato, un enzima determinado solo puede reaccionar con determinado sustrato o si acaso con un grupo de sustancias muy relacionadas qumicamente. Como los enzimas aceleran las reacciones La funcin principal de una enzima es rebajar el nivel de energa de activacin necesario para que tenga lugar una reaccin qumica. La energa de activacin es la cantidad de energa necesaria para inducir en una sustancia un estado de reactividad. El enzima se combina con la sustancia (S) inducindole una situacin transitoria que requiere una menor energa de activacin, para que tenga lugar la reaccin, ver figura 7. Ley de rapidez para una reaccin simple catalizada por un enzima. Considrese una reaccin con un reactivo, el sustrato S, y un producto, P. S P (1)

Figura 7. Como puede verse una reaccin catalizada por un enzima tiene una energa de activacin ms baja y por tanto se necesita menos energa para que tenga lugar (2).

Si es catalizada por un enzima los sustratos y productos as como su concentracin permanecen iguales. Lo que significa que la enzima acelera la reaccin en dos sentidos E S P (2) Es por su unin con el sustrato que la enzima efecta la conversin a producto, y esto puede expresarse como dos equilibrios

Los estudios sistemticos del efecto de la concentracin inicial del sustrato sobre la actividad enzimtica comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catlisis enzimtica. En 1913, Leonor Michaelis (foto de la izquierda) y Maud Menten (foto de la derecha) desarrollaron esta teora y propusieron una ecuacin de velocidad que explica el comportamiento cintico de los enzimas. Para explicar la relacin observada entre la velocidad inicial (v0) y la concentracin inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacin del producto, liberando el enzima libre:
K1 K3

E + S ES E + P
K2 K4

(3)

Las mediciones cinticas ms comunes de las reacciones catalizadas por enzimas son las de incremento uniforme en la concentracin del producto que ocurre en una solucin diluida de la enzima, a la cual se ha aadido un exceso de sustrato. Inmediatamente despus de que E y S se mezclan , el producto comienza a formarse a una LEOQ
3

rapidez constante. Este incremento constante en la concentracin del producto, d[P]/dt, se designa como v0, la velocidad inicial en estado estacionario . Se considera que v0 es una velocidad inicial porque solo se consume una proporcin muy pequea del sustrato mientras se estn haciendo las mediciones, la [S] prcticamente es constante y la v0 que se mide corresponde al valor inicial de la [S]. La concentracin de producto [P], ser muy pequea en las condiciones antes descritas. De esta manera puede pasarse por alto la reaccin inversa de E con P para formar ES, luego la ecuacin (3) se convierte en:
E + S ES E + P
K2 K1 K3

Si se evala ES en trminos de E0, [S] y las constantes cinticas, la ecuacin (6) dar el resultado esperado por Briggs y Haldane.

(4)

En ambas ecuaciones (3) y (4) esta implcita la recirculacin de E. por definicin un catalizador no es consumido por la reaccin que cataliza, explcitamente se representa en la ecuacin (5)

Figura 8 Modelo cintico de estado estacionario (3) Un valor constante para [ES] requiere que las velocidades de formacin y degradacin de ES sean iguales. La velocidad de formacin de ES esta dada por k1[E][S]. Puesto que ES puede perderse en dos reacciones, desdoblndose en E+S E+P, la velocidad de degradacin de ES est dada por la expresin k [ES ]+ k [ES ]. Al igualar las
2 3

E+S

K1 K 2

ES

K3

E+P

(5)

habr una fase de induccin con una duracin de una fraccin de segundo antes de que se alcance la v0 en estado estacionario. Por lo general se ignora en la cintica de estado estacionario. La concentracin total de E se define como E0, antes de que se aada el S E0=[E], una vez se ha aadido E0=[E] + [ES]. [ES] durante la breve fase de induccin aumenta hasta alcanzar su valor de estado estacionario y permanece constante, durante esta etapa de la reaccin, cuando v0 se mide y es constante. Briggs y Haldane utilizaron la condicin de estado estacionario de [ES] constante y la condicin de concentracin inicial de [S] constante para formular ecuaciones que relacionan con las constantes cinticas y las v0 concentraciones de enzima y de sustrato. Debido a que el P solo puede formarse por desdoblamiento de ES, gobernado por la constante de velocidad K3, puede concluirse que la velocidad en las condiciones de velocidad inicial es:

velocidades de formacin y degradacin se tiene que:

k [E ][S ] = (k + k )[ES ]
1 2 3

Despejando las variables de las constantes y combinando estas ltimas se tiene que:

[E ][S ] = k 2 + k 3 = km [ES ] k1

(7)

Donde km se designa como la constante de Michaelis, en honor a quin desarrollo las primeras formas de la ecuacin simple de cintica enzimtica. Este modelo cintico adopta la hiptesis del estado estacionario, segn la cual la concentracin del complejo enzima-sustrato es pequea y constante a lo largo de la reaccin (Figura 8)

V
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= k 3 [ES ]

(6)

mxima se alcanzar cuando esencialmente toda la enzima este es forma es decir, cuando ES E0. Cuando la [S]=Km en la ecuacin (10) el denominador de la ecuacin ser 2[S] y el numerador [S]Vmx. Esto significa que la V0 ser igual a 1/2Vmx. cuando [S]=km. En esta situacin [ES]=0.5E0, como lo ndica la ecuacin (8). En la figura 5 se muestra la hiprbola rectangular caracterstica que se obtiene al graficar la ecuacin (10). Figura 9 Maud Menten, Leonor Michahelis Dado que en la ecuacin (6) aparece [ES] y no [E], se sustituye E0 - [ES] por E en la ecuacin (7) para obtener Conforme [S] aumenta hasta varias veces el valor de Km, se aproxima a un valor de saturacin, el cual es indicado por V0 que se aproxima a Vmx. Dicha concentracin de sustrato 20 100 veces Km, se dice que es la concentracin de saturacin del sustrato debido a que virtualmente toda la enzima debe estar en la forma [ES]. En la velocidad de la reaccin no es posible obtener ningn incremento adicional debido a que la concentracin de E libre en estado estacionario, [E], es bastante pequea. A las concentraciones de saturacin del sustrato, la ecuacin (6) se convierte en:

(E [ES ])[S ] = k
0

[ES ]

Resolviendo la ecuacin para [ES] se tiene que:

[S ] [ES ] = E 0 [S ]+ k m
Sustituyendo en (6)

(8)

= k 3 E 0 V mx (11)

V0=

k (E [S ]) [S ] + k
3 0 m

(9)

Esta ecuacin es una forma del resultado de Briggs y Haldane. Las reacciones catalizadas enzimticamente presentan cintica de saturacin En algunos experimentos, puede no conocerse la concentracin de enzima E0, por lo que es conveniente sustituir el producto k3E0 por Vmx, velocidad mxima.

De esta forma K3 es el cociente de Vmx/E0, el cual es el nmero de moles de sustrato que se convierten en producto por unidad de tiempo dividido entre el nmero de moles de enzima. Este es el nmero de recambio para una reaccin de un solo sustrato y un solo producto, generalmente esta 4 dentro del intervalo de 1 x 10 por segundo. Km, definida por la ecuacin (7) para una reaccin de un solo sustrato, es una relacin de constantes de velocidad. Para la gran mayora de enzimas que carecen de nmeros de recambio muy grandes, K3 ser ms pequeo que K1 y K2. En esta condicin Km ser aproximadamente igual a Ks=K2/K1. De esta forma valores muy pequeos de Ks ndican una gran afinidad de la enzima por el sustrato, es decir la formacin del complejo [ES] se ve termodinmicamente favorecida. Los valores tpicos -2 -7 de Km estn dentro de los lmites de 10 a 10 M, la velocidad de la reaccin catalizada enzimticamente ser, en efecto, muy pequea, como se ndica en la figura 5, y ser casi proporcional al concentracin de sustrato [S]. Se espera que una reaccin catalizada enzimticamente sea de primer orden en cuanto a concentracin de sustrato a una baja [S], pero de

[S ] V = V ]+ [S k
mx 0 m

(10)

La justificacin de esta versin modificada de la ecuacin de Briggs y Haldane es que la velocidad

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orden cero en el caso de una gran [S], como se indica en la figura 10.

Figura 10. Grfica de las velocidades iniciales en estado estacionario de una serie de reacciones catalizadas por la misma concentracin de enzimas, variando la concentracin del sustrato [S], para cada reaccin. La velocidad de reaccin se aproxima a Vmx cuando los valores de [S] son muy grandes (3).

Figura 11. Grfica de Lineweaver y Burk. Todos los puntos de los datos correspondern por supuesto a valores positivos de 1/v y 1/[S] pero con frecuencia, la lnea se extrapola a valores negativos de 1/[S] para dar una estimacin de Km (4).

Experimentalmente, la Km puede estimarse utilizando una grfica de V0 contra [S], como en la figura 10, estimando un valor de Vmx y encontrando despus el valor de [S] que corresponde a una v igual a 1/2Vmx. para una reaccin simple catalizada por enzimas, Km es este valor de [S]. Sin embargo Vmx es un valor asinttico y, por tanto, difcil de estimar con exactitud. La grfica de Lineaweaver y Burk es uno de los varios tipos de anlisis que pueden hacerse para estimar Km y Vmx. En estos anlisis se utilizan todos los datos de v contra [S], en lugar de aquellos puntos que estn prximos a a Vmx y Km. Esta grfica se basa en la ecuacin (10) que se ha modificado utilizando el recproco de ambos lados de la ecuacin. El resultado es:

En la mayora de los anlisis, es importante utilizar valores de [S] que sean significativamente tanto mayores como menores que Km. Adems se debe tener en cuenta que los valores de Km y Vmx derivados de las grficas de Lineweaver y Burk y otros anlisis sern incorrectos a menos que las condiciones y el mtodo experimental correspondan con la teora que fundamenta el anlisis. Por ejemplo las velocidades iniciales deben ser velocidades iniciales reales, no debe haber algn inhibidor a una concentracin que cause algn efecto, etc. Nomenclatura y Clasificacin de los enzimas

1 1 1 = km + V V mx [S ] V mx
que tiene la forma de una ecuacin lineal simple, y=mx + b, donde m=Km/Vmx y b= 1/ Vmx. En la figura 11 se muestra una grfica de Lineweaver y Burk, 1/v contra 1/[S]. Un inconveniente es que los puntos para valores pequeos de [S] tienden a influir ms marcadamente en los resultados obtenidos.

La nomenclatura enzimtica se ha establecido mediante acuerdo internacional bajo los auspicios de la Comisin de Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica. El sufijo asa identifica a una enzima y se debe utilizar para enzimas nicos. Para complejos enzimticos en base a sus reacciones se utiliza la palabra sistema, por ejemplo el sistema succinato oxidasa, oxida cido succnico por el oxgeno en varios pasos catalizados por enzimas concretos.

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La base de la clasificacin y nomenclatura esta en el tipo de reaccin qumica que catalizan. De acuerdo con la clasificacin Internacional, los enzimas se agrupan en seis clases principales, ver tabla 1.

se incluso el monitoreo continuo de algunos compuestos biolgicamente importantes. Se ha desarrollado el electrodo de glucosa. Puesto que una molcula de enzima convierte muchas molculas de sustrato en producto, es posible detectar cantidades muy pequeas del enzima utilizando una prueba sensible para el producto. Por lo general muchos mtodos para anlisis cualitativos y cuantitativos sensibles para sustancias biolgicamente importantes depende de agentes acoplados qumicamente. El acoplamiento qumico de enzimas a matrices insolubles es la base de procedimientos preparatorios y analticos de laboratorio. Con dichas enzimas inmovilizadas puede lograrse produccin a escala industrial. Ver figura 12.

Tabla 1. Clasificacin de enzimas (4)

Naturaleza enzimtica

mecanismos

de

la

accin

La mayor parte de las reacciones enzimticas pueden representarse por la siguiente ecuacin general: E+S Complejo ES producto P + enzima E Figura 12. Tcnicas biocatalizadores (5) de inmovilizacin de

El enzima no se utiliza en la reaccin, sino que se libera de nuevo para reaccionar con otra molcula de sustrato, este proceso se repite hasta que se agotan las molculas del sustrato. La activacin de una molcula de sustrato tiene lugar por su elevada afinidad qumica para determinadas reas de la enzima llamados centros activos .Casi todas las enzimas intracelulares tienen un centro activo por molcula. La lactato deshidrogenasa tiene 4, la quimiotripsina, enzima extracelular tiene un centro activo. Usos analticos y preparatorios de los enzimas La especificidad de los enzimas y su capacidad para catalizar reacciones que de otra manera seran inmensamente lentas, permite analizar cuantitativamente sangre u otras mezclas compleja LEOQ
7

Factores que afectan la actividad enzimtica Entre los factores que afectan la actividad de enzimas estn los siguientes: 1. 2. 3. 4. Concentracin de enzima Concentracin de sustrato pH Temperatura

Generalmente se puede decir que existe un ptimo para la relacin de concentraciones enzima, figura 13, y de sustrato en el cual la actividad es mxima, figura 14. Igualmente cada enzima tiene un ptimo de pH, figura 15 y de temperatura para su funcionamiento, figura 16.

Figura 13. a) Efecto sobre la concentracin de enzima sobre la velocidad de la reaccin enzimtica (4)

Figura 16. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica. A bajas temperaturas la actividad crece al incrementarse la temperatura hasta que se alcanza un ptimo. El posterior incremento de la temperatura provoca un descenso de actividad y la eventual destruccin de la enzima (4). La desviacin de estas condiciones ptimas conduce a una reduccin significativa de la actividad enzimtica. Cintica de reacciones que utilizan sustratos mltiples Entre todas las enzimas, las de un solo sustrato constituyen un caso raro. Se reconocen tres mecanismos generales para los sistemas enzimticos que emplean sustratos mltiples: 1)Mecanismo ordenado Existe un orden preciso en el cual los sustratos se asocian con los sitios activos de la enzima. Todos los productos son liberados siguiendo un orden preciso y despus de reaccionar los sustratos, en la reaccin:

Figura 14. Efecto de la concentracin del sustrato sobre la actividad enzimtica. Incrementos muy grandes de sustrato no afectan a la velocidad; esta se hace independiente de la concentracin de sustrato.

Figura 15. Efecto del pH sobre la actividad enzimtica, la actividad mxima se da a un pH determinado y las desviaciones de este determinan menor actividad (4)

Se dice que este tipo de reaccin tiene un mecanismo ordenado Bi, Bi, que indica dos sustratos, dos productos, ejemplo, la deshidrogenasa alcohlica, los dos sustratos son + etanol y NAD y los dos productos son acetaldehdo y NADH.
Deshidrogenasa alcohlica

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CH3CH2OH + NAD

CH3CHO + NADH + H

Los sustratos siempre se desinan: A, B, C y D, los productos como P, Q y R y las enzimas como E, F y G. 2) Mecanismo aleatorio Cuando dos sustratos A y B se aaden a una enzima en forma aleatoria y los dos productos P y Q se liberan de la misma forma, dicha secuencia se libera como un mecanismo aleatorio Bi, Bi, la reaccin general sera:

Pueden ser frmacos, antibiticos, txinas y antimetabolitos. Se reconocen dos grupos de inhibidores, de acuerdo a su accin inhibitoria son reversible e irreversible. Inhibidores Irreversibles La inhibicin irreversible implica la modificacin de uno o ms grupos funcionales del enzima. Se une en otro punto del sitio activo y evitan el funcionamiento de la enzima. Su efecto no se revierte al aumentar la concentracin del S, [S], comparable con los inhibidores reversibles o competitivos, ejemplo la tosil-fenilalanil-clorometilcetona TPCK de la quimiotripsina, a muy bajas concentraciones la inactiva, la amida o ester usual del cido carboxlico es sustituido por el grupo clorometil. Inhibidores Reversibles Estos inhibidores solo se asocian transitoriamente a la enzima, implica un equilibrio entre la enzima y el inhibidor, K1, es una medida de afinidad del inhibidor por la enzima. Se conocen tres tipos de inhibicin reversibles. 1) Inhibicin competitiva 2) Inhibicin no competitiva 3) Inhibicin incompetitiva 1) Compuestos que pueden estar relacionados estructuralmente con el sustrato se combinan reversiblemente con la enzima o cerca del sitio activo. Se forman los complejos ES y EI pero nunca se forma el complejo EIS, altas concentraciones de los sustratos, superarn la inhibicin al hacer que la secuencia de reaccin se desplace hacia la derecha, de acuerdo con la ecuacin

Ejemplo, la enzima glucogeno oxidasa. 3) Mecanismo ping pong Para dos sustratos y dos productos el mecanismo se presenta como:

En esta secuencia F representa una enzima modificada, (es decir, una enzima X, donde X podra ser un grupo fosforilado o carboxilado o cualquier otro grupo funcional transitoriamente unido a la enzima) F se combina con B y, subsecuentemente, X es transferido a B para formar el segundo producto Q y regenerar la forma original de la enzima E. Un ejemplo de esta reaccin es la catalizada por la enzima acetil CoA carboxilasa
Acetil CoA + ATP +HCO3 Malonil CoA + ADP + Pi

La Acetil CoA cataliza una reaccin acoplada, es decir, actua como mediador en la formacin energticamente desfavorable de un enlace C-C al acoplar la reaccin a la reaccin de hidrlisis, estructuralmente no relacionada, pero energticamente favorable del ATP y el ADP. Inhibicin de la actividad enzimtica

En la inhibicin por retroalimentacin, el producto de una reaccin que esta 1 o ms pasos acta como inhibidor de la enzima, importante metablicamente y suele ser de tipo competitivo. En la figura 7, se muestran las curvas cinticas tpicas observadas en

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este tipo de inhibicin. En la tabla 2 se resumen los parmetros de inhibicin. Un ejemplo clsico de Inhibicin competitiva es el efecto del cido malnico sobre la succnico deshidrogenasa, la cual oxida rpidamente el cido succnico en cido fumrico. Si se agregan cantidades crecientes de cido malnico, que se asemeja al succnico en estructura, la actividad de la succnico deshidrogenasa disminuye considerablemente. A su vez esta inhibicin puede rervertirse aumentando la concentracin del sustrato cido succnico.

2) Inhibicin no competitiva: los compuestos se unen reversiblemente con la enzima o con el complejo enzima sustrato. las reacciones son:

Tabla 2. Parmetros cinticos de los inhibidores (4).

Figura 17. Efectos de un inhibidor competitivo sobre la velocidad de reaccin como funcin de la concentracin de sustrato. Ntese el valor sin cambios de Vmx y el valor incrementado de Km que son caractersticos de la inhibicin competitiva y que se observan tanto en la grfica directa (a) como en la grfica de Lineweaver y Burk (b) (4).

Figura 18. Efectos de un inhibidor no competitivo sobre la velocidad de la reaccin como una funcin de la concentracin de sustrato. Ntese el valor
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disminuido de Vmx y el valor sin cambios de Km, los cuales son caractersticos de la inhibicin no competitiva y que se observan tanto en la grfica directa (a) como en la grfica de Lineweaver y Burk (b) (4). Por tanto difiere de la competitiva en que el inhibidor puede combinarse con ES y S con EI, en ambos casos para formar el complejo EIS. Dado que el sitio de unin del inhibidor no es idntico al sitio activo, ni modifica a este directamente, la Km no se altera, en la tabla 2 se observa la ecuacin que define la inhibicin no competitiva, y la figura 18, muestra los grficas directa y reciproca para este tipo de inhibicin enzimtica. Las ecuaciones que predicen estos resultados aparecen en la tabla 2. 3) Inhibicin Incompetitiva: Los compuestos que se combinan reversiblemente solo con el complejo ES, pero no con la enzima libre.

Enzimas constitutivos: producidos por las clulas en todo momento.

No es superado por altas concentraciones de sustrato, la Km, en presencia del inhibidor es consistentemente ms pequea que el valor de Km de la reaccin no inhibida. Esto implica que S se une ms firmemente a la enzima en presencia del inhibidor. La figura 19, muestra los grficas directa y reciproca para este tipo de inhibicin enzimtica. Las ecuaciones que predicen estos resultados aparecen en la tabla 2. Factores que afectan la formacin de enzimas El contenido enzimtico de las clulas de los tejidos es relativamente constante. Sin embargo, la clula bacteriana est expuesta a un ambiente en continuo cambio. Por ejemplo E. coli puede crecer a un pH cido o alcalino (4.5-9.5), a temperatura ambiente o por encima de la temperatura corporal, aerbica o anaerobicamente. Las clulas de E coli que han crecido en condiciones que corresponden a uno u otro extremo, no contienen las mismas cantidades de enzimas. Por lo que respecta a la influencia del sustrato especfico en la formacin de enzimas, se pueden establecer dos grupos:

Figura 19. Efectos de un inhibidor incompetitivo sobre la velocidad de la reaccin como una funcin de la concentracin de sustrato. Notese la disminucin del Km aparente que da Km (llamada tambin S0.5. La Vmx tambin ha disminuido. Estoa resultados pueden observarse tanto en la grfica directa (a) como en la grfica de Lineweaver y Burk (b) (4).

Enzimas Inducibles: Se producen en la clula nicamente como respuesta a la presencia de un determinado sustrato, es decir, cuando se necesitan, este proceso se llama induccin enzimtica y el sustrato recibe el nombre de inductor. La -galactosidasa es un ejemplo de enzima inducible; su inductor es el azcar lactosa. Determinacin de la actividad enzimtica Puede medirse por diversas tcnicas. Algunos procedimientos requieren instrumentos especiales, mientras que otros un tubo de ensayo y reactivos. Se debe conocer lo siguiente: 1. Naturaleza de la reaccin que cataliza 2. Cofactores y coenzimas requeridos

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3. Concentraciones necesarias de sustrato y de cofactor o coenzima 4. pH ptimo 5. Temperatura ptima 6. Un procedimiento analtico sencillo para medir desaparicin de sustrato o aparicin de productos de la reaccin. La concentracin del sustrato ha de estar por encima del nivel de saturacin al objeto de que la velocidad inicial de la reaccin sea proporcional nicamente a la concentracin de enzima. Los cofactores y coenzimas deben aadirse en exceso. Todo esto asegura que el verdadero factor limitante sea la concentracin de enzima (a su pH temperatura ptimos). Generalmente es ms exacto medir formacin de producto de reaccin que desaparicin de sustrato. Naturaleza y mecanismos de la regulacin enzimtica La actividad enzimtica se puede regular de dos maneras: 1) control directo de la accin cataltica, puede realizarse sobre el mecanismo cataltico como tal, o bien a travs de su acoplamiento con otros procesos y 2) control gentico, incluye los procesos de induccin y represin enzimtica. 1) Control directo de la accin cataltica: Se ejerce por alteracin de las concentraciones de sustrato o de sustancias que reaccionan, por ejemplo al aumentar un sustrato aumenta la velocidad hasta alcanzar un valor lmite. Control directo por acoplamiento con otros procesos: Implica la regulacin por ligandos (molculas capaces de fijarse a la enzima) Retroinhibicin: El ligando que ejerce la regulacin es el producto final de una ruta metablica, puede bloquear su propia sntesis inhibiendo la actividad de los primeros o de enzimas que actan en dicha ruta. Activacin por precursores: El ligando regulatorio es el precursor del primer metabolito de una ruta, activa o estimula la actividad del ltimo enzima de la secuencia de reaccin. Control dependiente de energa: Los adenilatos son los ligandos de reaccin dependientes de energa, ATP, ADP y AMP.

Propiedades de fijacin de enzimas regulatorios: los enzimas regulatorios estan sujetos a la accin del metabolito regulador que puede ser activador o inhibidor. Disminuye la actividad enzimtica, disminuye la afinidad de la enzima por el sustrato que se fija a un sitio diferente del sitio cataltico, estos enzimas tienen dos o ms sitios de reconocimiento, se les llama enzimas alostricos ya que donde acta el efector es diferente del sitio cataltico por tanto el sitio alostrico regula la actividad enzimtica. Cuando la clula se adapta a un ambiente diferente los mecanismos de induccin y represin entran en juego. 2) Control gentico de induccin y represin enzimtica: Se lleva a cabo por la induccin y la represin de la sntesis de enzimas. Cuando se requiere una sustancia inductora el proceso recibe el nombre de induccin. Cuando otras sustancias actan como correpresores el fenmeno recibe el nombre de represin. Los correpresores se unen a el represor, formamdo un complejo activo capaz de actuar sobre el gen operador y bloquear la sntesis del RNAm o unirse al inductor y formar un complejo inactivo incapaz de unirse al gen operador y se lleva a cabo la sntesis de RNAm. La secuencia de aminocidos la determinan los genes estructurales y la velocidad de sntesis de los genes reguladores. Jacob-Monod, denominaron operon a un grupo de genes consecutivos, que forman una unidad operacional. Cuando se aaden inductores como la lactosa, se produce un incremento en la velocidad de sntesis de la -galactosidasa (hidroliza la lactosa a glucosa y galactosa), la -galactsido permeasa (transporta la lactosa al interior de la clula) y la tiogalactsido transacetilasa (de funcin fisiolgica desconocida), los genes se designan como z, y y a respectivamente. La velocidad de sntesis esta regulada por los genes reguladores, que se denominan i, p y o, tal como muestra la figura 20, i es el gen represor, p el gen promotor y o el gen operador. En el gen promotor p, donde se fija la RNA polimerasa, que cataliza la sntesis de RNAm. El control negativo lo ejerce el represor lac, en union del correpresor, forma un complejo represorcorrepresor (puede ser glucosa o galactosa), el cual se fija al gen o y bloquea la transcripcin. Los inductores estimulan la sntesis de RNAm lac, fijndose al represor y disminuyendo la afinidad para el operador. Tanto la represin como la
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induccin representan sistemas de control negativo, ya que la sntesis de enzima solo puede tener lugar cuando el represor se separa del operador. Se dice que tiene lugar un control positivo de la sntesis de enzima cuando se requiere una asociacin entre una protena y una parte de la regin regulatoria de un opern, para la expresin de genes estructurales asociados.

Figura 20. Operon lac (1)

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