Tesis Leonidas Perez

UNIVERSIDAD DE ALMERA Departamento de Hidrogeologa y Qumica Analtica
DEGRADACIN FOTOQUMICA DE CONTAMINANTES EMERGENTES MEDIANTE PROCESOS SOLARES. EVALUACIN ANALTICA.

Lenidas Armando Prez Estrada TESIS DOCTORAL Mayo 2008
Centro de Investigaciones Energticas, Medioambientales y Tecnolgicas
UNIVERSIDAD DE ALMERA
Departamento de Hidrogeologa y Qumica Analtica
DEGRADACIN FOTOQUMICA DE CONTAMINANTES EMERGENTES MEDIANTE PROCESOS SOLARES. EVALUACIN ANALTICA.

Memoria presentada para aspirar al grado de Doctor en Ciencias Qumicas por: LENIDAS ARMANDO PREZ ESTRADA
Fdo. Lenidas Armando Prez Estrada Visado en Almera a 12 de Marzo de 2008.
LOS DIRECTORES DE LA TESIS:
Dr. D. Sixto Malato Rodrguez Investigador Titular OPI CIEMAT Ministerio de Educacin y Ciencia
Dra. Da. Ana Agera Lpez Profesor titular del Departamento de Hidrogeologa y Qumica Analtica Universidad de Almera
Centro de Investigaciones Energticas, Medioambientales y Tecnolgicas
ntes de empezar los agradecimientos valga una mencin especial y agradecimiento infinito para mis Padres, Len Armando y Gloria Silvia, que me educaron de la mejor manera como persona para que llegara tan lejos como mis sueos, que me inculcaron la fe en Dios, que el valor de una persona est en lo que uno es, no en lo que sabe o lo que posee, y que las mejores cosas en la vida no son cosas. A ellos que aceptan mis decisiones y nunca se reservan palabras de cario, aliento, nimo y consejos. A mis queridos hermanos Yoyita y Daniel, les agradezco todos los buenos momentos y las plticas que hemos tenido, su soporte siempre ha sido muy importante para m.
Conocimientos correctos conducen a acciones correctas.

Y slo el que hace esto se convierte en un ser correcto. Cuando actuamos mal es porque desconocemos otra cosa. Por eso es tan importante que aumentemos nuestros conocimientos. Buscando definiciones claras y universales de lo que est bien y de lo que est mal. La capacidad de distinguir entre lo que est bien y lo que est mal se encuentra en la razn y no en la sociedad. Alguien podra vivir feliz si constantemente haces cosas que en el fondo sabe que no estn bien?, Crees que eso les hace felices? Scrates (400 a.C.)
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo de investigacin es el resultado de cuatro aos de investigacin, la cual se desarroll en la Plataforma Solar de Almeria, en el rea de Aplicaciones Medioambientales de la Energa Solar y en la Universidad de Almera, en el Grupo de Investigacin de Residuos de Plaguicidas. Primeramente quiero agradecer la gran oportunidad que me brindaron el Dr. Sixto Malato y la Dra. Ana Agera de formar parte de sus respectivos grupos de investigacin, la paciencia que mostraron sobre todo al inicio de mi estancia, as como tambin la manera tan clara con la que me mostraron un ritmo de investigacin y trabajo muy eficiente. Sixto y Ana muchas gracias. Quiero dar las gracias a la PSA, al Director Diego Martnez Plaza y al CIEMAT por facilitarme siempre los medios necesarios para el buen desarrollo de los experimentos presentados en el presente trabajo de investigacin. Agradezco al Dr. Amadeo R. Fernndez-Alba, Director del Grupo de Investigacin de Residuos de Plaguicidas, por la colaboracin prestada para el buen desarrollo de esta investigacin. Al Dr. Julin Blanco, con el que tuve el primer contacto con la PSA en 2000 y que posteriormente deriv en la realizacin de una tesis doctoral en este centro de investigacin. A los doctores M.I. Maldonado y W. Gernjak por la colaboracin prestada. Agradezco sinceramente a las instituciones que me otorgaron una beca para realizar esta investigacin doctoral, primeramente al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa, y posteriormente a la CIEMAT, dentro del Convenio de Colaboracin entre la Universidad de Almera y el Centro de Investigaciones Energticas, Medioambientales y Tecnolgicas para becas de doctorado relacionadas con lneas de investigacin en la Plataforma Solar de Almera. A una persona que tuvo una gran influencia en mi vida y me brind toda su ayuda, soporte y cario en todo momento, gracias Cosima. Un gran amigo y magnfica persona que da a da se esfuerza y hace lo mejor para que todos los experimentos salgan bien, y que nunca pierde el buen nimo ni se reserva palabras de aliento para todos, gracias Agustn. A mis compaeros del grupo de qumica: Isa, Aranxa, Pilar, Ana, Carla, Eli, Nick, etc. A todos los que forman o formaron parte de otros grupos de la plataforma: Jse, Mingo, Lidia, Cristina, Carmen, Nono, Antonio, etc.
Durante este tiempo han pasado muchas personas por la PSA que he tenido la suerte de conocer, hacer buena amistad, recibir algn consejo, nimo o algn comentario que repercuti en la mejora de mi trabajo: Cristina, Juan, Ing. Navntoft, Jordi, Nardi, Ana Garca, Ana Beln, Vittorio, Giuseppe. A mis compaeros de la Universidad de Almera: Octavio, Maria Jos, Milagros, Paula, Carmen, Chusa, Loli, Imma Ferrer, Mike Thurman. Un agradecimiento al Ministerio de Educacin y Ciencia, y al Ministerio de Ciencia y Tecnologa por los proyectos: Efecto de la radiacin solar y tratamiento mediante procesos de oxidacin avanzada (CTQ2005-09269-C02-01), y Estudio integrado de la eliminacin, vigilancia avanzada e impacto ambiental de contaminantes emergentes en la depuracin de aguas residuales urbanas e industriales (CTM2004-06265-C03-03), respectivamente, en los cuales se enmarca el presente trabajo de investigacin. Agradezco a todas las personas que de alguna u otra manera han contribuido a lograr que estos cuatro aos en Almera hayan sido muy agradables, y que no los he mencionado, sintanse aludidos.
Lenidas.
CONTENIDO
Contenido
CONTENIDO
RESUMEN .............................................................................................................ix OBJETIVOS ........................................................................................................xiii INTRODUCCIN ....................................................................................................1 1.1 La contaminacin en el medio ambiente .............................................1 1.2 Contaminacin del agua por compuestos orgnicos y normativa actual......................................................................................2 1.3 Fuentes de contaminacin en aguas .................................................10 1.4 Comportamiento de los contaminantes en el medio ambiente acutico: Estudios de degradacin fotoqumica...............................16 1.5 Descontaminacin de aguas mediante procesos de oxidacin avanzada ................................................................................................18 1.5.1 Fotocatlisis mediante TiO2 ...........................................................21 1.5.2 FotoFenton ...................................................................................25 1.6 Reactores fotocatalticos solares .......................................................28 1.7 Evaluacin analtica de los procesos de degradacin y tcnicas analticas aplicadas a la identificacin de productos de transformacin y degradacin. ......................................................31 1.7.1 Carbono Orgnico Total (COT)......................................................32 1.7.2 Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC) .......................34 1.7.3 Cromatografa Inica (CI)...............................................................35 1.7.4 Tcnicas analticas aplicadas a la identificacin de productos de transformacin.........................................................................37 1.7.5 Cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas (GC-MS) .......................................................................................44 1.7.6 Cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas (LC-MS) ........................................................................................52 EXPERIMENTAL..................................................................................................71 2.1 Compuestos modelo y reactivos ........................................................71 2.2 Dispositivo experimental .....................................................................72 2.2.1 Fotoreactores y procedimiento experimental.................................72 2.2.2 Fotlisis e hidrlisis ........................................................................76
Leonidas Armando Prez Estrada
Contenido
2.3 Mtodos analticos convencionales ...................................................77 2.3.1 Carbono Orgnico Total (COT)......................................................77 2.3.2 Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC) .......................79 2.3.3 Cromatografa Inica (IC)...............................................................82 2.3.4 Determinacin de hierro (Fe2+, Fe3+ y Fe total) .............................85 2.3.5 Determinacin de H2O2 por tritracin iodomtrica.........................87 2.4 Tcnicas analticas avanzadas ...........................................................88 2.4.1 Pretratamiento de las muestras: extraccin en fase slida (SPE) ............................................................................................88 2.4.2 Cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas (GC-MS) .......................................................................................90 2.4.3 Cromatografa de lquidos acoplada a espectrometra de masas (LC-MS) ............................................................................91 2.5 Evaluacin de la toxicidad...................................................................93 2.5.1 Bioensayo basado en la actividad bioluminiscente de la bacteria Vibrio fischeri ..................................................................93 DEGRADACIN FOTOQUMICA DE DICLOFENACO EN AGUA MEDIANTE FOTLISIS Y FOTOCATLISIS. IDENTIFICACIN DE PRODUCTOS DE TRANSFORMACIN Y ESTABLECIMIENTO DE RUTAS DE DEGRADACIN ...............................................................................97 3.1 Fotlisis del diclofenaco......................................................................97 3.1.1 Identificacin de productos de transformacin ............................102 3.1.2 Ruta de degradacin fotoltica .....................................................116 3.2 Descomposicin del diclofenaco .....................................................117 3.2.1 Aplicacin de procesos de oxidacin avanzada ..........................117 3.2.2 Tratamiento foto-Fenton en agua estndar a pH neutro. ............118 3.2.3 Tratamiento foto-Fenton en agua estndar a pH 2.8 ..................123 3.2.4 Tratamiento foto-Fenton en agua destilada sin control de pH.....127 3.2.5 Tratamiento fotocataltico (TiO2/UV) en medio neutro.................129 3.3 Determinacin de productos de degradacin y ruta de degradacin de diclofenaco mediante procesos de oxidacin avanzada. .............................................................................................130 3.3.1 Tratamiento foto-Fenton...............................................................131 3.3.2 Identificacin de productos de degradacin. ...............................134 3.3.3 Ruta de degradacin....................................................................140
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Tesis Doctoral
Contenido
DEGRADACIN DE DIPIRONA MEDIANTE FOTOCATLISIS CON TiO2 Y FOTO-FENTON. IDENTIFICACIN DE PRODUCTOS DE TRANSFORMACIN Y SEGUIMIENTO DE LA TOXICIDAD ..........................143 4.1 Introduccin ........................................................................................143 4.2 Estudios de hidrlisis y fotlisis ......................................................146 4.3 Tratamiento con foto-Fenton.............................................................149 4.4 Tratamiento mediante fotocatlisis con TiO2 ..................................153 4.5 Identificacin de productos de degradacin: anlisis por GCMS. ........................................................................................................155 4.6 Identificacin de productos de degradacin: anlisis por LCTOF-MS.................................................................................................157 4.7 Evaluacin de la toxicidad.................................................................163 DEGRADACIN DE VERDE MALAQUITA EN AGUA MEDIANTE IRRADIACIN CON LUZ SOLAR NATURAL. EVALUACIN DE LA CINTICA Y TOXICIDAD DE LOS PRODUCTOS DE TRANSFORMACIN..167 5.1 Introduccin ........................................................................................167 5.2 Cinticas de degradacin ..................................................................170 5.3 Identificacin de los productos de transformacin........................172 5.4 Ruta de transformacin .....................................................................178 5.5 Evaluacin de la toxicidad.................................................................182 CONCLUSIONES ...............................................................................................187 REFERENCIAS ..................................................................................................195 GLOSARIO .........................................................................................................217 ANEXO ...............................................................................................................221
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Contenido
ndice de Figuras
Figura 1.1: Representacin de proceso fotocataltico heterogneo en una partcula de catalizador TiO2. Figura 1.2: Referencias publicadas entre 1998 y 2007 relacionadas con el proceso de fotocatlisis mediante TiO2. Fuente: www.scopus.com. Figura 1.3: Referencias publicadas entre 1998 y 2007 relacionadas con el proceso de fotoFenton. Fuente: www.scopus.com. Figura 1.4. Esquema de un Captador Parablico Compuesto, y como refleja la radiacin solar que llega en diferentes ngulos de incidencia. Figura 1.5: Evolucin del COD y de la concentracin del plaguicida pirimetanil en el transcurso de un experimento de degradacin mediante fotocatlisis con TiO2. [Agera et al., 2000] Figura 1.6: Seguimiento de la formacin de cloruros y aniones de cidos orgnicos durante la degradacin del plaguicida imidacloprid mediante foto-Fenton (smbolos huecos) y fotocatlisis con TiO2 (smbolos slidos) [Malato et al., 2001] Figura 1.7: Esquema de un Espectrmetro de Masas. Figura 1.8: Identificacin de productos de degradacin del bezafibrato basada en la interpretacin de los espectros obtenidos mediante GC-EI-MS [Lambropoulou y col., 2008] Figura 1.9: Esquema de un cuadrupolo simple. Figura 1.10: Esquema en 3D de una IT, electrodos en los extremos y anillo magntico central. Los iones eyectados siguen la direccin, marcada por la flecha, hacia el detector [www.simion.com/info/Image:Sltools_view.png]. Figura 1.11: Espectros de masas obtenidos para el plaguicida imidacloprid a diferentes valores de voltaje de fragmentacin o fragmentor. Figura 1.12: Esquema del funcionamiento de un analizador de triple cuadrupolo. Q1: filtro de masas trabajando con una masa objetivo, Q2: celda de colisin, Q3: segundo filtro de masas trabajando en modo SIM. Figura 1.13: Espectros de masas obtenidos con LC-IT-MS durante la identificacin de un compuesto desconocido de diuron. A) MS, B) MS2 y C) MS3. Figura 1.14: Esquema de los componentes de un analizador de masas de triple cuadrupolo con trampa lineal. Figura 1.15: Detalle del funcionamiento de una trampa lineal. Figura 1.16: Esquema de los componentes en un detector de Tiempo de Vuelo. Figura 1.17: Ejemplo de la identificacin de dos frmacos (codena y acetaminofn), donde se obtuvieron errores menores a 1.5 ppm (0.5 mDa). Figura 1.18: Espectros de masa exacta, obtenidos en LC-TOF-MS, para el benzafibrato, y algunos de los intermedios ms relevantes identificados [Lambropoulou et al., 2008]. Figura 1.19: Esquema representativo de los componentes de un Q-TOF. Figura 2.1: Esquema e imagen de los reactores solares fotocataltcos. Figura 2.2: Ejemplo de un experimento de degradacin solar. (a) concentracin contra el tiempo de experimentacin, (b) concentracin contra Q. Figura 2.3: Imagen del analizador de COT. (a) Mdulo de COT y (b) Automuestreador. Figura 2.4: Datos de calibracin del equipo en los rangos de concentraciones de CT y CIT utilizados en esta Tesis. Figura 2.5: Imagen del HPLC Agilent serie 1100 (a). Detalle de los mdulos (b): automuestreador, columna, y detector UV-VIS (DAD). Figura 2.6: Sistema de IC Dionex utilizado. DX120 (cationes), DX600 (anines/cidos orgnicos) y automuestreador. Figura 2.7 (a): Cromatograma del patrn de referencia de cationes. Figura 2.7 (b): Cromatograma del patrn de referencia de aniones. Figura 2.7 (c): Cromatograma del patrn de referencia de cidos carboxlicos. 23 24 28 29 33
37 43 47 50 51 56 58 60 61 63 65 66 68 70 73 76 78 79 81 83 84 84 85
iv Tesis Doctoral
Contenido Figura 2.8: Complejo quelato de hierro y fenantrolina. (a) estructura molecular en 2D, (b) Estructura molecular en 3D. 86 Figura 2.9: Sistema utilizado para la pre-concentracin de muestras con SPE. 89 Figura 2.10: GC-MS Agilent 6890, con un MSD 5973 inert. 91 Figura 2.11: TOF-MS Agilent 93 Figura 2.12: Fotografa de bacterias Vibrio fischeri. 94 Figura 2.13: Imagen de un luminmetro ToxAlert 100 de MERCK 95 Figura 3.1: Espectro UV de 200 400 nm del diclofenaco (a pH 3 y 10) comparado con el espectro UV solar registrado en la Plataforma Solar de Almera. 98 Figura 3.2: Cintica de la desaparicin del diclofenaco por fotlisis, y evolucin del COT durante el experimento. A) Disolucin recin preparada de diclofenaco en agua. B) Disolucin al final del experimento. 101 Figura 3.3: Cromatograma obtenido mediante el anlisis por GC-EI-MS de una disolucin de diclofenaco tras tres das de exposicin solar, donde se identifican seis productos de la degradacin. El ejemplo del espectro de masas, en full-scan, corresponde al compuesto C-5. 105 Figura 3.4: Resultado obtenido de la bsqueda en la base de datos Wiley275 del compuesto C-8, de la Figura 3.3. A) Espectro de masas de referencia, B) Espectro de masas de la muestra. 107 Figura 3.5: Espectro de masas obtenido mediante PCI, utilizando metano como gas reactivo. En el espectro se observa la presencia de dos secuencias de iones caractersticas, las cuales se muestran en azul y rojo. 107 Figura 3.6: Seleccin de iones, provenientes del cromatograma PCI, con la cual se detecta la co-elucin de dos compuestos a un tiempo de retencin muy prximo. 108 Figura 3.7: Una vez detectada la co-elusin de ambos compuestos, se procedi a identificarlos en base a sus correspondientes espectros de masas en EI. 109 Figura 3.8: Cromatograma LC-TOF-MS obtenido en modo negativo y espectro de masas utilizado para identificar al compuesto C-13 (8-clorocarbazol-1-cido frmico). 111 Figura 3.9: Espectro de masas del compuesto C-13, donde se muestran los posibles resultados, formulas empricas y errores asociados a la masa exacta sealada. Se ha insertado la estructura de la formula emprica de este compuesto. 112 Figura 3.10: Esquema de la ruta propuesta de foto-transformacin del diclofenaco, por el efecto de la exposicin a la radiacin solar. 115 Figura 3.11: Especies de hierro frrico presentes en solucin acuosa a diferentes valores de pH. Constantes de equilibrio [Flynn, 1984], grfica [Gernjak, 2006]. 120 Figura 3.12: Tratamiento Foto-Fenton en agua estndar a pH neutro, a diferentes concentraciones de hierro (0.05, 0.075, 0.2, 0.75) mM. Comparacin de (a) concentracin de diclofenaco y consumo de perxido, y (b) Carbono orgnico disuelto (COD). 121 Figura 3.13: Tratamiento Foto-Fenton de diclofenaco en agua estndar a pH 2.8, concentracin de hierro 0.075 mM. 124 Figura 3.14: Tratamiento Foto-Fenton de diclofenaco en agua estndar a pH 2.8, a diferentes concentraciones de hierro (0.03, 0.075, 0.3 y 0.75 mM). (a) Evolucin de cloruro, (b) Evolucin de amonio, (c) Consumo de perxido de hidrgeno. No se detect consumo de perxido antes de iniciar la iluminacin. 126 Figura 3.15: Tratamiento Foto-Fenton de diclofenaco en agua destilada, con un pH inicial de 7 y una concentracin de hierro de 0.05 mM. 128 Figura 3.16: Tratamiento fotocataltico (TiO2, 0.2 g L-1) en agua estndar, sin control de pH. 130 Figura 3.17: Evolucin de la concentracin de diclofenaco (50 mg/L), COD y del pH con el tiempo de iluminacin, durante el tratamiento con foto-Fenton (concentracin de Fe2+ 0.05 mM). 132 Figura 3.18: Evolucin de Cloruro y Amonio durante el proceso foto-Fenton. 133 Figura 3.19: Cromatograma obtenido mediante LC-(ESI+)TOF-MS correspondiente al anlisis de un extracto de la mezcla de reaccin tras 10 min de tratamiento con
Contenido foto-fenton. En l se muestran los PTs identificados y los espectros de masas, de los compuestos D1 y D2. 136 Figura 3.20: Ruta de degradacin propuesta para la degradacin del diclofenaco por medio del tratamiento foto-fenton. 139 Figura 3.21: Evolucin de los principales productos de degradacin (B), durante el proceso foto-Fenton. A) Evolucin del diclofenaco y el carbono orgnico disuelto, C) cidos carboxlicos detectados. 140 Figura 4.1: Estructura qumica de (a) Dipirona como sal sdica, (b) 4-MAA principal metabolito hidrolizado. 144 Figura 4.2: Metabolitos de la Dipirona producidos naturalmente en el cuerpo humano [Gmez et al., 2007]. 145 Figura 4.3: Cromatogramas superpuestos de HPLC-DAD (= 254 nm) dnde se muestran los resultados de la hidrlisis de dipirona (muestras tomadas cada 10 minutos) y su transformacin en MAA. 147 Figura 4.4: (a) Comportamiento del COD y el pH durante la fotlisis del MAA. (b) Espectro solar en la superficie terrestre y espectro de absorcin de MAA. 148 Figura 4.5: Degradacin de MAA utilizando 20 mg/L de Fe2+. Se muestra tambin el consumo de H2O2 durante el tratamiento. 150 Figura 4.6: (a) Cintica de degradacin del MAA con el proceso foto-Fenton, utilizando 2 mg/L de Fe2+. (b) Evolucin de los principales cidos carboxlicos y especies inorgnicas detectadas. 151 Figura 4.7: (a) Cintica de la degradacin del MAA por medio de fotocatlisis con TiO2 (200 mg/L). (b) Evolucin de los principales cidos carboxlicos y especies inorgnicas detectadas. 154 Figura 4.8: Cromatograma tpico de GC-MS de un muestra tomada despus de 10 min de tratamiento fotocataltico con TiO2. 157 Figura 4.9. Cromatograma obtenido mediante LC-TOF-MS despus de 15 min. de tratamiento fotocataltico (TiO2/UV), donde todos los productos de degradacin identificados estn presentes. 158 Figura 4.10: Especto de masa en LC-TOF-MS del compuesto D3, sus fragmentos de ionizacin con la masa exacta detectada y las estructuras con la masa exacta terica. 160 Figura 4.11: Ruta de degradacin del MAA, durante el tratamiento fotocataltico. 161 Figura 4.12: Evolucin de los PDs mas importantes, formados durante el tratamiento fotocataltico. 162 Figura 4.13: Evolucin de la toxicidad y del carbono orgnico disuelto (COD) durante el tratamiento con foto-Fenton. 164 Figura 4.14: Evolucin de la toxicidad y del carbono orgnico disuelto (COD) durante el tratamiento fotocataltico. 165 Figura 5.1:. Estructura qumica de la sal del Verde Malaquita Oxalato. 168 Figura 5.2: Evolucin del VM, COD y pH durante el experimento de fotlisis, radiacin UV global promedio = 24.2 Wm2. 171 Figura 5.3: Cromatograma de iones totales obtenido mediante LC-(ESI)TOF-MS, donde son visibles 15 de los PTs identificados. 173 Figura 5.4: Espectro de masa exacta del Verde leucomalaquita (VLM), en el cual se observa la presencia simultnea de los iones [M+H]+ y [M+2H]2+. 176 Figura 5.5a: Ruta de transformacin (I) y PTs propuestos. Los compuestos marcados con * se detectaron solo ocasionalmente. 179 Figura 5.5b: Rutas de transformacin (II) y (III) y PTs propuestos. 180 Figura 5.6: Cintica de los PTs de la ruta de transformacin (I) propuesta. 181 Figura 5.7: Curva de calibracin para el EC50, 30 min del compuesto D20. Ajustada a una curva sigmoidal de Dosis Efecto (r2 = 0.99986). 183 Figura 5.8: Cintica del compuesto D20 y el VM, durante la fotodegradacin. 185
vi Tesis Doctoral
Contenido
ndice de Tablas
Tabla 1.1A: Contaminantes considerados como emergentes hoy en da [Barcel, 2003]. Tabla 1.1B: Lista de Substancias Prioritarias (33) y de otros contaminantes (8) incluida en propuesta de Directiva de Substancias Peligrosas, (COM(2006) 397 final) (*) Tabla 1.2: Algunos de los AOPs ms conocidos. Tabla 1.3: Tipos de adsorbentes ms utilizados y sus estructuras. Tabla 1.4: Revisin de mtodos de LC-MS empleados en la identificacin de PTs en procesos de transformacin fotoqumica de frmacos [Petrovic y Barcel, 2007] Tabla 2.1: Composicin de la fase mvil utilizada para cada compuesto Tabla 2.2: Mtodo para la determinacin de aniones. Tabla 2.3: Mtodo para la determinacin de cidos orgnicos. Tabla 3.1: Resultados de los experimentos de fotlisis, expresados en % de desaparicin del diclofenaco. Tabla 3.2: Datos de masa exacta, error y frmula emprica obtenidos para los productos de transformacin del diclofenaco identificados por TOF-MS. Tabla 3.3: Medidas de Masa Exacta obtenidas de los espectro LC-TOF-MS, de los productos de degradacin protonados identificados. Tabla 4.1: Concentraciones medias y ms altas de los metabolitos de la dipirona encontradas en aguas residuales y medioambientales Tabla 4.3: Informacin sobre los compuestos detectados por GC-MS. Tabla 4.4: Informacin analtica obtenida mediante LC-TOF-MS, a partir de los espectros de masa exacta de los PDs identificados. Tabla 5.1: Tiempos de retencin y medidas de masa exacta obtenidas de los espectros del LC-TOF-MS para los productos de transformacin identificados. Tabla 5.2: Tiempos de retencin e informacin estructural de los productos de transformacin del VM identificados por GC-MS. 4 6 21 40 54 80 82 82 102 113 137 146 156 159 175 177
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Contenido
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RESUMEN
RESUMEN
Los resultados y discusin contenidos en esta Tesis pretenden proporcionar una metodologa analtica para evaluar adecuadamente procesos de fotodegradacin solar de contaminantes en agua y procesos avanzados de oxidacin (fotocatlisis mediante TiO2 y foto-Fenton) llevados a cabo utilizando radiacin solar. Para ello se han elegido diferentes contaminantes encontrados habitualmente en agua como son diclofenaco, dipirona y verde malaquita. Se han realizado estudios de hidrlisis y fotolisis en fotoreactores expuestos directamente a la radiacin solar en la Plataforma Solar de Almera. Los estudios relacionados con la aplicacin de procesos de oxidacin avanzada se han realizado solo con dipirona y diclofenaco, utilizando para ello captadores parablicos compuestos que forman parte de una planta piloto de 35 litros tambin emplazada en la Plataforma Solar de Almera. Los resultados se han evaluado mediante diferentes tcnicas analticas sencillas (cromatografa lquida, cromatografa inica, carbono orgnico total, etc.) y avanzadas (cromatografa gaseosa y lquida acoplada a espectrometra de
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Resumen
masas) que han permitido conocer el grado de descomposicin de los contaminantes, los principales productos de transformacin/degradacin y los mecanismos relacionados con ello, que han permitido establecer una ruta metablica. Adems, los resultados tambin se han evaluado mediante tcnicas toxicolgicas basadas en la bacteria Vibrio fischeri. La fotolisis de diclofenaco se llev a cabo en agua desmineralizada, pero tambin sobre agua dulce estndar. Las muestras se extrajeron mediante SPE (cartuchos Oasis HLB y MAX) y la separacin e identificacin de PTs se consigui mediante GC/MS y LC/TOFMS), que proporcionaron informacin complementaria permitiendo la identificacin de hasta 13 PTs diferentes. Los fotoproductos formados permitieron establecer que el diclofenaco se transforma por el efecto de la radiacin solar mediante una fotociclacin que lo convierte en derivados carbazlicos, pero tambin a travs de una descarboxilacin y una oxidacin subsiguiente de la cadena alqulica. El principal PT identificado fue 8cloro-9H-carbazol-1yl-cido actico. Los experimentos en planta piloto solar mediante TiO2 supusieron un tiempo de tratamiento de 200 minutos, siguiendo una cintica tpica de orden 1 (aparente). En el caso del tratamiento de diclofenaco mediante foto-Fenton, los resultados muestran una oxidacin completa despus de 60 minutos y una mineralizacin total despus de 100 minutos de iluminacin. Se estableci la ruta de degradacin mediante GC-MS y LC/TOF-MS, identificando 18 PDs y proponiendo dos rutas de degradacin, que difieren sustancialmente de las propuestas anteriormente mediante otros procesos de oxidacin diferentes (ozonizacin y UV/H2O2). En estos experimentos mediante foto-Fenton se detect una oxidacin, precipitacin y redisolucin simultnea provocada por el tratamiento a pH 2.8, que llev a la completa descomposicin de diclofenaco. Sin embargo, se propone el tratamiento ms adecuado a un pH similar al pKa de diclofenaco: alrededor de pH = 4.
Tesis Doctoral
Resumen
El tratamiento mediante TiO2 y foto-Fenton de dipirona en planta piloto permiti la eliminacin de la dipirona y sus metabolitos. Se compararon los dos tratamientos atendiendo a la velocidad de mineralizacin, formacin de PDs (identificados mediante HPIC, GC/MS y LC/TOF-MS) y evolucin de toxicidad (mediante Vibrio fischeri). El tratamiento de foto-Fenton fue ms eficiente (ms rpido) que el de TiO2, pero sin ninguna diferencia relevante en cuanto al tipo de PDs generados y evolucin de la toxicidad. Se ha propuesto un mecanismo de degradacin, siendo cidos carboxlicos los principales PDs antes de la mineralizacin completa. Un descenso de la toxicidad durante el tratamiento tambin se ha demostrado. La evaluacin de los PTs generados durante la fotodegradacin de verde malaquita se llev a cabo mediante LC-TOF-MS y GC-MS. Los 28 PTs identificados indican que tienen lugar tres reacciones principales: (i) Ndesmetilacin, (ii) hidroxilacin y (iii) rotura de la estructura formando derivados benzofennicos. Estos procesos tienen lugar en presencia de radicales hidroxilo que atacan el anillo aromtico, el grupo N,N-dimetilamnico y el tomo de carbono central. La toxicidad evaluada mediante Vibrio fischeri demuestra que la disolucin sigue siendo txica despus de la desaparicin del verde malaquita. Esta toxicidad se ha asignado al PT 4-(dimetilamina)benzofenona que tiene EC50,30min = 0.061 mg L-1.
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OBJETIVOS
OBJETIVOS
El trabajo de investigacin que se recoge en esta Memoria ha sido desarrollado en las instalaciones de la Plataforma Solar de Almera y de la Universidad de Almera (Dep. de Qumica Analtica, G.I. Residuos de Plaguicidas). Las operaciones de tratamiento actualmente implantadas en las Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales (EDAR), han demostrado no ser efectivas para la depuracin de ciertos compuestos. Este hecho, junto con vertidos directos de ciertas sustancias qumicas consecuencia de actividades en auge, como la acuicultura, hacen que multitud de compuestos qumicos alcancen las aguas naturales. Por ello, resulta necesario ampliar las investigaciones sobre estos contaminantes en dos sentidos: ampliando los conocimientos acerca de su comportamiento e impacto en el medio ambiente y proponiendo procesos de tratamientos alternativos o complementarios que logren reducir el vertido de estos compuestos a las aguas naturales. Trabajos realizados recientemente ponen de manifiesto que el uso de la radiacin solar para la aplicacin de los AOPs (fotocatlisis heterognea con TiO2 y fotocatlisis homognea mediante
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Objetivos
foto-Fenton) usando Captadores Cilindro Parablicos Compuestos (CPC) se plantea como un mtodo atractivo para conseguir un tratamiento efectivo. En este contexto, los objetivos principales de esta Tesis Doctoral han sido tres: 1. Evaluar procesos de fotodegradacin solar de contaminantes orgnicos en agua, a fin de ampliar el conocimiento sobre el comportamiento e impacto de los contaminantes en el medio ambiente. 2. Evaluar la aplicacin de Procesos de Oxidacin Avanzada (AOPs) solares para conseguir la depuracin de aguas contaminadas con sustancias orgnicas persistentes y poder disear un tratamiento adecuado para estas aguas. 3. Desarrollar una metodologa analtica til que permita la completa evaluacin de estos procesos, en especial en lo que se refiere a la identificacin de productos de transformacin generados durante los mismos. Se ha pretendido alcanzar estos objetivos mediante la consecucin de los siguientes objetivos parciales: Evaluar la fotodegradacin de los contaminantes mediante la exposicin de disoluciones acuosas de los mismos a la radiacin solar directa. Descontaminar el agua mediante fotocatlisis utilizando los dos nicos procesos que se pueden llevar a cabo mediante radiacin solar: fotocatlisis heterognea con TiO2 y fotocatlisis homognea con Fe/H2O2 (foto-Fenton). Operar una planta piloto que permita desarrollar la experimentacin en las condiciones ms reales posible, ajustando todos sus parmetros de control con el objetivo de conseguir los resultados ms fiables posibles. Comparar cual de los dos procesos fotocatalticos aplicados es el ms adecuado en cada caso.
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Tesis Doctoral
Objetivos
Evaluar la descomposicin de los contaminantes mediante el seguimiento de la desaparicin del Carbono Orgnico Total (TOC) y la aparicin de sus iones, tanto inorgnicos como orgnicos.
Conocer la cintica de degradacin tanto del compuesto original como de sus productos de transformacin (PTs), mediante el anlisis por cromatografa lquida de alta resolucin con detector ultravioleta (HPLCDAD) del compuesto original.
Desarrollar una estrategia analtica basada en el empleo de tcnicas de extraccin en fase slida seguidas de anlisis mediante cromatografa gaseosa acoplada a espectrometra de masas (GC-MS) y cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas con analizador de tiempo de vuelo (LC-TOF-MS), a fin de identificar los PTs generados durante los procesos de degradacin y establecer sus posibles rutas de degradacin.
Asegurar la correcta destoxificacin de las aguas durante los procesos estudiados, mediante la aplicacin de bioensayos de toxicidad aguda.
Demostrar que la combinacin de toda la informacin obtenida permite evaluar mejor un tratamiento de oxidacin avanzada y, por tanto, conocer mejor su comportamiento para intentar optimizarlo. Todo ello debe conducir a una reduccin de costes que permita la implantacin de esta tecnologa
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Objetivos
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Tesis Doctoral
CAPITULO
Capitulo 1
INTRODUCCIN
1.1 La contaminacin en el medio ambiente

El medio ambiente ha sido siempre esencial para la vida. Las preocupaciones acerca del equilibrio entre la vida humana y el medio ambiente alcanzaron dimensiones internacionales en la dcada de 1950. Durante los aos siguientes, se comenzaron a ensamblar las piezas, supuestamente inconexas, de un rompecabezas mundial para revelar la imagen de un mundo con un futuro incierto. Para finales de los aos sesenta, la voz de la preocupacin ambiental slo se escuchaba en Occidente. Dentro del mundo comunista, la destruccin incansable del medio ambiente en nombre de la industrializacin continu sin freno. En los pases en desarrollo, las preocupaciones ambientales se consideraban lujos occidentales. La pobreza es la peor forma de contaminacin, afirm la Primer Ministro de India, Indira Ghandi, quien desempe un papel clave al orientar la agenda de la 1
Introduccin
Conferencia de las Naciones Unidas sobre el Medio Humano celebrada en Estocolmo en 1972 hacia las preocupaciones de los pases en desarrollo [Strong, 1999]. A principios del decenio de los setenta, la atencin se centr en el ambiente biofsico, por ejemplo, en asuntos de manejo de la fauna y flora silvestres, conservacin de los suelos, contaminacin del agua, degradacin de la tierra y desertificacin, considerndose a las personas como la causa fundamental de tales problemas. En Occidente convivan (y hasta cierto punto todava lo hacen) dos importantes escuelas de pensamiento con opiniones divergentes sobre las causas de la degradacin del medio ambiente. Una culpaba a la ambicin sin medida y a la bsqueda incansable del crecimiento econmico, mientras que la otra responsabilizaba al crecimiento demogrfico. Sin embargo, la contaminacin que no se combate y una poblacin que no se estabiliza constituyen ambas verdaderas amenazas a nuestro modo de vida y a la vida misma [Stanley Foundation, 1971].
1.2 Contaminacin del agua por compuestos orgnicos y normativa actual

Una de las caractersticas del desarrollo econmico de los pases es la generacin de residuos, por tanto el volumen de stos crece de manera exponencial con respecto al grado de industrializacin. Actualmente se tiene registro de unos cinco millones de sustancias qumicas, y se estima que cada ao unas 1000 sustancias nuevas se integran al registro [GEO-3, 2002]. A medida que las sociedades desarrolladas evolucionaban, tuvieron que enfrentarse a problemas ambientales, sobre todo en funcin del uso del agua [Domnech et al., 2001]. Por tanto, en los pases desarrollados se han
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establecido estrategias y soluciones para revolver la contaminacin por altos niveles de metales pesados, uso intensivo de nutrientes (principalmente nitratos y fosfatos) y contaminantes orgnicos, stos ltimos hasta niveles de ultra-traza (< ng/L). Algunas de las herramientas utilizadas son el tratamiento de efluentes industriales y municipales, desinfeccin de aguas, limitacin y sustitucin de nitratos y fosfatos en productos de uso masivo, los desarrollos en ingeniera para el tratamiento de agua, qumica analtica, ecotoxicologa, y una transferencia tecnolgica cada vez ms rpida de los centros de investigacin a la industria. Todas estas herramientas, sin embargo, no estn disponibles muy a menudo en los pases en vas de desarrollo. Contaminantes Emergentes Se denominan contaminantes emergentes a contaminantes que vienen siendo detectados en las aguas desde hace poco tiempo (fundamentalmente porque no existan tcnicas analticas que los detectaran, o simplemente porque no se les haba prestado atencin antes) y que a menudo no cuentan con una regulacin especfica. Sin embargo, suelen ser candidatos a ser incluidos en normativas especficas, dependiendo sobretodo de los resultados que la investigacin aporte sobre sus efectos nocivos sobre el medio ambiente (incluida la salud humana) y del monitoreo de datos concerniente a su incidencia. Esto ltimo es de especial importancia ya que su presencia continuada en campaas de anlisis medioambiental es indicadora de la necesidad de regular su vertido y/o su utilizacin. Los compuestos que han surgido recientemente, Tabla 1.1A, con una particular relevancia son los detergentes, productos farmacuticos, productos de higiene personal y aditivos de gasolinas. Estos grupos de contaminantes tienen adems la caracterstica de que no necesitan ser muy persistentes en el medio ambiente para causar un efecto negativo, ya que su alto grado de transformacin/eliminacin es compensado por su constante ingreso en el medio ambiente debido a su utilizacin masiva [Barcel, 2003].
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Tabla 1.1A: Contaminantes considerados como emergentes hoy en da [Barcel, 2003]. Contaminantes Emergentes
Grupos de Compuestos Productos Farmacuticos Antibiticos (de uso humano y veterinario) Analgsicos y anti-inflamatorios Frmacos psiquitricos Anti-epilpticos Reguladores de lpidos -bloqueadores Rayos-X, contraste de Esteroides y hormonas (anticonceptivos) Productos de higiene personal Fragancias Cremas solares, compuestos activos de Repelentes de insectos Antispticos Detergentes y sus metabolitos Nitro, policiclic y macrociclic almizcle Benzofenona N,N-dietiltoluamida Triclosan, clorofeoe Etoxilatos de Alquilfenol, alquilfenoles (nonilfenol y octilfenol), carboxilatos de alquilfenol Retardadores de llama Difenil teres polibrominados (PBDEs), bisfenol A tetrabromo, Tris(2-cloroetil)fosfato Aditivos industriales Agentes quelantes (EDTA), sulfonatos aromticos Aditivos de gasolinas Subproductos de desinfectantes Diaqul teres, metil-ter-butil ter (MTBE) Bromocidos, bromoacetonitrlos, bromoaldehdos, cianoformaldehdos Trimetoprim, eritromicina, lincomicina, sulfametoxazol Codena, ibuprofeno, acetaminofen, cido acetl saliclico, diclofenaco, fenoprofen Diazepan Carbamazepina Bezafibrato, cido clofbrico, cido fenofbrico Metoprolol, propranolol, timolol Iopromide, iopamidol, diatrizoato Estradiol, estrona, estriol, dietilbestrol Ejemplos
La Comunidad Europea y la Directiva Marco del Agua Comparando la Comunidad Europea (CE) con otras regiones del mundo, la distribucin y el saneamiento del agua tienen un desarrollo muy elevado, sin embargo persisten problemas de contaminacin diversos. La CE basa su poltica
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del agua en el uso de la informacin cientfica y los datos tcnicos disponibles, tomando en cuenta la variabilidad de las condiciones ambientales en las diferentes regiones de la Comunidad, con el objetivo de mejorar la calidad de los recursos de agua dulce que posee [Malato et al., 2003a]. La Directiva Marco del Agua (Water Framework Directive, WFD) 2000/60/CE, es la directiva de la CE que establece las bases para la proteccin de las aguas continentales, para los estados miembros. La WFD, entre otros muchos temas, detalla la estrategia de la CE contra la contaminacin de agua por sustancias peligrosas. Hace 30 aos la CE dio el primer paso para controlar la contaminacin causada por determinadas sustancias peligrosas vertidas en el medio acutico de la Comunidad. Para controlar stos vertidos puntuales y difusos de sustancias peligrosas se formul la directiva 76/464/CEE. La directiva WFD establece que se deben tomar medidas especficas a nivel comunitario contra la contaminacin de las aguas, causada por determinados contaminantes o grupos de contaminantes que representen un riesgo significativo al medio acutico. Adems, sta directiva introdujo una metodologa cientfica para seleccionar las sustancias prioritarias en funcin de su riesgo significativo. La primera lista de sustancias seleccionadas se incluy en la decisin 2455/2001/CE, donde se incluyen 33 sustancias prioritarias. Esta lista de sustancias es examinada cada cuatro aos, y las revisiones tienen en cuenta toda la informacin procedente de los estados miembros, el Comit de Toxicologa, Ecotoxicologa y Medio Ambiente, la Agencia Europea de Medio Ambiente, los programas comunitarios de investigacin, las asociaciones empresariales europeas y las organizaciones de proteccin del medio ambiente. A travs de proyectos como CADOX, EMCO, POSEIDON, P-THREE, la CE promueve que se generen soluciones tecnolgicas para el tratamiento de contaminantes que hasta el momento no ha sido posible eliminar (http://ec.europa.eu/environment/water/index_en.htm). Como consecuencia de todo este trabajo desarrollado desde que se public la WFD, en Julio de 2006 la CE acord intentar establecer una nueva Directiva,
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que se conocer como Directiva de Sustancias Prioritarias, que apoya a la WFD (WISE Newsletter, Iss. 5, Jun 2007, ISSN-725-390X). Esta directiva est ahora mismo (Enero 2008) en fase de discusin en el Parlamento Europeo. Ms informacin en: http://ec.europa.eu/environment/water/waterdangersub/surface_water.htm. Esta directiva establece estndares de calidad para 41 sustancias o grupos de sustancias (Tabla 1.1B). Esta propuesta, que se espera sea definitiva durante el ao 2008, es parte de una nueva estrategia contra la contaminacin qumica de aguas, introducida por la WFD para el establecimiento de un nuevo marco de trabajo. Gran parte de el establecimiento de estas nuevas propuestas, directivas y estndares de calidad, se debe a que existen los instrumentos legislativos, tcnicos y cientficos para llevar a cabo su implementacin, provenientes principalmente de los proyectos financiados por la CE dentro de los programas marco, FP (http://cordis.europa.eu/).
Tabla 1.1B: Lista de Substancias Prioritarias (33) y de otros contaminantes (8) incluida en propuesta de Directiva de Substancias Peligrosas, (COM(2006) 397 final) (*) Identificado como Nmero Nombre de la sustancia sustancia Nmero CAS EU prioritaria peligrosa prioritaria
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) 15972-60-8 120-12-7 1912-24-9 71-43-2 n.a. 7440-43-9 85535-84-8 470-90-6 2921-88-2 107-06-2 75-09-2 117-81-7 330-54-1 240-110-8 204-371-1 217-617-8 200-753-7 n.a. 231-152-8 287-476-5 207-432-0 220-864-4 203-458-1 200-838-9 204-211-0 206-354-4 Alaclor Antraceno Atrazina Benceno Difenileters Brominados (**) Cadmio y sus compuestos C10-13-cloro alcanos (**) Clorfenvinfos Clorpirifos 1,2-Dicloroetano Diclorometano Di(2-etilhexil)ftalato Diuron X(***) X X X
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115-29-7 959-98-8 206-44-0 118-74-1 87-68-3 608-73-1 58-89-9 34123-59-6 7439-92-1 7439-97-6 91-20-3 7440-02-0 25154-52-3 104-40-5 1806-26-4 140-66-9 608-93-5 87-86-5 n.a. 50-32-8 205-99-2 191-24-2 207-08-9 193-39-5
204-079-4 n.a. 205-912-4 204-273-9 201-765-5 210-158-9 200-401-2 251-835-4 231-100-4 231-106-7 202-049-5 231-111-4 246-672-0 203-199-4 217-302-5 n.a. 210-172-5 201-778-6 n.a. 200-028-5 205-911-9 205-883-8 205-916-6 205-893-2 204-535-2 211-704-4 n.a. 234-413-4 204-428-0 200-663-8 216-428-8
Endosulfan (alpha-endosulfan) Fluoranteno (****) Hexaclorobenceno Hexaclorobutadieno Hexaclorociclohexano (Lindano, isomero gama) Isoproturon Plomo y sus compuestos Mercurio y sus compuestos Naftaleno Niquel y sus compuestos Nonilfenoles (4-(para)-nonilfenol) Octilfenoles (para-tert-octilfenol) Pentaclorobenceno Pentaclorofenol Hidrocarburos poliaromticos (Benzo(a)pireno), (Benzo(b)fluoranteno), (Benzo(g,h,i)perileno), (Benzo(k)fluoranteno), (Indeno(1,2,3-cd)pireno) Simazina Compuestos de Tributiltin (cationes de Tributiltin) Triclorobencenos (1,2,4-Triclorobenceno) Triclorometano (Cloroformo) Trifluralin
X X X
X X
(29) (30) (31) (32) (33) * **
122-34-9 688-73-3 36643-28-4 12002-48-1 120-82-1 67-66-3 1582-09-8
Donde se han elegido grupos de sustancias, normalmente se lista una sustancia individual representativa como un parmetro indicativo (entre parntesis y sin nmero). Estos grupos de sustancias normalmente incluyen un considerable nmero de compuestos individuales. Actualmente no es posible dar un parmetro indicativo apropiado.
***
Solamente Pentabromobifenileter (nmero CAS 32534-81-9).
Introduccin **** Fluoranteno est en la lista como indicador de otros ms peligrosos, Hidrocarburos Poliaromticos.
Nmero CAS (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8)
[1]
Otros contaminantes DDT total [1] para-para-DDT Aldrin Dieldrin Endrin Isodrin Carbontetracloruro Tetracloroetileno Tricloroetileno
No aplica 50-29-3 309-00-2 60-57-1 72-20-8 465-73-6 56-23-5 127-18-4 79-01-6 DDT total y sus ismeros.
Estos ltimos ocho contaminantes, los cuales caen dentro del alcance de la Directiva 86/280/EEC, e incluidos en el anexo de la Directiva 76/464/EEC, no estn en la lista de sustancias prioritarias. Sin embargo, los estndares de calidad ambiental para estas sustancias se incluyen en la anteriormente mencionada propuesta de la Comisin, de forma que se mantenga la regulacin sobre ellas. Estados Unidos (EUA) La situacin en Europa es similar a la que se presenta en los Estados Unidos. En 1999, por iniciativa del gobierno, se realiz un estudio muy extenso con el fin de monitorear un amplio rango de compuestos orgnicos, incluyendo frmacos, antioxidantes, fitoesteroides, biocidas, y retardantes de flama [Kolpin et al., 2002]. Algunos resultados de este estudio llaman la atencin, como el hecho de que se detect, cuando menos en una muestra, la presencia de 82 de los 95 compuestos monitoreados. Posteriormente se han publicado estudios como el de Metcalfe y colaboradores en Norteamrica [Metcalfe et al., 2003], un poco mas concretos con respecto al lugar de estudio, las fuentes de contaminacin y los compuestos detectados, que sin embrago remarcan la presencia y procedencia de contaminantes orgnicos como los frmacos y productos para el 8
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cuidado personal, PPCPs por sus siglas en ingls, que se han integrado en el ciclo del agua, especficamente en el agua potable para consumo humano. Como una medida concreta en los Estados Unidos la Agencia de Proteccin del Medio Ambiente (EPA), tiene un rea especfica donde se realizan proyectos sobre los PPCPs (http://www.epa.gov/ppcp/), enfocndose en reas como: fuentes de contaminacin, destino y transporte, rutas de exposicin humana, rutas de exposicin ecolgica, herramientas de monitoreo y deteccin, valoracin de efectos ecolgicos potenciales, valoracin de efectos potenciales a la salud humana, y comunicacin de la gestin publica ambiental. An con estos esfuerzos, los investigadores todava carecen de un conocimiento completo de los efectos ambientales de la mayora de los microcontaminantes del grupo de los PPCPs [Ternes et al., 2004]. Realmente no se tiene claro cual es la concentracin mnima a la cual estos contaminantes pueden producir efectos adversos en la biota acutica y terrestre o bien si la toxicidad de una mezcla compleja puede ser totalmente diferente a la de un compuesto individual, observndose efectos sinrgicos que potencian el efecto txico [Altenburger et al., 2004]. Pases en Desarrollo En los pases en desarrollo, donde la situacin socio-econmico-poltica dificulta la implementacin de nuevas tecnologas para un control exhaustivo de la contaminacin en agua, se empiezan a dar iniciativas legales que darn marco a la ejecucin de medidas de proteccin del medio ambiente. Entre los organismos que promueven estas polticas principalmente se encuentran la Comisin Econmica para Amrica Latina y el Caribe, CEPAL (http://www.eclac.org/) y la Organizacin para la Cooperacin y el Desarrollo Econmico, OCDE (http://www.oecd.org/), ambas dependientes de las Naciones Unidas (ONU), engloban la realizacin de varios proyectos con el fin de constituir una poltica medioambiental en Latino Amrica y el Caribe, la cual permita la competencia con otros mercados internacionales y un desarrollo sostenible.
Introduccin
Especialmente para la financiacin de proyectos para la utilizacin racional y proteccin del medio ambiente, en pases en desarrollo, se creo el Fondo para el Medio Ambiente Mundial, GEF por sus siglas en ingls, (http://www.gefweb.org http://www.undp.org/gef/05/). Con un financiamiento de hasta 5 millones de dlares (USD), el GEF financia proyectos a travs del Programa de las Naciones Unidas para el Desarrollo, PNUD (http://www.undp.org/), el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente, PNUMA (http://www.pnuma.org/) y el Banco Mundial. El GEF concentra su trabajo en 6 reas, dos de las cuales son complementarias en lo que a contaminantes orgnicos en aguas se refiere, Aguas Internacionales (IW) y Contaminantes Orgnicos Persistentes (POPs). Entre otros objetivos estas dos reas dirigen acciones enfocadas al monitoreo, reduccin y eliminacin de los POPs y otros contaminantes.
1.3 Fuentes de contaminacin en aguas

a) Productos farmacuticos La presencia de productos farmacuticos en aguas naturales de la UE, se ha convertido en un problema ambiental importante (ver Tabla 1.1A), fundamentalmente debido a que esta presencia es causada por una incompleta eliminacin en las plantas de tratamiento de aguas residuales urbanas [Quinn et al., 2007; Reemtsma et al., 2006; Hernando et al., 2006; Joss et al., 2005;]. La preocupacin por sus posibles efectos txicos o por su capacidad de trastornar a nivel hormonal tanto a humanos como a animales, ha hecho que su inters en eliminarlos correctamente sea cada vez mayor. La contaminacin por frmacos en el medio ambiente puede atribuirse a mltiples fuentes, como las emisiones en los lugares de produccin, generacin directa de residuos en casas, hospitales y granjas, excrecin humana y animal, entre otras. Al hacer un balance de los frmacos que entran y salen de las plantas de tratamiento de aguas residuales, se revela que muchos no son 10
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eliminados durante el tratamiento [Andreozzi et al., 2003; Ferrer y Thurman, 2003; Ternes et al., 2002]. Los compuestos farmacuticos no suelen ser biodegradables, han sido diseados para ser lipoflicos y biolgicamente persistentes, con objeto de mantener su actividad teraputica hasta que su funcin especfica se haya desarrollado. Estas caractersticas hacen que la preocupacin sobre este tipo de contaminantes sea an mayor. En muchos casos el agua procedente de plantas de tratamiento biolgico es descargada directamente en el medio ambiente (ros, lagos, embalses), lo que al ser aguas superficiales [Kolpin et al., 2002] favorece que el problema se trasmita de forma inmediata. En muchos casos esta agua es utilizada en la produccin de agua potable. De esta manera se obtiene un ciclo donde el agua proveniente de una planta de tratamiento municipal puede ser utilizada a corto plazo para producir agua potable para consumo humano. Debido a que los recursos de agua son limitados y al incremento en la demanda de agua, se hace necesario incrementar y extender la reutilizacin de las aguas residuales [Kosjek, et al., 2007], lo cual lleva aparejado el problema ya comentado. Esto hace, si cabe, ms acuciante el resolver el problema de estas sustancias biorecalcitrantes que se vierten en grandes cantidades hoy en da. En la fabricacin de productos medicinales humanos y veterinarios son utilizados del orden de 3000 diferentes compuestos [Ternes, 2001], lo que representa un amplio rango de estructuras qumicas. Debido a este gran nmero de compuestos, a los que hay que aadir sus correspondientes productos de degradacin, parece casi imposible desarrollar mtodos eficaces de eliminacin para todas estas sustancias y sus metabolitos. Esta situacin se agrava cuando los compuestos son adems de elevada polaridad (muy solubles en agua). En esta situacin, la eliminacin (o retencin mediante adsorcin en los ciclos primarios o en la biomasa) en una planta de tratamiento de aguas convencional es aun menor.
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Todo esto ha hecho que los compuestos farmacuticos hayan sido considerados como un problema solo recientemente (contaminantes emergentes), cuando la implantacin de los tratamientos biolgicos en la UE ha sido generalizada y adems, las tcnicas analticas se han desarrollado para poder detectar la presencia de estos compuestos aguas abajo de las plantas de tratamiento. Tradicionalmente los compuestos polares no eran incluidos en las campaas de monitoreo, lo que resultaba en una severa deficiencia de informacin de la presencia de este tipo de compuestos en el medio ambiente. A este respecto Reemtsma y col. han publicado un estudio reciente sobre el seguimiento de ms de 40 contaminantes polares [Reemtsma et al., 2006], en el cual se establece un ndice con el cual medir la distribucin en el ciclo del agua de este tipo de contaminantes. La herramienta tradicionalmente utilizada para la deteccin, seguimiento y control de contaminantes en agua ha sido la cromatografa de gases acoplada a la espectrometra de masas (GC-MS). Es as que con esta herramienta y los mtodos desarrollados las agencias ambientales encargadas de evaluar y controlar la liberacin de contaminantes en el agua, constituyeron procedimientos estndares de anlisis y establecieron niveles de concentracin. Prueba de ello es que hace aos la Agencia de Proteccin Medio Ambiental de los Estados Unidos (US-EPA) dise una lista de 126 contaminantes, y la Comisin Europea otra de 132 sustancias peligrosas (76/464/CE) utilizando GCMS. Como se ha comentado anteriormente, muchos de los frmacos se caracterizan por ser altamente polares, lo que hace necesario el desarrollo de mtodos de preparacin de las muestras, como son la extraccin o derivacin, para posteriormente analizarse. La utilizacin de GC-MS, para la determinacin de un amplio abanico de sustancias es muy apreciada, por la reproducibilidad de los resultados y por que se cuenta con bases de datos que facilitan la identificacin pero queda limitada para compuestos termolbiles, muy polares, y molculas
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orgnicas de gran tamao. Para este tipo de compuestos orgnicos se utiliza la cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas (LC-MS), utilizada de manera generalizada en campaas de monitoreo solo recientemente. Por ello, muchos de los compuestos incluidos en la Tabla 1.1A y otros solo han podido detectarse, identificarse y cuantificase recientemente [Buser et al., 1999; Buser et al., 1998; Buser y Mller, 1998; Heberer, 2002; Deng et al., 2003; Lindqvist et al., 2005; Richardson, 2003; Weigel et al., 2004A; Joss et al., 2005; PrezEstrada et al., 2005;.Petrovic et al., 2007; Kosjek et al., 2007;.Quinn et al., 2008]. Debido a que los efluentes de las aguas residuales urbanas y los contaminantes en el medio ambiente se han vuelto cada vez ms complejos, la identificacin y cuantificacin de las nuevas sustancias o contaminantes emergentes se podr realizar haciendo uso y desarrollando tcnicas analticas cada vez ms sofisticadas. Los mtodos analticos modernos, que ms adelante se comentarn con detalle, que se utilizan en la determinacin de productos farmacuticos incluyen procesos de extraccin en fase slida (SPE), derivacin, deteccin y confirmacin por MS en tndem [Ternes, 2001], que actualmente es el mtodo preferido en anlisis ambientales [Barcel y Petrovic, 2007], detectores de Triple Cuadrupolo (QqQ), Tiempo de Vuelo (TOF), as como tcnicas hbridas como Cuadrupolo con Trampa de iones Lineal (Qq-LIT) y Cuadrupolo con Tiempo de Vuelo (Qq-TOF). Productos de uso en acuicultura La acuicultura en el Mediterrneo ha sido una industria en continuo crecimiento durante los ltimos 15 aos. Si bien este auge ha sido menor en Espaa, hay claros signos de su incorporacin a esta actividad industrial a un nivel similar a otros pases de esta rea como Grecia [Snchez-Mata et al., 2000]. Sin embargo, la calidad del agua costera y su deterioro es el argumento principal que se esgrime contra la proliferacin de piscifactoras, tanto por los dems sectores industriales usuarios de estas zonas como por autoridades o grupos
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ambientales. En contraste con este hecho, la informacin cientfica existente sobre la interaccin de la acuicultura y el ecosistema marino es limitada, as como de su impacto en las especficas caractersticas del ecosistema mediterrneo, muy diferentes a las de cuencas de ros o incluso a las de zonas martimas de otras latitudes. Es indudable que las piscifactoras producen deshechos biticos y abiticos que se vierten en las columnas de agua donde se instalan. Entre ellos cabe destacar: Compuestos qumicos mayoritarios. En especial compuestos de fsforo y nitrgeno que se adicionan como nutrientes de forma continua o productos del metabolismo de los propios peces, que suponen una importante desviacin de la fluctuacin natural de las columnas de agua. El anlisis, control y seguimiento de los contenidos de fosfatos, nitratos y amonio en la columna de agua y sedimentos de la propia piscifactora y en el entorno es una prctica regular de estas industrias dando su inters en optimizar el suministro de nutrientes. Compuestos qumicos minoritarios. En especial determinados compuestos como plaguicidas y herbicidas, desinfectantes, antibiticos, aditivos alimentarios, etc., que se adicionan de forma voluntaria con fines autorizados. Adems otros compuestos minoritarios se pueden adicionar de forma involuntaria al estar presentes (como impurezas) en los diferentes productos o como aditivos en alimentos necesarios en el proceso industrial y que tengan un importante potencial contaminante que es necesario controlar. Aunque cabe pensar que la dilucin natural en el medio marino de lugar a concentraciones finales de estos compuestos muy bajas, hay que considerar, por un lado, los posibles valores elevados que se pueden alcanzar a escala local (ej: bahas) y los efectos inesperados y negativos que, incluso a baja concentracin, pueden tener a medio-largo plazo. Por las caractersticas
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especficas de muchos de estos compuestos (potencial contaminante, ausencia de control, aplicacin irregular) el conocimiento de su comportamiento en el medio marino es de gran importancia. Los compuestos qumicos usados en la acuicultura marina en Europa se pueden clasificar en tres grandes grupos: desinfectantes, alguicidas y medicamentos veterinarios (ej: antibiticos, anestsicos, parasiticidas, vacunas) [Costello et al., 2001]. Este ltimo grupo ha recibido especial atencin por parte de la UE y su aplicacin est regulada en la ordenanza 2377/90/EEC que establece LMRs autorizados en peces. Entre los medicamentos regulados se encuentran sulfamidas, trimetoprim, betalactmicos (como la penicilina) y cefalosporinas, macrolidos, aminoglicsidos y tetraciclinas. Si bien existen LMRs fijados en peces para algunos de estos compuestos, estando otros en proceso de revisin, no existe normativa especfica en lo que se refiere a tolerancias de compuestos orgnicos en los vertidos de industrias acucolas en el medio ambiente marino. Al empleo de medicamentos hemos de aadir el de otros compuestos como alguicidas o desinfectantes que tambin suponen un aporte de compuestos txicos al medio ambiente, o el de otros compuestos como aditivos alimentarios (etoxiquina), fungicidas y otros usos (verde malaquita), sustancias inductoras de la maduracin del sistema digestivo (espermina), etc. (http://www.fao.org/docrep/005/y7300s/y7300s06a.htm). La mayor parte de los estudios de control realizados por las propias piscifactoras o por agencias medioambientales responsables de la supervisin de la actividad acucola y su impacto en el medio ambiente, se refieren a la descarga de nutrientes (en especial fsforo y nitrgeno), crecimiento de microalgas, biotoxinas, y otros parmetros caractersticos de las aguas, pero no as de la presencia de estos contaminantes orgnicos, de ah que no exista
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Introduccin
informacin suficiente relativa al uso, comportamiento e impacto ambiental de estas sustancias a escala europea.
1.4 Comportamiento de los contaminantes en el medio ambiente acutico: Estudios de degradacin fotoqumica.
Una vez que los compuestos orgnicos procedentes de diversas fuentes alcanzan el medio ambiente acutico son susceptibles de sufrir procesos biticos o abiticos de degradacin. Ambos procesos son responsables del destino y eliminacin de estos compuestos en el medio. Para algunos compuestos, las transformaciones abiticas pueden tener lugar mediante hidrlisis o fotlisis. Los frmacos, en general, estn diseados para su ingesta va oral y, como regla general suelen ser resistentes a la hidrlisis, por lo que la fotlisis, tanto directa como indirecta, puede considerarse como la principal ruta de degradacin de estos compuestos en aguas superficiales. Mientras que la fotlisis directa tiene lugar por la absorcin directa de la radiacin solar [Zepp y Cline, 1977] en la fotlisis indirecta estn involucradas especies naturales fotosensibles (nitratos, cidos hmicos) que bajo el efecto de la radiacin solar pueden generar especies altamente oxidantes como los radicales hidroxilo u oxigeno singlete. El conocimiento de estos procesos de degradacin y de las variables que los afectan es esencial para el conocimiento del comportamiento de los contaminantes en las aguas naturales. Por otro lado, durante estos procesos se generan productos de degradacin que pueden ser ms txicos y persistentes que los compuestos de partida [Mezcua et al., 2004]. En consecuencia es necesario realizar una evaluacin de los mismos para, en caso de ser necesario, determinar qu nuevos compuestos habr que incluir en los sistemas de vigilancia. La necesidad de realizar estudios de degradacin fotoqumica de los contaminantes presentes en las aguas superficiales ha sido evidenciada por
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Tesis Doctoral
Introduccin
diversos autores y se prev que en el futuro sea un rea de investigacin creciente [Boreen et al., 2003]. Sin embargo, la realizacin de estos estudios requiere de un adecuado diseo experimental [OECD, 2000. Guidance document for testing of chemicals. Phototransformation of Chemicals in water. Direct and indirect photolysis] y del empleo posterior de tcnicas analticas, sensibles y especficas y que permitan la identificacin de los productos de degradacin, como la espectrometra de masas [Agera y Fernndez-Alba, 1998; Malato et al., 2003; Agera et al., 2000]. Es evidente que tanto la introduccin de contaminantes orgnicos como la formacin de sus productos de degradacin puede alterar o empobrecer la biodiversidad y los recursos genticos de los ecosistemas en las aguas naturales a travs de la alteracin de la cadena trfica, como consecuencia de los efectos nocivos que pueden tener sobre las diferentes especies que la componen. Existe abundante informacin sobre el impacto ambiental de derivados del petrleo o de las sustancias consideradas prioritarias [GESAMP, 1990; Shahidul y Tanaka, 2004], sin embargo, esta informacin es limitada para contaminantes emergentes como los frmacos o compuestos orgnicos utilizados en actividades acucolas [Costello et al., 2001]. Para predecir realmente los supuestos efectos txicos son necesarios datos sobre cantidades, procesos de degradacin, persistencia y distribucin de estas sustancias txicas o de sus productos de transformacin. Ante la escasez de informacin al respecto, es necesario realizar investigaciones que permitan avanzar en el conocimiento de los peligros mediante estudios de toxicidad que permitan hacer una evaluacin adecuada de las repercusiones de los mismos y en especial de los productos de transformacin generados, para los que existe un total desconocimiento. Algunos de los resultados presentados en esta memoria son parte de un proyecto ms amplio destinado a la evaluacin del impacto de la acuicultura en el medio marino.
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1.5 Descontaminacin de aguas mediante procesos de oxidacin avanzada

El objetivo de cualquier tratamiento de contaminantes en agua es siempre el mismo: eliminar ciertos contaminantes, normalmente mezclas complejas de compuestos orgnicos e inorgnicos, presentes en un efluente de tal manera que una vez tratado cumpla las especificaciones de vertido determinadas por el organismo competente. Los procesos y tecnologas de que se dispone en la actualidad para el tratamiento de contaminantes en agua son muy diversos [Sawyer et al., 2003]. Las tcnicas de tratamiento de residuos en agua que se usan con ms frecuencia en la actualidad se pueden dividir en tres grandes grupos: tratamientos fsicos, qumicos y biolgicos. Como norma general, los diferentes tratamientos existentes se dividen en los siguientes grupos generales: Tratamientos naturales: Estos sistemas de tratamiento no suelen ser muy utilizados en el caso de aguas residuales con contaminantes difcilmente biodegradables, debiendo tener los vertidos de partida unas condiciones comparables a los urbanos. Sin embargo son muy utilizados debido a su bajo coste y su naturaleza ecolgica. Entre ellos estn el Filtro Verde y el Lagunaje. Tratamientos primarios: Se incluyen en este grupo aquellos procesos o conjunto de procesos que tienen como misin la separacin por medios fsicos de partculas en suspensin que existan en el agua a tratar. Estamos hablando de procesos como: la Decantacin, Homogeneizacin, Cribado o filtrado, Coagulacin Floculacin, Precipitacin y Neutralizacin. Tratamientos secundarios: Fundamentalmente consisten en procesos biolgicos empleados para degradar la materia orgnica biodegradable. Pueden agruparse en dos grandes grupos: los procesos Aerobios y Anaerobios.
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Tratamientos terciarios: Tradicionalmente se han considerado los tratamientos terciarios como procesos de afino para sustraer los contaminantes que no han podido ser eliminados en las fases de tratamiento anteriores. Adems, los tratamientos terciarios a utilizar dependan mucho del uso posterior que iba a hacer del agua ya depurada. Sin embargo en la actualidad esto ya no es as y los tratamientos terciarios se han generalizado y, en el caso de las aguas con contaminantes persistentes y no biodegradables, muchas veces es el nico que se realiza ya que se trata, normalmente, de eliminar contaminantes muy especficos. Se suelen incluir procesos como: adsorcin, intercambio Stripping, inico, ultrafiltracin, smosis de inversa, oxidacin electrodilisis, desinfeccin, procesos
convencionales y procesos de oxidacin avanzada. En aguas urbanas, se suele utilizar nicamente los tratamientos primarios y secundarios, con los que se logra reducir en gran medida la contaminacin de los efluentes, pero con los cuales generalmente no se cumple la normativa que se est proponiendo hoy en da (basndose en la WFD), cada vez ms estricta como se ha comentado anteriormente. La tendencia es hacia la utilizacin cada vez mayor de tratamientos terciarios, tanto para cumplir la normativa, como para lograr un reciclado cada vez mayor del agua utilizada, que es el gran objetivo del futuro. Los procesos de oxidacin avanzada (Advanced Oxidation Processes, AOPs) posiblemente constituyan en un futuro prximo uno de los recursos tecnolgicos ms utilizados en el tratamiento de aguas contaminadas con productos orgnicos, que no son tratables mediante tcnicas convencionales debido a su elevada estabilidad qumica y/o baja biodegrabilidad, De hecho, los congresos y conferencias en este campo son cada vez ms numerosos:
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Introduccin
Environmental Applications of advanced oxidation processes (EAAOP-1). Chania, Crete, 7-9 Sept. 2006. 2nd Int. Conf. on Semiconductor Photochemistry (SP-2). Aberdeen, UK 2335 July 2007. The 12th International Conference on TiO2 Photocatalysis: Fundamentals & Applications - The 13th International Conference on Advanced Oxidation Technologies for Treatment of Water, Air and Soil, Conference CenterNiagara Falls, New York, USA, September 24-27, 2007.
5th
European
Meeting
on
Solar
Chemistry
and
th
Photocatalysis:
Environmental Applications, Palermo, Italy. October 4 8th 2008.). En el futuro cercano los AOPs podran convertirse en la tecnologa de tratamiento de agua mas utilizada para estos contaminantes [Gogate y Pandit, 2004A, 2004B; Pera-Titus et al., 2004; Malato et al., 2007]. La eficacia de estos procesos se basa en que se generan radicales hidroxilo (OH), los oxidantes ms fuertes despus del fluoruro, los cuales tienen un como caracterstica el no ser selectivos, siendo capaces de oxidar todo tipo de estructuras y enlaces qumicos. Otra ventaja es que la produccin de OH por medio de AOPs puede ser muy diversa, adaptndose con cierta sencillez a los requerimientos de un tratamiento especfico [Malato et al., 2007]. La desventaja de los AOPs es que suele ser un tratamiento caro frente a los tratamientos convencionales, por el uso de fuentes de radiacin y/o de reactivos caros (ver tabla 1.2). Por ello es que debe estudiarse con detalle cuando es preciso aplicar un AOP y no un tratamiento convencional. Existe sin embargo una ventaja de estos tratamientos respecto a muchos de los habituales hoy en da, como es que algunos AOPs precisan un aporte de energa que puede realizarse mediante radiacin solar. Debido a esto la investigacin cada vez se enfoca ms en los que se puedan llevar a cabo por medio de la radiacin solar, como son principalmente el proceso de foto-Fenton y la catlisis heterognea con TiO2.
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Tabla 1.2: Algunos de los AOPs ms conocidos. Fotoqumicos No Fotoqumicos Fotlisis directa Ozonizacin Fotlisis en el ultravioleta de vaco (UVV) UV / H2O2 UV / O3 Foto-Fenton (Fe
+2/+3
O3/OHO3/H2O2
Reaccin de Fenton (Fe+2/+3/H2O2) Oxidacin electroqumica Tratamiento con haces de electrones
/H2O2/UV)
Plasma no trmico Ultrasonidos
Fotocatlisis Heterognea (TiO2/UV)
Las ventajas de los AOPs, frente a los tratamientos tradicionales se pueden resumir en: El contaminante se transforma qumicamente, a diferencia de los sistemas de separacin del agua de los contaminantes. Se puede obtener una mineralizacin completa del contaminante. No se generan fangos que requieran un tratamiento posterior. Son de mucha utilidad frente a contaminantes txicos y/o nobiodegradables. Funcionan en el tratamiento de contaminantes hasta muy bajas concentraciones (g/L).
1.5.1 Fotocatlisis mediante TiO2 La fotocatlisis est basada en que el catalizador es sensible a la luz, por tanto es la aceleracin de una transformacin fotoqumica por la accin de un catalizador. La mayora de los fotocatalizadores utilizados hasta ahora suelen ser xidos de metales semiconductores, los que se caracterizan por tener una
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Introduccin
banda prohibida que se extiende desde la banda de valencia, rica en electrones, hasta la banda de conduccin, con vacantes. Cuando el catalizador recibe la energa de un fotn (hv) se produce la excitacin de un electrn en el catalizador y ste gana la suficiente energa para cambiar de nivel, de la banda de valencia a la banda de conduccin (figura 1.1). Al mismo tiempo se forma una vacante, un hueco, para cada electrn que abandona la banda de valencia. Estas dos especies que forman un par electrn-hueco de electrn viajan a la superficie del catalizador, donde se pueden recombinar o participar en reacciones redox con las sustancias adsorbidas en la superficie del catalizador [Malato et al., 2007; Dalrymple, 2007; Herrmann, 1999a, 1999b, 2005]. Si esta interaccin se realiza en un ambiente acuoso se producirn radicales
OH. Las propiedades qumicas de adsorcin del sustrato y las condiciones de la
reaccin qumica determinarn en gran medida el mecanismo de reaccin que predominar. Otras especies reactivas que se forman incluyen al radical superxido (O2), que resulta de la reaccin con oxgeno. En la fotocatlisis se han utilizado diversos materiales como xido de zinc (ZnO), sulfuro de zinc (ZnS), xido frrico (Fe2O3), xido de estao (SnO2), sulfuro de cadmio (CdS), entre otros, sin embargo despus de dos dcadas el ms utilizado es el TiO2, considerado como referencia cuando se plantea el uso de materiales nuevos susceptibles de ser fotocatalizadores [Dalrymple et al., 2007].
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Figura 1.1: Representacin de proceso fotocataltico heterogneo en una partcula de catalizador TiO2. Las evidencias han demostrado que los radicales OH son los principales causantes de las reacciones de oxidacin de contaminantes orgnicos mediante la ruptura progresiva de sus enlaces (ver estas reacciones en la seccin dedicada a Fenton y foto-Fenton). Se ha demostrado la descomposicin total de compuestos orgnicos simples y complejos (halogenados, derivados de alcanos, alquenos, cidos carboxlicos y sustancias aromticas, etc.) mediante fotocatlisis heterognea. En compuestos aromticos, por ejemplo, se produce la hidroxilacin de la parte aromtica y sucesivos pasos de oxidacin / adicin llevan a la apertura del anillo. Los aldehdos y cidos carboxlicos resultantes son descarboxilados y finalmente producen CO2. Hay que tener en cuenta que, al tratarse de un proceso de oxidacin-reduccin, se puede usar tambin la va reductiva. Un ejemplo puede ser la reduccin mediante fotocatlisis de metales (como es el caso de Cr6+ a Cr3+), de forma simultnea a la oxidacin de compuestos orgnicos. Durante la ltima dcada, el nmero de referencias y
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patentes publicadas sobre tratamiento de sustancias txicas y peligrosas en agua y aire mediante fotocatlisis puede ser contado por miles. El nmero de compuestos que se han ensayado mediante fotocatlisis con TiO2 tambin puede ser contado por centenares. Adems, resulta notable que el nmero de publicaciones realizadas sobre este tema se haya ido incrementando de forma continua durante los ltimos aos (ver figura 1.2). Sin embargo, la gran mayora de las experiencias realizadas hasta la fecha, lo han sido en el mbito de laboratorio y utilizando lmparas para la generacin de los fotones necesarios. Hasta hoy solo se observa en una sustancia orgnica la ausencia de mineralizacin total. Los pesticidas basados en una estructura triacnica (atracina, simacina, etc.) se transforman nicamente hasta 1,3,5-triacina-2,4,6, trihidroxi (cido cianurico) [Hincapi et al., 2005], sin producirse la mineralizacin completa.
1000 900 Nmero de publicaciones 800 700 600 500 400 300 200 100 0 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Ao
70 116 133 239 318 416 502 489 527 717
Figura 1.2: Referencias publicadas entre 1998 y 2007 relacionadas con el proceso de fotocatlisis mediante TiO2. Fuente: www.scopus.com.
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1.5.2 FotoFenton A finales del siglo XIX H. J. H. Fenton [Fenton, 1894] describi una reaccin en medio acuoso en la que degradaba cido tartrico al combinar sales de Fe2+ disueltas en agua con H2O2, debido a la produccin de radicales hidroxilo. Posteriormente esta reaccin tom el nombre de su descubridor. Sin embargo solo hasta la segunda mitad del siglo XX [Walling, 1975] ha empezado a discutirse la aplicacin de la reaccin Fenton en el tratamiento de aguas residuales. La reaccin Fenton, reacciones (1.1) y (1.2), es de reactivo limitante, por tanto cuando el H2O2 se agota la reaccin prcticamente se detiene. La regeneracin de hierro, reaccin (1.2), es mucho ms lenta que la reaccin inicial, reaccin (1.1). Al utilizar radiacin UV-VIS, la reaccin Fenton se mejora enormemente, ya que acelera la regeneracin de hierro ferroso, a partir de diferentes complejos de hierro, como se muestra en las reacciones (1.3 1.6) [Ruppert et al., 1993; Pignatello, 1992], donde L es un ligando orgnico.
Fe 2+ + H 2 O2 Fe 3+ + OH + OH Fe 3+ + H 2 O2 Fe 2+ + HO2 + H + FeOH 2+ hv Fe 2+ + HO
(1.1) (1.2) (1.3) (1.4) (1.5) (1.6)
[ Fe 3+ L] hv [ Fe 3+ L] Fe 2+ + *L
[ Fe 3+ (OH ) x ( H 2O) y ] hv Fe 2+ + ( x 1)OH + yH 2 O + OH [ Fe 3+ ( RCO2 )] hv Fe 2+ + R + CO2
Cuando el proceso Fenton se desarrolla en un sistema donde estn presentes sustancias orgnicas, stas reaccionan en muchas maneras con los radicales hidroxilo. Las siguientes reacciones han sido reportadas para diferentes sustratos orgnicos [Haag et al., 1992; Legrini et al., 1993]:
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Introduccin
Abstraccin de hidrgeno de tomos de carbono aliftico:
OH + RH R + H 2 O
(1.7)
Adicin electroflica en dobles enlaces de anillos aromticos:
R CH = CH 2 + OH R C H CH 2 OH
Reacciones de transferencia de electrones:
(1.8)
OH + RX RX + + OH
(1.9)
En el caso de contaminantes aromticos el anillo normalmente es hidroxilado antes de su ruptura durante el proceso de oxidacin. Las sustancias que contienen estructuras del tipo quinona e hidroquinona son tpicamente productos intermedios de degradacin. Este tipo de estructuras se producen por reacciones como (1.10) y (1.11)
OH OH OH
+
OH OH OH
(1.10)
O2
+
OH OH
HO2
(1.11)
Estas especies proporcionan una ruta ms rpida para la regeneracin del hierro ferroso, por medio de las reacciones (1.12) y (1.13), con lo que aceleran el proceso:
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Introduccin
OH
O Fe
2+
Fe
3+
+
OH
+
OH O
(1.12)
O Fe
3+
+
OH
Fe
2+
+
O
(1.13)
Las estructuras benzoquinnicas resultantes pueden a su vez reducirse (1.14). Por tanto cada molcula puede reducir varios iones Fe3+ en un ciclo cataltico. Sin embargo este ciclo cataltico llega a su fin cuando se abre el anillo de las especies quinnicas, lo que conduce a la mineralizacin de la molcula [Chen y Pignatello, 1997].
O OH OH O
+
O OH OH
+
OH
(1.14)
Cuando el objetivo es la mineralizacin total solo con el proceso Fenton, se muestra su limitacin en la degradacin de intermedios carboxlicos, ya que con este sistema stos no pueden ser degradados. Se sabe que los cidos carboxlicos y dicarboxlicos forman complejos estables con el hierro, lo que inhibe la reaccin con el perxido [Kavitha y Palanivelu, 2004]. Esta limitacin no existe cuando se utiliza foto-Fenton.
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Introduccin
El nmero de compuestos que se han ensayado mediante foto-Fenton tambin es numeroso, pero mucho menor que mediante TiO2, sobretodo porque su utilizacin en el tratamiento de aguas contaminadas es mucho ms reciente. En todo caso, el nmero de publicaciones realizadas sobre este tema se haya ido incrementando de forma continua durante los ltimos aos (figura 1.3).
150 125 100 75 50 25 0 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Ao
23 14 25 23 45 39 69 53 95 115
Figura 1.3: Referencias publicadas entre 1998 y 2007 relacionadas con el proceso de foto-Fenton. Fuente: www.scopus.com.
1.6 Reactores fotocatalticos solares

La fotocatlisis heterognea y el proceso foto-Fenton son de gran inters ya que se pueden llevar a cabo utilizando radiacin solar, lo que representa una mejora al proceso, no solo en trminos del coste del tratamiento de agua, sino tambin en la sostenibilidad del mismo al evitar el uso de energa elctrica. Los experimentos de foto-Fenton mostrados en este trabajo fueron realizados en captadores parablicos compuestos (CPCs) en la Plataforma Solar de Almera (PSA). Los CPCs son captadores estticos con una superficie formada por dos
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Nmero de publicaciones
Tesis Doctoral
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espejos parablicos conectados, con un tubo absorbedor en el foco (figura 1.4), y se ha encontrado que proporcionan la mejor ptica para sistemas de baja concentracin [Muschaweck et al., 2000]. Estos colectores no tienen sistema de seguimiento solar y su diseo permite que todos los rayos solares sean reflejados en el foco (absorbedor) y utilizando una baja concentracin solar. Debido a este diseo, casi toda la radiacin UV (directa y difusa) que llega a la apertura del CPC puede ser captada y estar disponible para el proceso en el reactor. La radiacin reflejada por el CPC es tambin distribuida en la parte trasera del fotoreactor tubular. Todos estos factores contribuyen a que el CPC tenga un desempeo excelente en aplicaciones fotoqumicas y fotocatalticas [Ajona y Vidal, 2000; Anderozzi, 1999; Herrmann, 1999a y 1999b; Malato et al., 2004; Pera-Titus et al., 2004; Malato et al., 2007].
1 2 a)
1. Tubo absorbedor 2. Superficie reflectante
b)
Figura 1.4. Esquema de un Captador Parablico Compuesto, y como refleja la radiacin solar que llega en diferentes ngulos de incidencia. La mayora de los componentes de un reactor fotocataltico solar estn hechos de materiales estndares, sin requerimientos especiales, excepto para el reactor y la superficie reflectiva. Los reactores fotocatalticos deben contener el fluido de
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Introduccin
trabajo, incluyendo al catalizador, y deben transmitir la luz UV solar eficientemente, adems deben permitir fluir el lquido de trabajo con la mnima presin a travs del sistema. Deben tambin tener buena transferencia de materia desde la corriente de fluido a catalizador. Se debe asegurar una adecuada distribucin del flujo dentro del reactor, ya que una distribucin no uniforme conlleva unos tiempos de residencia no uniformes dentro del reactor. La eleccin de materiales transparentes a la luz UV y resistentes a su efecto destructivo es limitada. Las temperaturas dentro del fotorreactor pueden alcanzar fcilmente los 40-50 C. Adems, el material del reactor debe ser inerte y resistente a pH altos y bajos. El cuarzo tiene una excelente transmisin UV, y es resistente a la temperatura y a los reactivos, pero su alto coste lo hace completamente inviable. Los fluoropolmeros son una buena eleccin ya que tienen una buena transmitancia UV y es qumicamente inerte [Malato et al., 2002.]. Una de sus mayores desventajas es que, para alcanzar una resistencia razonable a la presin, el grosor de la pared de un tubo de fluoropolmero debe incrementarse, lo cual hace disminuir su transmitancia UV. El vidrio es la eleccin lgica para los fotorreactores. El vidrio borosilicatado de bajo contenido en hierro tiene buenas propiedades transmisivas del espectro solar con un lmite inferior a unos 285 nm, y por tanto, parece ser el ms adecuado [Malato et al., 2002]. Dos efectos indeseables reducen la eficacia del reactor de vidrio para los propsitos de fotocatlisis solar: (i) la absorcin por parte del hierro contenido en el vidrio en el rango UV solar entre 300 y 400 nm; (ii) un decrecimiento adicional de la transmisividad UV durante la operacin debido al impacto perjudicial de la radiacin solar (solarizacin UV) [Blanco et al., 2000]. Ambos efectos son causados por cambios de valencia de los cationes de metales de transicin contenidos en el vidrio, fundamentalmente el hierro. El efecto de los iones de hierro en el vidrio es especialmente daino, ya que los iones Fe2+ son oxidados a Fe3+ por fotones de longitudes de onda menores de 400 nm. Adems, Fe3+ absorbe en el UV.
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Tesis Doctoral
Introduccin
Los requisitos para la calidad ptica de superficies reflectivas en aplicaciones solares estn normalmente relacionados con la captacin de la radiacin solar. El aluminio es la mejor opcin debido a su bajo coste y su alta reflectividad. La superficie reflectiva ideal para aplicaciones fotocatalticas solares debe tener alta reflectividad UV, resistencia a la intemperie adecuada para un largo tiempo de vida y un precio razonable. Las superficies actualmente disponibles que mejor cumplen estos requerimientos son de aluminio anodizado electropulido [Ajona y Vidal, 2000]. Los colectores solares (tipo CPC) utilizados en esta Tesis Doctoral son descritos con detalle en la seccin 2.2.1 del captulo Experimental.
1.7 Evaluacin analtica de los procesos de degradacin y tcnicas analticas aplicadas a la identificacin de productos de transformacin y degradacin.
En todo proceso de degradacin fotoqumica de contaminantes orgnicos en agua es necesario conocer en cada momento el grado de eliminacin y/o mineralizacin del compuesto objetivo. Esta informacin se obtiene a partir de anlisis qumicos que permitan conocer la cantidad de Carbono Orgnico Total (COT), la concentracin del compuesto objetivo y la aparicin de iones inorgnicos procedentes de los heterotomos contenidos en las molculas orgnicas. Asimismo, una completa caracterizacin de los procesos de degradacin requiere la identificacin de los principales productos de transformacin generados en el transcurso de los mismos, en especial en el caso de procesos fotolticos, as como de los cidos carboxlicos de cadena corta generados como paso previo a la mineralizacin. A continuacin detallaremos el inters de cada una de estas medidas y las tcnicas analticas empleadas en su determinacin.
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Introduccin
1.7.1 Carbono Orgnico Total (COT) La medida del COT representa, como su nombre indica, el contenido total de carbono de los compuestos orgnicos presentes en un agua, siendo por tanto indicativo del nivel de contaminacin orgnica de sta. Dentro del COT nos podemos encontrar con diversas fracciones de carbono. El Carbono Orgnico Disuelto (COD), es la medida ms habitual y representa el contenido de compuestos orgnicos disueltos en una muestra acuosa (muestra filtrada). El seguimiento del COD es prctica habitual en los procesos de degradacin ya que es una medida del grado de mineralizacin alcanzado en cada momento del proceso. Cuando el estudio de degradacin parte de una disolucin de un compuesto puro, el valor medido de COD permite informar acerca de la formacin de productos de transformacin. Tal es el caso que se muestra en la figura 1.5 para la degradacin del plaguicida pirimetanil mediante fotocatlisis con TiO2. Puede observarse como una vez que el pirimetanil se ha degradado por completo, tras 250 min de tratamiento, el valor del COD se mantiene an elevado, indicando la presencia de PTs en la mezcla de reaccin. Dado que los PTs pueden ser en muchos casos ms txicos y peligrosos que el producto de partida, el conocimiento del grado de mineralizacin alcanzado durante los procesos de degradacin es de gran inters. La medida de COD puede englobar multitud de compuestos que se forman durante el proceso de degradacin y que se derivan del compuesto original. La caracterizacin de estas mezclas de reaccin no es una tarea fcil, por lo que el disponer de un parmetro global como el COD es de gran utilidad para la evaluacin del proceso, sobre todo cuando se tiene una mezcla de diferentes sustancias que se desean degradar o cuando la degradacin se realiza en una matriz compleja como aguas residuales o industriales.
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Tesis Doctoral
Introduccin
60 60 Concentracin, mg/L Concentracin (mg/L) 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 Evolucin del COD
PDs PTs
200 200 400 400 600 600 800 800 1000 1000
0 Desaparicin 0 Pirimetanil Desaparicin Pirimetanil
Tiempo (min) min tiempo,
Figura 1.5: Evolucin del COD y de la concentracin del plaguicida pirimetanil en el transcurso de un experimento de degradacin mediante fotocatlisis con TiO2. [Agera et al., 2000] Como se ha comentado, el acoplamiento de sistemas biolgicos con procesos de oxidacin avanzada se realiza con objeto de disminuir costes. En este caso, resulta de mucha utilidad el seguimiento del COD ya que representa la cantidad de materia orgnica que los microorganismos tendrn disponible para su alimentacin. En los procesos de oxidacin avanzada el COD puede llegar a disminuir hasta valores cercanos a cero [Prez-Estrada et al., 2005, 2007; Malato et al., 2001, 2003b; Maldonado et al., 2006], indicando que en su mayora el carbono orgnico se ha oxidado formado CO2, con lo cual se puede asegurar una descarga segura del agua tratada en el medio ambiente. La cuantificacin de los productos de degradacin presentes en los ltimos estadios del proceso, principalmente cidos orgnicos de cadena corta (actico, frmico, etc.) permitira, de ser posible, cerrar el balance del carbono en este tipo de procesos.
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Introduccin
En estudios de degradacin fotoltica, la desaparicin del COD es inusual debido a que la energa de los fotones contenidos en el espectro solar no es suficiente para mineralizar los compuestos por si mismos.
1.7.2 Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC) La cromatografa lquida de alta resolucin con detector ultravioleta (HPLC-UV) es una tcnica ampliamente utilizada para el seguimiento de procesos de degradacin de contaminantes orgnicos. Esto se debe a su gran sensibilidad y exactitud en determinaciones cuantitativas y a su especial capacidad para la separacin de compuestos polares, no voltiles y termolbiles, lo que la hace, aplicable a un gran nmero de contaminantes ambientales de inters. La utilizacin de HPLC con detector UV-VIS permite un fcil y rpido seguimiento de la cintica de degradacin de uno o varios compuestos. Las muestras, generalmente en disolucin acuosa, pueden ser inyectadas directamente sin necesidad de complejos procesos de pretratamiento de las mismas que puedan alterar su composicin. Tan slo es recomendable una dilucin de la muestra con el disolvente orgnico utilizado en la fase mvil, por lo general metanol o acetonitrilo, y su posterior filtracin a travs de filtros de 0.22
m. La adicin del disolvente orgnico, adems de mejorar las caractersticas

del anlisis, pretende un doble efecto, asegurar la disolucin de cualquier partcula precipitada en la solucin o adsorbida en el catalizador, en el caso de tratamientos con TiO2, y la detencin de la reaccin fotocataltica mediante el llamado efecto quenching, lo cual es especialmente importante en experimentos con foto-Fenton, en los que pueden ocurrir reacciones en la oscuridad despus de tomar la muestra del reactor.
Para el estudio de cinticas de degradacin la HPLC-UV es una herramienta fundamental, ya que adems de poderle dar seguimiento a sustancias
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Tesis Doctoral
Introduccin
especficas, como el compuesto objeto de estudio y/o algunos productos de transformacin conocidos, la informacin que proporciona es una base para anlisis ms especficos. Es de esperar que si se estudia la degradacin de una sustancia en particular deba coincidir la desaparicin de sta con la formacin de productos de degradacin que, aunque no puedan ser identificados, puedan revelarse como productos mayoritarios y por tanto indicadores de las principales rutas de degradacin. Esta tcnica analtica es de gran utilidad por su modularidad. De especial inters es la posibilidad de conectarla a un colector de fracciones ya que con l se pueden separar cada uno de los componentes de una muestra y posteriormente realizar diferentes anlisis. Para la identificacin de los productos de degradacin de alto peso molecular, el empleo de detectores UV no proporciona informacin estructural suficiente para la identificacin. Uno de los detectores que se utilizan en LC para este fin son los espectrmetros de masas. Esta tcnica analtica nos da informacin especfica de las molculas contenidas en una muestra. La espectrometra de masas es una tcnica sofisticada, ms adelante se habla de ella detalladamente.
1.7.3 Cromatografa Inica (CI) La CI es un tipo de cromatografa lquida basado en el intercambio selectivo de los componentes inicos de la muestra con contraiones presentes en la fase estacionaria. Actualmente, esta tcnica se ha convertido en uno de los mtodos ms importantes para el anlisis de trazas de aniones y cationes. Su rpido desarrollo y su capacidad y facilidad operativa han hecho que su gama de aplicaciones se haya ampliado a los aniones de cidos orgnicos, metales y azcares y carbohidratos. En los procesos de degradacin los compuestos orgnicos se transforman en CO2, H2O y los cidos (o sales) minerales correspondientes que provienen de
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Introduccin
los heterotomos contenidos en las molculas orgnicas. La deteccin y cuantificacin de los correspondientes iones inorgnicos (F-, Cl-, Br-, NO2-, NO3-, SO4=, PO33-) permite realizar un seguimiento del proceso de degradacin y aporta informacin acerca de la naturaleza de los intermedios generados. Igualmente, esta tcnica es til para la determinacin de aniones de cidos orgnicos (Acetato, Glicolato, Formiato, Piruvato, Propianoato, Oxalato, Maleato) que se generan normalmente en las ltimas etapas del proceso, y que en ocasiones son responsables del COD residual en procesos de degradacin. Un ejemplo de la utilidad de esta tcnica se muestra en la figura.1.6 en la que se representa el seguimiento de la degradacin del plaguicida imidacloprid mediante foto-Fenton y fotocatlisis con TiO2. Es apreciable (figura 1.6a) como la concentracin de iones cloruro aumenta conforme disminuye la concentracin de imidacloprid en la disolucin. Sin embargo, en ambos tratamientos, la desaparicin de imidacloprid no coincide con la mxima liberacin de cloruros a la disolucin, lo que significa que en este punto no se ha alcanzado la total mineralizacin y aun permanecen en disolucin productos de transformacin clorados, poniendo de manifiesto la mayor estabilidad de esta parte de la estructura. Asimismo, en el tratamiento con foto-Fenton (figura 1.6b) se observa como el mximo de concentracin detectado para los iones de cidos orgnicos aparece a tiempos de tratamiento elevados, revelando la formacin de cidos orgnicos como una de las etapas finales del proceso previas a la total mineralizacin.
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Introduccin
8 7
100
200
300
400
500 7.5
5.0
100
200
300
400
500 5.0 4.0 3.0
Iones orgnicos (mg/L)
Cl- (mg/L)
6 5 4 3 2 1 0
Cloruros
Cloruros
5.0
4.0 3.0 2.0 1.0 0.0
Acetato
Desaparicin de Imidacloprid
2.5
Formiato Oxalato
0 100 200 300
2.0
(a)
300 400 0.0 500
(b)
1.0 0.0 500
100
200
t30w (min)
N N Cl CH 2 N N H NO 2
400
t30W(min)
PTs
R-COOH
CO2 + H2O
Figura 1.6: Seguimiento de la formacin de cloruros y aniones de cidos orgnicos durante la degradacin del plaguicida imidacloprid mediante fotoFenton (smbolos huecos) y fotocatlisis con TiO2 (smbolos slidos) [Malato et al., 2001]
1.7.4 Tcnicas analticas aplicadas a la identificacin de productos de transformacin La determinacin analtica, cuantitativa y cualitativa, de los productos de transformacin (PTs) es una tarea que tiene una gran dificultad, y requiere de la aplicacin de tcnicas sofisticadas como la espectrometra de masas (MS), generalmente acoplada a equipos de cromatografa de lquidos (LC) o gases (GC), la espectroscopa de resonancia magntica nuclear (RMN); la espectroscopa de infrarrojos con transformada de Fourier (FT-IR) [Amalric et al., 1995]. En la evaluacin analtica de un proceso de degradacin se tienen que superar algunas dificultades como:
La formacin de un gran nmero de compuestos impredecibles que complican la separacin y, en consecuencia, la identificacin. Las diferentes propiedades fsico-qumicas de los PTs, que dificulta su determinacin con solo un procedimiento analtico o de extraccin.
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Introduccin
La ausencia, en muchos casos, de estndares comerciales para confirmar la identidad de los PTs.
Estas dificultades hacen necesaria la utilizacin de ms de una tcnica analtica que proporcionen informacin complementaria, para evaluar lo ms completamente posible el proceso. Una etapa importante en este tipo de estudios es la seleccin del procedimiento para la preparacin de las muestras. El anlisis de productos de degradacin e identificacin de los mismos, normalmente se realiza a niveles de mg/L o en muchos casos inferiores, debido a esto es necesario preparar o pre-concentrar la muestra que se va a introducir en los equipos de espectrometra de masas. Preparacin de muestras La extraccin lquido lquido (LLE) es un proceso comn utilizado en el tratamiento de muestras acuosas por su simplicidad y porque no requiere de material de laboratorio especial ni costoso. Sin embargo, con esta tcnica de extraccin se pueden perder algunos compuestos altamente polares, se consumen grandes volmenes de disolventes orgnicos, se generan importantes interferencias de matriz, y en ocasiones se pueden formar emulsiones difciles de romper [Chiron et al., 1998; Richardson et al., 1996]. stos y otros inconvenientes hacen que la LLE est cada vez ms en desuso. Una alternativa eficaz a la tradicional LLE es la extraccin en fase slida (SPE) que, en los ltimos aos, se ha convertido en la tcnica de eleccin para el anlisis de contaminantes orgnicos en muestras acuosas, especialmente por su eficacia para la extraccin de analitos polares y por el menor consumo de disolvente requerido. El desarrollo de nuevos adsorbentes utilizados en las minicolumnas de extraccin en fase slida, que permiten separar los PTs de la muestra en un rango de polaridades cada vez ms amplio, ha hecho que el uso de la SPE haya ganado preferencia sobre el uso de LLE. Existe en el mercado una amplia gama
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Introduccin
de adsorbentes, como las slicas enlazadas qumicamente con cadenas alqulicas (C-18, C-8, CN), polmeros porosos (estireno-divinilbenceno, PRP-1 o PLRP-S), carbn modificado (PGC) o adsorbentes de intercambio inico, entre otros. Estos materiales poseen diferentes propiedades y su comportamiento, en lo referente a capacidad y volumen de rotura, vara en funcin de los compuestos a analizar. Esto nos permite seleccionar adsorbentes adecuados para la determinacin de analitos dentro de un mayor rango de polaridades y caractersticas fsico-qumicas. Recientemente, el empleo de adsorbentes de balance hidroflico lipoflico, como el Oasis (Waters Co.) est teniendo una gran aplicacin en este tipo de estudios [Marinas et al., 2001]. Oasis HLB es un relleno de fase reversa, humectable en agua, adecuado para la extraccin en fase slida de una amplia gama de compuestos. Su composicin consiste en una combinacin de dos monmeros: N-vinilpirrolidona (hidroflica) y divinilbenceno (lipoflica). Esta combinacin proporciona una capacidad de retencin superior en fase reversa, con una capacidad especial para optimizar la retencin de los analitos polares. Basados en el relleno usado en los HLB se ha desarrollado una serie de adsorbentes de modo mixto intercambio inico-fase reversa. As, los rellenos Oasis MCX (modo mixto intercambio catinico-fase reversa) presentan una alta selectividad para compuestos bsicos y los Oasis MAX (modo mixto intercambio aninico-fase reversa), proporcionan adecuada recuperacin para compuestos cidos. De ms reciente desarrollo han sido los rellenos de intercambio dbil catinico y aninico WCX y WAX, diseados para mejorar las recuperaciones y la capacidad de procesamiento de cidos y bases fuertes en laboratorios de metabolismo de drogas / ADME / Toxicologa. En la Tabla 1.3, se muestran como ejemplo algunos nombres y estructuras de materiales usualmente utilizados en SPE.
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Introduccin
Tabla 1.3: Tipos de adsorbentes ms utilizados y sus estructuras. Tipo de Nombre Estructura qumica adsorbente O Carbono Carbono grafitizado O+ grafitizado (ej. Carbopack B )
O
Slica enlazada
Fase reversa (ej. RP-C18)
Si O O Si OH O
(CH2)17CH3
Fase reversa endcapped (ej. con trimetilclorosilano)
Si O O
(CH2)17CH3
Si O Si(CH3)3 O
Intercambio aninico (SAX) (ej. cidos benceno sulfnicos) Intercambio catinico (SCX) (ej. trimetil-amonio)
O Si O O
O Si O O (CH2)2 N+ Cl-
(CH2)2
SO3-Na+
Copolmeros
Poliestireno-divinilbenzeno (ej. Lchrolut EN)
Poliestireno-divinilbenzeno hidroxilado (ej. ENV+)
OH
OH
HO
OH
Divinilbenzeno-N-vinilpirrolidona (ej. OASIS HLB)

O N
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Introduccin
Fases mixtas
RP-C8 y SCX
O
Si
(CH2)7CH3 (CH2)2 SO3-Na+
Si O O
Divinilbenzeno-N-vinilpirrolidona sulfonado (ej. OASIS MCX)
SO3OH
Tcnicas de anlisis: Espectrometra de Masas (MS) Aunque, como se ha comentado anteriormente, se han aplicado muchas tcnicas para la identificacin de productos de transformacin de contaminantes en procesos de degradacin [Malato et al., 2001, 2003B, 2003C; Detomaso et al., 2005; Martnez Bueno et al., 2007; Gmez et al., 2007A, 2007B, 2008], es evidente que el empleo de la espectrometra de masas acoplada a potentes tcnicas de separacin como la cromatografa de gases y, en especial ms recientemente, la cromatografa lquida, se ha impuesto como la tcnica de eleccin para este objetivo. La espectrometra de masas se basa en la produccin de iones a partir de molculas neutras y en el examen de la posterior descomposicin de estos iones. Los iones obtenidos para cada sustancia son caractersticos y nos pueden proporcionar informacin cualitativa y cuantitativa de la misma a la vez que informacin estructural. La espectrometra de masas (MS) es, sin duda alguna, la tcnica analtica instrumental ms completa que existe hoy en da. Entre las cualidades que justifican esta afirmacin, podemos citar:
Su capacidad de identificacin. Puede identificar cualitativamente y de forma inequvoca, casi cualquier tipo de sustancia, desde compuestos sencillos hasta molculas extraordinariamente complejas, como biopolmeros de pesos moleculares elevados.
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Introduccin
Es cualitativa y cuantitativa. No slo es capaz de identificar las sustancias sino tambin de cuantificar y medir la concentracin de las mismas. Puede analizar mezclas complejas. Es capaz de identificar una sustancia incluso en presencia de otra de composicin similar. Posee una gran sensibilidad. Puede detectar prcticamente cualquier elemento en cantidades de hasta las ppq (partes por cuatrilln). Es universal y especfica. Es decir, puede analizar sustancias o mezclas de sustancias slidas, lquidas o gaseosas, y tambin es capaz de detectar y separar una sustancia concreta en presencia de una matriz compleja.
Puede proporcionar informacin estructural de la molcula analizada, energa de enlaces, informacin cintica, fsico-qumica, cuntica, etc. Suministra inters. informacin isotpica. Puede aplicarse para estudios isotpicos de istopos estables o radiognicos en campos de creciente
Es una tcnica muy rpida. Puede realizar un espectro en dcimas de segundo.
Todas estas caractersticas convierten a la espectrometra de masas es una tcnica instrumental muy evolucionada y automatizada que, si bien durante aos fue considerada como una tcnica difcil y compleja, hoy en da es de uso muy sencillo y extendido. De hecho, actualmente se utiliza profusamente como tcnica de anlisis de rutina en procesos industriales, control de calidad en fabricacin, etc. Si a la capacidad de identificacin de la MS le unimos la capacidad de separacin de la cromatografa, tanto de gases (GC) como de lquidos (LC), parece evidente que la asociacin de tales tcnicas d lugar a potentes tcnicas combinadas (GC-MS, LC-MS) que permiten la separacin e identificacin de mezclas complejas. Actualmente existen una gran variedad de sistemas GC-MS y LC-MS fruto de los importantes avances en sistemas de introduccin de
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Introduccin
muestras, analizadores, detectores o mtodos de tratamiento de la informacin obtenida. Un espectrmetro de masa consta bsicamente de una fuente de ionizacin que produce iones, un analizador que los clasifica por su masa y un detector que mide la intensidad relativa de las diferentes masas (figura 1.7). El principio de todos los espectrmetros de masas es que el comportamiento de una corriente de iones en fase gaseosa, a travs de una campo electromagntico es dependiente de la relacin masa-carga (m/z) de los iones, y dicha relacin es usada por el analizador para distinguir unos de otros, consiguindose su separacin.
Muestra
Fuente de ionizacin + + + + + + + + + + + +
Analizador de Masas
Detector Seal
+ + +
+ + + +
Alto Vaco
Alto Vaco Espectrmetro de Masas
Figura 1.7: Esquema de un Espectrmetro de Masas. Debido a la necesidad de introducir en el analizador iones de la muestra en fase gaseosa, el tipo fuente de ionizacin tuvo mucha importancia en el desarrollo de la MS. En los aos 50 se desarroll un espectrmetro de masas acoplado a un cromatgrafo de gases (GC-MS) [Gohlke y McLafferty, 1993]. Esta tcnica result muy til para analizar, identificar y cuantificar compuestos orgnicos, sin embargo muchos compuestos quedaban excluidos debido a la necesidad de ser trmicamente volatilizados.
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Introduccin
Mayor fue la dificultad del acoplamiento de una tcnica de fase lquida de flujo constante como la HPLC y una en fase gas que se realiza con alto vaco, como la MS, constituyndose la cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas (LC-MS) con la cual fue posible analizar molculas termolbiles, no voltiles y de tamao relativamente grande. Constantes avances en la instrumentacin han convertido hoy da a la LC-MS en una potente tcnica aplicable a un gran nmero de nuevas sustancias orgnicas y biolgicas, alcanzndose lmites de deteccin de partes por trilln (ppt) [Fenn, 2002].
1.7.5 Cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas (GC-MS) La cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas es, con diferencia, la herramienta de anlisis ms frecuente para la identificacin de PTs. Las ventajas ms importantes de los mtodos basados en la GC-MS son:
Alta sensibilidad y eficiencia de separacin. Elevado potencial de identificacin, gracias a la abundante informacin estructural que proporcionan los espectros de masas. Posibilidad de utilizar bibliotecas comerciales de espectros.
A continuacin se comentarn algunos aspectos de la instrumentacin y modos de operacin en GC ms utilizados en la identificacin de PTs.
Sistemas de ionizacin. Los instrumentos de GC-MS ofrecen dos tcnicas de ionizacin: impacto electrnico (EI) e ionizacin qumica (CI). Ambas tcnicas poseen caractersticas que las hacen complementarias en su aplicacin a la identificacin de compuestos desconocidos, como es el caso de los PTs.
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Introduccin
a) Ionizacin por impacto electrnico (EI) La identificacin de los PTs se realiza principalmente en base a los espectros obtenidos en impacto electrnico (EI). La ionizacin por impacto electrnico ha sido utilizada de forma muy comn en el anlisis de contaminantes por su simplicidad y reproducibilidad. La ionizacin por impacto electrnico se produce por la colisin de las molculas de la muestra con una cortina de electrones procedentes de un filamento incandescente. Aunque se habla de impacto o choques, lo que realmente tiene lugar es una interaccin entre los electrones incidentes y las molculas de la muestra, sin que llegue a haber contacto real. Si la energa de los electrones es superior al potencial de ionizacin de nuestras molculas, stas se ionizarn por emisin estimulada de un nuevo electrn, generndose as iones moleculares. Si el choque ha sido muy eficaz, la energa comunicada por el electrn es superior a la necesaria para producir la ionizacin, y el exceso de energa provoca la fragmentacin del in molecular inicialmente formado por rotura de uno o varios enlaces, lo que dar lugar a los iones fragmento. Para un compuesto dado y siempre que se reproduzcan las condiciones de ionizacin, las proporciones relativas del ion molecular y de los diferentes fragmentos producidos sern fijas, constituyendo el patrn de fragmentacin de esa molcula, que queda reflejado en el espectro de masas obtenido y que es como una huella digital de la molcula. Se pueden obtener espectros idnticos en diferentes tipos de espectrmetros de masas siempre y cuando la energa de los electrones sea la misma. Por convenio se ha adoptado el valor de 70 eV como energa electrnica estndar, para poder comparar directamente los espectros obtenidos en diferentes laboratorios y poder elaborar bases de datos de espectros. El empleo de bases de datos comerciales (Wiley275, NIST) que almacenan espectros de masas de miles de compuestos representa una ventaja a la hora de identificar compuestos desconocidos, gracias a los algoritmos de bsqueda de que disponen los
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Introduccin
equipos de GC-MS. stos permiten comparar el espectro de masas obtenido de la muestra con los espectros de masas almacenados en la base de datos, encontrando aquellos que mejor coinciden con el mismo con un determinado grado o nivel de concordancia. De esta manera es posible realizar la identificacin de compuestos desconocidos de una forma rpida y sencilla y con un alto grado de confianza. Sin embargo, las bases de datos espectrales no siempre son de utilidad en la identificacin de productos de transformacin, ya que en muchos casos stos no estn recogidos en las mismas. En estos casos, la abundante fragmentacin obtenida en EI proporciona informacin estructural til para la elucidacin de las estructuras, que una vez propuestas pueden ser confirmadas mediante el anlisis de los patrones correspondientes. Un ejemplo de identificacin de intermedios basada en la interpretacin de los espectros de masas obtenidos por GC-EI-MS se muestra en la figura 1.8 para el caso de la degradacin fotocataltica con TiO2 del frmaco bezafibrato [Lambropoulou et al., 2008] Sin embargo, pese a la ventaja que presentan los espectros de EI en cuanto a la abundante informacin estructural que ofrecen, en algunos casos la energa interna retenida por el catin [M]+ es tan grande que ste fragmenta completamente y no es posible determinar el ion molecular, lo que supone una seria limitacin en la identificacin de compuestos desconocidos. Dado que la asignacin del ion molecular es esencial para una correcta caracterizacin de los compuestos, es recomendable el empleo de tcnicas de ionizacin blandas, como la ionizacin qumica que aseguren la correcta identificacin del mismo.
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Figura 1.8: Identificacin de productos de degradacin del bezafibrato basada en la interpretacin de los espectros obtenidos mediante GC-EI-MS [Lambropoulou y col., 2008] b) Ionizacin qumica (CI) La utilizacin de la tcnica de ionizacin qumica positiva (PCI) es una alternativa muy til para poder confirmar el peso molecular de compuestos desconocidos [Agera et al., 2000, 2003, 2005, 2006; Gmez et al., 2007B, 2007C,]. La diferencia ms importante entre este modo de ionizacin y el impacto electrnico es la cantidad de energa transmitida a las molculas de la muestra durante el proceso de ionizacin. En PCI las molculas de la muestra son ionizadas a cationes por otros cationes procedentes de un gas reactivo
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Introduccin
(metano, isobutano, amonio, acetonitrilo). El rango de energa para estas reacciones es mucho ms estrecho (aproximadamente hasta 20 eV) lo que da lugar a una menor fragmentacin. La tcnica requiere que una mezcla gaseosa consistente en un gas reactivo [R] y las molculas de la muestra [M] estn presentes en la fuente inica en una relacin de 10000:1. Como el gas reactivo est en claro exceso con respecto a la muestra, prcticamente todos los cationes primarios [Cp+] se producen por ionizacin electrnica directa del gas reactivo. Las molculas de la muestra no se ionizan por ionizacin electrnica. Estos cationes primarios posteriormente reaccionarn con otras molculas de gas reactivo para producir una serie de cationes secundarios ([C]1+, [C]2+,...[C]n+) que son caractersticos del gas reactivo utilizado y cuya concentracin alcanza un estado estacionario. El nmero de cationes secundarios generados depende del tipo de gas reactivo. Estos iones secundarios interaccionan con las molculas de la muestra dando lugar a reacciones catin/molcula. Se produce as la ionizacin de la muestra producindose, entre otros, cationes moleculares protonados [M+H]+ abundantes, as como aductos que tambin dependen del tipo de gas reactivo, su presin y la temperatura de la fuente.
e + [R ] C p + 2e +
+ C p + [R ] [C ]1 + [C ]2 + ... + [C ]n + + +
(1.14) (1.15) (1.16) (1.17) (1.18)
C + + [M ] [M + H ] + [C H ]
+
C + + [M ] [M ] + C
+
C + + [M ] [M + C ]
La presencia del ion molecular protonado, tpica en espectros de CI permite confirmar el peso molecular de la molcula. Con metano como gas reactivo, la formacin de los aductos caractersticos, [M+C2H5]+ y [M+C3H5]+ a m/z M+29 y M+41, respectivamente, tambin refuerzan la confirmacin del compuesto de inters. 48
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Introduccin
A pesar del indudable potencial de las tcnicas de GC-MS en la identificacin de metabolitos, existen una serie de limitaciones inherentes a la tcnica, como son su limitada capacidad para analizar compuestos muy polares, de escasa volatilidad o trmicamente inestables. Con el fin de ampliar el rango de compuestos que pueden ser detectados por esta tcnica, en ocasiones se ha recurrido a procesos de derivacin con diazometano [Nelieu et al., 1996]; BF3/MeOH [Chiron et al., 1998]; BSTFA [Guillard et al., 1996], etc., previos al anlisis cromatogrfico. Las tcnicas de derivacin, pese a representar una interesante alternativa, son en general complicadas y tediosas, pueden ocasionar la degradacin de algunos PTs, como consecuencia de las severas condiciones de operacin aplicadas (calentamiento, pH cido), o afectar seriamente a su recuperacin, lo que hace inviable una correcta evaluacin cuantitativa de los intermedios [Nelieu et al., 1996]. Por otro lado, la formacin de compuestos indeseados durante el proceso de derivacin, como consecuencia de la presencia en las muestras de compuestos adicionales (agentes del formulado, cidos flvicos, etc.), puede complicar la interpretacin de los resultados. Como consecuencia, se ha limitado el uso de la derivatizacin [Buxton et al., 1998; Chiron et al., 1997; Richardson et al., 1996]. Otra alternativa de inters para la determinacin de compuestos polares en GC consiste en usar columnas con fases polimricas del tipo polietilen-glicol, que presentan una mayor polaridad, siempre y cuando las caractersticas de las columnas, en cuanto a estabilidad y sangrado a altas temperaturas, lo permitan [Agera et al., 2000].
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Introduccin
Analizadores de masas a) Analizadores cuadrupolares (Q) La mayor parte de los estudios aplicados a la identificacin de PTs emplean analizadores cuadrupolares. La popularidad de estos espectrmetros de masas surge de su relativamente bajo costo, del hecho de que es un sistema compacto, de la facilidad con la que su electrnica puede ser controlada y la simplicidad de operacin. Los analizadores tipo cuadrupolo pueden ser considerados como un filtro de masas y consisten bsicamente en cuatro barras cilndricas colocadas paralelamente en formacin radial (Figura 1.9). Una combinacin apropiada de corriente elctrica y campo elctrico de radiofrecuencia aplicado a las cuatro barras induce un movimiento oscilatorio en el flujo de iones introducido en el sistema. Las trayectorias oscilatorias de los mismos son dependientes de sus masas y as, los iones con una particular relacin m/z se van moviendo consecutivamente por el cuadrupolo hacia el detector.
+ + + + + + + + +
+ + + + + +
+ + + +
Figura 1.9: Esquema de un cuadrupolo simple.
Los cuadrupolos simples han sido ampliamente utilizados para el anlisis de contaminantes medioambientales y PTs mediante GC-MS, principalmente porque ofrecen una alta sensibilidad y robustez, buena informacin cualitativa y resultados cuantitativos adecuados, teniendo la ventaja adicional de su capacidad de confirmacin de estructuras. 50
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Introduccin
Analizador trampa de iones (IT). Este tipo de analizadores de masas se introdujo a principios de los aos 80. Basa su funcionamiento en la separacin de iones con diferentes valores de m/z en el tiempo, atrapndolos de forma selectiva en el espacio cerrado que constituye la trampa. El detector IT consta de 3 electrodos: uno de entrada, otro de salida y un electrodo anular central. Juntos forman una cavidad donde tiene lugar la ionizacin, fragmentacin, almacenamiento y anlisis de masas (Figura 1.10).
Figura 1.10: Esquema en 3D de una IT, electrodos en los extremos y anillo magntico central. Los iones eyectados siguen la direccin, marcada por la flecha, hacia el detector [www.simion.com/info/Image:Sltools_view.png].
Adems de su mejorada sensibilidad en full scan con respecto a los cuadrupolos simples, los analizadores de trampa de iones permiten la obtencin de espectros de masas en tndem (MS/MS) de una forma sencilla.
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La tcnica de MS/MS consiste en seleccionar en el espectro de la primera fragmentacin, sea impacto electrnico o ionizacin qumica, un in selectivo del compuesto a analizar, al que se denomina in precursor. Una vez seleccionado, ste es aislado en la trampa de iones, expulsndose de la misma, mediante la aplicacin de campos elctricos adecuados, los iones de masa inferior y superior. A continuacin, mediante la aplicacin de un campo elctrico sinusoidal, los iones almacenados colisionan con el helio presente en la trampa mediante un proceso conocido como Disociacin Inducida por Colisin (CID). Los iones producto as generados se expulsan de la trampa segunda fragmentacin (MS2). mediante la aplicacin de una rampa de radiofrecuencia, registrndose el espectro de la
Este modo de trabajo proporciona informacin estructural adicional, permitiendo la asignacin de iones fragmento seleccionados, ya que es posible incluso repetir el proceso, aislndose de nuevo un ion producto para obtener espectros de MSn.
Si bien es indiscutible el inters de este modo de trabajo, su aplicacin en GCMS, dada la abundante informacin estructural proporcionada por los espectros de EI, se ha centrado en mayor medida en la identificacin de compuestos objetivo en muestras complejas, dada su mayor selectividad que repercute en una mejora de la sensibilidad. Sin embargo, si que ha encontrado un importante campo de aplicacin para la elucidacin de estructuras en LC-MS, por la escasa fragmentacin proporcionada por esta tcnica, como se comentar ms adelante [Calza et al., 2003, 2001]
1.7.6 Cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas (LC-MS) La cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas, se ha revelado en los ltimos aos como una herramienta de gran utilidad en la determinacin de 52
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Introduccin
compuestos desconocidos y PTs en agua. Pese a que esta tcnica ofrece menor resolucin y limitada informacin estructural, en comparacin con la GC-MS, presenta tambin, sin embargo, importantes ventaja como son:
Mayor facilidad para analizar compuestos polares, de escasa volatilidad y trmicamente inestables. Posibilidad de realizar el anlisis directo de las muestras, cuando la sensibilidad requerida lo permite, evitando as las prdidas derivadas del proceso de extraccin.
El reciente desarrollo de interfases de ionizacin a presin atmosfrica (API), como la ionizacin qumica a presin atmosfrica (APCI) y la ionizacin con electrospray (ESI), ha permitido mejorar la sensibilidad de estos sistemas y obtener mayor informacin estructural que con las interfases tradicionales (thermospray y particle beam), aumentando as la aplicabilidad de la tcnica de LC-MS en este tipo de estudios [Barcel et al., 1997; Chiron et al., 1997]. A modo de ejemplo la Tabla 1.4 incluye algunas referencias relativas a la aplicacin de diferentes tcnicas de LC-MS a la determinacin de PTs de frmacos en procesos de degradacin fotoqumica [Petrovic y Barcel, 2007]. A continuacin se discutirn las ventajas e inconvenientes de cada una de las estrategias analticas ms comunes. Analizadores cuadrupolares sencillos (Q): Una ventaja del uso de tcnicas blandas de ionizacin a presin atmosfrica es que permiten obtener informacin relativa al peso molecular de los compuestos. Generalmente, se obtiene el ion molecular protonado [M+H]+ o aductos de amonio [M+H+NH3]+ o sodio [M+H+Na]+, cuando se trabaja en modo positivo, y el ion molecular desprotonado [M-H]-, si se trabaja en modo negativo.
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Introduccin
Tabla 1.4: Revisin de mtodos de LC-MS empleados en la identificacin de PTs en procesos de transformacin fotoqumica de frmacos [Petrovic y Barcel, 2007] Proceso Compuesto Mtodo MS Referencia Oxidativo Frmacos anti-inflamatorios y analgsicos: Diclofenaco Diclofenaco Zomepiraco Naproxeno Carprofeno Fotlisis Fotocatlisis Foto-Fenton Fotlisis Fotlisis Fotlisis LC-TOF LC-TOF LC-MS(Q) LC-MS(Q) LC-MS(Q) [Agera et al., 2005] [Prez-Estrada et al., 2005] [Wang et al., 2004] [Hsu et al., 2006] [Sheu et al., 2003]
-Bloqueadores e hipertensivos:
Atenolol Propranolol Metoprolol Enalapril Fotlisis LC-Qq-TOF LC-Qq-LIT [Prez et al., 2006] Fotlisis LC-MS2 (QqQ) [Liu y Williams, 2007]
Agentes reguladores de lpidos: cido Clorofbrico Atorvastatin Fotocatlisis (TiO2) Fotlisis LC-MS2 (QqQ) LC-MS2 (QqQ) [Doll y Frimmel, 2004] [Lam y Mabury, 2005]
Antidepresivos y antiepilpticos: Carbamazepina Carbamazepina Fotocatlisis (TiO2) Fotlisis LC-MS2 (QqQ) LC-IT [Poiger et al., 2001] [Chiron et al., 2006]
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Introduccin
Fluoxetina Citalopram
LC-MS2 Fotlisis Fotlisis (QqQ) LC-MS

2
[Lam et al.,2005], [Kwon y Armbrust, 2006] [Kwon y Armbrust, 2005]
(QqQ)
Contraste de rayos X: Ipromida Iomeprol Antibiticos: Sulfamethoxazol Clinafloxacin Clorotetraciclina Sulfonamidas Fotlisis Fotlisis Fotlisis LC-IT LC-IT LC-TOF LC-IT LC-TOF [Lovdahl y Priebe, 2000] [Eichhorn y Aga, 2004] [Boreen et al., 2004], [Boreen et al., 2005] Fotocatlisis (TiO2) LC-MS2 (QqQ) [Poiger et al., 2001]
En contrapartida, hay algunas dificultades que deben ser resueltas cuando se utilizan los sistemas LC-API-MS como son la insuficiente informacin estructural y la carencia de bibliotecas espectrales que nos permitan identificar intermedios desconocidos, lo que significa un esfuerzo considerable en la obtencin de informacin concluyente en relacin a su identificacin. Una forma de obtener espectros con mayor fragmentacin, y por tanto una mayor informacin estructural, empleando analizadores cuadrupolares sencillos es mediante lo que se conoce como colisin inducida en la fuente. sta se basa en el incremento del llamado voltaje de fragmentacin que provoca la aceleracin de los iones generados en la fuente incrementando su energa cintica y favoreciendo su colisin efectiva con un gas de colisin, generalmente He, Ar o N2. Este procedimiento llegar a mejorar esta situacin, en algunos casos, aunque a costa de una simultnea disminucin de la sensibilidad
55
Introduccin
conforme se incrementa el voltaje, y de la dificultad de predecir los parmetros de operacin de la CID cuando se analizan compuestos desconocidos, lo que requiere realizar mltiples inyecciones. La figura 1.11 muestra un ejemplo de espectros a diferentes valores de voltaje de fragmentacin.
256.0
100 80 60
FRAGMENTOR=40 V
N Cl
[M+H]+
N N N
NO2
40 20 0 50 100 80 60 40 20 0 50 100
278.1 [M+Na]+
M = 255
100 150 200 250 300 m/z
256.0 FRAGMENTOR=80 V 175.1 209.0 278.0
150
200
250
300
m/z
100 80 60 40 20 0 50 100
175.1 FRAGMENTOR=120 V 209.0
210.0
150
200
250
300
m/z
Figura 1.11: Espectros de masas obtenidos para el plaguicida imidacloprid a diferentes valores de voltaje de fragmentacin o fragmentor.
56
Tesis Doctoral
Introduccin
Los inconvenientes de la CID ya comentados han limitado la aplicabilidad de los cuadrupolos simples a la identificacin de PTs (ver Tabla 1.3). En este sentido, el seleccionar una tcnica apropiada de LC-API-MS basada en la capacidad de los distintos analizadores que se utilizan, puede solucionar estos inconvenientes. En general, dos son las estrategias ms comnmente utilizadas que proporcionan una mejora en la informacin estructural:
Empleo del anlisis de masas en tndem mediante el empleo analizadores de trampa de iones (IT) o sistemas hbridos como el triple cuadrupolo (QqQ) o el cuadrupolo-trampa de iones lineal (Q-LIT).
Empleo de analizadores de masas de alta resolucin como el analizador de tiempo de vuelo (TOF) o el cuadrupolo-tiempo de vuelo (Qq-TOF).
Diversos estudios han evaluado las ventajas e inconvenientes del uso de los diferentes analizadores [Ferrer y Thurman, 2003a; Petrovic y Barcel, 2007; Malato et al., 2003c], en este tipo de aplicaciones. Triple cuadrupolo (QqQ) Estos sistemas constan bsicamente de tres cuadrupolos colocados en serie, cada uno con una funcin diferente. El primer cuadrupolo se utiliza para escanear un rango de m/z preseleccionado y aislar un ion en particular. El segundo cuadrupolo, tambin conocido como celda de colisin, enfoca y transmite los iones mientras se aplica un gas (argn o helio) para provocar la fragmentacin por colisin inducida del ion precursor seleccionado. El tercer cuadrupolo sirve para analizar los fragmentos generados en la celda de colisin y eliminar los fragmentos neutros que se han generado, en la figura 1.12 se muestra un esquema sencillo de este analizador.
57
Introduccin
Q1 + + + + + + + + + + + + + + +
Q2 Q3
+ ++ +++ + +
+/+/-
+
+/-
+
+/+/-
gas de colisin
Figura 1.12: Esquema del funcionamiento de un analizador de triple cuadrupolo. Q1: filtro de masas trabajando con una masa objetivo, Q2: celda de colisin, Q3: segundo filtro de masas trabajando en modo SIM. Los QqQ-MS se han aplicado fundamentalmente al anlisis cuantitativo de compuestos objetivo por la elevada selectividad y sensibilidad que proporcionan operando en modo SRM (selected reaction monitoring), Sin embargo, estos instrumentos tambin proporcionan modos de operacin alternativos que pueden ser tiles para identificacin de compuestos desconocidos, como la bsqueda de prdidas neutras (neutral loss scan), bsqueda de ion precursor (precursor-ion scan) o bsqueda de iones producto (product-ion scan). Un ejemplo es el trabajo de Quintana y colaboradores [Quintana et al., 2005] que utilizan espectros de iones producto registrados a diferentes energas de colisin para identificar los productos de biotransformacin de cinco frmacos. La principal limitacin sin embargo es la escasa sensibilidad que proporcionan los QqQ cuando operan en modo scan. Una mejor alternativa al triple cuadrupolo, por la mayor sensibilidad para registrar espectros de iones producto es la utilizacin de analizadores de trampa de iones
58
Tesis Doctoral
Introduccin
Trampa de Iones (IT) Estos analizadores proporcionan, adems de una mayor sensibilidad, la posibilidad de obtener espectros de MSn. En este modo de operacin se pueden aislar consecutivamente diferentes iones precursores de una misma molcula en etapas sucesivas obtenindose patrones de fragmentacin diferentes a los proporcionados en MS o MS2, que pueden proporcionar informacin especfica de diferentes fracciones de la molcula, o ayudar a determinar la posicin de determinados grupos funcionales. Un ejemplo se muestra en la figura 1.13, correspondiente a la identificacin de un derivado hidroxilado del plaguicida diuron, generado durante un experimento de degradacin por fotocatlisis [Malato et al., 2003c]. La observacin de los fragmentos obtenidos en los anlisis posicin del grupo OH en la molcula. de MS2 y MS3 permiti confirmar la
59
Introduccin
Intens. x10 5 8
Compuesto desconocido
OH Cl Cl NH N O H CH 3
[M+H] + 235
234.9
or
237
A
Cl NH N Cl O H CH 2 OH
194.9 218.9 200 220 240 m/z
0 Intens. 4 x10 6
60
80
100
120
140
160
180
B
OH Cl Cl NH N O H CH 3
178
177.9
235 MS2
180
178
[M+H] + 235
60 80 100 120 140 160 180 200 220
236.9
0 Intens. 6000
240
m/z
C
161 143
Cl Cl OH NH N O CH 3 H
143
142.9
235 [178] MS3
5000
4000
3000
2000
178
1000
161
160.9 100 120 140 160
178
180.9
60
80
180
200
220
240
m/z
Figura 1.13: Espectros de masas obtenidos con LC-IT-MS durante la identificacin de un compuesto desconocido de diuron. A) MS, B) MS2 y C) MS3.
60
Tesis Doctoral
Introduccin
Cuadrupolo Lineal (Q-LIT) Una de las mayores limitaciones de la IT tridimensional es que no es posible realizar bsquedas de iones precursores con una gran sensibilidad como lo hara un triple cuadrupolo (QqQ), y que el rango dinmico de la IT es limitado ya que cuando muchos iones estn presentes en la misma, la presencia de efectos espacio-carga disminuyen el rendimiento de la trampa. Esto se refleja cuando se presenta un problema de buscar un ion que est acompaado por una gran poblacin de iones de fondo.
Q1
Celda de Colisin
Q2
Fuente de ionizacin
enfoque de iones
masa objetivo
iones fragmento molculas neutras
SIM
Figura 1.14: Esquema de los componentes de un analizador de masas de triple cuadrupolo con trampa lineal. Recientemente se ha desarrollado un sistema hbrido cuadrupolo-trampa de iones lineal (Qq-LIT o Q-TRAP) que conjuga la tecnologa de los triple cuadrupolo con la trampa lineal de iones. La figura 1.14 muestra un esquema de la configuracin de un Qq-LIT. El instrumento est basado en un QqQ en el cual el tercer cuadrupolo (Q3) puede operar como un cuadrupolo normal o en modo LIT. El Qq-LIT se diferencia de la IT tridimensional en la manera en que se confinan los iones a lo largo del eje del cuadrupolo (figura 1.15), utilizando el QqLIT una distribucin de radiofrecuencia en 2D, en lugar de una de 3D como en la IT. La principal ventaja del Qq-LIT frente a la trampa tridimensional es su mayor capacidad inica debido a su mayor volumen por lo que se reducen los efectos espacio-carga.
61
Introduccin
Estos sistemas permiten trabajar en modo triple cuadrupolo (con todos los tipos de scan caractersticos de ste, las altas prestaciones para la cuantificacin, gran selectividad, etc.), en modo tpicamente trampa de iones, o en modo combinado cuadrupolo con trampa de iones lineal, pudiendo aadir nuevos tipos de scan. Adems, el uso de la trampa proporciona mayor sensibilidad en modo scan que el QqQ, caracterstica sta que incrementa sensiblemente su capacidad para anlisis de metabolitos, en muchos casos presentes a bajas concentraciones. Adicionalmente, a diferencia del QqQ, la trampa lineal permite trabajar registrando espectros de MSn. A pesar de las ventajas comentadas, aun no existen aplicaciones de esta tcnica al anlisis de PTs de frmacos en muestras medioambientales. Un ejemplo, sin embargo, que demuestra la potencialidad del Qq-LIT es reportado por Xia y colaboradores [Xia, et al., 2003] para la determinacin de 5 metabolitos del frmaco gemfibrozil en fluidos biolgicos. Este trabajo describe la aplicacin simultnea, en un mismo anlisis, de diferentes estrategias de identificacin como la bsqueda de prdidas neutras, iones producto (MS2) y MS3. La combinacin de estos modos de trabajo en un nico anlisis es posible gracias al uso del modo IDA (information-dependent-acquisition) provisto por el software del sistema, el cual permite la obtencin de abundante informacin estructural de forma rpida y sencilla.
62
Tesis Doctoral
Introduccin
cuadrupolo
+ + + + + + + + + + + + + + + + iones
+ + + + + + + + + + + + + + + + +
trampa magntica
+ + +
Iones seleccionados
Figura 1.15: Detalle del funcionamiento de una trampa lineal. Tiempo de Vuelo (TOF) Los analizadores de tiempo de vuelo pueden considerarse actualmente como una de las herramientas ms potentes en la identificacin de compuestos desconocidos. Esto es debido a su capacidad de proporcionar medidas de masa exacta, tanto de los iones moleculares (de)protonados como de los posibles iones fragmento presentes en los espectros, lo que supone una importante mejora con respecto a cuadrupolos o trampas de iones que solo proporcionan informacin de la masa nominal. En base a las medidas de masa exacta obtenidas, el software del sistema calcula la composicin elemental y la frmula emprica de los correspondientes iones, proporcionando una lista de posibles resultados que mejor se ajustan a la masa medida. La informacin sobre la composicin elemental de los PTs, junto con el conocimiento del compuesto del que proceden, as como de los mecanismos de transformacin (fotolticas, fotocatalticos, biolgicos, etc.) que los originan suponen un importante punto de partida para su correcta identificacin. A esto hay que aadir la excelente sensibilidad en full scan que
63
Introduccin
proporcionan los nuevos instrumentos LC-TOF, que permiten detectar compuestos desconocidos a niveles traza. El funcionamiento del TOF, se esquematiza en la figura 1.16 Una vez producida la ionizacin, los iones formados son retenidos en la fuente inica por medio de la aplicacin de un potencial de retardo de igual signo al de la carga de los iones, evitando que puedan salir de la fuente dispersos en el tiempo. Una vez conseguida la ionizacin, y confinados los iones en el recinto de la fuente, se aplica un voltaje de extraccin, que permite que todos los iones salgan de la fuente de modo simultneo. Seguidamente, stos pasan por un campo electrosttico acelerador con un voltaje determinado, adquiriendo una elevada energa cintica que les impulsa en la direccin del tubo de vuelo, o analizador, hacia el detector. Los iones de mayor m/z volarn a menor velocidad que los de menor m/z. El resultado es que los iones ms pequeos alcanzan antes el detector, seguidos en el tiempo y de modo sucesivo por los de mayor tamao. El tiempo empleado en recorrer la longitud del tubo de vuelo es proporcional a su masa. Recientes mejoras tcnicas implementadas en los nuevos equipos TOF, han permitido mejorar sensiblemente la resolucin y sensibilidad de los mismos. As, el accesorio llamado reflectrn (Figura 1.16) proporciona una mejora de la resolucin sobre los antiguos detectores TOF, los cuales solo posean un tubo y los iones viajaban en lnea recta desde el impulsor al detector. Esta mejora incrementa la distancia que tienen que recorrer los iones y la energa cintica enfocada a travs del reflectrn, consiguiendo un incremento en la resolucin y sensibilidad del TOF.
64
Tesis Doctoral
Introduccin
reflectrn + + + + + + + + +
+ +
enfoque de iones +
fuente de ionizacin iones
+ ++ ++ ++ + + ++ + + + + + + + +
+ ++ +++ +
detector fuente de impulso
Figura 1.16: Esquema de los componentes en un detector de Tiempo de Vuelo. Los analizadores de tiempo de vuelo proporcionan determinaciones de masa exacta con errores tpicamente inferiores a 2 mDa, lo que permite una gran certidumbre en la asignacin de las frmulas empricas de los compuestos. En la figura 1.17 se muestra un ejemplo de identificacin de dos frmacos de uso comn en una muestra de agua residual, donde se aprecian errores entre la masa experimental y la calculada, tanto para los iones moleculares protonados como para los iones fragmento, inferiores a 0.5 mDa.
+ ++ ++ ++ + + ++ + + + + + + + +
65
Introduccin
El nmero de posibles frmulas empricas detectadas por el equipo para un determinado compuesto a identificar pueden reducirse drsticamente si se limita el umbral del error de exactitud de masa (a < 5 ppm) y si se consideran las caractersticas estructurales de la molcula. La observacin del perfil isotpico de la molcula protonada en el espectro de masa exacta nos permite confirmar la presencia o ausencia de heterotomos (normalmente tomos de halgenos o azufre) y tambin, utilizando las abundancias relativas, podemos deducir el nmero de ellos que hay presentes en la molcula investigada [Garca-Reyes et al., 2005; Thurman et al., 2005].
1.7e7 1.3e7
TIC
CONFIRMATION Confirmacin
ESI+
Intensity, cps
9.0e6 5.0e6 1.0e6
10
14
18
22
Time, min
26
30
34
38
42
10.80
2.1e4
300.1595 300.1595
1.05e4 Intensity, counts
XIC
Intensity, cps
Codeine Codena
1.3e4
6500.00
5000.0
4.15
15.39
15.66
2500.00
1.0
5.0 m/z, amu
9.0
13.0
240
280 Time, min
320
360
8.33
5.6e5
Intensity, cps
NH3 152.0710 152.0710

3.2e5
XIC
Intensity, counts
Acetaminophen Acetaminofen
HO
2.4e5
4.0e5
[M+H2-COCH3]
1.6e5
2.4e5
110.0606
8.0e4 8.0e4 1.0 5.0 9.0 13.0 Time, min 17.0 21.0 85 125 m/z, amu 165
Figura 1.17: Ejemplo de la identificacin de dos frmacos (codena y acetaminofn), donde se obtuvieron errores menores a 1.5 ppm (0.5 mDa). Diversos estudios han evidenciado la aplicabilidad de TOF-MS en la determinacin de rutas metablicas o elucidacin de los productos de fotodegradacin de ciertos frmacos y contaminantes orgnicos en agua. No 66
Tesis Doctoral
Introduccin
obstante, y a pesar del potencial de estos instrumentos para la identificacin de desconocidos, los trabajos publicados son aun escasos, estando muchos de ellos recogidos en esta memoria. Algunos ejemplos son la aplicacin de TOF-MS para la elucidacin de los productos de foto-degradacin del desinfectante triclosan en aguas residuales [Ferrer et al., 2004]. Mezcua y col. [Mezcua et al., 2006] identificaron con TOF-MS los productos de degradacin de fotlisis y fotocatlisis de un disruptor endocrino omnipresente en las aguas medioambientales, el bisfenol A, en matrices de agua residual. Tambin se aplic TOF-MS para la identificacin de los principales PTs del antiinflamatorio/antipirtico dipirona, en procesos de degradacin solar en diferentes matrices ambientales [Gmez et al., 2008]. Ibez y col. [Ibez et al., 2006] describen la aplicacin de LC-TOF y LC-QTOF en la identificacin de PTs del plaguicida diazinon en agua, poniendo de manifiesto la capacidad de estas tcnicas para la identificacin de compuestos isobricos, con la misma masa nominal. Lambropoulou y colaboradores [Lambropoulou et al., 2008] identifican 17 PTs de bezafibrato generados durante la degradacin fotocataltica con TiO2. Errores inferiores a 2 mDa permitieron la asignacin de la frmula emprica de los intermedios. La seleccin de un in diagnstico de m/z 138.9965, correspondiente a una seccin de la molcula comn a la mayora de los intermedios [C7H3ClO], permiti la identificacin los mismos mediante la obtencin del cromatograma de iones seleccionados. La figura 1.18 muestra los espectros de masa exacta de algunos de los intermedios ms relevantes identificados.
67
Introduccin
Figura 1.18: Espectros de masa exacta, obtenidos en LC-TOF-MS, para el benzafibrato, y algunos de los intermedios ms relevantes identificados [Lambropoulou et al., 2008].
68
Tesis Doctoral
Introduccin
Cuadrupolo con Tiempo de Vuelo (Qq-TOF) Con el fin de mejorar y ampliar las capacidades de los sistemas LC-TOF, se ha introducido recientemente un sistema hbrido que combina la estabilidad de un analizador cuadrupolar (Q) con la alta eficiencia, sensibilidad, precisin y medida de masa exacta de un analizador de masas TOF (figura 1.19). En este sistema hbrido Qq-TOF, el cuadrupolo puede utilizarse para aislar selectivamente un ion precursor, fragmentarlo y obtener espectros de iones producto de masa exacta, lo que aumenta la capacidad de esta tcnica para diferenciar entre ismeros estructurales. El Qq-TOF ana as las capacidades del cuadrupolo para seleccionar un ion en particular y la habilidad del TOF para llevar a cabo mediciones simultneas y precisas de los iones dentro de todo el rango de masas. Esto contrasta con los analizadores de masas convencionales, tales como los cuadrupolos en tndem, los cuales tienen que escanear una sola masa cada vez. El Qq-TOF ofrece una sensibilidad y precisin significativamente mayor, en comparacin con los QqQ cuando se ha de adquirir espectros de fragmentacin en todo el rango de masas. El Qq-TOF es un instrumento que puede utilizar de igual manera el cuadrupolo o el TOF independientemente o en conjunto para anlisis de masas en tndem. En el campo medioambiental, solo unos pocos autores han explorado las capacidades de estos sistemas para la identificacin de PTs. Eichhorn y col. [Eichhorn et al., 2005] realizan la elucidacin estructural de 2 metabolitos del antibitico trimetroprim producidos por degradacin con lodos activados con bacteria nitrificantes. La identificacin de los metabolitos fue posible con errores de masa inferiores a los 5 mDa. Otros estudios reportan la identificacin de productos de fotodegradacin de diversos plaguicidas, como carbofurn [Detomaso et al., 2005], diuron [Malato et al., 2003b] o triazinas [Ibez et al., 2004]. El empleo de masa exacta permita, en el caso del carbofurn eliminar
69
Introduccin
incertidumbres relativas a prdidas neutras isobricas. As las prdidas neutras de 28 Da presentadas por algunos PTs pudieron diferenciarse con exactitud y asignarse a prdidas de CO C2H4, de 27.9949 y 28.0313 Da, respectivamente.
TOF
+ + +
reflectrn + + + + + + + + +
enfoque de iones celda de colisin cuadrupolo fuente de ionizacin
+ ++
+ ++ +++ +
detector fuente de impulso
+ + +
Figura 1.19: Esquema representativo de los componentes de un Q-TOF.
Pese a la potencialidad de las tcnicas descritas, la mayora de los trabajos publicados proponen la combinacin de ms de una de ellas o con otras tcnicas como la RMN para conseguir una evaluacin ms completa de los procesos de degradacin, lo que refleja la complejidad de estos estudios.
70
Tesis Doctoral
+ ++ ++ ++ + + ++ ++ + + + + + +
+ ++ +++ +
+ + + +
+ +
CAPITULO
Capitulo 2
EXPERIMENTAL
2.1 Compuestos modelo y reactivos

Se utiliz Diclofenaco y Dipirona en su forma de sal sdica, Verde Malaquita en su forma de sal oxlica, todos de SigmaAldrich y pureza 90%. El hierro utilizado para el sistema Foto-Fenton fue FeSO47H2O pureza del 75%, H2SO4 y NaOH para ajustes de pH, perxido de hidrgeno (H2O2) 30% (p/v) de Panreac (Barcelona, Espaa). El TiO2 fue Degussa P-25. Para los mtodos cromatogrficos se utiliz metanol y acetonitrilo de alta pureza de Sigma-Aldrich, NaOH 50% de J.T. Baker (Deventer, Holland), agua de alta pureza de un sistema Milli-Q (Bedford, MA, US) 0.052 S/cm. En todos los experimentos se utiliz agua desmineralizada obtenida de la planta de destilacin en la Plataforma Solar de Almera (PSA) (conductividad < 10 S/cm, Cl- = 0.2 0.3 mg/L, SO4-2 = 0.2 0.3 mg/L, NO3- = 0.2 0.3 mg/L, carbono orgnico < 5 mg/L). En algunos experimentos se utiliz agua estndar la cual se prepar aadiendo NaHCO3 (96 mg/L), CaSO42H2O (60mg/L), MgSO4 (60 mg/L) y KCl (4 mg/L) al 71
Experimental
agua destilada, como lo estipula el mtodo del manual de mtodos estndar [Standard Methods, 1998] para agua con una dureza media.
2.2 Dispositivo experimental
2.2.1 Fotoreactores y procedimiento experimental Todos los experimentos fotocatalticos (en fase homognea y heterognea) se realizaron utilizando captadores solares cilindro parablico compuestos (CPC), dispuestos en una planta piloto, como se muestra en la figura 2.1. Localizacin: Tabernas, Espaa. Latitud: 37 N; Longitud: 2.4 W. La planta piloto se utiliz con un volumen total de 35 litros, el volumen de liquido iluminado es de 22 litros, la superficie irradiada de captadores fue de 3.08 m2. La planta piloto se constituye de dos lazos gemelos, compuestos por tres captadores CPCs en paralelo inclinados 37, lo que maximiza la captacin de radiacin solar, el agua se recircula mediante una bomba centrfuga que proporciona un caudal de 20 L/min. Con el objetivo de disponer de suficiente volumen para muestreo, poder recircular el agua y poder aadir los reactivos necesarios el sistema cuenta con un tanque de 10 L perfectamente agitado. El sentido del flujo tiene el siguiente orden: tanque de agitacin, bomba de recirculacin, mdulos CPC, retorno al tanque de agitacin. Las muestras fueron tomadas a travs de una vlvula colocada en el tramo entre los mdulos CPCs y el tanque de mezcla. La planta piloto trabaja en sistema de lotes (batch), recirculado constantemente el volumen total de trabajo, manteniendo un flujo turbulento en los tubos absorbedores. La temperatura no es controlada en el sistema, por tanto la temperatura dentro de los reactores vara dependiendo de la estacin del ao, normalmente entre 30 y 40 C. Al comienzo del experimento se cubren los mdulos CPCs, se agrega el compuesto a degradar y se mantiene la recirculacin hasta que se alcance la concentracin deseada, posteriormente se
72
Tesis Doctoral
Experimental
agrega el catalizador a utilizar, de nuevo se mantiene la recirculacin por un perodo predeterminado de tiempo, con el objeto de verificar alguna reaccin en la oscuridad. Finalmente se retira la cubierta del captador y las muestras son tomadas a intervalos de tiempo pre-establecidos. En el caso de los experimentos, este procedimiento se complementa con el ajuste de pH a 2.8, antes de aadir el catalizador (Fe2+) y con la adicin de perxido de hidrgeno antes de retirar la cubierta del captador solar.
CPC
Tanque
Bomba
Figura 2.1: Esquema e imagen de los reactores solares fotocataltcos.
En el caso del proceso de Foto-Fenton (fotocatlisis homognea), el reactivo limitante es el perxido de hidrgeno (H2O2), el cual se mantiene entre 200 400 mg/L por medio de adiciones peridicas, en la medida que se vaya consumiendo. En los procesos fotocatalticos solares la radiacin solar juega un papel muy importante, debido a que interviene directamente en los procesos activando el TiO2 o permitiendo la regeneracin de Fe+2. Sin embargo una caracterstica de la radiacin solar es que nunca es constante, adems del hecho de que no se puede controlar. Con el fin de comparar diferentes experimentos que se
73
Experimental
realizaron bajo diferentes condiciones de radiacin solar, se desarroll una metodologa tomando en cuenta el valor medido de la radiacin solar en el momento del experimento. Esta metodologa introduce de una manera sencilla un tiempo de iluminacin estandarizado. Una radiacin de 30 Wm2 puede ser
o considerada como un estndar de radiacin UV global ( I G ,UV ) para un da
perfectamente soleado y despejado en la Plataforma Solar de Almera (PSA) [Malato et al., 2003]. I G ,UV es la radiacin media medida en cada intervalo de muestreo, siendo t el tiempo trascurrido desde que se inici el experimento. La radiacin solar ultravioleta fue medida a travs de un radimetro de UV global (KIPP&-ZONEN, modelo CUV3), el cual se encuentra montado en una plataforma inclinada 37, la misma inclinacin que los mdulos CPCs, el cul proporciona datos en trminos de radiacin incidente WUVm2. Esto nos da una idea de la energa que alcanza cualquier superficie en la misma posicin con respecto al sol, y por tanto en los CPCs. Las ecuaciones (2.2 y 2.3) permiten normalizar el tiempo de iluminacin mediante el clculo de t30W. En las figuras que describen los experimentos de degradacin (captulos de resultados) se utilizan a veces tiempos negativos. Esta notacin pretende aclarar el tiempo trascurrido (en este caso tiempo real y no normalizado) antes de iniciar la iluminacin con los captadores tapados, siendo t30W = 0 el momento en que se inici con la iluminacin. Esta forma de presentacin de los datos permite simplificar la comprensin de los mismos, utilizndose fundamentalmente en el caso de foto-Fenton para los periodos trascurridos durante la mezcla de reactivos y, sobretodo, para remarcar el periodo inicial dnde solo se produce la reaccin de fenton en la oscuridad al mezclar perxido de hidrgeno y Fe2+.
t 30W = t
I G , UV
0 I G , UV
(2.2)
t 30W =
1 I
0 G , UV 0
G , UV
(t )dt
(2.3)
74
Tesis Doctoral
Experimental
Este concepto de utilizar un tiempo estandarizado con respecto a la radiacin solar hace posible la comparacin del rendimiento experimental de diferentes captadores solares. Evidentemente otra manera de comparar este tipo instalaciones es desde el punto de vista del coste de tratamiento, sin embargo esto no es sencillo de hacer y en la mayora de los casos no es muy exacto [Goswami et al., 1997]. En un esfuerzo por lograr un acuerdo la IUPAC recomienda que la comparacin de los sistemas de captacin solar est basada en el rea de captador necesaria para lograr un cierto objetivo por unidad de tiempo [Bolton et al., 2001]. La energa UV incidente acumulada en la superficie del captador por unidad de volumen la denominaremos Q, y se calcula con la ecuacin (2.4) [Malato et al., 2002]. En la Figura 2.2 se muestra un ejemplo de un experimento de degradacin, donde se demuestra claramente la utilizad de usar Q, cuando se discuten resultados experimentales.
Q=
A Vtot
I
0
G , UV
(t )dt
(2.4)
La curva de degradacin con respecto al tiempo experimental (t, figura 2.2a) tiene un aspecto difcil de interpretar, debido a los tres puntos de inflexin provocados por los cambios en la intensidad de iluminacin, pero la curva de degradacin con respecto a Q (figura 2.2b) permite evaluar mejor una cintica de reaccin de primer orden. Finalmente con la ecuacin (2.5) se puede calcular el rea del captador por unidad de masa, como lo define la IUPAC [Bolton et al., 2001], donde c es la diferencia de concentracin del parmetro analtico que se est midiendo, desde el inicio hasta el final del tratamiento.
ACM =
Q I
0 G , UV
(2.5)
75
Experimental
Todo lo anterior se puede calcular a partir de los datos de I G ,UV recogidos durante los experimentos, sin embargo en esta tesis se ha decidido utilizar el parmetro t30W por ser el ms intuitivo por su similitud a los tiempos de reaccin utilizados en reactores convencionales. De hecho, las velocidades de reaccin se calculan habitualmente como dC/dt.
90 40
1st 1 da day
nd 22 day da
IG, UV [Wm2]
30 20
60
(a)
30
250
500 [min] tt [min] t, min
750
0 90
2nd day
2 da
60
(b)
st 11erday da
30
10
20
30
40
Q [kJ/L]
Figura 2.2: Ejemplo de un experimento de degradacin solar. (a) concentracin contra el tiempo de experimentacin, (b) concentracin contra Q.
2.2.2 Fotlisis e hidrlisis Los experimentos de fotlisis se realizaron en botellas de 5 L de vidrio pyrex con una transmisividad a la radiacin UV > 80% de 320 a 400 nm, y alrededor del 40% a 300 nm, dimetro interno 15 cm y altura 30 cm. La solucin se prepar en las mismas botellas, previamente cubiertas con papel aluminio; una vez
76
Tesis Doctoral
Ccontaminante [mg/L]
10
Experimental
expuestas al sol se mantuvieron en agitacin constantemente y la boca de la botella se cubri, con el objeto de prevenir contaminacin externa. En los experimentos de hidrlisis se utilizaron botellas mbar de 250 mL, y matraces mbar o forrados de papel aluminio para la preparacin de las soluciones. Durante las hidrlisis realizadas, las botellas se mantuvieron en oscuridad.
2.3 Mtodos analticos convencionales
2.3.1 Carbono Orgnico Total (COT) La medida del Carbono Orgnico Total (COT) se lleva a cabo a travs de un analizador que realiza mediciones de Carbono Total (CT) y Carbono Inorgnico Total (CIT) en muestras de agua; la diferencia entre el CT y el CIT es la medida del COT. Este analizador efecta la medicin de CT al pasar una cantidad determinada de muestra que es arrastrada por una corriente de aire por un reactor (con catalizador de platino soportado en perlas de almina) a 680 C, donde todo el carbono de la muestra se transforma en CO2. Posteriormente la corriente de gas pasa a travs de un detector de infrarrojo no dispersivo. Se genera una seal proporcional a la cantidad de carbono contenido en la muestra. El analizador obtiene el CIT al dosificar cido fosfrico en una cantidad determinada a la muestra y burbujearla con aire de alta pureza. De esta manera al disminuir el pH y purgar con aire se provoca la generacin rpida de CO2 proveniente de la oxidacin de carbonatos y bicarbonatos contenidos en la muestra. La corriente de gas es conducida directamente al detector infrarrojo, generndose tambin una seal proporcional al carbono inorgnico contenido en la muestra. El dispositivo utilizado para medir el carbono orgnico disuelto (COD) es un equipo Shimadzu TOC 5050A equipado con un automuestredor ASI5000, que se muestra en la Figura 2.3. Este analizador de COT tiene instalados tubos
77
Experimental
capilares, que son demasiado pequeos para permitir el ingreso de partculas o material no disuelto, por tanto la medida de carbono que proporciona es la de que se encuentra disuelto, es decir carbono orgnico disuelto (COD).
(a)
(b)
Figura 2.3: Imagen del analizador de COT. (a) Mdulo de COT y (b) Automuestreador. Todas las muestras fueron filtradas (por eso hablar de COD) utilizando filtros de PTFE con un tamao de poro de 0.22 m (Millipore Millex GN). Una vez filtradas las muestras, por medio del automuestreador, fueron inyectadas y analizadas automticamente. Cada medida estuvo basada en dos inyecciones con una variacin mxima del 2% entre ellas, de lo contrario se realiza una tercera inyeccin. Esto lo realiza automticamente el sistema en atencin a los lmites de variacin que se le programen. Con las muestras provenientes de los experimentos utilizando el proceso foto-Fenton se procedi con especial rapidez (se inyectaban en el sistemas inmediatamente despus de ser tomadas) ya que el hierro disuelto y el perxido de hidrgeno siguen reaccionando una vez que se han retirado de la exposicin a la luz, con la consecuente degradacin de la muestra. En el caso de la fotocatlisis utilizando TiO2 una vez que las muestras son retiradas de la radiacin solar se detiene toda actividad cataltica, siendo as muestras ms estables.
78
Tesis Doctoral
Experimental
Peridicamente soluciones patrn son inyectadas en el equipo para comprobar el correcto funcionamiento, en la figura 2.4 se muestra la calibracin de los rangos de concentraciones utilizadas. Adems de esto, en cada experimento realizado se comprob que la concentracin terica de COD, calculada para cada compuesto modelo utilizado. Una comprobacin adicional es que la concentracin inicial del COD y la del compuesto de inters, medida por HPLC, deben de ser congruentes.
40000
TC [1.0 - 10.0] mg/L R2 = 1.00
60000 50000 40000
IC [0.5 - 5.0] mg/L R2 = 1.00
30000 Area
20000
Area
0 2 4 [mg/L] 6 8 10
30000 20000
10000
10000
0
0 0.0 1.0 2.0 [mg/L]

50000
R2 = 1.00
3.0
4.0
5.0
40000
TC [10.0 - 50.0] mg/L
IC [5.0 - 20.0] mg/L R2 = 1.00
30000 Area 20000
40000 30000 20000 10000 0

0 10 20 [mg/L] 30 40 50
10000 0
Area
10 [mg/L]
15
20
Figura 2.4: Datos de calibracin del equipo en los rangos de concentraciones de CT y CIT utilizados en esta Tesis.
2.3.2 Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC) La concentracin de los compuestos de inters en agua, se analiz utilizando un sistema HPLC Agilent Technologies, series 1100 (Figura 2.5), con detector UVVIS Diode Array Detector (DAD), columna C-18 (LUNA 5 micron, 3 150 mm, de
79
Experimental
Phenomenex) y flujo de 0.5 mL/min, y un volumen de inyeccin de 10 L. Las muestras se prepararon diluyendo 1:1, la muestra con acetonitrilo o metanol (dependiendo de la fase mvil utilizada) y filtrando posteriormente utilizando filtros Milipore de 0.22 m. Los mtodos de separacin para cada sustancia se muestran en la tabla 2.1. La dilucin 1:1 tiene un doble objetivo: (i) detener cualquier reaccin que pueda ocurrir en la oscuridad desde que se toma la muestra hasta que se analiza; (ii) desorber cualquier compuesto que pueda haber quedado adsorbido en la superficie del catalizador slido (TiO2) o hidrxidos de hierro formados en el proceso de foto-Fenton antes de la filtracin para evitar que quede retenido en le filtro.
Tabla 2.1: Composicin de la fase mvil utilizada para cada compuesto Compuesto Fase Mvil (nm) Diclofenaco Dipirona Verde Malaquita
* para el VM. ** para los productos de transformacin.
ACN / NH4COOH 10 mM (50/50) pH= 3 MeOH / H3PO4 20 mM (50/50) pH= 2.5 ACN / CH3COONH4 50 mM (50/50) pH= 4.4
254 254 617*/254**
80
Tesis Doctoral
Experimental
(a)
(b)
Figura 2.5: Imagen del HPLC Agilent serie 1100 (a). Detalle de los mdulos (b): automuestreador, columna, y detector UV-VIS (DAD). Para asegurar el buen funcionamiento del equipo se inyecta a menudo un patrn. Adems, como medida de control adicional, siempre se dispone de la concentracin inicial de cada experimento, que debe ser congruente con la cantidad de compuesto que se ha agregado al volumen deseado agua. Finalmente la concentracin inicial, medida en HPLC, y el valor de TOC deben de ser congruentes.
81
Experimental
2.3.3 Cromatografa Inica (IC) La determinacin de cationes se llev a cabo en un cromatgrafo Dionex DX120, con una columna Dionex IonPac CS12A de 4 x 250 mm y flujo de 1.2 mL min-1, en mtodo isocrtico, con el que fue posible determinar la concentracin de NH4+. El mtodo isocrtico tiene un tiempo de 15 min y como eluente se utiliz H2SO4 a una concentracin de 20 mN. Para los aniones y cidos carboxlicos se utiliz un cromatgrafo Dionex DX-600, con una columna Dionex IonPac AS11-HC de 4 x 250 mm, y flujo de 1.5 mL/min. El mtodo para aniones fue isocrtico de 15 min, con un escaln de concentracin como se detalla en la tabla 2.2. Con este mtodo es posible determinar las concentraciones de Cl-, NO2-, NO3-, SO42-, PO43- .
Tabla 2.2: Mtodo para la determinacin de aniones. NaOH Tiempo Agua [100 mN] 0 7.5 min 7.5 15 min 80% 65% 20% 35%
Para los cidos carboxlicos se utiliz un mtodo de rampa de concentraciones, descrito en la tabla 2.3: Est mtodo nos permite determinar Acetato/Glicolato, Propianoato, Formiato, Piruvato, Maleato, Oxalato.
Tabla 2.3: Mtodo para la determinacin de cidos orgnicos. NaOH NaOH Tiempo Agua [5 mN] [100 mN] 0 min 18 min 18 min 28 min 28 min 38 min 80% 85% 70% 20% 15% 30%
82
Tesis Doctoral
Experimental
DX600 DX120 Automuestreador
Figura 2.6: Sistema de IC Dionex utilizado. DX120 (cationes), DX600 (anines/cidos orgnicos) y automuestreador. Con el fin de asegurar el buen funcionamiento de los cromatgrafos inicos, antes de cada secuencia de inyecciones, se analiza agua ultra pura (MilliQ) y posteriormente se introducen patrones de 2.5 10 mg/L para cationes, aniones y cidos carboxlicos. Adems el equipo se calibra peridicamente con concentraciones que van desde 0.1 mg/L hasta 50 mg/L, para aniones y cationes, y de 0.1 - 10 mg/L para cidos carboxlicos. Se dispone de rectas de calibracin en rangos de 0.1 1 mg/L, 1 10 mg/L, y 10 50 mg/L. En las figuras 2.7a, 2.7b y 2.7c se muestran los cromatogramas de los patrones mencionados anteriormente.
83
Experimental
70
S 1 - Na+ - 4.173
60
40
30
5 - Ca2+ - 11.937
2 - NH4+ - 4.773
50
3 - K+ - 6.153
4 - Mg2+ - 9.750
-30 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0
min 16.0
Figura 2.7 (a): Cromatograma del patrn de referencia de cationes.
90
S 2 - Chloride - 3.403
80
70
60
50
40 3 - Nitrate - 6.390
4 - Sulphate - 7.370
30 1 - Fluoride - 2.220
20
10
5 - Phosphate - 12.840
-10 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0
min 15.0
Figura 2.7 (b): Cromatograma del patrn de referencia de aniones.
84
Tesis Doctoral
Experimental
6.00
5.00
4.00
3.00 2 - Propionate - 9.780 3 - Formiate - 10.777
8 - Maleate - 24.370 9 - Sulphate - 24.823
10 - Oxalate - 25.877
5 - Chloride - 15.553
2.00
11 - Phosphate - 30.890
4 - Pyruvate - 12.657
1 - Acetate - 8.333
6 - Bromide - 20.987
1.00
7 - 23.073
12 - 34.290 min
-0.50 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0
38.0
Figura 2.7 (c): Cromatograma del patrn de referencia de cidos carboxlicos. Los dos cromatgrafos DX-120 y DX-600 se controlan a travs del software Chromelon, el cual determina el rea de la seal generada por la muestra, y la integra automticamente, teniendo la opcin de corregir manualmente dicha integracin. Utilizando la recta de calibrado adecuada para una determinada concentracin, previamente construida, se obtiene el resultado directamente en mg/L de cada ion o cido carboxlico.
2.3.4 Determinacin de hierro (Fe2+, Fe3+ y Fe total) La determinacin de hierro disuelto se realiz formando un complejo quelato con fenantrolina (1,10-fenantrolina), este complejo adquiere un color naranja-rojizo y la absorcin de luz se mantiene sin cambios en un rango de pH de 3 9, sin embargo se observa una respuesta mejor a valores de pH cercanos a 3, por tanto la medida se realiza utilizando una solucin tampn de cido actico.
85
Experimental
(a)
(b)
Figura 2.8: Complejo quelato de hierro y fenantrolina. (a) estructura molecular en 2D, (b) Estructura molecular en 3D. Cdigo de colores: ( ) Fe, ( ) N, ( ) C, ( ) H. La determinacin de hierro se realiz en dos pasos, primero se determin la cantidad de hierro ferroso (Fe2+) mezclando 4 mL de la muestra, previamente filtrada utilizando filtros con tamao de poro de 0.22 m (Millipore Millex GN), con 1 mL de 1-10-fenantrolina, preparada a 0.1% (p/v) en agua, y 1 mL de solucin tampn (62.5g de acetato de amonio y 175 mL de acido actico en 250 mg/L agua). Despus de 1 minuto se midi la absorbancia a una longitud de onda de 510 nm en un espectrmetro (Unicam II Spectrometer), la medida se realiz tomando como referencia un blanco preparado de la misma manera, reemplazando la fenantrolina por agua para eliminar cualquier interferencia de color. El hierro disuelto total se midi agregndole cido ascrbico (dos puntas de esptula) a la preparacin para la medicin de hierro ferroso. El cido ascrbico reduce el hierro frrico (Fe3+), y cualquier oxidante presente en la solucin. La preparacin se homogeniz, se dej sedimentar el cido ascrbico suspendido, y se realiz la medida de absorbancia como se describi anteriormente. El calculo para determinar la concentracin de hierro frrico (Fe3+) se realiza 86
Tesis Doctoral
Experimental
restando la concentracin de hierro ferroso (Fe2+) a la concentracin de hierro total (Fe2+ + Fe3+). La evaluacin cuantitativa de la absorbancia se realiz utilizando la ecuacin (2.6), la cual se obtuvo para un rango de concentraciones de 0.4 a 7 mg/L, con un r2 de 1.000. De acuerdo con la ley de Beer para soluciones coloreadas, de diluy la muestra para valores de absorbancia >1.
C Fe ( mg / L ) = [( 7.15 )( ABS ) 0.036 ]( factor de dilucin )
(2.6)
El parmetro de control para verificar el buen estado del equipo es la medida de diferentes soluciones patrn. Adems en cada experimento se tom una medida de referencia antes de agregar el hierro a la solucin, posteriormente se midi una muestra despus de haber agregado el hierro para comprobar la concentracin terica inicial deseada.
2.3.5 Determinacin de H2O2 por tritracin iodomtrica El mtodo de titracin iodomtrica puede ser utilizado en la medicin de muchos agentes oxidantes. El principio de esta medicin se basa en agregar un exceso de yoduro a la muestra en condiciones cidas, el agente oxidante reacciona con el yoduro para formar una cantidad estequiomtricamente equivalente al anin tri-yoduro, como se muestra en la reaccin (2.7). La cantidad de anin tri-yoduro formado es determinado por la adicin de tiosulfato, el cual reacciona cuantitativamente formando tetrationato, reaccin (2.8). El reactivo indicador forma un complejo azul-gris oscuro con el ion tri-yoduro. Consecuentemente en presencia de almidn, como reactivo indicador, la desaparicin completa del ion tri-yoduro puede ser observada, ya que el complejo vira del color azul-gris oscuro a transparente. H 2 O2 + 3 I + 2 H + I 3 + 2 H 2 O I 3 + 2 S 2 O32 3I + S 4 O62
(2.7) (2.8)
87
Experimental
Para la determinacin del perxido de hidrgeno se sigui el siguiente procedimiento: se tomaron unos mL de muestra (ver ecuacin 2.9) y se mezclaron directamente con 25 mL de yoduro potsico 0.2 M (KI 33.2 g/L), 20 mL cido sulfrico 1 M, y 5 10 gotas del reactivo indicador (Zinc starch titration solution de MERCK Ref. 5445). La solucin se mantiene en la oscuridad por 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente la solucin se titra con tiosulfato de sodio 0.05 M (Na2S2O3 24.82 g/L). La concentracin de perxido de hidrgeno puede ser calculada con la ecuacin (2.9), asumiendo que toda la oxidacin del yoduro al in tri-yoduro se debe a la presencia de perxido.
C H 2O2 =
V Na2 S 2O3 Vmuestra
(1700 mg / L )
(2.9)
Donde V Na2 S 2O3 es el volumen gastado en la titracin, y Vmuestra es el volumen de muestra para el anlisis, que suele ser de 5 mL.
2.4 Tcnicas analticas avanzadas
2.4.1 Pretratamiento de las muestras: extraccin en fase slida (SPE) Las muestras fueron pre-concentradas mediante SPE, utilizando un regulador de vaco Supelco Visiprep, antes de su anlisis en los equipos de MS. Con este fin, se utilizaron minicolumnas Oasis HLB (divinilbenzeno/N-vinilpirrolidona) de 3 cm3 con 60 mg de adsorbente (Waters, Miliford, USA). Este adsorbente fue seleccionado por su capacidad de proporcionar una adecuada recuperacin para analitos en un amplio rango de polaridades. En los estudios de diclofenaco tambin se utilizaron minicolumnas Oasis MAX, (modo mixto fase reversaintercambio aninico), de 3 cm3 con 60 mg de adsorbente (Waters, Miliford, USA), con alta selectividad para compuestos cidos.
88
Tesis Doctoral
Experimental
En la Figura 2.9 se muestra el equipo utilizado para realizar la SPE.
Figura 2.9: Sistema utilizado para la pre-concentracin de muestras con SPE. Se aplic el siguiente esquema general de extraccin:
Acondicionamiento: 2 mL de metanol + 2 mL de agua destilada (acidificada a pH 3 con HCl en el caso de diclofenaco) Carga: 20 mL de muestra, a un flujo aproximado de 10 mL/min (50 mL en el caso de diclofenaco). Elucin en cartuchos Oasis HLB: 2x4 mL de metanol, flujo de 1 mL/min Elucin en cartuchos Oasis MAX: 3 mL de metanol, flujo de 1 mL/min
Los eluatos obtenidos fueron concentrados, evaporando el disolvente con una corriente suave de nitrgeno, hasta un volumen final de 1 mL en metanol (4 mL en el caso de verde malaquita). Estos extractos fueron analizados directamente en GC-MS o diluidos convenientemente con agua MiliQ para su anlisis en LCMS. Los extractos fueron conservados en oscuridad y refrigeracin para prevenir cualquier degradacin posterior.
89
Experimental
2.4.2 Cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas (GC-MS) Para el anlisis en GC-MS se utiliz un HP 6890 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) acoplado a un detector selectivo de masas (MSD) HP 5973 (Figura 2.10). Los analitos fueron separados en una columna capilar HP-5MS, compuesta en un 5% por difenilpolisiloxano y en un 95% por dimetilpolisiloxano, 30 m de longitud, 0.25 mm dimetro interno, y 0.25 m de grosor. El tipo de inyector utilizado fue un split-splitless en modo de pulso de presin bajo las siguientes condiciones: Volumen de inyeccin 10 L, temperatura de inyeccin 250 C, presin del impulso inicial 30 psi (1.5 min), flujo de split 50.0 mL/min y tiempo de split 1.5 min, gas portador Helio a 1 mL/min, programa de temperatura del horno: 1.0 min a 105 C, 25 C/min hasta 180 C, 5 C/min hasta 230 C (230 C durante 1 min); temperatura de la lnea de transferencia 280 C. Los espectros de masas que fueron obtenidos por Impacto Electrnico (EI) se obtuvieron con una energa de ionizacin de 70 eV y se detectaron desde 50 a 400 unidades de masa. La fuente de ionizacin y el analizador de cuadrupolo fueron ajustados a 230 C y 106 C, respectivamente. Para la Ionizacin Qumica Positiva (PCI) se utiliz metano como gas reactivo para el anlisis de las muestras y para este caso la fuente de ionizacin y el analizador de cuadrupolo se ajustaron a 120 C y 250 C, respectivamente. Las condiciones de operacin del MSD se optimizaron automticamente utilizando la aplicacin de autotuning del software del equipo.
90
Tesis Doctoral
Experimental
Figura 2.10: GC-MS Agilent 6890, con un MSD 5973 inert.
2.4.3 Cromatografa de lquidos acoplada a espectrometra de masas (LCMS) Para el anlisis de las muestras mediante LC-MS se utiliz un analizador de tiempo de vuelo (TOF) con interfase de electrospray (ESI) (Figura 2.11), operando en modo de ionizacin positiva (y negativa en el caso del diclofenaco). La muestra fue separada utilizando un sistema HPLC Agilent Technologies Series 1100 (Palo Alto, CA, USA), consistente en un desgasificador a vaco, automuestreador y bomba binaria de pistn. Este sistema cuenta con una columna analtica C8 de fase reversa (Zorbax Eclipse XDB-C8) de 150 mm x 4.6 mm y tamao de partcula de 5 m. La temperatura de la columna se mantuvo a 25 C, la fase mvil consisti en acetonitrilo (canal A) y agua con 0.1% de cido
91
Experimental
frmico (canal B). Se programaron diferentes gradientes de fase mvil en cada ensayo: Diclofenaco y dipirona: gradiente lineal desde 15% hasta 100% de A en 30 min, 5 minutos a 100% A. Velocidad de flujo: 0.6 mL/min, volumen de inyeccin: 50 L. Verde Malaquita: gradiente lineal desde 20% hasta 100% de A en 42 min, 5 minutos a 100% A. Velocidad de flujo: 0.2 mL/min, volumen de inyeccin: 10 L. El detector de masas de tiempo de vuelo (TOF) utilizado es un Agilent MSD TOF (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) con interfase de electroespray (ESI). El registro de la masa exacta se realiz en el rango desde 50 a 1000 m/z, y los datos se obtuvieron a travs del software Analyst QS Applied Biosystems / MDS SCIEX (Frankfurt, Germany). Este equipo se mantiene calibrado usando la mezcla que provee el fabricante en el rango de 50 3200 m/z. Un segundo spray, colocado de manera ortogonal es utilizado con una solucin de referencia como un calibrado continuo, usando las siguientes masas de referencia: 121.0509 y 922.0098 m/z (resolucin: 9500500 @ 922.0098 m/z).
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Tesis Doctoral
Experimental
Figura 2.11: TOF-MS Agilent
2.5 Evaluacin de la toxicidad
2.5.1 Bioensayo basado en la actividad bioluminiscente de la bacteria Vibrio fischeri Vibrio fischeri es un hetertrofo marino (Figura 2.12), del grupo Gram-negativo, perteneciente a la familia Vibrionaceae, la cual contiene especies que desarrollan una interaccin cooperativa y/o patgena con el animal husped. V. fischeri se encuentra en todo el mundo en regiones templadas y subtropicales,
93
Experimental
existiendo como una bacteria libre o como un organismo luminoso en simbiosis con algunas especies de jibias y peces [Nealson y Hastings, 1991].
Figura 2.12: Fotografa de bacterias Vibrio fischeri. La toxicidad fue evaluada utilizando el bioensayo basado en la inhibicin de la luminiscencia emitida por la bacteria V. fischeri. La luz emitida por la bacteria es el resultado de la interaccin de la encima luciferaza, reduciendo la flavina, y una larga cadena de aldehdo en presencia de oxgeno. La energa metablica generada por esta ruta es convertida en energa qumica, la cual es convertida en luz visible, a travs de un sistema de transporte de electrones. Esta ruta metablica est intrnsecamente relacionada con la respiracin celular, as que la interrupcin del metabolismo regular causa una disminucin en la produccin de luz [Hernando et al., 2007]. Se utiliz un luminmetro ToxAlert 100 de MERCK (Darmstadt, Germany) (Figura 2.13). La bacteria (NRRL B-11177) fue adquirida a Macherey-Nagel (Dren, Germany), como reactivo congelado y liofilizado, se mantuvo congelada a -20 C y se re-hidrat previo al anlisis. Las muestras fueron preparadas
94
Tesis Doctoral
Experimental
ajustando el valor de pH entre 6 8, con soluciones diluidas de NaOH y HCl, y la osmolaridad de las muestras a un contenido de sal del 2%, agregando cloruro de sodio de alta pureza (Suprapure, Merck) para un rendimiento ptimo. La bacteria liofilizada fue reactivada por hidratacin con una solucin estril de cloruro de sodio.
Figura 2.13: Imagen de un luminmetro ToxAlert 100 de MERCK El efecto a corto plazo del compuesto de inters y de las muestras recolectadas durante los experimentos, se evaluaron a 5, 15, 30 minutos de exposicin, como se estipula en el mtodo ISO 11348-3 de calidad de agua (determinacin del efecto inhibitorio de muestras de agua en la emisin de luz de Vibrio fischeri, prueba de bacteria luminiscente. Parte 3: Mtodo utilizando bacteria congelada liofilizada). El efecto inhibitorio se obtuvo con la ecuacin (2.10), donde, IS,0 y IS,x son las intensidades de luminiscencia, en unidades relativas de luz (RLU), de la muestra inicial y despus de un tiempo de contacto de x minutos respectivamente. El factor de correccin , ecuacin (2.11), se utiliza para la medida de control, donde IC,0 y IC,x son las intensidades de luminiscencia (RLU) del control inicialmente y despus de un tiempo de contacto de x minutos, respectivamente.
95
Experimental
I S ,x INH % = 1 I S ,0
100
(2.10)
I C,x I C ,0
(2.11)
Los datos de inhibicin fueron expresados en trminos de la funcin gamma (), ecuacin (2.12), es decir, la relacin de la prdida de luz y la luz remanente. Finalmente la funcin gamma se relaciona con la inhibicin detectada en el metabolismo de la bacteria como lo muestra la ecuacin (2.13) [Fernndez-Alba, et al., 2001].
I S ,0 I S , x = I S ,x
(2.12) (2.13)
INH % 100 INH %
El EC50 o concentracin efectiva se determin como la concentracin de una muestra que causa una reduccin del 50% en la luminiscencia emitida por la bacteria V. fischeri. Las curvas de calibracin para la determinacin de los valores de EC50 fueron preparadas con los estndares disponibles de los productos de degradacin identificados con las tcnicas de LC-MS y GC-MS, como se muestra en la seccin 5.5, del captulo 5. Las soluciones de las muestras fueron analizadas para determinar el efecto inhibidor observado en cada muestra. La inhibicin se calcul en trminos de porcentaje y se compar con la luminiscencia obtenida con un control libre de toxicidad [Fernndez-Alba et al., 2001].
96
Tesis Doctoral
CAPITULO
Capitulo 3
DEGRADACIN FOTOQUMICA DE DICLOFENACO EN AGUA MEDIANTE FOTLISIS Y FOTOCATLISIS. IDENTIFICACIN DE PRODUCTOS DE TRANSFORMACIN Y ESTABLECIMIENTO DE RUTAS DE DEGRADACIN
3.1 Fotlisis del diclofenaco

Previos a los estudios de fotlisis se realizaron experimentos para determinar la contribucin de la hidrlisis a la fotodegradacin del diclofenaco. Los experimentos partieron de la misma concentracin inicial y se realizaron a 3 diferentes valores de pH (3, 7, y 9), durante 72 horas. No se detect hidrlisis a pH 7 y 9, permaneciendo la concentracin de diclofenaco constante durante los experimentos. Sin embargo, los resultados a pH 3 demostraron una disminucin del 90% de la concentracin inicial, que se demostr debida a la precipitacin de
97
Degradacin fotoqumica de diclofenaco
diclofenaco. En un medio neutro o alcalino, el diclofenaco es muy soluble (50 g/L), es un producto farmacutico cido con un pKa de 4.15 [Packer et al., 2003], pero a pH = 4 se vuelve casi insoluble y a pH < 4 precipita. Este hecho es de gran importancia para entender algunos resultados obtenidos durante los experimentos de fotlisis y foto-Fenton expuestos a lo largo del captulo. La causa principal de la disminucin de pH observada durante los experimentos puede explicarse por la liberacin de iones cloruro, que proporcionan valores de pH < 3 durante la degradacin de diclofenaco.
3.5 3 2.5 pH 3.0 pH 10.0
1.2
Absorbancia
2 0.6 1.5 0.4 1
Espectro UV Solar
0.5 0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 0.2
, nm
Figura 3.1: Espectro UV de 200 400 nm del diclofenaco (a pH 3 y 10) comparado con el espectro UV solar registrado en la Plataforma Solar de Almera. La comparacin del espectro UV del diclofenaco con el espectro solar (a la latitud de 37 N y longitud 2.4 W) permite suponer que se degradar por fotlisis directa al exponerse a la radiacin solar natural. El mximo de absorcin del diclofenaco es a 273 nm, no obstante se solapa con el espectro de la radiacin 98
Tesis Doctoral
W/m
nm
0.8
Degradacin fotoqumica de diclofenaco...
solar en la regin desde 300 330 nm. Por tanto, la absorcin de radiacin y la consecuente foto-alteracin de la molcula del diclofenaco es factible, tal y como se ha reportado anteriormente [Andreozzi et al., 2003; Boreen et al,. 2003; Buser et al., 1998; Packer et al., 2003]. Esto se muestra en la figura 3.1. Los experimentos de fotlisis se realizaron con diclofenaco disuelto en agua desmineralizada y agua estndar, en el captulo Experimental se detalla la composicin del agua estndar), expuesta a la radiacin solar para una mejor y ms realista evaluacin de los procesos de foto-transformacin. Los estudios del efecto de la radiacin solar en los productos de la foto-transformacin de un compuesto son ms informativos si se realizan con un solo compuesto, de este modo nos aseguramos que los intermedios formados proceden nicamente de la interaccin entre los fotones solares y el compuesto inicial. La concentracin de oxgeno fue la que se alcanz al mantener el agua en contacto con la atmsfera, es decir entre 6 y 8 mg/L de oxgeno disuelto. Estas condiciones, de saturacin de oxgeno a presin atmosfrica fueron elegidas porque son las ms representativas de las condiciones reales en el medio ambiente. No se consider pertinente hacer pruebas en ausencia de oxgeno, porque esto no ocurrira bajo condiciones naturales, ya que el agua se encontrar sin oxgeno solamente a grandes profundidades y la luz solar no llegara hasta ah. Los resultados obtenidos en estos dos tipos de agua, desmineralizada y estndar, indican que el diclofenaco experimenta una espontnea y rpida fototransformacin bajo iluminacin solar. Sin embargo, se observaron importantes diferencias entre los experimentos, respecto a la evolucin del pH. La fotlisis en agua destilada mostr una disminucin en el pH debida a la mencionada liberacin de cloruros, lo que daba lugar a la disminucin del COT y de la concentracin de diclofenaco, como consecuencia de la precipitacin de ste ltimo..Para evitar la precipitacin del diclofenaco, pequeas cantidades de
99
sodio hidrxido se aadieron progresivamente, con el objeto de mantener el pH en un rango entre 7 y 8. Esto no fue necesario en el caso de los experimentos realizados con agua estndar, al poseer sta una capacidad de tampn, la cual mantuvo el valor de pH entre 7.0 y 7.4 durante todo el ensayo. A pesar de estas diferencias, los resultados de la degradacin del diclofenaco en agua destilada y agua estndar fueron similares. La figura 3.2 muestra la evolucin de la concentracin de diclofenaco con el tiempo de reaccin utilizando agua estndar. El experimento de fotlisis se desarroll exponiendo las disoluciones de diclofenaco desde las 08:30h hasta las 15:30h y se tomaron muestras cada dos das. El eje de abscisas en la Figura 3.2 representa el tiempo de iluminacin normalizado (UVpromedio = 25 W/m-2), como se detalla en el captulo Experimental. Se observ una rpida disminucin, de mas del 70%, de la concentracin inicial (45.5 mg/L) de diclofenaco, durante las primeras 30 horas de iluminacin. Posteriormente, la velocidad de foto-transformacin disminuy notablemente, debido a la acumulacin de intermedios de reaccin coloreados, que actan como un filtro interno ante la luz. De hecho, la solucin adquiri un color marrn oscuro durante los experimentos. Este efecto ha sido reportado anteriormente para aguas naturales superficiales [Buser et al., 1998; Andreozzi et al., 2003; Packer et al., 2003; Boreen et al., 2003], en las cuales la solucin adquiere un color marrn oscuro, presumiblemente debido a la formacin de estructuras carbazlicas, como las reportadas por Moore [Moore, 1998], formadas tras la prdida de cloro.
100 Tesis Doctoral
50 45 40 35 30 UVprom = 25 W/m2 COT Diclofenaco
C, mg/L
25 20 15 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
tiempo, h
Figura 3.2: Cintica de la desaparicin del diclofenaco por fotlisis, y evolucin del COT durante el experimento. A) Disolucin recin preparada de diclofenaco en agua. B) Disolucin al final del experimento. A pesar de la rpida desaparicin del diclofenaco en la disolucin, no hubo mineralizacin en ningn caso, tal como lo muestra el comportamiento del COT, el cual permanece casi constante durante los anlisis. Esto demuestra la formacin de un gran nmero de productos de transformacin (PTs), los cuales son ms resistentes a la foto-degradacin que el diclofenaco. La tabla 3.1
Leonidas Armando Prez Estrada 101
muestra los resultados de los experimentos de fotolisis con el diclofenaco disuelto en agua destilada y en agua estndar.
Tabla 3.1: Resultados de los experimentos de fotlisis, expresados en % de desaparicin del diclofenaco. tiluminacin (A) (h) % tiluminacin (B) (h) % 4 11 18 32 90 160 28 47 59 68 87 99 7 27 34 62 105 160 36 71 75 85 95 100
C0 50 mg/L, A: agua destilada a pH 7.5; B: agua estndar a pH 7.2
3.1.1 Identificacin de productos de transformacin Bajo ciertas condiciones, la foto-transformacin del diclofenaco ha sido referenciada por varios autores como un proceso rpido y efectivo [Packer et al., 2003; Poiger et al., 2001]. Sin embargo, hasta ahora no se haba realizado un estudio en profundidad de la ruta fotoltica de degradacin de este compuesto. La evaluacin analtica de este tipo de procesos de degradacin presenta en general muchas dificultades:
La formacin de un gran nmero de compuestos impredecibles que complica su separacin y consecuentemente su identificacin. Las diferentes propiedades fsico-qumicas de los PTs, lo que dificulta su determinacin. La ausencia, en la mayora de los casos, de estndares comerciales para confirmar su identidad.
102 Tesis Doctoral
Estas dificultades hacen necesario el desarrollo de mtodos de extraccin de amplio espectro y tcnicas analticas avanzadas, basadas en la Espectrometra de Masas (MS), que permitan una evaluacin lo ms completa posible del proceso. En esta investigacin se utilizaron varias estrategias de este tipo como son: GC-EI-MS, GC-PCI-MS y LC-TOF-MS.
Tratamiento de la muestra Como hemos comentado anteriormente, el tratamiento de la muestra es una importante etapa en este tipo de estudios. La seleccin del procedimiento de preparacin de la muestra se realiza con dos objetivos:
Obtencin de extractos de las muestras analizables por las tcnicas analticas empleadas. Preconcentracin de las muestras para determinar los PTs presentes a bajas concentraciones o escasamente recuperados con la tcnica de extraccin seleccionada.
El uso de la extraccin en fase slida con adsorbentes polimricos representa la mejor y ms simple opcin en este tipo de aplicaciones. Debido a la naturaleza polar de los productos de transformacin y/o degradacin generados, muchos escaparan a la tradicional extraccin lquido lquido (LLE). Para la SPE se utilizaron adsorbentes capaces de extraer compuestos en un amplio rango de polaridades, como el Oasis HLB, que consiste en un copolmero macroporoso, sintetizado a partir de dos monmeros, el divinilbenceno, de carcter lipoflico, y la N-vinilpirrolidona, de carcter hidroflico.. Adems, debido a la presencia de grupos funcionales cidos en la molcula del diclofenaco, se utiliz un adsorbente con grupos funcionales de intercambio aninico, Oasis MAX, que consiste en un relleno de retencin mixta (intercambio aninico-fase reversa), el cual proporciona buenos resultados en la recuperacin de intermedios cidos. Una descripcin ms detallada de los adsorbentes y el proceso de extraccin se encuentran descritos en el captulo Experimental.
La comparacin entre ambos tipos de extracciones (Oasis HLB y Oasis MAX) fue muy til para confirmar la presencia de grupos funcionales cidos en los PTs detectados.
Anlisis por GC-MS Los extractos obtenidos por el mtodo descrito se analizaron inicialmente por GC-EI-MS. El empleo de la ionizacin por impacto electrnico permite la obtencin de espectros en full scan que proporcionan abundante informacin estructural a la vez que una fragmentacin reproducible (a 70 eV) que permite su comparacin con bases de datos de espectros comerciales (Wiley, NIST, etc.). Todos los picos presentes en los cromatogramas fueron investigados y seis de ellos fueron identificados como posibles PTs. La Figura 3.3 muestra como ejemplo el cromatograma correspondiente al anlisis de un extracto obtenido tras tres das de exposicin solar. Las estructuras de estos compuestos, presentadas en la Figura 3.10, fueron propuestas utilizando los correspondientes espectros de masas. Dos de ellas (compuestos C-5 y C-11) fueron confirmadas utilizando bases de datos de espectros de masas (Wiley 275). En la Figura 3.3 se muestra el espectro de masas obtenido para el compuesto C-5, el cual fue identificado como 3-clorocarbazol con un 83% de certeza.
104 Tesis Doctoral
Abundance
80000 75000 70000 65000 55000
Cl H N
201
GC-MS / EI
C-10 DCFNC
1.8e+07 60000 1.6e+07

50000 45000 40000 35000 1.4e+07 30000 25000 20000 1.2e+07 15000 10000
3-Chlorocarbazole Library fit: 83% C-5

38 50
40
166
1e+07 5000
0
63
60
82 100 114
80 100 120
139
140
160
180
200
220
240
8000000 6000000 4000000 2000000
C-11
7.00 8.00 9.00 10.00
C-8
C-2
C-9
11.00
12.00
13.00
14.00
15.00
16.00
17.00
Time
Figura 3.3: Cromatograma obtenido mediante el anlisis por GC-EI-MS de una disolucin de diclofenaco tras tres das de exposicin solar, donde se identifican seis productos de la degradacin. El ejemplo del espectro de masas, en fullscan, corresponde al compuesto C-5. Las bases de datos espectrales disponibles constituyen una herramienta muy valiosa en la identificacin de compuestos desconocidos analizados en GC-MS. Sin embargo, su utilidad algunas veces se ve dificultada por la complejidad de las muestras. La presencia de interferencias de matriz o de coeluciones entre los propios productos de transformacin generados, incrementan la dificultad para una identificacin correcta de los mismos, especialmente cuando stos no han sido previamente descritos, debido a la complejidad de los espectros obtenidos. En este caso, la realizacin de anlisis utilizando ionizacin qumica positiva (PCI), con metano como gas reactivo, puede ayudar a resolver este problema. La simplicidad de los espectros obtenidos con PCI y la presencia de series de aductos caractersticos del uso de metano como gas reactivo, [M+C2H5]+ y
[M+C3H5]+, nos permiten detectar la presencia de ms de un ion molecular en el mismo espectro. Las figuras 3.5 y 3.6 muestran la secuencia seguida en la identificacin del compuesto C-8 mediante el uso de ionizacin qumica positiva. En los anlisis mediante impacto electrnico, el pico correspondiente a este compuesto (tr=10.82 min) fue identificado por la base de datos Wiley275 como el ster metlico del cido hexadecanoico (Figura 3.4A), con un 93% de concordancia entre espectros. Sin embargo, la observacin del espectro de masas de la muestra (Figura 3.4B) permita detectar la presencia de iones (m/z 181, 214, 251 principalmente) que no correspondan con el espectro identificado por la base de datos. La obtencin del espectro de ionizacin qumica (Figura 3.5) mostraba ms fragmentacin de la que es usual obtener por esta tcnica de ionizacin dbil. Una observacin ms detenida del espectro permiti detectar dos series de iones [M+H]+, [M+29]+ y [M+41]+ caractersticos, mostrados en rojo y azul en la figura, que evidenciaban la presencia de dos compuestos diferentes coeluyendo al mismo tiempo de retencin. Esto se confirm mediante la obtencin de los cromatogramas de iones seleccionados correspondientes a los iones de m/z 252 y 271, respectivamente, que evidenciaron la presencia de dos picos a tiempos de retencin muy prximos (Figura 3.6). Una vez confirmada la coelucin se pudo volver al cromatograma de impacto electrnico, separar ambos compuestos mediante cromatogramas de iones seleccionados e identificar el compuesto C-8 mediante la interpretacin del espectro de masas (Figura 3.7)
106 Tesis Doctoral
74
9000 7000 5000
41 57 89
80 100
181 251 106 126 143 164

120 140 160 180
SAMPLE B) Muestra
214 236
220 240 260
1700000 1500000 1300000 1100000 900000 700000 500000 300000
GC-MS (EI)
3000 1000
20 40 60
199
200
270
297 280 300 320 334 340 355
74
9000 7000 5000 3000
43
LIBRARY A) Wiley275
59 143 101
80 100
27
20 40
10.82
1000
60
125
120 140 160
185200
180 200 220
227 242
240 260
270
280 300 320 340
Hexadecanoic acid, methyl ester Match Quality: 93
9.50
10.00
10.50
11.00
11.50
12.00
Figura 3.4: Resultado obtenido de la bsqueda en la base de datos Wiley275 del compuesto C-8, de la Figura 3.3. A) Espectro de masas de referencia, B) Espectro de masas de la muestra.
252
75000 65000 1700000 1500000 1300000 1100000 900000 700000 500000 300000 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00
GC-MS (PCI)/CH3
55000 45000 35000 25000 15000
271
216 182
60 80 100 120 140 160 180 200 220
237
240 260
10.82
5000
280 299 292 231

280 300
Figura 3.5: Espectro de masas obtenido mediante PCI, utilizando metano como gas reactivo. En el espectro se observa la presencia de dos secuencias de iones caractersticas, las cuales se muestran en azul y rojo.
[M+H]+
GC-MS (PCI)/CH3
200000 150000 100000 50000 10.00 10.20 10.40 10.60 10.80
75000 65000 55000 45000 35000 25000 15000 5000 0 60
252
Ion 252.00
10.80
216 182
[M+29]+ 280 [M+41]+

292
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
11.00
11.20
11.40
11.60
11.80
+ 271 [M+H]
60000 200000 150000 100000 50000 10.00 10.20 10.40 10.60 10.80
Ion 271.00
10.83
50000 40000 30000 20000 10000 0
237
[M+29]+ 299 [M+41]+

311
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 11.20 11.40 11.60 11.80
11.00
Figura 3.6: Seleccin de iones, provenientes del cromatograma PCI, con la cual se detecta la co-elucin de dos compuestos a un tiempo de retencin muy prximo.
Adems de esta utilidad, el anlisis mediante ionizacin qumica positiva proporciona la confirmacin exacta del peso molecular de los PTs, esencial en la elucidacin estructural de compuestos desconocidos. As, por ejemplo, los compuestos C-8 a C-11 presentan en impacto electrnico un patrn de fragmentacin a baja m/z similar al del diclofenaco, ya que todos ellos comparten la estructura comn de la bifenilamina. La confirmacin del peso molecular junto con la presencia de patrones de abundancia isotpica y prdidas caractersticas como [MCl]+, [MCHO]+, [MCH3]+, permiten la asignacin de las estructuras.
108 Tesis Doctoral
GC-MS (EI)
50000 40000 30000 20000 10000
10.00 10.20 10.40 10.60 10.80 11.00 11.20 11.40
74
65000 60000 55000 50000 45000
43 87 55
Hexadecanoic acid, methyl ester Match Quality: 95
Ion 270
40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 40 60 80
101
100 120
143 181 201

140 160 180 200
227 251 270

220 240 260 280
297
300
11.60
11.80
12.00
12.20
12.40
12.60
12.80
181
75000 65000
-Cl -Cl
Cl H N CH3
50000 40000 30000 20000 10000

10.00
Ion 251
55000 45000 35000 25000

51
-CH3
216 65 89 106 152 166 125
235 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
251
Cl
15000 5000 0
37 40
270 260 280 300 320 340
355
10.20
10.40
10.60
10.80
11.00
11.20
11.40
11.60
11.80
12.00
12.20
12.40
12.60
12.80
Figura 3.7: Una vez detectada la co-elusin de ambos compuestos, se procedi a identificarlos en base a sus correspondientes espectros de masas en EI. Anlisis por LC-TOF-MS Dado que se prefiri la inyeccin directa de los extractos de las muestras en GCMS en lugar de la aplicacin de complejos y tediosos procesos de derivacin previos al anlisis, cabe pensar que productos de transformacin altamente polares o no voltiles pudieran haber escapado al anlisis. Por este motivo, la aplicacin de tcnicas de LC-MS fue una alternativa atractiva e inevitable para cubrir la identificacin de este tipo de compuestos. La aplicacin de diversas tcnicas de LC-MS para la identificacin de compuestos desconocidos ha sido ampliamente evaluada y discutida por otros autores [Malato et al., 2003, 2001; Marinas et al., 2001; Ferrer et al., 2003, 2004; Thurman et al., 2005]. Con estos antecedentes, en el presente estudio se eligi trabajar con un sistema LC-MS con analizador de tiempo de vuelo (TOF) por su capacidad para obtener espectros de masa exacta. En base a las medidas de masa exacta obtenidas, el sistema cuenta con un software que calcula la
composicin elemental y la frmula emprica de las molculas protonadas, proporcionando una lista de resultados que mejor se ajustan a la masa medida experimentalmente. La informacin disponible acerca de la composicin atmica de la molcula original y la observacin del patrn de abundancias isotpicas del ion molecular protonado puede utilizarse para delimitar el nmero de posibles resultados, los cuales, en todos los casos estudiados aqu, se redujeron a una sola opcin. A continuacin se describe la secuencia seguida en la identificacin de posibles productos de transformacin en las muestras:
Para cada pico del cromatograma de iones totales (TIC) se obtuvo el espectro de masa exacta. Se calcularon las frmulas empricas que mejor coincidan con la masa experimental, dentro de un margen de error previamente establecido, generalmente menor de 2-3 ppm. En esta etapa el conocimiento de la composicin elemental de la molcula original y del proceso fotoqumico al que es sometida permite delimitar el nmero y tipo de tomos presentes en la molcula, restringiendo as el nmero de resultados.
En el caso del diclofenaco, el nmero de tomos de cloro presentes en la frmula propuesta deba estar en concordancia con el patrn isotpico observado en el espectro.
Finalmente, la aplicacin de este proceso a los posibles iones fragmento presentes en el espectro, si los hubiere, permiti ayudar a confirmar la estructura molecular a travs de la identificacin de prdidas caractersticas.
Con este procedimiento, siete PTs fueron identificados. La Figura 3.8 muestra el cromatograma de LC-ESI-TOF-MS y el espectro obtenido para el compuesto C13. En la figura 3.9 se muestran los resultados generados por el software, donde se proponen las posibles formulas empricas y sus errores asociados. Tambin se muestra la masa exacta de cada fragmento, utilizada en la identificacin del compuesto C-13.
110 Tesis Doctoral
LC-TOF-MS (ESI-)
5.2e6 4.8e6
Intensity, counts
-TOF MS: 17.009 to 17.081 min from DCFNC_5Feb_SPE.wiff Agilent, subtracted (9.138 to 9.554 min) 7.8e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4 6.0e4
246.0329
m/z = 294
-COO-
Cl H N
COOH
4.4e6 4.0e6 3.6e6 3.2e6 Intensity, cps 2.8e6 2.4e6 2.0e6 1.6e6 1.2e6 8.0e5 4.0e5
5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0 60
202.0431
-Cl
8-Chlorocarbazole-1-formic acid C-13
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
m/z = 258
m/z = 240 m/z = 493 m/z = 479 m/z = 254
m/z = 246
10
12
14
16
18
Time, min
Figura 3.8: Cromatograma LC-TOF-MS obtenido en modo negativo y espectro de masas utilizado para identificar al compuesto C-13 (8-clorocarbazol-1-cido frmico).
-TOF MS: 17.009 to 17.081 min from DCFNC_5Feb_SPE.wiff Agilent, subtracted (9.138 to 9.554 min) 7.8e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4 6.0e4 5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0
246.0329
Max. 7.8e4 counts.
-COO-
LC-TOF-MS Modo: (ESI-)
La Tabla 3.2 muestra informacin relativa a la frmula emprica de los iones (des)protonados de los productos de transformacin identificados, sus masas experimental y calculada y el error entre ambas masas, que fue menor de 0.3 mDa o 1.0 ppm en todos los casos. Las estructuras propuestas para estos compuestos se muestran en la Figura 3.10.
112 Tesis Doctoral
Intensity, counts
202.0431
-Cl
Cl H N
COOH
m/z = 246.0329 Error < 1ppm
167.0547
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z, amu 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
Frmula Emprica
C13H9NO2Cl
Masa Calculada
246.0327
Error (mDa)
0.19
Error (ppm)
0.98
Figura 3.9: Espectro de masas del compuesto C-13, donde se muestran los posibles resultados, formulas empricas y errores asociados a la masa exacta sealada. Se ha insertado la estructura de la formula emprica de este compuesto.
Tabla 3.2: Datos de masa exacta, error y frmula emprica obtenidos para los productos de transformacin del diclofenaco identificados por TOF-MS. Compuesto(mo do de ionizacin) C-1 (ESI-) C-3 (ESI+) C-4 (ESI +) C-6 (ESI-) C-7 (ESI-) C-12 (ESI+) C-13 (ESI-) C14H9NO2Cl C13H11NOCl C13H9NOCl C14H10NO3 C14H9NO4 C13H10NO2Cl2 C13H9NO2Cl Formula Masa calculada (m/z) 258.0327 232.0523 230.0367 240.0666 254.0458 282.0083 246.0327 Masa experiment al (m/z) 258.0330 232.0524 230.0368 240.0667 254.0460 282.0084 246.0329 Error (mDa) 0.3 < 0.1 < 0.1 < 0.1 0.2 < 0.1 0.2 Error (ppm) 1.0 0.1 0.4 0.3 0.8 0.3 0.7
Las medidas de masa exacta de los iones fragmento presentes en los espectros de masas fueron en nuestro caso de particular importancia en la elucidacin estructural de los PTs. La presencia de grupos funcionales cidos en la molcula (-COOH) (compuestos C-1, C-6, C7 y C-13) pudo ser confirmada por la presencia del fragmento [M-H-COO]- en el espectro ESI(). Los iones a m/z 258, 240, 254 y 246 todos mostraban una prdida de 43.9898 uma +/- 0.0002, que corresponda con la masa exacta para la prdida de CO2 (la masa calculada para CO2 es 43.9898 uma). Esto demuestra la perdida de CO2 e indica la presencia de grupos carboxilo en la estructura de los productos de degradacin. En la figura 3.9 se muestra como ejemplo la identificacin del compuesto C-13, cido frmico 8-clorocarbazol y la masa exacta de sus fragmentos. Estos compuestos no estuvieron presentes en los extractos obtenidos por SPE con las columnas Oasis MAX, con el procedimiento de elusin aplicado, debido a su gran retencin en los grupos funcionales de intercambio aninico del adsorbente, lo cual tambin confirmaba la presencia de tales grupos. Los compuestos C-3 y C-12 fueron caracterizados por la aparicin en su espectro ESI(+) de fragmentos correspondientes a la prdida [M H2O]-, tpica de
alcoholes, que fue tambin confirmada mediante medidas de masa exacta. Aunque no es posible determinar con exactitud la posicin exacta del grupo OH en la molcula, una estructura provisional se propone en la figura 3.10. Adems de los productos de transformacin mencionados anteriormente, tambin pudo ser detectada la presencia de dmeros durante la fotlisis del diclofenaco. La formacin de dmeros ha sido previamente referenciada en procesos de foto-degradacin [Lnyi y Dinya, 2003]. Estos compuestos no han sido asignados, pero considerando algunas caractersticas de su estructura, tal como la presencia de grupos cidos o la ausencia de tomos de cloro, puede decirse que se forman a partir de intermedios de diclofenaco de alto peso molecular que coexisten en la mezcla de reaccin. Anlisis hechos con un detector UV a 400 nm han revelado que algunos de estos dmeros, con pesos moleculares de 494, 481 y 524, son los compuestos coloreados de ms abundancia a sta longitud de onda, siendo en parte responsables de la aparicin de color durante el proceso de foto-transformacin. Un ejemplo de esto es el ion de masa exacta m/z 479.1248, al cual le corresponde, como el mejor ajuste, la frmula emprica C28H20N2O6 (molcula neutra). Esta frmula corresponda exactamente al doble del compuesto C-6, lo que sugiere la formacin de un dmero a partir de este compuesto. El ion de masa exacta m/z 493.1041 tambin est muy relacionado con el compuesto C-6, diferencindose solamente en un oxgeno y tres tomos de hidrgeno. De este modo, parece que la prdida de un tomo de cloro origina la estructura carbazlica la cual va seguida de la sustitucin del segundo tomo de cloro por un grupo hidroxilo para formar el compuesto C-6. Esta molcula es activada por la presencia de una estructura fenlica y por tanto es fcilmente dimerizada. Esta ruta de degradacin explica la formacin de dmeros libres de cloro y puede considerarse la principal causante de que la solucin adquiera un color oscuro.
114 Tesis Doctoral
Cl H N
CH2COOH
I
Cl CH2COOH H N
Cl
II
Cl CH3 H N
Mw=295 C-1 Mw=259
GC-MS LC-MS MAX
Ib
CH2-CHO
OH H N
CH2COOH
Ia
C-2 Mw=243
Cl H N
Cl
C-6 Mw=241
C-8 Mw=251
Cl H N CHO
Cl H N
CHO
OH
Cl CH2OH H N
CH2COOH H N
Cl
HO
Cl
C-3 Mw=231
Cl
C-9 Mw=265 C-7 OH Mw=254

Cl H N CHO
C-12 Mw=281
CHO H N
C-4 Mw=229
DIMERS FORMATION
Cl H N
C-10 Mw=231
Cl H N COOH
Cl H N
C-5 Mw=201
C-13 Mw=247
C-11 Mw=203
Figura 3.10: Esquema de la ruta propuesta de foto-transformacin del diclofenaco, por el efecto de la exposicin a la radiacin solar.
3.1.2 Ruta de degradacin fotoltica A la luz de los PTs detectados, en la figura 3.10 se propone una posible ruta de degradacin. Dado que solo pudo obtenerse en este estudio informacin cualitativa o semi-cuantitativa, para la mayora de los productos de fotodegradacin identificados no fue posible realizar un estudio cintico, ya que la concentracin de estos compuestos es desconocida debido a la falta de estndares analticos. El proceso de foto-transformacin ms significativo que sufre el diclofenaco es la foto-ciclacin, para dar lugar al correspondiente carbazol mono-halogenado (C1), (Ruta I). Este proceso ha sido descrito anteriormente [Moore, 1998; Poiger et al., 2001; Encinas et al., 1998] y es el punto de partida de otros procesos posteriores que afectan principalmente a la cadena alqulica. Se ha encontrado que la deshalogenacin del clorocarbazol juega un papel menor en la fototransformacin, ya que el tomo de cloro est presente en la mayora de los fotoproductos detectados (Ruta Ia) Sin embargo, la sustitucin del tomo de cloro por un grupo hidroxilo se observa con la formacin del 8-hidroxi-9,9a-dihidro-4aH-carbazol-1-yl cido actico (C-6), Ruta Ib. Como se coment anteriormente, ste producto altamente reactivo es el precursor de la formacin de dmeros. La formacin de carbazoles es de gran inters debido a su relacin con la fototoxicidad causada por el diclofenaco [Moore, 1998]. Adems de esta ruta de foto-transformacin, tambin se observ una ruta de degradacin alternativa; Ruta II. Esta ruta se inicia con la descarboxilacin del diclofenaco (C-8) y la posterior oxidacin de la cadena alqulica (C-9 a C-13). La presencia de esta ruta alternativa no ha sido referenciada anteriormente y representa una importante contribucin en el proceso de transformacin de este compuesto. Los compuestos C-8 a C-10 y C-11 fueron identificados utilizando GC-MS, siendo el C-10 el ms abundante. Todos ellos resultaron ser muy estables, permaneciendo hasta el final del experimento. En LC-MS, el
116 Tesis Doctoral
compuesto C-13 tambin mostr un pico intenso y muy estable. Compuestos de menor peso molecular, procedentes de la rotura de la estructura carbazlica o de la bifenilamina no fueron identificados, sugiriendo la estabilidad de estas estructuras.
3.2 Descomposicin del diclofenaco
3.2.1 Aplicacin de procesos de oxidacin avanzada Una vez estudiado el efecto de la degradacin natural que sufre el diclofenaco en agua y expuesto a la radiacin solar, se realizaron experimentos fotocatalticos a una concentracin inicial constante, e igual a la utilizada anteriormente. Es un hecho que la radiacin solar por si misma puede producir la foto-degradacin de sta sustancia. Sin embargo tal foto-degradacin natural es muy lenta, bajo condiciones aerbicas y buena iluminacin, y en este escenario la mineralizacin del diclofenaco nunca ocurri. Por tanto tiene sentido planear un mtodo de tratamiento que s sea capaz ce mineralizar este contaminante, como es la oxidacin avanzada.. Ya se ha aclarado el efecto de precipitacin del diclofenaco, evitando su confusin con una posible descomposicin. Sin embargo, en este punto se debe remarcar que en la revisin bibliogrfica no se ha reportado este efecto. Casi todos los POAs utilizados anteriormente para degradar el diclofenaco han sido llevados a cabo en un medio neutro o bsico. Mayoritariamente se han aplicado tcnicas con ozono, ozono/UV, y H2O2/UV. En todos los casos los valores de pH fueron ajustados a 7 mayores agregando hidrxido de sodio. El nico trabajo donde se realiz la degradacin del diclofenaco utilizando el proceso foto-Fenton a un valor de pH de 2.8 [Ravina et al., 2002] no menciona la precipitacin de este frmaco, que sin embargo s se ha producido claramente durante los experimentos comentados en esta Tesis.
3.2.2 Tratamiento foto-Fenton en agua estndar a pH neutro. El hecho de la precipitacin de hierro a pH neutro es bien conocido, sin embargo la precipitacin de hierro y el envejecimiento de ese precipitado es un proceso complejo. En general, la hidrlisis que presenta el hierro inorgnico (Fe3+) se desarrolla en varios pasos, 1) formacin de especies de bajo peso molecular, 2) formacin de un polmero catinico rojo, 3) envejecimiento del polmero, con una conversin eventual a fases oxidadas, 4) precipitacin de las fases de oxidadas, directamente de los precursores de bajo peso molecular [Flynn, 1984]. Estos precipitados, xidos e hidrxidos, contienen mucha agua y un carcter fuertemente catinico, co-precipitan con muchos otros iones e incluso sustancias orgnicas. Al precipitar las especies de bajo peso molecular, forman polmeros constituidos por esferas de 2 4 nm de dimetro, los cuales se condensan para formando el susodicho polmero. El hierro frrico (Fe3+) hidrolizado no est en equilibrio y con la temperatura el proceso de envejecimiento se acelera. Los cambios reportados en el envejecimiento de la solucin que contiene el polmero incluyen cambios en la composicin qumica, el pH, incremento de la absorcin de luz por turbidez, y la degradacin del polmero. Los precipitados de las soluciones hidrolizadas de hierro Fe3+ son depositados en un perodo de das a semanas; la precipitacin contina por meses. Utilizando rayos X se demostr que los precipitados formados consisten en -FeO(OH) (geotita) y algunos -FeO(OH) (lepidocrocita). Las cantidades y velocidades de formacin de estas dos especies indican que la geotita es el producto fundamental del envejecimiento del polmero. El mecanismo sugerido para la formacin y envejecimiento del polmero hidroltico involucra la condensacin del monmero [Fe(H2O)6-n(OH)n](3-n)+ para formar polmeros en los cuales el hierro Fe3+ est enlazado con grupos OH- (Ec. 3.1) o con iones O2- (Ec. 3.2) [Flynn, 1984].
118 Tesis Doctoral
[Fe(OH)2+]n + Fe3+ + 2H2O [Fe(OH)2+]n [FeO(OH)]n + nH
[Fe(OH)2+]n+1 + 2H+
+
(3.1) (3.2)
Debido a que las soluciones son irradiadas en los experimentos, paralelamente al proceso de envejecimiento, se produce la fotoreduccin del hierro coloidal y de los precipitados de hierro que pueden liberar hierro ferroso (Fe+2) a la solucin el cul ser re-oxidado, por el perxido de hidrgeno (H2O2) produciendo radicales hidroxilo (OH) por medio de la reaccin de Fenton, o por el oxgeno disuelto en el agua. La foto-reduccin provocada por la luz es una reaccin de transferencia de carga ligando metal (ec. 3.3), donde el ligando puede ser agua o una sustancia orgnica, ecuaciones (3.4) (3.6) [Wells et al., 1991; Pulgarin y Kiwi, 1995; Zepp et al., 1992]. Adicionalmente, los precipitados de hierro Fe+3 pueden tener propiedades semiconductoras, por tanto es posible que se produzcan pares electrn-hueco (y la subsiguiente produccin de OH), una vez que incide un fotn sobre el sustrato precipitado y consecuentemente se provocar la oxidacin de los contaminantes adsorbidos en la superficie del mencionado sustrato [Pulgarin y Kiwi, 1995; Leland, 1987]. [Fe3+L] + hv [Fe(H2O)]
3+
[Fe3+L]* Fe
2+
Fe2+ + L* + OH + H
2+ +
(3.3) (3.4) (3.5)
+ hv
2+
[Fe(OH)]2+ + hv [Fe(OOC-R)] + hv
Fe2+ + OH Fe + CO2 + R
(3.6)
El equilibrio de concentraciones de las especies ms importantes de los complejos acuosos del hierro frrico, en presencia nicamente de agua y a diferentes valores de pH, para una concentracin de hierro frrico de 20 mg/L, se muestran en la figura 3.11.
pH [-]
1 10 1.E-03
-3
1.5
2.5
3.5
4.5
10-4 1.E-04
c [M]
10 1.E-05
-5
10 1.E-06
-6
10 1.E-07
-7
3+ [Fe(H2O)6] aaaaaaaaaaaa [Fe(H2O)3(OH)3] ddddddddddddddd
2+ [Fe(H2O)5(OH)] bbbbbbbbbbbbbbb 4+ [Fe2(H2O)8(OH) eeeeeeeeeeee 2]
[Fe(H2O)4(OH)2]+ ccccccccccccccccc
Figura 3.11: Especies de hierro frrico presentes en solucin acuosa a diferentes valores de pH. Constantes de equilibrio [Flynn, 1984], grfica [Gernjak, 2006]. Tomando en cuenta todo lo anterior, el tratamiento foto-Fenton se desarroll con hierro recin precipitado, a pH 7, para prevenir la insolubilizacin del diclofenaco. Este proceso, presuntamente poco eficiente, tiene inters en aquellos casos concretos dnde el contaminante objetivo puede insolubilizarse si se trabaja al pH ptimo del proceso de foto-Fenton (alrededor de pH 2.8). Los experimentos se llevaron a cabo con agua estndar para proveer un medio neutro. La adicin de hierro tuvo un efecto acidificante debido a la formacin de diferentes especies frricas precipitadas, como se ha mencionado anteriormente. Si la concentracin de hierro es suficientemente alta, el efecto acidificante puede exceder la capacidad de tampn del agua estndar. Por este motivo la cantidad de carbonato sdico se increment utilizando una relacin molar de 3:1, comparada a la que se indica en el protocolo de preparacin de agua estndar [Standard Methods, 1998]
120 Tesis Doctoral
70
60
1
50
0.05 0.075 0.2 0.75

2
70
30
1
60 25
"Iluminacin", t = 0 1 Diclofenaco + adicin de Fe 2 Adicin de H2O2
50
H2O2 consumido, mM
Diclofenaco, mg/L
20
40
40
COD, mg/L
15
30
30
10
20
20
10
10
a)
0 -50 0 50 100 150 200 0 0 -50 0 50 100 150
b)
200
t30W, min
t30W, min
Figura 3.12: Tratamiento Foto-Fenton en agua estndar a pH neutro, a diferentes concentraciones de hierro (0.05, 0.075, 0.2, 0.75) mM. Comparacin de (a) concentracin de diclofenaco y consumo de perxido, y (b) Carbono orgnico disuelto (COD). En la figura 3.12 (a) y (b), se muestran los resultados de la descomposicin de diclofenaco, el consumo de perxido y la mineralizacin del carbono orgnico disuelto (COD). En la figura 3.12 (a) se observa que la descomposicin del diclofenaco tiene un comportamiento muy parecido a una reaccin de primer orden, mientras que el consumo de perxido y la mineralizacin COD tienen una velocidad constante, tpico de una cintica de orden cero. Para todas las concentraciones de hierro, la velocidad de descomposicin del diclofenaco as como el consumo de perxido perecen ser iguales. En contraste con la mineralizacin del COD, que a primera vista, parece depender de la concentracin de hierro. Pero, si la rpida disminucin inicial, con la concentracin ms alta de hierro (Fe = 0.75 mM) no se considera, se podra suponer tambin una velocidad constante, sin importar la concentracin de hierro utilizada. La explicacin podra ser que el precipitado de hierro amorfo
est cargado positivamente [Flynn, 1984], mientras que a pH 7 el diclofenaco est mayormente deprotonado, es decir, cargado negativamente. De este modo la adsorcin del diclofenaco en el precipitado de hierro esta favorecida; y cuanto mayor sea la cantidad de hierro precipitado, mayor ser este efecto. Por lo tanto debe aclararse que la disminucin del COD a elevado concentracin de Fe no es debida a mineralizacin de diclofenaco, sino a que est adsorbido. Este efecto no se aprecia en los resultados de degradacin del diclofenaco (medido por HPLC), debido a la manera en que las muestras son preparadas para su anlisis. Las muestras son mezcladas con una cantidad equivalente de acetonitrilo, el cual desorbe el diclofenaco del precipitado de hierro, previamente a su filtracin e inyeccin en el HPLC. La similar velocidad de reaccin, a diferentes concentraciones de hierro podra explicarse teniendo en cuenta la geometra del reactor, absorcin de luz y adsorcin de diclofenaco. Los tubos absorbedores de los CPCs tienen una dimetro interno de 29.7 mm y teniendo en cuenta que la profundidad de penetracin de los fotones solares depende de la densidad ptica de la solucin, y que el xido de hierro amorfo absorbe fuertemente la luz, entonces tenemos que toda la radiacin activa disponible es absorbida an en el experimento con menor concentracin de hierro (0.05 mM). Esto provoca que la velocidad de reaccin sea independiente de la concentracin de hierro. Esto tambin puede explicar el consumo linear de perxido. El consumo de ste depende de la cantidad de Fe2+ disponible para que transcurra la reaccin de Fenton. Y como el Fe2+ es producido a partir de la fotoreduccin de Fe3+, si toda la radiacin disponible es absorbida a la menor concentracin de hierro, el aumentar la concentracin de Fe no tiene ningn efecto sobre la produccin de Fe2+ por fotoreduccin. Por tanto, el consumo de H2O2 ser mnimo en esas condiciones y por tanto el mismo que para mayores concentraciones de hierro. Ya que se plantea que la produccin de OH tiene que ver con el comportamiento como semiconductores de los precipitados de hierro, la degradacin del diclofenaco podra tambin seguir un mecanismo del tipo Langmuir-Hinshelwood en la
122 Tesis Doctoral
superficie del hierro precipitado, provocando que la reaccin tenga un comportamiento de primer orden aparente. Esto sera vlido tanto para una transferencia de carga de ligando a metal como para una oxidacin, por medio pares electrn-hueco fotogenerados [Pulgarin y Kiwi, 1995]. En todos los experimentos la descomposicin del diclofenaco tom entre 100 110 minutos, para alcanzar este punto el consumo de perxido fue de entre 35 40 mM. Esto excede bastante la demanda estequiomtrica terica de perxido para la oxidacin de 50 mg/L de diclofenaco (5.3 mM), Ec. 3.7. Si el mecanismo responsable de la oxidacin del diclofenaco es una reaccin en la superficie del hierro precipitado, se podra proponer un tratamiento alternativo sin la necesidad de agregar perxido de hidrgeno, ya que el hierro ferroso es oxidado a hierro frrico que precipita en medio neutro [Wells et al., 1991].
33 O2 2
C14 H 10 Cl 2 NNaO2
14CO2 + 4 H 2 O + 2 HCl + NO3 + Na +
(3.7)
3.2.3 Tratamiento foto-Fenton en agua estndar a pH 2.8 El tratamiento foto-Fenton, normalmente se realiza en medio cido para mantener el hierro en solucin. Algunos autores han trabajado en ciertos rangos de pH ms bajos, sin embargo la mayora sigue la recomendacin clsica de Pignatello [Pignatello, 1992], que propone un pH de 2.8 como valor ptimo. En medio cido el diclofenaco se vuelve prcticamente insoluble.
Consecuentemente, las especies oxidantes producidas en el proceso de fotoFenton (OH) tienen que difundir hacia el contaminante precipitado o reaccionar con la pequea porcin disuelta. En el caso que nos ocupa se producen ambos procesos simultneamente. La mineralizacin del COD, la descomposicin del diclofenaco y la evolucin de los iones cloruro y amonio, utilizando una concentracin de hierro de 0.075 mM, se muestran en la figura 3.13, en la cual
se aprecia que el COD y la concentracin de diclofenaco disminuyen una vez que el cido y el hierro se han agregado, pero esto sucede antes de la adicin de perxido de hidrgeno, indicando la precipitacin del diclofenaco. El comportamiento a partir de ese momento de diclofenaco (y por tanto del COD) es provocado por un proceso continuo de precipitacin de diclofenaco, descomposicin de diclofenaco (precipitado y en disolucin) y redisolucin de diclofenaco precipitado; hasta alcanzar una descomposicin y mineralizacin casi completa.
50
Diclofenaco y COD, mg/L
40
Diclofenaco COD Cl + NH4
Cloruro terico
"Iluminacin", t = 0 1 Diclofenaco, ajuste de pH 2 pH 2.8 + adicin de Fe 3 Adicin de H2O2
14
12
30
6 20
Amnio terico
10
3
2
0 -50 0 50 100 150 200 250
t30W, min
Figura 3.13: Tratamiento Foto-Fenton de diclofenaco en agua estndar a pH 2.8, concentracin de hierro 0.075 mM. De este modo, las mediciones del COD y de la concentracin de diclofenaco durante el experimento, no garantizan la correcta evaluacin de la descomposicin de esta sustancia. Por tanto, la evolucin de los iones inorgnicos puede dar una indicacin del estado del proceso de oxidacin; estos 124 Tesis Doctoral
NH4 y Cl , mg/L
10
iones al ser solubles pueden ser medidos a travs de cromatografa inica. La liberacin de cloro (en forma de cloruro) del anillo aromtico es uno de los primeros pasos en la oxidacin de compuestos aromticos mediante procesos avanzados de oxidacin. De sta manera, la evolucin de la cantidad de cloruro liberada puede ser usada para contrastar los resultados del anlisis del diclofenaco mediante HPLC de los experimentos desarrollados en medio neutro y a pH 2.8. La mineralizacin del nitrgeno orgnico en la molcula del diclofenaco, el cul une sus dos anillos aromticos, es un poco ms lenta que la evolucin del cloruro (figura 3.13). Casi nada del nitrgeno orgnico fue mineralizado a nitrato, comparado con la cantidad de amonio (menos del 3%). Por consiguiente solo se consider la evolucin del amonio. Los resultados indican una mineralizacin completa del nitrgeno orgnico en un estado muy avanzado de la mineralizacin del diclofenaco. Debido a la estructura molecular es probable que la liberacin del nitrgeno sea uno de los ltimos pasos antes de que la mineralizacin sea completa. En este capitulo se abunda al discutir la ruta de degradacin del diclofenaco mediante foto-Fenton, unas pginas ms adelante. Aunque la concentracin de hierro es muy diferente, habiendo un factor de 25 entre la concentracin ms baja y la ms alta en los experimentos mostrados en la Figura 3.14, las diferencias entre la evolucin del cloruro y el amonio, as como tambin el consumo de perxido, son pequeas. Solamente el experimento en el que se utiliz la concentracin ms alta de hierro es claramente ms rpido. En todos los experimentos la evolucin del cloruro tom alrededor de 100 minutos, lo cual es muy similar a la desaparicin de diclofenaco medida con el HPLC en los experimentos a pH alrededor de 7, como se muestra en la figura 3.12. En cambio la evolucin del amonio tom ms o menos el doble de tiempo, entre 160 y 250 minutos, siendo las diferencias para las cuatro concentraciones de hierro un poco ms pronunciadas.
14
Cloruro terico
250
"Iluminacin", t = 0 1 Adicin de H2O2

3
12
Amnio terico
200
Cl , mg/L
0.03 0.075 0.3 0.75

1
H2O2 consumido, mM 1
10
150
NH4 , mg/L
100
50
a)
0 -50 0 50 100 150 200 0 -50
b)
0 50 100 150 200
0 0 50 100 150 200
c) t30W, min
t30W, min
t30W, min
Figura 3.14: Tratamiento Foto-Fenton de diclofenaco en agua estndar a pH 2.8, a diferentes concentraciones de hierro (0.03, 0.075, 0.3 y 0.75 mM). (a) Evolucin de cloruro, (b) Evolucin de amonio, (c) Consumo de perxido de hidrgeno. No se detect consumo de perxido antes de iniciar la iluminacin. Esto mismo sucede en el caso del perxido consumido. Sin embargo, como se mencion antes, con relacin a las diferentes concentraciones de hierro, la velocidad de descomposicin del perxido de hidrgeno es muy similar. Experimentos hechos conteniendo solo perxido de hidrgeno y hierro sin ninguna sustancia orgnica, mostraron un comportamiento similar en cuanto a la descomposicin de perxido. Una explicacin puede ser que la generacin de radicales hidroxilo es mayor a mayor concentracin de hierro, pero debido a la baja concentracin de las sustancias que reaccionan con este radical (diclofenaco y sus PDs,) la reconstitucin de perxido de hidrgeno a partir de los radicales producidos est favorecida. Por tanto se sugiere que la concentracin de radicales en la solucin tambin es mayor a mayor concentracin de hierro, lo cual podra explicar porque los productos intermedios de descomposicin solubles son mineralizados y la produccin de amonio es ms rpida a mayor concentracin de hierro. Por otro lado, la oxidacin del diclofenaco, como lo indica la aparicin de cloruro, parece depender de su solubilizacin. Esto tambin se indica por el alto consumo de perxido hasta completar la decloracin (80 110 mM, figura 3.14c), el cual es alrededor de 15 126 Tesis Doctoral
20 veces la demanda estequiomtrica de la mineralizacin total del diclofenaco. Si el diclofenaco estuviera bien disuelto desde el principio, ese consumo sera claramente menor.
3.2.4 Tratamiento foto-Fenton en agua destilada sin control de pH. Los tratamientos realizados en medio cido y neutro mostraron ser desventajosos con respecto a la precipitacin del hierro y del diclofenaco. Por consiguiente, el tratamiento foto-Fenton se llev a cabo con un pH inicial de alrededor de 7, en agua sin capacidad de tampn, as que el pH resultante cambiara de 7 a 3.7 durante el tratamiento, debido a la formacin de intermedios como cidos carboxlicos y por efecto de la liberacin de cloruro al medio. Esto significa que el diclofenaco ser ms soluble ya que el pH est ms cercano a su pKa (4.5) [Packer et al., 2003] y la precipitacin del hierro ser menor produciendo posiblemente una aceleracin de todo el proceso de descomposicin. En los resultados que se muestran en la figura 3.15, la descomposicin del diclofenaco, medida con HPLC, casi coincide con la evolucin del cloruro, aunque el pequeo incremento en la concentracin del cloruro, una vez que el diclofenaco ha desaparecido, indica que algo de diclofenaco ha precipitado debido a la disminucin del pH. Es importante remarcar que esta precipitacin no pudo ser claramente determinada debido a que la descomposicin del diclofenaco fue muy rpida. De nuevo la formacin de amonio es ms lenta que la evolucin de cloruro. El perfil de mineralizacin del COD tambin indica que el proceso es determinado por el equilibrio de solubilidad del diclofenaco, que es a su vez influenciado por el pH. El incremento de la concentracin del COD despus de los primeros minutos es debido a la formacin de intermedios solubles, los cuales son mineralizados posteriormente en el transcurso de la reaccin. Con el fin de conocer parte de estos productos de oxidacin muy solubles, se determin la concentracin de algunos cidos carboxlicos (actico,
frmico, malico y oxlico). Coincidiendo con la mxima concentracin de COD despus de 30 minutos, la concentracin mxima detectada de stos cidos fue de 0.1, 1.5, 4.0, 7.0 mg/L, para el cido malico, actico, frmico y oxlico, respectivamente. El cido actico parece ser el ms recalcitrante de ellos, y junto con el cido oxlico el nico que se encontr en concentraciones bajas hasta el final del experimento. No se detectaron cidos que contuvieran tres carbonos. Los PDs son estudiados con ms detalle en la siguiente seccin de este captulo.
H2O2 cons. (mM), Diclofenaco y COD, mg/L
60
12
1
50
Cloruro terico
40
pH
"Illumination", t = 0 1 Diclofenac + Fe addition 2 H2O2 addition
30
20
Amnio terico
10 2
0 -50 0 50 100 150 200
t30W, min
Figura 3.15: Tratamiento Foto-Fenton de diclofenaco en agua destilada, con un pH inicial de 7 y una concentracin de hierro de 0.05 mM. Si para asegurar la descomposicin de diclofenaco se utiliza la medida del HPLC, este proceso tiene una duracin de alrededor de 50 minutos y el consumo de perxido de hidrgeno hasta este momento est en torno a 15 mM. Esto es considerablemente ms rpido que en los otros casos, y el consumo de
128 Tesis Doctoral
pH, NH4 y Cl , mg/L
Diclofenaco DOC H2O2 Cons. 10 Cl + NH4
perxido es mucho menor. Ahora bien, si se utiliza la evolucin del cloruro para asegurar el resultado, el tiempo de descomposicin aumentar hasta los 100 minutos aproximadamente, como en los otros tratamientos, y el consumo de perxido se incrementar a 40 mM. De los resultados obtenidos parece adecuado trabajar en un rango de pH de entre 4.5 5 que asegura una buena solubilidad de diclofenaco y una lenta precipitacin del hierro. Al mismo tiempo la adicin de sustancias acomplejantes de hierro puede tambin mejorar el proceso a este pH, como lo han propuesto diferentes autores [Sun y Pignatello, 1992; Paciolla et al., 2002; Safazadeh-Amiri et al., 1996] para prevenir la precipitacin del hierro.
3.2.5 Tratamiento fotocataltico (TiO2/UV) en medio neutro. La fotocatlisis con dixido de titanio (TiO2) se utiliz despus de haber abordado todas las dificultades, que se han comentado anteriormente, sobre la insolubilidad del diclofenaco a pH muy bajo, ya que la fotocatlisis se puede realizar sin ajuste de pH. El experimento se realiz en agua estndar con 0.2 g/L de TiO2 en suspensin, sta concentracin se utiliz ya que se encuentra cerca del valor ptimo de acuerdo a experimentos previos [Fernndez-Ibez et al., 1999] en los mismos fotoreactores. En la figura 3.16 se muestran los resultados de este experimento. La evolucin del cloruro coincide de nuevo con la descomposicin del diclofenaco medida con HPLC. La descomposicin total del diclofenaco tarda alrededor de 200 minutos, lo cual es mucho mas lento que cualquiera de los tratamientos de Foto-Fenton utilizados. Como se puede observar en la figura 3.16, la cintica de descomposicin encaja en una cintica de seudoprimer orden, de acuerdo con el mecanismo generalmente aceptado de LangmuirHinshelwood para la fotocatlisis del dixido de titanio [Herrmann, 1999] cuando la concentracin del contaminante es baja. La mineralizacin del COD inicia despus de una perodo de 100 minutos, lo cual es tpico en una oxidacin fotocataltica, ya que las primeras reacciones que toman lugar no
inducen a la mineralizacin, sino que solamente oxidan parcialmente al compuesto, generndose los PDs que se estudian ms adelante.
60
50
Diclofenaco DOC Cl + NH4

ln (C0/C)
14
12
10
3
8
2
30
6
1
20 4
0 0 50 100 150 200
10
t30W, min
0 0 50 100 150 200 250 300 350
t30W, min
Figura 3.16: Tratamiento fotocataltico (TiO2, 0.2 g L-1) en agua estndar, sin control de pH.
3.3 Determinacin de productos de degradacin y ruta de degradacin de diclofenaco mediante procesos de oxidacin avanzada.
A partir de los resultados anteriores, y con el fin de investigar los productos de degradacin generados con los dos procesos de oxidacin avanzada descritos antes, se realizaron otra serie de ensayos especficos para este fin.
130 Tesis Doctoral
NH4 y Cl , mg/L
40
3.3.1 Tratamiento foto-Fenton. En estos ensayos se utiliz la concentracin de hierro de 0.05 mM (la ms baja de las utilizadas en la seccin 3.2), a fin de reducir la velocidad de reaccin, y poder evaluar correctamente los PDs obteniendo una mayor cantidad de muestras. En la Figura 3.x se observa que los PDs principales son generados durante los primeros 20 minutos. Adems, se decidi trabajar en agua desmineralizada sin control de pH para evitar la precipitacin del diclofenaco o del hierro, en los momentos iniciales de la degradacin. Los experimentos mostrados en las siguientes figuras fueron hechos en condiciones similares a las comentadas en seccin 3.2.4, pero repetidos varias veces con el objeto de asegurar los resultados y evaluar correctamente los PDs. Como puede observarse en la Figura 3.17, la concentracin de diclofenaco decrece rpidamente durante la reaccin Fenton (Fe2+) en la oscuridad, reduciendo la cantidad inicial en ms del 50%. La reduccin del COD tambin fue evaluada durante este perodo, reducindose significativamente. Despus de iluminar el fotoreactor (foto-Fenton), aunque la velocidad del proceso general empez a disminuir, este condujo a la completa mineralizacin. Hasta ese momento hay dos efectos presentes:
La degradacin parcial de la molcula principal, con la subsiguiente aparicin de algunos PDs, y La rpida disminucin del pH, la cual desencadena la ya comentada precitacin del diclofenaco.
Despus de t = 0, la concentracin de diclofenaco permaneci baja y la de COD se increment debido al mencionado proceso de precipitacin redisolucin degradacin del diclofenaco, que ya se coment en la seccin 2 de este captulo.
100
1
7 pH, durante el experimento 6 5 4
90 80 70
Diclofenaco, adicin de Fe 2 Adicin de H2O2
Oscuridad
Iluminacin
3 2 -40
Concentracin
60 50 40 30 20 10 0 -40 -20 0 20
40
80
120
Diclofenaco, mg/L COD, mg/L H2O2, mM
40
60
80
100
120
t30W
Figura 3.17: Evolucin de la concentracin de diclofenaco (50 mg/L), COD y del pH con el tiempo de iluminacin, durante el tratamiento con foto-Fenton (concentracin de Fe2+ 0.05 mM). El COD se incrementa, hasta un mximo de concentracin que es mayor que el obtenido a t = 0 (16 mg/L a 30 min), pero nunca tan alto como el punto donde se aadi el perxido (24 mg/L a -15 min, correspondiente aproximadamente a 45 mg/L de diclofenaco). Esto significa que a t = 0 algo del diclofenaco inicial ya ha precipitado. A los 43 min, 96% del compuesto principal ya haba desaparecido y el COD ya haba cado de nuevo hasta el mismo valor que tena en el momento de exponer la solucin a la radiacin solar (t = 0). La velocidad de consumo de perxido fue aproximadamente constante hasta los 43 min, incrementndose posteriormente hasta muy cerca del punto donde se logra la mineralizacin del COD (t = 70 min). Se podra concluir que despus de t = 43 min, todo el
132 Tesis Doctoral
contenido orgnico estaba ya en disolucin porque la velocidad de consumo de perxido de hidrgeno es la ms alta de todo el experimento. Al final del tratamiento, a pesar de la precipitacin del diclofenaco al inicio, todo el contenido orgnico ha sido mineralizado, como lo evidencia no solo las medidas de COD, sino tambin la liberacin de cloro y amonio de la molcula de diclofenaco. Otras consideraciones respecto a estos experimentos ya se comentaron en la seccin 3.2.4. La figura 3.18 muestra la generacin de cloruro y amonio.
12
60
Illumination
10
Cl max
50
NH4 y Cl , mg/L
40
30
20
NH4 max
2 10
0 -40 -20 0 20 40 60 80 100
0 120
t30W
Figura 3.18: Evolucin de Cloruro y Amonio durante el proceso foto-Fenton. Prcticamente todo el cloro (94%) y alrededor del 60% del amonio aparecen alrededor de los 20 minutos despus de la iluminacin, coincidiendo con la desaparicin de la mayora de los PDs, como se aprecia en la Figura 3.18. Sin embargo debe ser aclarado que solo el 6% de cloruro se libera entre el minuto 20 y el 80, lo cual correspondera a una pequea parte de diclofenaco re-disuelto y degradado durante este perodo (entre el minuto 20 y 60), durante el cual los intermedios identificados, mostrados en la Figura 3.20, no fueron detectados. Se
Cl + NH4 Diclofenaco COD
asume que pequeas cantidades de ellos se formaron y se degradaron muy rpidamente. nicamente se encontraron cidos carboxlicos en el agua a partir de 20 minutos de tratamiento. Por otro lado, la evolucin del amonio proporcion otra medida para asegurar la degradacin de diclofenaco y de sus intermedios principales, debido a que el nitrgeno en la molcula que mantiene unidos a los dos anillos aromticos. Despus de 40 min, 80% del amonio aparece y el diclofenaco casi desaparece.
3.3.2 Identificacin de productos de degradacin. Al igual que en estudios previos, se procedi a la identificacin de los principales productos de degradacin generados durante el tratamiento por foto-Fenton, con el fin de obtener un mayor conocimiento de los mecanismos de reaccin y proponer una posible ruta de mineralizacin. La oxidacin del diclofenaco por foto-Fenton condujo a la formacin de un gran nmero de intermedios, algunos de los cuales fueron identificados mediante GC-MS y LC-TOF-MS. La identificacin por GC-MS se realiz mediante la comparacin directa del espectro de masas de los picos del cromatograma, en modo full-scan, con bases de datos de espectros de masas o por interpretacin de los patrones de fragmentacin, tal como se coment en los estudios de fotolisis. De igual modo, el anlisis con ionizacin qumica positiva (PCI) fue de gran ayuda, haciendo posible la asignacin de los iones moleculares en el espectro de masas. Los PDs polares y semi-polares fueron analizados por LC-TOF-MS con interfase de electrospray. La identificacin de los productos de degradacin del diclofenaco se bas en medidas de masa exacta, mediante el procedimiento descrito en el captulo anterior. Los anlisis por LC-TOF-MS mostraron la pronta aparicin de dos picos durante la reaccin Fenton (Fe2+/H2O2), antes de la exposicin a la luz solar. Estos picos 134 Tesis Doctoral
eluan antes que el diclofenaco a tiempos de retencin de 21.4 y 20.9 min. El primero de ellos, designado como D1 en la Figura 3.20, presentaba una masa exacta de 312.0193 uma, la cual dio como mejor ajuste la frmula C14H11NO3Cl2 (molcula neutra), con una exactitud de masa de 1.3 ppm. Esta frmula corresponda a la adicin de un tomo de oxgeno, lo cual es consistente con la formacin de derivados monohidroxilados. El segundo pico, designado como D2 en la Figura 3.20, mostraba una masa exacta de 310.0031 uma, la cual se ajustaba prcticamente sin error (-0.4 ppm) a la frmula C14H9NO3Cl2 (molcula neutra), que contena a un tomo de oxgeno ms y dos tomos de hidrgeno menos que el diclofenaco. La presencia de ambos compuestos sugera que la degradacin inicial de diclofenaco era debida al ataque inicial de radicales OH en el anillo aromtico, produciendo un derivado monohidroxilado, el cual posteriormente era oxidado al correspondiente intermedio iminoquinona. Aunque la informacin analtica disponible no posibilita la localizacin precisa del ataque del radical OH en la molcula, consideraciones concernientes a la reactividad de las diferentes posiciones activas de la molcula del diclofenaco [Moore, 1998] y la bibliografa disponible, permitieron sugerir que la hidroxilacin tena lugar preferentemente en la posicin C-5 como la opcin ms probable. Es sabido que los radicales
OH son especies fuertemente electroflicas y no
selectivas. En base a su carcter electroflico y de acuerdo a la teora de los orbitales frontera, los lugares con ms alta densidad electrnica en los orbitales moleculares ocupados de ms alta energa (HOMO, Highest Ocuppied Molecular Orbital) en el estado fundamental, son ms susceptibles al ataque de radicales
OH [Pignatello, 1992]. Aunque ambas posiciones C-4 y C-4 presentan un
coeficiente HOMO relativamente alto [Vogna et al., 2004], se ve ms probable que la posicin 4, la cual est en posicin para con respecto al sustituyente NH en el anillo aromtico mas rico en electrones, sera el ms reactivo hacia los oxidantes. Esta hiptesis es consistente con publicaciones anteriores [Sun y Pignatello, 1992; Paciolla et al., 2002].
2.7e7 2.6e7 2.5e7 2.4e7 2.3e7 2.2e7 2.1e7 2.0e7 1.9e7 1.8e7 1.7e7
Intensity, counts 2.1e5 2.0e5 1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 312.0193
Intensity, counts Intensity, counts Intensity, counts
2.5e5 2.4e5 2.3e5 2.2e5 2.1e5 2.0e5 1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 306 308
310.0037
26.81
Diclofenac
312.0013
311.0067 313.0042 314.0002 310.2068 310 312 314 m/z, amu 316 318 320
D8
30.05
314.0168
1.6e7 Intensity, cps 1.5e7 1.4e7 1.3e7 1.2e7 1.1e7 1.0e7 9.0e6 8.0e6 7.0e6 6.0e6 5.0e6 4.0e6 3.0e6 2.0e6 1.0e6 0.0 2
D1
20.92
313.0222 315.0198
305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 355 m/z, amu
D2
21.47
D4 D3
16.47 17.52
D6 D7
22.69 24.57
D5
31.43
10
12
14
16
18
20 Time, min
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
Figura 3.19: Cromatograma obtenido mediante LC-(ESI+)TOF-MS correspondiente al anlisis de un extracto de la mezcla de reaccin tras 10 min de tratamiento con foto-fenton. En l se muestran los PTs identificados y los espectros de masas, de los compuestos D1 y D2. Inicialmente, los compuestos D1 y D2 produjeron respuestas similares en el LCMS. En ese momento la solucin en el reactor era incolora. Una vez que la solucin fue expuesta a la radiacin solar y que la reaccin foto-Fenton (Fe3+/H2O2/UV-vis) iniciara, D2 se increment a mas del doble de D1, dando a la solucin el color marrn-rojo oscuro caracterstico del grupo iminoquinona. Despus de esto, muchos otros picos fueron detectados (Figura 3.19). Solo los mas significativos fueron investigados y en base al conocimiento previo de este tipo de foto-reacciones, se propusieron las estructuras que se muestra en la Figura 3.19. En la Tabla 3.3 se muestran los datos relacionados con las masas exactas experimentales y calculadas de iones protonados, el error entre ellos y
136 Tesis Doctoral
la formula emprica propuesta que corresponden a los compuestos identificados. Las masas exactas resultantes para estos compuestos fueron encontradas con un error de menos de 0.7 mDa 2.5 ppm en todos los casos. La gran exactitud en los resultados obtenidos puede ser atribuida a la manera en que el instrumento procesa todos los datos, todo el tiempo y la manera de calcular la masa exacta. Este instrumento utiliza una fuente de ionizacin con doble nebulizador y un sistema automtico de calibrado continuo, el cual introduce las masas de referencia interna (121.0509 y 922.0098) a una velocidad de flujo muy baja, combinando esto con el software utilizado que constantemente autocalibra y graba los resultados de las masas de referencia interna conjuntamente con los datos que se van generando de las muestras. Esta estrategia proporciona una exactitud mejorada en comparacin con muchos detectores TOF anteriores, los cuales aplican una calibracin de masas externa.
Tabla 3.3: Medidas de Masa Exacta obtenidas de los espectro LC-TOF-MS, de los productos de degradacin protonados identificados. Compuesto D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 Frmula C14H12NO3Cl2 C14H10NO3Cl2 C14H11NO4Cl C14H10NO4Cl2 C13H10NOCl2 C13H10NO2Cl2 C13H8NO2Cl2 C14H10NO2Cl2 Masa Calculada (m/z) 312.0188 310.0032 292.0371 325.9981 266.0133 282.0083 279.9926 294.0083 Masa Experimental (m/z) 312.0193 310.0031 292.0373 325.9983 266.0132 282.0084 279.9926 294.0090 Error mDa 0.4 -0.1 0.2 0.1 -0.2 < 0.1 <0.1 0.7 Error ppm 1.3 -0.4 0.6 0.5 -0.7 0.3 -0.2 2.3
Los anlisis realizados por GC-MS condujeron a la identificacin de otro grupo de compuestos (D9, D10, D11 y D12) los cuales no poseen el grupo
iminoquinona.
Las
estructuras
de
estos
compuestos,
representados
grficamente en la figura 3.20, fueron tentativamente asignadas a partir de los espectros de masas en modo full-scan. Los anlisis realizados con ionizacin qumica positiva (PCI), utilizando metano como gas reactivo, proporcionaron una confirmacin precisa del peso molecular de los compuestos lo cual es esencial para la propuesta de las estructuras. La evolucin en el tiempo de algunos de los principales PDs identificados se representa en la Figura 3.21B. Solo aquellos PDs que son ms representativos y presentan una respuesta ms alta fueron incluidos para simplificar la grfica, aunque el resto de compuestos exhibieron un comportamiento similar. Se puede observar en la grfica que los compuestos D1 y D2 aparecieron con una respuesta significativa antes de la exposicin a la radiacin solar. Otros PDs con alto peso molecular (D3-D5, D9-D13) tambin aparecen a t30W = 0 pero con una respuesta considerablemente menor y alcanzaron su mximo de concentracin entre los 4 y 8 minutos de tratamiento. De aqu en adelante cuando sus concentraciones relativas, basadas en el rea relativa de los picos en el cromatograma, empiezan a decrecer aparecen los cidos carboxlicos. Utilizando cromatografa inica se consigui la identificacin de cuatro cidos orgnicos, los cuales fueron: actico, malico, oxlico y frmico. Estos cidos constituyen el ltimo paso en el proceso de mineralizacin. Su evolucin en el tiempo est representada en la Figura 3.21C, donde el efecto de la degradacin mineralizacin del diclofenaco puede ser observada ms claramente. La concentracin mxima alcanzada por estos cidos fue de 0.1, 1.5, 4.0 y 7 mg/L, para malico, actico, frmico y oxlico respectivamente. El cido actico parece ser el ms recalcitrante de ellos y junto con el cido oxlico fue el nico que fue encontrado en bajas concentraciones, hasta el final del experimento.
138 Tesis Doctoral
H2C COOH N O Cl O
COOH Cl H N Cl
DICLOFENAC Mw:295
OH CH2 H N Cl
H2C
OH
H2C
COOH N Cl
Cl
H2C
COOH Cl H N Cl
HO HO
H2C
Cl
D3 Mw:291
H2C COOH N O Cl OH CH3 N O H2C OH N O Cl CHO N O Cl Cl Cl
D2 Mw:309
H2C CO N Cl Cl
D1 Mw:311
H3C HN O Cl
D9 Mw:281
CH3
H N Cl
Cl
HO HO
D4 Mw:325
D8 Cl Mw:293 D5 Mw:265
Cl
D15 Cl Mw:203
HN
D10 Mw:251
Cl H2C OH H N Cl HC HC O H N Cl Cl Cl OH Cl Cl
D16 Cl Mw:189 D6 Mw:281

H2N
D11 Mw:267
O H N Cl
Cl
Cl
D17 Cl Mw:161
OH HN Cl Cl
D13 Mw:281
H2N
D7 Mw:279
D18 Mw:177
D12 Mw:265
D14 Cl Mw:177
OH
Figura 3.20: Ruta de degradacin propuesta para la degradacin del diclofenaco por medio del tratamiento foto-fenton.
50
C, mg/L
40 1 30 20 10
2 3
A
Diclofenaco, adicin de Fe Diclofenac + Fe, adicin de H2O2 Diclofenac + Fe + H2O2, iluminacin Diclofenaco COD
D5 D6 D3 D1 D2 D4
0 7 4.50x10
Area
Iones
3.00x10
7
B
1.50x10
7
0.00
C, mg/L
6 4 2 0 -30 -20 -10 0 10 20 30
cidos Orgnicos C
Acetato y Glycolato Frmico Malico Oxlico
40
50
60
70
80
90
100
110
t30W
Figura 3.21: Evolucin de los principales productos de degradacin (B), durante el proceso foto-Fenton. A) Evolucin del diclofenaco y el carbono orgnico disuelto, C) cidos carboxlicos detectados.
3.3.3 Ruta de degradacin. La mayor parte de los compuestos identificados por LC-TOF-MS, representados dentro del recuadro en la Figura 3.20, presentan la estructura iminoquinona, sugiriendo la formacin de D2 como la principal ruta de degradacin del diclofenaco utilizando el proceso foto-Fenton. La degradacin posterior sucede a travs de un proceso de etapas mltiples, las cuales incluyen reacciones de hidroxilacin de los derivados iminoquinona (D2) a travs del ataque de radicales
OH (D3 y D4); reacciones de descarboxilacin en la cadena aliftica; etapas de
oxidacin posterior (D5, D6 y D7); y una posible ciclacin de D1 con prdida de una molcula de H2O (D8). La hidroxilacin de D2 en el anillo dihalogenado
140 Tesis Doctoral
conduce a la formacin de los compuestos D3 y D4. D4 resulta del ataque directo de los radicales OH en el sitio ms reactivo, tomo C-4. El ataque de los radicales OH en los sitios halogenados tambin conduce a la formacin de D3, por reemplazo de un tomo de cloro con un grupo OH [Malato et al., 2003]. Otra etapa de la degradacin de los derivados iminoquinonicos fue la descarboxilacin del grupo cido fenilactico para formar D5, y las etapas posteriores de oxidacin de la cadena aliftica para formar el correspondiente alcohol y aldehdo, CH3, CH2OH, CHO. Conjuntamente con esta ruta de degradacin principal, una ruta alternativa tambin fue identificada, la cual no pasa a travs de la formacin de derivados iminoquinonicos. Estos compuestos principalmente resultan de la reaccin directa de la cadena aliftica en la estructura del diclofenaco. Fue posible identificar cinco estructuras (D14-D18), presentes en cantidades muy pequeas) que resultaron de la apertura del anillo sin cloros, despus de la oxidacin hidroxilacin y/o hidrlisis, seguida por una etapa de descarboxilacin posterior. Todos ellos mantenan el grupo 2,6-dicloroanilina, sugiriendo que la posicin C1 no era susceptible al ataque de radicales OH, como haba sido referenciado antes [Vogna et al., 2004]. La ruta de degradacin propuesta, aunque con algunas similitudes, difiere de otras previamente reportadas en la literatura. As, en fotlisis, la transformacin del diclofenaco se debe principalmente a la fotociclacin inicial del diclofenaco que da lugar a la formacin de derivados carbazolicos [Safazadeh-Amiri et al., 1996]. Utilizando ozono/H2O2/UV [Vogna et al., 2004], se tiene un similar pero no idntico mecanismo de reaccin, el cual en este caso conduce a la formacin de intermedios hidroxilados y otros productos provenientes de la ruptura del enlace C-N, sin embargo no se observa la formacin de los derivados iminoquinonicos. Evidencia de la formacin de D2 durante la oxidacin del diclofenaco con HOCl, myeloperoxidasa (MPO), o neutrfilos activados, fue reportada por primera vez
por Miyamoto y colaboradores [Miyamoto et al., 1997], quienes concluyeron que la formacin de D2 era probablemente responsable de la hepatotoxicidad asociada al diclofenaco. Othman y colaboradores [Othamn et al., 2000] tambin hacen referencia a la formacin de D2 durante la hidroxilacin preparativa del diclofenaco con H2O2 o t-BuOOH en presencia de porfirina de hierro. Sin embargo, a pesar de las similitudes, puede concluirse que el diclofenaco sigue diferentes mecanismos de reaccin dependiendo del tratamiento de degradacin utilizado.
142 Tesis Doctoral
CAPITULO
Capitulo 4
DEGRADACIN DE DIPIRONA MEDIANTE FOTOCATLISIS CON TiO2 Y FOTO-FENTON. IDENTIFICACIN DE PRODUCTOS DE TRANSFORMACIN Y SEGUIMIENTO DE LA TOXICIDAD
4.1 Introduccin
Este captulo aborda los estudios de degradacin mediante Foto-Fenton y fotocatlisis con TiO2 del frmaco dipirona. La Dipirona es un popular analgsico y antipirtico tambin conocido como Metamizol o Novalgin. Su uso como analgsico ha generado una gran controversia debido a su asociacin con trastornos sanguneos potencialmente mortales como la agranulocitosis. Por ese motivo ha sido prohibido en muchos pases como Estados Unidos, Reino Unido o Suecia. Sin embargo, en pases como Italia, Alemania o Espaa, su uso est muy extendido tanto en pacientes peditricos como en adultos, debido a su fuerte efecto analgsico, bajo costo, y por no requerir receta mdica [Ergn et al., 2004]. De especial relevancia es el uso en hospitales como tratamiento post operatorio, lo cual se ha puesto de manifiesto en el elevado contenido de su
143
Degradacin de dipirona. Identificacin de productos de transformacin...
principal metabolito, la metilaminoantipirina (MAA), en las aguas residuales hospitalarias [Ramos et al., 2007]. La Dipirona (figura 4.1a) se encuentra dentro del grupo de medicamentos denominados prodrogas. Este tipo de frmacos son administrados en su forma inactiva o significativamente menos activa, una vez ingeridos son metabolizados in-vivo al compuesto activo. Por tanto la Dipirona una vez ingerida, se hidroliza espontneamente en su principal metabolito (figura 4.1b) 4-metilaminoantipirina (4-MAA), y posteriormente en una gran variedad de compuestos va reacciones enzimticas (Figura 4.2). (a)
CH3 N O N CH3 N S O
Dipirona: Formula Emprica: C13H16N3NaO4S Peso Molec.: 333.3
CH3 O Na
(b)
CH3 N O N CH3 NH CH3
4-MAA: Formula Emprica: C12H15N3O Peso Molec.: 217.2
Figura 4.1: Estructura qumica de (a) Dipirona como sal sdica, (b) 4-MAA principal metabolito hidrolizado.
144 Tesis Doctoral
Los metabolitos generados naturalmente no son biodegradables, aunque en general todava se conoce poco sobre su comportamiento y persistencia en el medio ambiente.
N O
N O S O
DIPYRONE
Na O-
N O
HN
4-MAA
N N O HN
N O O
H2N
4-AA
4-FAA
N O
HN
4-AAA
Figura 4.2: Metabolitos de la Dipirona producidos naturalmente en el cuerpo humano [Gmez et al., 2007]. Presencia de los principales metabolitos como MAA, N-acetil-4aminoantipirina (AAA), N-formil-4-aminoantipirina (FAA) ha sido detectada en aguas superficiales y efluentes de plantas de tratamiento de aguas residuales en concentraciones significativamente altas (Tabla 4.1). Dada su incompleta eliminacin con los tratamientos biolgicos convencionales, las EDAR suponen una fuente puntual de contaminacin de estos compuestos que contribuyen al continuo aporte de
los mismos a las aguas naturales. Este hecho justifica el inters de investigar la aplicacin de tratamientos alternativos que minimicen o reduzcan su entrada al medio ambiente.
Tabla 4.1: Concentraciones medias y ms altas de los metabolitos de la dipirona encontradas en aguas residuales y medioambientales Agua Efluente de Efluente de superficial hospital EDAR Referencias Compuesto [g/L] [g/L] [g/L] Media-Mayor Media-Mayor Media-Mayor 1.05 9.25 0.26 0.36 1486 4304 0.33 0.63 Martnez-Bueno, 2007 Ternes, 2001 Gmez, 2007 Martnez-Bueno, 2007 Zuehlke, 2004 Moldovan, 2006 Wiegel, 2004 Feldmann, 2007 Martnez-Bueno, 2007 Zuehlke, 2004 Moldovan, 2006 Wiegel, 2004 Feldmann, 2007
4-MAA
4-FAA
3.40 10.1 0.85 2.00 1.81 2.20
0.07 1.00 0.27 0.51 0.22 0.71
4-AAA
7.30 25.00 2.90 7.00 4.44 4.87
0.12 1.00 0.99 1.50 0.23 0.69
4.2 Estudios de hidrlisis y fotlisis

Como ya se ha comentado, la dipirona una vez ingerida se hidroliza espontneamente dando lugar a su principal metabolito, la 4-metilaminoantipirina (MAA) [Ergn et al., 2004]. Similar comportamiento fue observado en los estudios de hidrlisis realizados en disolucin acuosa a diferentes valores de pH (natural, 3 y 9), en los que se pudo comprobar como la completa transformacin de dipirona en MAA tena lugar en menos de una hora en todos los casos (Figura 4.3), mantenindose esta ltima estable por un largo periodo de tiempo. 146 Tesis Doctoral
Ambos comportamientos explican que solo se encuentren referencias de la presencia de MAA u otros metabolitos generados a partir de ste, tanto en aguas naturales como residuales (Tabla 4.2). En base a esto, estudios posteriores de fotlisis y fotocatlisis fueron realizados con disoluciones acuosas de MAA en lugar de con dipirona. As, para los experimentos de fotlisis se prepar una solucin de 20 mg/L de dipirona, a pH natural. Una vez que la dipirona se hubo transformado en MAA, la solucin fue expuesta a la luz solar una media de 8 horas diarias, con agitacin constante, durante un periodo de cuatro semanas.
50
Dipirona
MAA
40 30 20 10
mu 0min es 10min tra 20min 30min 50min 17 18 19 20 12 13 14 15 16
10 11 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 tiempo de elucin, min
Figura 4.3: Cromatogramas superpuestos de HPLC-DAD (= 254 nm) dnde se muestran los resultados de la hidrlisis de dipirona (muestras tomadas cada 10 minutos) y su transformacin en MAA.
mAu
20 18 16 14 C, [mg/L] 12 10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80
(a)
14 COD MAA pH 12 10 8 6 4 160 pH
100
120
140
tiempo, hr
MAA
Radiacin Solar (AM 1.5)
200
250
300
, nm
350
400
(b)
Figura 4.4: (a) Comportamiento del COD y el pH durante la fotlisis del MAA. (b) Espectro solar en la superficie terrestre y espectro de absorcin de MAA.
148 Tesis Doctoral
Durante este periodo la concentracin de MAA experiment una ligera reduccin de 1 mg/L y el COD 2 mg/L, como puede apreciarse en la Figura 4.4a. Esta estabilidad a la fotlisis directa puede explicarse por el escaso solapamiento entre el espectro de absorcin del MAA y el espectro de la radiacin solar (Figura 4.4b) que alcanza la superficie de la tierra (ASTM AM 1.5), y puede contribuir a la acumulacin de este contaminante en aguas superficiales, dado tambin el continuo aporte del mismo al medio ambiente a travs de las plantas de tratamiento de aguas residuales u otros focos puntuales. Este comportamiento justifica la necesidad de aplicar tratamientos alternativos que minimicen o eliminen la presencia de MAA en los efluentes, ya que su permanencia en el medio ambiente se confirma muy prolongada incluso bajo condiciones de insolacin idneas.
4.3 Tratamiento con foto-Fenton

Los experimentos utilizando el proceso foto-Fenton se realizaron a dos diferentes concentraciones de Fe2+, 2 y 20 mg/L. En los experimentos a 20 mg/L (figura 4.5), el MAA desapareci totalmente despus de 15 minutos sin iluminacin, debido a la reaccin Fenton (Fe2+ / H2O2) en la oscuridad. En ese momento, el COD haba disminuido alrededor de un 40% respecto a la concentracin inicial. Una vez que la solucin se expuso a la radiacin solar el COD disminuy rpidamente de 16 a 5 mg/L. Sin embargo, se necesitaron 80 minutos ms para alcanzar valores de 1 mg/L, mostrando que las ltimas etapas de mineralizacin fueron lentas. Despus de la desaparicin del MAA (t30W= 0 min), mediante los cromatogramas de HPLC-DAD no se detectaron intermedios de reaccin. Posiblemente en ese momento ya solo quedaban en disolucin compuestos que no eran retenidos correctamente en la columna cromatogrfica y/o no presentaban absorcin en el UV-Vis, escapando as a la deteccin (ms adelante se muestra que la
presencia de cidos carboxlicos justifica este resultado). Por tanto, se puede deducir que el tratamiento utilizando 20 mg/L de Fe2+ fue excesivamente oxidativo para permitir la deteccin y/o determinacin de cualquier intermedio de reaccin.
60
50 1 40 C, [mg/L]
1 adicin de Fe [20 mg/L] 2 adicin de H2O2 3 inicio de iluminacin
2+
1000
30 COD MAA H2O2
600
20
400
10 3 -20 0 20 40 t30W 60 80
200
0 100
Figura 4.5: Degradacin de MAA utilizando 20 mg/L de Fe2+. Se muestra tambin el consumo de H2O2 durante el tratamiento. Con la experiencia adquirida con la concentracin de 20 mg/L, los siguientes experimentos se realizaron utilizando una concentracin 10 veces menor, 2 mg/L. A esta baja concentracin de Fe2+, el MAA desapareci tambin despus de 15 minutos de reaccin en la oscuridad (Figura 4.6a). Sin embargo, la velocidad de degradacin del COD fue menor que con 20 mg/L de Fe2+, permitiendo la deteccin de productos de degradacin.
150 Tesis Doctoral
H2O2 consumido, [mg/L]
800
40 35 30 25 C, [mg/L] 20 15 10 5 0 -20
1 2
1 adicin de Fe [2 mg/L] y H2O2 2 inicio de iluminacin
2+
1600 1400 H2O2 consumido, [mg/L] 1200 1000 COD MAA H2O2 800 600 400 200
20
40
60
80
0 100 120 140 160 180 200
t30W
3.0 NH4
+
(a)
14 12 10
acetato formiato oxalato
2.5
propianoato
2.0 C, [mg/L]
1.5
C, [mg/L]
8 6 4 2 0 0 20 40
1.0
0.5
0.0 0 20 40 60 80 100 t30W 120 140 160 180 200
60
80
100 t30W
120
140
160
180
200
(b)
Figura 4.6: (a) Cintica de degradacin del MAA con el proceso foto-Fenton, utilizando 2 mg/L de Fe2+. (b) Evolucin de los principales cidos carboxlicos y especies inorgnicas detectadas.
A esta concentracin de Fe2+ (2 mg/L), la mineralizacin total tom un tiempo sustancialmente ms largo que con 20 mg/L y la mayora del tiempo se consumi en la mineralizacin de los compuestos presentes desde un COD de 6 mg/L hasta completar el experimento. Se conoce bien que en la reaccin fotoFenton se producen un gran nmero de radicales OH, siendo este radical altamente reactivo y no selectivo, pero especies con bajo contenido de carbono, como el cido carbmico (NH2COOH), urea (NH2CONH2), formamida (NH2HCO) o hidracinas pueden resistir este tipo de ataques [Calza et al., 2005] haciendo los ltimos pasos, hasta la mineralizacin completa del carbono orgnico, muy lentos. Aunque el MAA desapareci por completo antes de iluminar el fotoreactor, el COD solo decreci alrededor del 10% del valor inicial. Una vez que se inici la exposicin del reactor a la radiacin solar, el COD disminuy rpidamente en los siguientes 30 min del tratamiento. A partir de ah el COD experiment un descenso relativamente lento hasta los 60 min alcanzando una concentracin de 5 mg/L a partir de la cual la mineralizacin es tan lenta que se necesitaron 120 min ms de radiacin solar para alcanzar un COD final de 2.5 mg/L. La disminucin del COD se lleva a cabo principalmente en dos etapas, cayendo rpidamente de 20 a 5 mg/L (75% de mineralizacin) en los primeros 30 min, y luego muy lentamente de 5 a 2.5 mg/L (12.5% mineralizacin) en 160 min. El primer paso de descenso ms acusado del COD puede ser explicado por la mineralizacin del anillo pirazlico y sus sustituyentes alqulicos (responsables del 75% del COD del MAA). La segunda etapa, ms lenta, est relacionada con la apertura y mineralizacin del anillo aromtico, ms estable. Esto se explica por la formacin de cidos carboxlicos descritos como recalcitrantes para el proceso foto-Fenton [Kavitha y Palanivelu, 2004]. Los cidos carboxlicos y dicarboxlicos se conoce que forman complejos estables de hierro los cuales inhiben la reaccin con el perxido. Los cidos carboxlicos ms importantes encontrados fueron acetato, formiato y oxalato a unas concentraciones mximas
152 Tesis Doctoral
de 13, 6 y 5 mg/L (Figura 4.6b), respectivamente, detectndose tambin bajas concentraciones de propionato en algunas muestras. Estos compuestos estuvieron presentes en el transcurso de toda la degradacin, y a una concentracin significativa al final del tratamiento. La concentracin relativamente alta de estos cidos a t30W = 0 min, justo despus del proceso Fenton (en la oscuridad), muestra qu tan dbil es la molcula de MAA frente al ataque de los radicales OH, y sugiere qu enlaces sern los primeros en ser atacados. La discusin sobre la ruta de degradacin contiene ms informacin en este sentido.
4.4 Tratamiento mediante fotocatlisis con TiO2

Durante la fotocatlisis, como se muestra en la Figura 4.7a, el MAA se adsorbi ligeramente en el TiO2 (alrededor del 5%) y fue degradado de forma notablemente ms lenta que con el proceso foto-Fenton. La concentracin de MAA disminuy rpidamente del 95% al 30%, durante los primeros 20 min de tratamiento, y desapareci completamente despus de 60 min. La desaparicin del MAA sigui una cintica aparente de primer orden con k = 0.069 min-1, algo comn en fotocatlisis heterognea con TiO2. El clculo de la constante cintica con el proceso foto-Fenton no pudo hacerse dado que la desaparicin de MAA ocurra muy rpidamente durante la primera etapa en la oscuridad (reaccin Fenton). El COD disminuy casi al mismo ritmo que el MAA durante la primera etapa, y a una sustancialmente menor velocidad de mineralizacin al final del tratamiento. Los cidos carboxlicos detectados a concentraciones ms relevantes fueron maleato y propianoato, que alcanzaron concentraciones mximas de 13 y 8 mg/L, respectivamente.
40
1
35 30 25 C, [mg/L] 20 15 10 5 0 -20
1 adicin de TiO2 2 inicio de iluminacin
COD MAA
20
40
60 t30W
80
100
120
140
(a)
14 12 10 8 6 4 2 0
propianoato maleato
1.6 1.4 1.2 1.0 C, [mg/L] 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 10 20 30 t30W 40 120 140
acetato formiato piruvato oxalato + NH4
C, [mg/L]
10
20
30 t30W
40
120
140
(b)
Figura 4.7: (a) Cintica de la degradacin del MAA por medio de fotocatlisis con TiO2 (200 mg/L). (b) Evolucin de los principales cidos carboxlicos y especies inorgnicas detectadas.
154 Tesis Doctoral
Ambos
se
formaron
rpidamente
se
degradaron
ms
lentamente,
presumiblemente en cidos carboxlicos de menor peso molecular (acetato, formiato, piruvato, oxalato), los cuales siempre aparecieron a muy bajas concentraciones (figura 4.7b) durante el proceso. Esto puede ser debido a que los cidos carboxlicos de bajo peso molecular, se forman y se degradan continuamente a partir de los de mayor peso molecular, no dando lugar a que se acumulen a concentraciones significativas en el agua tratada durante la fotocatlisis con TiO2. As, los cidos carboxlicos encontrados a ms elevada concentracin durante el proceso fotocataltico fueron diferentes de los determinados durante el proceso foto-Fenton. En realidad, es posible que maleato y propianoato tambin se formaran a altas concentraciones durante las primeras etapas del foto-Fenton, pero su rpida transformacin en cidos carboxlicos de bajo peso molecular, podra impedir su deteccin. Debido a la formacin de pequeas cantidades de amonio, el pH se increment levemente durante las primeras etapas del tratamiento de 5.8 a 7.5, disminuyendo despus debido a la formacin de cidos carboxlicos hasta un pH de alrededor de 4 e incrementndose de nuevo al final debido a la mineralizacin de los cidos orgnicos.
4.5 Identificacin de productos de degradacin: anlisis por GCMS.

El anlisis con GC-MS con ionizacin por impacto electrnico condujo a la identificacin de 5 productos de degradacin (D1, D3, D4, D5 y D6) del MAA, los cuales fueron tentativamente asignados por su espectro de masas obtenido en modo full-scan. En la Figura 4.8 se muestra el cromatograma de una muestra tomada despus de 10 minutos de tratamiento con TiO2. Cuatro de los productos de degradacin (PDs), D3, D4, D5 y D6, mostraban el mismo patrn de fragmentacin con fragmentos a m/z 121, 107, 92 y 77 (Tabla 4.3). Todos ellos procedan de la apertura del heterociclo, consecuencia del
ataque de los radicales OH al doble enlace del anillo. El fragmento a m/z 121 corresponda al grupo Nfenilformamida, presente en todas las estructuras detectadas. Los compuestos D3 y D5 han sido previamente descritos [Wessel et al., 2006] como productos de biotransformacin detectados a nivel traza en muestras de orina humana. El compuesto D5 tambin ha sido detectado en agua subterrnea, presumiblemente proveniente de las industrias farmacuticas cercanas [Reddersen et al., 2002].
Tabla 4.3: Informacin sobre los compuestos detectados por GC-MS. Peso Tiempo molecular de retencin (PM) 18.28 17.88 18.38 12.53 8.05 9.92 217 203 249 220 164 164
Compuesto MAA D1 D3 D4 D5 D6
Masa de los fragmentos (%) 217 (50), 123 (11), 98 (9), 83 (48), 56 (100) 203 (70), 119 (39), 83 (55), 56 (100) 249 (6), 207 (20), 191 (63), 164 (41), 121 (100), 107 (15), 92 (16), 77 (17) 220 (26), 192 (15), 121 (100), 107 (10), 92 (25), 77 (27) 164 (62), 121 (81), 107 (57), 92 (100), 77 (20) 164 (65), 150 (22), 121 (100), 107 (23), 92 (25), 77 (24)
El nico PD detectado por GC-MS que todava conservaba el heterocclico fue la 4-aminoantipirina (D1). Su identidad fue tambin confirmada con la base de datos Wiley275 con un 70% de fiabilidad. La cintica observada para este compuesto tambin justifica su identidad ya que aparece tempranamente en el proceso y desaparece mientras los derivados procedentes de la apertura del anillo todava estn presentes.
156 Tesis Doctoral
1.4e+07
MAA
1.3e+07 1.2e+07 1.1e+07 1e+07 9000000 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000
D3 D1 D6 D5 D4
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
Figura 4.8: Cromatograma tpico de GC-MS de un muestra tomada despus de 10 min de tratamiento fotocataltico con TiO2.
4.6 Identificacin de productos de degradacin: anlisis por LCTOF-MS.

Siguiendo la estrategia descrita de forma ms detallada en el captulo 3, los anlisis mediante LC-TOF-MS permitieron la identificacin de cinco intermedios (D2, D7, D8, D9, D10), adicionales a los detectados con GC-MS. En la Figura 4.9 se muestra un cromatograma obtenido despus de 15 minutos de tratamiento en el cual todos los compuestos detectados estaban presentes en su mxima intensidad.
6x10
MAA
5x10
D3 D4
4x10
Intencidad
3x10
2x10
D10 D8 D7 D1 D9 D2
1x10
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
tiempo, min
Figura 4.9. Cromatograma obtenido mediante LC-TOF-MS despus de 15 min. de tratamiento fotocataltico (TiO2/UV), donde todos los productos de degradacin identificados estn presentes.
Las masas exactas, medidas por el TOF y calculadas por el software, de los iones moleculares protonados se muestran en la Tabla 4.4. Tambin se muestra el error entre ambos y la frmula emprica propuesta. En todos los casos se obtuvo una muy buena concordancia entre las medidas de masa exacta experimentales y las formulas propuestas (< 2.8 ppm de error), lo cual confiere una elevada certidumbre en la identificacin. La propuesta de estructuras qumicas fue posible tomando como base el conocimiento previo de la molcula precursora y del mecanismo del proceso oxidativo aplicado.
158 Tesis Doctoral
Tabla 4.4: Informacin analtica obtenida mediante LC-TOF-MS, a partir de los espectros de masa exacta de los PDs identificados. PD Tiempo de retencin Frmula del ion [M+H]+ Masa calculada (m/z) Masa medida (m/z) Error Error DBE (mDa) (ppm)
D10 D8 MAA D1 D7 D9 D2 D3 D4
4.0 4.1 6.9 7.5 8.9 9.6 12.0 12.3 15.3
C6H8N 94.0651 C12H16N3O2 234.1237 C12H16N3O C11H14N3O C9H11N2O3 218.1287 204.1131 195.0764
94.0652 234.1236 218.1287 204.1130 195.0759 232.1078 189.1017 250.1180 221.0918
0.07 -0.1 <0.1 -0.1 -0.5 -0.2 -0.5 -0.6 -0.3
0.8 -0.4 -0.4 -0.6 -2.6 -1.0 -2.8 -2.4 -1.2
3.5 6.5 6.5 5.5 5.5 7.5 6.5 6.5 6.5
C12H14N3O2 232.1080 C11H13N2O 189.1022 C12H16 N3O3 250.1186 C11H13 N2O3 221.092
El compuesto con frmula C12H16N3O2 (D8) corresponda a la adicin de un tomo de oxgeno en la estructura del MAA (C12H16N3O). Esto es consistente con la formacin de derivados hidroxilados, tpica de estos procesos y ya referida previamente, como consecuencia de la adicin de radicales OH al anillo aromtico, tal como se propone en la Figura 4.11. La oxidacin posterior de D8 produjo el correspondiente derivado iminoquinona (D9). La formacin de este tipo de estructuras es comn y ya se ha descrito con anterioridad para el diclofenaco. La observacin del parmetro DBE (del ingls, double bond
equivalency), que representa el nmero de anillos y dobles enlaces presentes en
la molcula, es consistente con las estructuras propuestas (Tabla 4.4). As, la presencia de un doble enlace adicional en la molcula de D9 con respecto a D8 corresponde con un incremento del DBE de 6.5 (5 dobles enlaces y dos anillos) a 7.5 (6 dobles enlaces y dos anillos). Este parmetro representa una gran ayuda a la hora de confirmar las estructuras propuestas. La formacin del compuesto D3, por oxidacin del doble enlace del heterociclo y correspondiente apertura del anillo, dio lugar a la aparicin de una serie de
159
derivados, consecuencia de sucesivas prdidas en las cadenas alifticas, como D4, D5, D6 y D7.
[D3 (C2H4O) (CH4N) O]+ 165.1019
O
2.2e5 2.1e5 2.0e5 1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 Intensidad 1.2e5 1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 50
H2N
[D3 C2H4O]+ 208.1076
O N N
[D3]+ C12H16N3O3+ 250.1186
Anilina 93.0572
C10H14N3O2+ 208.1081
C9H13N2O+ 165.1022
[D3]+ 250.1178
[D3 + Na]+ 272.1004
H2N
Anilina 93.0578
100
150
200 m/z
250
300
350
400
450
500
Figura 4.10: Especto de masa en LC-TOF-MS del compuesto D3, sus fragmentos de ionizacin con la masa exacta detectada y las estructuras con la masa exacta terica.
La identificacin de D3 fue confirmada por la presencia de fragmentos caractersticos a m/z 165 y 208, tambin presentes en el espectro de GC-MS, que correspondan a los iones [M+H-COCONHCH2]+ y [M+H-COCH2]+. La frmula emprica de ambos fragmentos fue confirmada con errores de -1.4 y -1.2 ppm, respectivamente, lo que una vez ms subraya la capacidad del TOF-MS para la identificacin de compuestos desconocidos. En la Figura 4.10 se muestra el espectro de masas obtenido en el TOF-MS para la identificacin del 160 Tesis Doctoral
compuesto D3. Finalmente, tambin se identific la presencia de anilina (D10) como etapa final de la oxidacin del anillo pirazlico.
O Na O S
O H N
DIPIRONA
N N O H N N N N
D9 PM=231
H N
MAA
PM=217
H2N
NH
H N
N N
D1 PM=203
O O N
N N
D3 PM=249
OH
D8 PM=233
O
NH O
O N N
D2 PM=188
O N
N
HN D4 PM=220 D6 PM=164
O N
HN
O
D5 PM=164
N N
HO
D7 PM=195
H2N
D10 PM=93
Figura 4.11: Ruta de degradacin del MAA, durante el tratamiento fotocataltico.
161
Observando las cinticas de los PDs principales, como se muestra en la Figura 4.12, se puede apreciar que la degradacin del MAA tiene lugar principalmente a travs de la oxidacin y la apertura del anillo heterocclico, ya que el anillo aromtico es ms estable y resistente a la degradacin. Las muestras del tratamiento con foto-Fenton son similares, excepto por las severas condiciones de oxidacin, que hace que la mayora de los compuestos presentes al inicio del experimento desaparezcan inmediatamente despus de la adicin de perxido.
3.0x10
7
40
2.5x10
2.0x10
Area
1.5x10
20 15 10
1.0x10
5.0x10
5 0
0.0 0 10 20 30 t30W 40 50 60 70
Figura 4.12: Evolucin de los PDs mas importantes, formados durante el tratamiento fotocataltico.
La mayora de los intermedios detectados mediante LC-TOF-MS, contenan nitrgeno en su estructura (la cintica del ion amonio se muestra en las Figuras 4.6 y 4.7). La informacin suministrada por cromatografa inica revela que el ion nitrato est presente a bajas concentraciones durante el tratamiento con TiO2, y el amonio tambin es insignificante.
162 Tesis Doctoral
MAA, [mg/L]
D3 D4 D9 D7 D10 D1 MAA
35 30 25
La molcula de MAA contiene una estructura pirazlica, la cual libera nitrgeno, de la parte (NH-NH), principalmente en forma de N2, gas, (70% de la cantidad estequiomtrica) y amonio (aproximadamente 7% de la cantidad estequiomtrica) [Calza et al., 2005; Waki et al., 2000]. Durante el tratamiento de foto-Fenton el amonio fue liberado lentamente, pero no fueron encontradas cantidades significativas al final del tratamiento. La presencia de anilina puede ser justificada ya que los ataques de los radicales OH tienden a ocurrir preferentemente en el tomo de nitrgeno en lugar del de carbono, debido a la mayor riqueza electrnica. De esta manera, la seccin (NH-C6H6) generalmente es oxidada a anilina. Este compuesto est presente como uno de los iones relevantes, por tanto el mecanismo propuesto es congruente con los datos experimentales.
4.7 Evaluacin de la toxicidad.

La evaluacin de la toxicidad de la disolucin a lo largo del proceso de degradacin se determin mediante la aplicacin del test de toxicidad BioTox, basado en la inhibicin de la luminiscencia emitida por la bacteria Vibrio fischeri. El procedimiento aplicado se explica con detalle en la seccin experimental. La toxicidad se establece como la concentracin de la muestra que causa una reduccin del 50% en la luz emitida medida con un luminmetro. La toxicidad de la solucin tratada fue determinada, utilizando solamente muestras provenientes del fotorreactor una vez que se inici la iluminacin sobre ste. En las Figuras 4.13 y 4.14 se muestra la evolucin de la toxicidad durante ambos tratamientos, foto-Fenton y TiO2, respectivamente. Todas las muestras evaluadas durante el tratamiento con foto-Fenton estuvieron por debajo del 50% de inhibicin, valor considerado como lmite por encima del cual la disolucin es considerada como txica. La escasa toxicidad detectada, la cual alcanz como mximo el 45% de inhibicin al inicio del ensayo, no puede
163
ser asociada con el MAA ya que ste ya haba desaparecido durante el tratamiento en oscuridad (reaccin Fenton), como se aprecia en la Figura 4.13. Los resultados demuestran que en el tratamiento mediante foto-Fenton no se forman productos de degradacin txicos. Sin embargo, no se produce un descenso de toxicidad, como sera lo deseable, mantenindose el % de inhibicin de la actividad bioluminiscente de la bacteria prcticamente constante a lo largo del proceso, incluso cuando el COD desciende considerablemente en el transcurso del mismo.
100 90 80 70 % Inhibicin 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 t30W 5min 15min 30min COD
24 22 20 18 COD, [mg/L] 16 14 12 10 8 6 4 90 100 110
Figura 4.13: Evolucin de la toxicidad y del carbono orgnico disuelto (COD) durante el tratamiento con foto-Fenton.
Las muestras analizadas durante el tratamiento fotocataltico con TiO2 mostraron un pequeo incremento de la toxicidad durante las primeras etapas del proceso, cuando los principales productos de degradacin generados estn presentes en
164 Tesis Doctoral
su concentracin ms alta, Figura 4.14. Este incremento solo se observa durante el tratamiento con TiO2 debido a que la velocidad de degradacin es ms lenta y la permanencia de MAA y los PDs ms prolongada.
100 90 80 70 % Inhibicin 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 t30W 40 50 60 70 5 min 15 min 30 min COD
25
20
10
Figura 4.14: Evolucin de la toxicidad y del carbono orgnico disuelto (COD) durante el tratamiento fotocataltico.
Tambin se puede observar que despus de 10 minutos de ambos tratamientos, foto-Fenton y TiO2, la concentracin del COD fue alrededor de 11 mg/L y 20 mg/L, respectivamente. Por tanto, a mayor concentracin de COD se detecta una toxicidad algo mayor. Pero cuando ambos tratamientos reducen el COD hasta un valor similar (aunque el TiO2 ms lentamente), el grado de toxicidad tambin es similar. No es muy arriesgado afirmar que por tanto los DPs formados mediante ambos tratamientos deben ser similares. Es de sealar que durante el tratamiento con TiO2 la toxicidad permaneci sobre el lmite de 50%,
165
COD, [mg/L]
15
mientras que la concentracin del MAA era significativa, t30 W < 40 min, MAA > 2.5 mg/L, como se puede apreciar en las Figuras 4.12 y 4.14. Por tanto, se puede concluir que el MAA puede suponer un riesgo cuando es vertido en el medio ambiente.
166 Tesis Doctoral
CAPITULO
Capitulo 5
DEGRADACIN DE VERDE MALAQUITA EN AGUA MEDIANTE IRRADIACIN CON LUZ SOLAR NATURAL. EVALUACIN DE LA CINTICA Y TOXICIDAD DE LOS PRODUCTOS DE TRANSFORMACIN
5.1 Introduccin
Este captulo describe los estudios de degradacin fotoltica del verde malaquita. El Verde Malaquita (VM) es un colorante catinico perteneciente al grupo de los conocidos como colorantes azicos. Su estructura se muestra en la figura 5.1. Se ha utilizado en un gran nmero de actividades industriales. En la industria acucola es utilizado como fungicida y antisptico, ya que es altamente eficaz contra infecciones provocadas por protozoarios y hongos [Alderman, 1985; Schnik, 1988; Srivastava et al., 2004]. Adems del efecto fungicida del VM, ste se utiliza tambin como colorante en la industria textil sobre algunos tipos de
167
Degradacin de verde malaquita
manufacturados, como son seda, lana, yute, piel, algodn o nylon; en la industria papelera; en la industria alimentria como aditivo y conservante o en el rea mdica tambin como desinfectante y como pigmento para muestras de microscopa [Culp y Beland, 1996].
H3C CH3 O
-
Verde Malaquita Oxalato:

OH
Formula Emprica: C25H26N2O4 Masa Exacta: 418.1893 Peso Molec.: 418.4849 Verde Malaquita:
N CH3
CH3
Formula Emprica: C23H25N2 Masa Exacta: 329.2012 Peso Molec.: 329.4575
Figura 5.1:. Estructura qumica de la sal del Verde Malaquita Oxalato.
El VM se prepara condensando una parte de benzaldehdo con dos partes de dimetilanilina, en presencia de cido sulfrico concentrado. Su constante de ionizacin (pK) es 6.9 y es estructuralmente similar a las aminas aromticas clsicas. El VM es un precursor de otros colorantes durante su produccin [Srivastava et al., 2004]. Durante su uso como colorante, se estima que entre el 1% y 15% del colorante se pierde [Mordirshahla et al., 2006] con las aguas de vertido, causando serios problemas en los tratamientos biolgicos. Los colorantes azoicos son el grupo ms amplio de colorantes sintticos y suelen ser resistentes a los procesos de biodegradacin. Solamente un grupo pequeo de bacterias anaerbicas pueden degradar colorantes de este tipo, transformndolos en aminas aromticas, las cuales suelen ser ms txicas que el colorante inicial [Hu et al., 2001].
168 Tesis Doctoral
El VM es un fungicida ilegal que se utiliza todava ampliamente en acuicultura. Su uso se ha convertido en una preocupacin, debido al riesgo que posee de llegar al hombre a travs de peces o crustceos sometidos a este tratamiento. Se sospecha que el VM es genotxico y cancergeno, y a pesar de que en varios pases se ha prohibido su uso, su utilizacin contina en muchos lugares del mundo, debido a su bajo costo, amplia disponibilidad y eficacia. El VM y su principal metabolito hidrolizado, Leuco-Malaquita (LM) han sido detectados a una concentracin final de 0.1 M, en muestreos aleatorios realizados en supermercados en Reino Unido [Culp et al., 2002; Mittelstaedt et al., 2004]. Hasta ahora, las industrias acucolas han estado utilizando el VM
extensivamente en los trpicos, a travs de mtodos de baos o descargas, sin poner ninguna atencin al hecho de que este compuesto puede ser absorbido sistemticamente y producir efectos internos significativos. Desde el punto de vista del medio ambiente, existe una preocupacin sobre el destino de ambos compuestos VM y LM. Adems una vez utilizado, el eliminar el exceso de VM es un problema importante que se presenta en la industria acucola, debido a que cantidades residuales de VM permanecen largo tiempo en las aguas de las lagunas de cra, despus de haberse aplicado este tipo de tratamiento [Srivastava et al., 2004]. Es tan amplio el uso de VM, que muy a menudo no se puede diferenciar si la exposicin del ser humano puede provenir del consumo de peces tratados con ellos y/o de la exposicin directa [Stammati et al., 2005]. Al tratarse de un compuesto diferente a los frmacos comentados con anterioridad (diferente estructura, diferente uso, diferente preocupacin medioambiental), de clara actividad fotoqumica y de difcil biodegradabilidad se ha decidido incluirlo tambin en este estudio.
169
5.2 Cinticas de degradacin

En paralelo a los estudios de degradacin fotoltica se realizaron ensayos de hidrlisis, a fin de conocer la contribucin de este fenmeno al proceso de degradacin global. Para ello se prepar una solucin de Verde Malaquita (VM) de la misma concentracin que la expuesta a la radiacin solar y se mantuvo en oscuridad, tomndose muestras diariamente para determinar posibles variaciones en la concentracin del compuesto. Se observ una disminucin del 45% de la concentracin inicial de VM despus de 145 horas, lo que demuestra que una parte importante de la degradacin de este compuesto era debida a la hidrlisis. Los experimentos de fotlisis se iniciaron con una solucin de 19 mg/L de VM, en forma de oxalato, la cual produjo un pH de 4.2. La disolucin se prepar y expuso a la radiacin solar (8 horas de exposicin diaria) de la forma descrita en la seccin experimental. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 5.2. En ella puede observarse como en las primeras 30 horas de iluminacin se produce una rpida disminucin de la concentracin de VM hasta un 50% del valor inicial. Despus de esta disminucin inicial, la concentracin del VM permaneci ms o menos estable durante un perodo de 20 horas, y despus de 50 horas de exposicin a la radiacin solar empez a degradarse de una manera ms lenta, hasta su total desaparicin despus de 210 horas, aproximadamente 26 das de exposicin. La concentracin de COD medida mostr un comportamiento similar con una disminucin lenta hasta alcanzar un valor de 9 mg/L al final del tratamiento, lo que indica una mineralizacin parcial de VM.
170 Tesis Doctoral
20 18 16 14 12 C, [mg/L] 10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 tiempo, hr VM COD pH
8 7 6 5 4 3 2 1 pH
171
Figura 5.2: Evolucin del VM, COD y pH durante el experimento de fotlisis, radiacin UV global promedio = 24.2 Wm2.
El pH de la disolucin (Figura 5.2) mostr un comportamiento similar al observado en los experimentos de hidrlisis. Durante las primeras 10 horas de exposicin el pH se mantuvo ligeramente cido (pH 4.2), incrementndose, despus de 20 horas, hasta un valor de 6.2, alrededor del cual se mantuvo hasta el final del experimento. Puede pensarse que la contribucin de la hidrlisis a la degradacin global del VM fuese mayor durante este primer perodo a pH cido. En general, los resultados muestran una elevada estabilidad del VM a la fotlisis directa, as como la formacin de productos de transformacin ms persistentes. Ambas conclusiones hacen pensar que la presencia de este compuesto en el medio ambiente acutico pueda representar un riesgo potencial.
5.3 Identificacin de los productos de transformacin

Dada la estabilidad de algunos de los productos de transformacin formados durante la fotodegradacin de VM, puesta de manifiesto por la parcial disminucin del COD observada durante los experimentos, se procedi a la identificacin de los mismos, a fin de establecer una posible ruta de degradacin y determinar cuales son ms persistentes en el medio acutico natural. En la literatura se reportan varios estudios sobre el VM, la mayora de los cuales se concentran en su degradacin utilizando procesos de oxidacin avanzada [Modirshahla y Behnajady, 2006; Xie et al., 2001; Chen et al., 2002], degradacin de sustancias orgnicas a travs del uso del VM y/o colorantes similares, en sistemas combinados VM(+)/UV/H2O2 y VM(+)/UV/Fe2+/3+/H2O2, o caracterizacin y sntesis del VM y algunos de sus metabolitos [Cho et al., 2000]. No se encontraron referencias respecto a la formacin de productos de transformacin (PTs) del VM, durante la fotlisis, su persistencia e impacto medioambiental. Los anlisis de las muestras tomadas durante los experimentos muestran la formacin de una mezcla de compuestos de reaccin muy compleja, consecuencia de la fuerte reactividad fotoltica del VM. Un gran nmero de PTs fueron detectados y posteriormente identificados, tomando como base los anlisis con LC-TOF-MS y GC-MS, y la literatura disponible. La identificacin de todos lo compuestos presentes en la solucin fue complicada, debido especialmente a las diferencias en las concentraciones a las que fueron generados y extrados por los mtodos de SPE utilizados. Los PTs mayoritarios son fcilmente reconocibles en el cromatograma de iones totales (TIC). Sin embargo, aquellos que se generaron en bajas concentraciones o que se recuperaron poco, no son visibles y pueden escapar a la deteccin. En tal caso, la bsqueda de iones fragmento que pueden corresponder a partes de la molcula comunes a ms de un producto de degradacin puede ayudar a
172 Tesis Doctoral
detectar compuestos minoritarios en los cromatogramas de iones seleccionados. Esta estrategia es posible en estudios de este tipo en donde los intermedios generados proceden de un mismo compuesto inicial y por tanto pueden mantener partes comunes en su estructura que fragmenten de forma similar en la fuente de ionizacin. Las muestras fueron inicialmente analizadas con LC-(ESI+)-TOF-MS, ya que la capacidad de sta tcnica para identificar compuestos desconocidos ha sido ampliamente demostrada a lo largo de esta memoria. En la Figura 5.3 se muestra un ejemplo de un cromatograma de iones totales obtenido durante los experimentos de fotlisis.
4.0x10 3.5x10 3.0x10

7 7
D1 D21 D20 D2 D22 D3 D4 D11 D28 D27

0 5 10
Intensidad
2.5x10 2.0x10 1.5x10 1.0x10 5.0x10 0.0 15 20 25

6 7 7 7
MG
D5 D12 *
D26
D8 D24
30 35 40
tiempo, min
Figura 5.3: Cromatograma de iones totales obtenido mediante LC-(ESI)TOFMS, donde son visibles 15 de los PTs identificados.
Despus de un anlisis detallado de todos los picos presentes en los cromatogramas, fueron identificados 28 compuestos como posibles PTs. Se
173
tom como base su masa exacta y la informacin que proporciona el software del sistema, el cual, como se ha comentado en captulos anteriores, calcula la composicin elemental y la frmula emprica de las molculas protonadas, proporcionando una lista de compuestos posibles ordenados en funcin de la mejor concordancia con la masa exacta medida. Los datos de los PTs identificados se muestran en la tabla 5.1. La mayora de los resultados de masa exacta fueron encontrados con un error menor a 0.3 mDa o 1 ppm, lo que proporciona un alto grado de certeza a la hora de asignar frmulas empricas. La lista de las posibles frmulas propuestas se redujo a no ms de 3 4 opciones en la mayora de los casos, y la seleccin de la frmula correcta fue relativamente sencilla, conocindose la molcula inicial. La observacin del parmetro DBE, ya comentado en captulos previos y que representa el nmero de anillos y dobles enlaces presentes en la molcula, fue tambin de gran ayuda en la asignacin de estructuras, proporcionando una confirmacin adicional de la estructura molecular propuesta. Utilizando este parmetro, tres grupos principales de compuestos fueron claramente diferenciados:
Compuestos que todava posean la estructura de trifenilmetano, la mayora derivados demetilados e hidroxilados del VM, con DBE de 12.5, compuestos D1 a D14 (Tabla 5.1)
Derivados de la benzofenona (BF), compuestos con DBE de 8.5, D20 a D25 (Tabla 5.1), debida a la prdida de un anillo aromtico y a la formacin del doble enlace C=O.
Compuestos con DBE de 11.5, D16 a D19 (Tabla 5.1), derivados de la forma reducida del VM, el Verde Leucomalaquita (VLM).
174 Tesis Doctoral
Tabla 5.1: Tiempos de retencin y medidas de masa exacta obtenidas de los espectros del LC-TOF-MS para los productos de transformacin identificados.
C PM tR Formula M.Ex. (m/z) M.C. (m/z) 329.2017 315.1855 301.1699 301.1699 287.1542 273.1386 345.1961 361.1910 377.1859 331.1806 347.1754 363.1703 317.1648 320.1281 306.1124 329.1644 331.2168 317.2012 363.2067 322.1437 226.1226 212.1069 198.0918 242.1175 228.1019 214.0862 240.1019 260.1281 260.1281 Error DBE (ppm) 0.38 1.6 -0.2 0.2 0.9 -0.4 -0.1 -0.7 -0.4 0.3 -0.3 0.5 -0.7 -0.3 -0.8 -1.3 0.6 0.8 0.8 -0.8 -1.5 -0.9 0.05 -0.6 -0.4 0.2 -0.8 1.0 0.7 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 12.5 13.5 11.5 11.5 11.5 11.5 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 9.5 7.5 7.5 Estructura
VM 329 29.0 C23H25N2 329.2019 D1 315 26.3 C22H23N2 315.1861 D2 301 23.7 C21H21 N2 301.1697 D3 301 22.7 C21H21N2 301.1700 D4 287 20.2 C20H19N2 287.1540 D5 273 16.7 C19H17N2 273.1385 D6 345 24.6 C23H25N2O 345.1961 D7 361 21.6 C23H25N2O2 361.1908 D8 377 27.1 C23H25N2O3 377.1858 D9 331 22.0 C22H23N2O 331.1804 D10 347 32.0 C22H23N2O2 347.1753 D11 363 7.5 C22H23N2O3 363.1705 D12 317 19.3 C21H21N2O 317.1646 D13 320 34.9 C20H18NO3 320.1280 D14 306 27.5 C19H16NO3 306.1122 D15 329 17.9 C22H21N2O 329.1648 D16 330 26.0 C23H27N2 331.2171 D17 316 20.0 C22H25N2 317.2015 D18 362 8.4 C23H27N2O2 363.2070 D19 321 15.7 C20H20NO3 322.1435 D20 225 35.8 C15H16NO 226.1223 D21 211 29.4 C14H14NO 212.1068 D22 197 22.5 C13H12NO 198.0919 D23 241 39.4 C15H16NO2 242.1174 D24 227 32.8 C14H14NO2 228.1018 D25 213 25.6 C13H12NO2 214.0863 D26 239 25.4 C15H14NO2 240.1017 D27 259 9.7 C15H18NO3 260.1284 D28 259 11.6 C15H18NO3 260.1283 C.: Compuesto. PM: Peso Molecular. tR: Tiempo de Retencin. M.Ex.: Masa Experimental. M.C.: Masa Calculada. DBE: Equivalencia de Dobles Enlaces. BPD: Derivado de la benzofenona DPMD: Derivado del difenilmetanol. VLM: Verde leucomalaquita.
VM-CH2 VM-2(CH2) VM-2(CH2) VM-3(CH2) VM-4(CH2) VM+OH VM+2OH VM+3OH VM-CH2+OH VM-CH2+2OH VM-CH2+3OH VM-2(CH2)+OH VM-N-3(CH2)+3OH VM-N-4(CH2)+3OH VM-CH2-2H+O VLM VLM-CH2 VLM+2OH VLM-3(CH2)+3OH BPD BPD-CH2 BPD-2(CH2) BPD+OH BPD-CH2+OH BPD-2(CH2)+OH BPD-2H+O DPMD+2OH DPMD+2OH
175
El DBE tambin fue til para distinguir la formacin de derivados hidroxilados o aldehdos, ya que en el primer caso la adicin de un tomo de oxgeno a la molcula no altera el DBE, mientras que en la segunda el DBE se incrementa en uno, por la formacin del enlace C=O. Este es el caso de los compuestos D9/D15 y D56/D26. La infrecuente, pero interesante formacin de iones doblemente protonados [M+2H]2+ se observ para el VLM (D16) y PTs relacionados (compuestos D17 a D19). Este fenmeno est directamente relacionado con la disposicin del nitrgeno en la estructura molecular. La figura 5.4 muestra el espectro de masa exacta del VLM, en el cual se observa la presencia simultnea de los iones [M+H]+ y [M+2H]2+.
[M+H]+
1.9e5 1.8e5
331.2138
NH
LM
[M+2H]2+
1.6e5 1.4e5
N
166.1121
NH
Intencidad
1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4 0.0 C23H28N22+ Masa Exacta: 332.2169 (Masa Exacta / 2 = 116.1121) Masa Observada: 116.1121
C23H27N2+ Masa Exacta: 331.2169 Masa Observada: 331.2138
NH
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500 550 m/z, amu
Figura 5.4: Espectro de masa exacta del Verde leucomalaquita (VLM), en el cual se observa la presencia simultnea de los iones [M+H]+ y [M+2H]2+.
176 Tesis Doctoral
Las estructuras asignadas a algunos de los compuestos incluidos en la tabla 5.1 fueron confirmadas mediante anlisis por GC-MS. Los espectros de impacto electrnico en modo full-scan proporcionaron suficiente informacin estructural para su identificacin inequvoca. Dos de ellos, D20 y D22, fueron identificados tambin con bases de datos comerciales (Wiely275 y NIST2) como (4(dimetilamino) fenil)(fenil)metanona y el (4-aminofenil)(fenil)metanona con una similitud mayor del 95%. Las estructuras de otros cuatro compuestos fueron confirmadas mediante la asignacin de los fragmentos de masa, como se muestra en la tabla 5.2. La prdida de 77 uma, correspondiente a un grupo fenilo, as como tambin la masa del fragmento a m/z 77, fue observada en todos ellos. Tambin fue caracterstica la prdida de los iones [M-C6H5CO]+, [MN(CH3)2]+ y [M- C6H5N(CH3)2.
Tabla 5.2: Tiempos de retencin e informacin estructural de los productos de transformacin del VM identificados por GC-MS.
C tR PM
D20 D21 D22 D23 D16 (VLM) D17 D26
28.77 27.77 24.92 31.91 41.62 41.56 30.83
225 211 197 241 330 316 239
Fragmentos principales (m/z) 225 [M]+, 148 [M-C6H5]+, 181 [M-N(CH3)2]+, 105 [C6H5CO]+, 77 [C6H5]+ 211 [M]+, 134 [M-C6H5]+, 105 [C6H5CO]+, 77 [C6H5]+ 197 [M]+, 120 [M-C6H5]+, 105 [ C6H5CO]+ 92 [M-C6H5-CO]+, 77 [C6H5]+ 241 [M]+, 224 [M-OH]+, 148 [M- C6H4OH]+, 121 [C6H5NC2H6]+, 105
[C6H5CO]+, 77 [C6H5]+
330 [M]+, 286 [M-N(CH3)2]+, 253 [M- C6H5]+, 209 [ M- C6H5N(CH3)2]+ 316 [M]+, 272 [M-N(CH3)2]+, 239 [M- C6H5]+, 194 [ M- C6H5N(CH3)2]+ 239 [M]+, 224 [M-CH3]+, 210 [M-COH]+, 162 [M-C6H5]+, 105 [C6H5CO]+, 77
[C6H5]+ C: Compuesto tR: Tiempo de Retencin PM: Peso Mecular
177
5.4 Ruta de transformacin

La N-desmetilacin de la molcula de VM y la formacin de derivados de la benzofenona (BPD), debido a la divisin de la estructura conjugada, ha sido descrita como el mecanismo principal de fotodegradacin del VM en muchos procesos diferentes de fotooxidacin (Figura 5.5). Chen y colaboradores [Chen
et al., 2007], en su estudio de la fotodegradacin del VM, inducida con luz UV
utilizando nanopartculas de TiO2, proponen que, bajo condiciones de pH bsico, la ruta preferencial es la N-desmetilacin, la cual gradualmente tiene lugar hasta la total desaparicin de los cuatro grupos metilo. Sin embargo, bajo condiciones de pH cido, la divisin de la estructura cromfora conjugada es el mecanismo usual. La ruta de degradacin del VM provocada por la reaccin foto-Fenton, asistida por luz visible [Xie et al., 2001; Chen et al., 2002; Cheng et al., 2004], es similar. En ste caso hay ms mineralizacin, debido a la produccin continuada de los radicales hidroxilo e hidroperoxilo durante el proceso de foto-Fenton. Por consiguiente, han sido reportados intermedios de bajo peso molecular, como la N,N-dimetilanilina, 4-dimetilaminofenol, cido 4-hidroxibenzico, entre otros, que son generados en etapas de oxidacin ms avanzadas. Hasta ahora, sin embargo, existen pocas referencias sobre la formacin de los derivados hidroxilados del VM. Un estudio referido a la fotooxidacin del VM con UV/H2O2 en medio acuoso a 254 nm [Milano et al., 1995], reporta la formacin de derivados monohidroxilados como consecuencia del ataque de radicales OH en el anillo aromtico antes o despus de la divisin de la molcula.
178 Tesis Doctoral
NH2
D5
NH2
NH2
NH
D4
D2/D3
D1
VM (I)
NH2
N H
D22
D21
D20
OH
NH2
N H
N N
OH
D23
OH
OH
D27/D28
NH2
HO
HO
(HO)2
D24
Compuestos fenlicos
* Detectados solo en algunas muestras
HO
N H
Figura 5.5a: Ruta de transformacin (I) y PTs propuestos. Los compuestos marcados con * se detectaron solo ocasionalmente.
179
NH2
D12
NH
D9
D6
VM (II)
HO
HO
HO
NH
D17
D16 (LM)
N
D18
VM (III)
(HO)2
Figura 5.5b: Rutas de transformacin (II) y (III) y PTs propuestos.
Estos tres mecanismos, los cuales incluyen el ataque de radicales hidroxilo en el grupo N,N-dimetilamina, en el tomo de carbono central y en el anillo bencnico, fueron observados en este trabajo durante la exposicin del VM a la radiacin solar natural. La produccin fotoinducida de los radicales hidroxilo durante la exposicin del VM en una solucin acuosa saturada de oxgeno, ha sido previamente reportada [Brezov et al., 2004] por la secuencia de reacciones (5.1) (5.5).
MG (*) + O2 D + + O2
(5.1) (5.2) (5.3)
O +H O2 H
O2 H + O2 H H 2O2 + O2
180 Tesis Doctoral
O2 + H 2O2 OH + OH + O2
(5.4) (5.5)
H 2O2 + hv OH
Los radicales hidroxilo producidos de esta manera pueden inducir la oxidacin del VM, y de esta manera catalizar su propia degradacin, la cual es acelerada por el ataque de los radicales OH en sitios de alta riqueza electrnica. En nuestros experimentos, los compuestos D1, D6 y D20, los cuales son tpicos de las tres principales reacciones oxidativas mencionadas anteriormente (Figura 5.5, VM(I) y VM(II)), estn presentes desde el inicio de la fotlisis. La evolucin en el tiempo de las reas de los picos cromatogrficos (Figura 5.6), indican que la N-desmetilacin y la divisin del VM son las rutas predominantes.
3.0E+09
D20
2.5E+09
D21 D22 D1 D2 D3 D4 D5
2.0E+09
Area
1.5E+09
1.0E+09
5.0E+08
0.0E+00 0 48 96 144 192 240
tiempo, hrs
Figura 5.6: Cintica de los PTs de la ruta de transformacin (I) propuesta.
Durante el experimento se detect la formacin de derivados mono-, di-, y hasta tri-hidroxilados, antes y/o despus de la desmetilacin, aunque en menor medida. Considerando que el VM cataliza su propia degradacin y que esta reaccin auto-catalizada est limitada por el propio reactivo, se puede entender
181
por qu, en las primeras etapas de degradacin fotoltica, se observan la formacin de productos de transformacin tan pequeos,
cuando
la
concentracin del VM todava es significativa y los radicales OH son ms abundantes, y por qu tambin PTs de alto peso molecular aparecen al final del experimento. Por lo anterior, tambin se puede explicar la rpida disminucin de la concentracin del VM durante las primeras 30 horas de exposicin solar. Los principales PTs y las rutas identificadas se muestran en las figuras 5.5 a y b. La secuencia de degradacin y rutas principales fueron inferidas de las secuencias cromatogrficas y cinticas obtenidas. Como se aprecia en la figura 5.5b, la transformacin reductiva del VM a VLM y su posterior desmetilacin e hidroxilacin tambin fueron observadas.
5.5 Evaluacin de la toxicidad

La alta toxicidad del VM es bien conocida. Ensayos de toxicidad utilizando Vibrio
fischeri, han demostrado la toxicidad aguda con un EC50,
30 min
de 0.031 mg/L
[Hernando et al., 2007], lo cual ha hecho que esta sustancia sea clasificada como txica para organismos acuticos por la legislacin europea [EC, 1993,1996]. Sin embargo, se conoce poco sobre la toxicidad de sus productos de fotodegradacin, los cuales pueden ser generados al ser vertido el VM al medio ambiente. Con el objetivo de evaluar los efectos txicos de los PTs persistentes, generados por el VM, se midi la toxicidad de la disolucin, despus de que el VM haba desaparecido por completo. Los anlisis de toxicidad fueron realizados utilizando el ensayo bioluminiscente con la bacteria V. fischeri, como se describi en el capitulo experimental (seccin 2.5.1). Se observ una inhibicin del 63% despus de 5, 15, 30 minutos de exposicin, demostrando la toxicidad de la solucin.
182 Tesis Doctoral
Con el fin de poder asignar los PTs responsables de esta toxicidad, se obtuvo un estndar comercial del compuesto D20 (4-(dimetilamino)benzofenona), compuesto mayoritario detectado despus de 220 horas de exposicin, y se realiz una curva calibracin del tipo dosis efecto (sigmoidal) para calcular el EC50 de este compuesto. Previo al diseo de la curva de calibracin y a la evaluacin del nivel de toxicidad, se probaron concentraciones desde 5 hasta 0.005 mg/L. Como se aprecia en la figura 5.7 Todos los puntos de la curva de calibracin fueron ajustados a una curva estadstica del tipo dosis efecto (sigmoidal).
100
75
% Inhibicin
50
25
0 0.1 1 10
log (C)
Figura 5.7: Curva de calibracin para el EC50, 30 min del compuesto D20. Ajustada a una curva sigmoidal de Dosis Efecto (r2 = 0.99986).
183
El EC50 resultante, de 0.061 mg/L, es ms alto que el del VM. Sin embargo, la 4(dimetilamino)benzofenona, continua siendo muy txica, de acuerdo a la actual regulacin de la CE. La figura 5.8 muestra la evolucin de la concentracin del D20 durante el experimento de fotlisis. Al final del experimento, despus de 220 horas de exposicin a la radiacin natural, la concentracin del D20 todava estaba por encima del valor de EC50 calculado, lo que significa que la toxicidad de ste compuesto, as como del resto de la disolucin, permaneca elevada durante todo el experimento. De esta manera, la alta toxicidad de la solucin remanente podra ser causada principalmente por el D20, el cual estuvo presente en la solucin a una concentracin bastante alta despus de que desapareciera el VM. Ms an, la formacin de este compuesto es favorecida en un medio saturado de oxgeno [Barlet e Indig, 1999]. Los compuestos fenlicos pueden ser otra fuente de toxicidad, la cual merece ser analizada separadamente del resto. Estudios ms detallados, analizando las diferentes fracciones de la disolucin podra permitir evaluar la toxicidad generada por otros PTs aunque este anlisis queda fuera de los objetivos de esta tesis.
184 Tesis Doctoral
10
Verde Malaquita D20 (PM = 225)
10
CD20, [mg/L]
0.1
EC50 = 61.38 ppb
0.1
0.01 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 tiempo, hr
0.01
Figura 5.8: Cintica del compuesto D20 y el VM, durante la fotodegradacin.
VM, [mg/L]
185
186 Tesis Doctoral
CAPITULO
Capitulo 6
CONCLUSIONES
De los objetivos planteados al inicio de este trabajo de investigacin y despus de llevada a cabo todo lo descrito en los captulo anteriores, se desprenden las siguientes conclusiones generales y especficas para cada compuesto estudiado.
Conclusiones generales
La aplicacin de tratamientos de oxidacin avanzada, como la fotocatlisis con TiO2 o el foto-Fenton, representa una alternativa viable para la degradacin de contaminantes emergentes como los frmacos (diclofenaco, dipirona) en aguas. Se observa que la utilizacin del tratamiento foto-Fenton en comparacin con la fotocatlisis con TiO2 es ms eficaz en trminos de tiempo de tratamiento y velocidad de degradacin de contaminantes disueltos en agua. Adems se comprob no solo la desaparicin, sino la mineralizacin de las sustancias
187
Conclusiones
estudiadas con ambos tratamientos. Los ensayos se realizaron con radiacin solar y a escala de planta piloto. El estudio de la transformacin fotoltica de contaminantes en agua mediante irradiacin solar es esencial para el conocimiento del comportamiento de los contaminantes en el medio ambiente y de su impacto en el mismo. Los experimentos realizados con diclofenaco y verde malaquita han puesto de manifiesto la formacin de gran nmero de intermedios de fotodegradacin ms persistentes que el compuesto precursor. La evaluacin analtica de los procesos de transformacin fotoqumica, tanto fotlisis como fotocatlisis, representa una tarea compleja que requiere de la aplicacin de tcnicas instrumentales capaces de proporcionar la informacin cualitativa necesaria para la identificacin del elevado nmero de productos de transformacin generados. La identificacin de estos intermedios es importante para un mejor entendimiento de los mecanismos que rigen estos procesos a la vez que permiten la identificacin de compuestos mayoritarios y/o relevantes desde el punto de vista de su persistencia o toxicidad, y posibilita el establecimiento de rutas de transformacin. La utilizacin combinada de GC-MS y LC-TOF-MS junto con diferentes mtodos de SPE ha demostrado ser una estrategia eficaz en la deteccin e identificacin de productos de transformacin. Las medidas de masa exacta y la informacin relativa a la frmula emprica proporcionada por la LC-TOF-MS, tanto de la molcula protonada como de los fragmentos obtenidos mediante colisin inducida en la fuente, han confirmado a esta tcnica como una herramienta decisiva en la identificacin de productos de transformacin. Aunque la informacin obtenida no siempre es suficiente para la asignacin precisa de la estructura molecular, el conocimiento previo de la molcula original y de los mecanismos que rigen los procesos de degradacin, facilitan esta tarea. Adems la elevada sensibilidad de la tcnica, que permite detectar intermedios
188 Tesis Doctoral
Conclusiones
generados a bajas concentraciones, y la posibilidad de inyectar las muestras acuosas sin tratamiento previo, la convierten en una alternativa sencilla, rpida y eficaz para esta aplicacin. Las estrategias de identificacin desarrolladas son aplicables a los procesos de oxidacin avanzada, en general, y no solo a la fotocatlisis mediante TiO2 y fotoFenton. Es ms, estos procedimientos pueden ser de inters para la Qumica Analtica ambiental, sobre todo focalizada en compuestos orgnicos presentes en agua. La aplicacin de bioensayos de toxicidad, como el basado en la inhibicin de la bioluminiscencia de la bacteria Vibrio fischeri, es til para un seguimiento toxicolgico del tratamiento fotocataltico de contaminantes orgnicos, as como para la identificacin de productos de transformacin txicos en procesos de fotlisis. Este ltimo aspecto es de gran inters ya que puede contribuir a la mejora de los programas de seguimiento de contaminantes en aguas naturales. Se remarca la necesidad de una completa evaluacin del comportamiento de los POAs, no solamente midiendo la degradacin y mineralizacin del contaminante en cuestin, sino tambin determinando los principales intermedios de degradacin y su toxicidad.
Degradacin fotoltica y fotocataltica de diclofenaco
El diclofenaco sufre una rpida y espontnea degradacin por fotlisis directa por efecto de la radiacin solar. A pesar de ello, la fotlisis del diclofenaco no conduce a su mineralizacin, sino a la formacin de una gran cantidad de productos de transformacin ms persistentes a la degradacin fotoltica que el propio diclofenaco Esto demuestra que la presencia del diclofenaco en aguas superficiales supondr la generacin de productos de trasformacin ms persistentes sobre los que no existe informacin acerca del efecto que pueden causar sobre el medio ambiente.
189
Conclusiones
La aplicacin combinada de tcnicas de GC-MS y LC-ESI-TOFMS, as como de diferentes modos de trabajo (EI y PCI), ha permitido la identificacin de 13 productos de transformacin generados durante la fotlisis de diclofenaco. Se ha demostrado que ambas tcnicas son complementarias y necesarias para una evaluacin ms completa de la mezcla de reaccin. El empleo de la ionizacin qumica en GC-MS ha sido til en la asignacin de la masa molecular de los compuestos y en la identificacin de coeluciones, aspecto este de gran inters dado que la optimizacin de la separacin no es posible en mezclas de composicin compleja y desconocida. La identificacin de los productos de transformacin demostr que la fotlisis del diclofenaco tiene lugar mediante dos rutas principales. Una originada por la fotociclacin de la molcula de diclofenaco para dar lugar a la formacin de derivados con estructura carbazlica. La segunda ruta se origina a partir de la descarboxilacin inicial del diclofenaco y posterior oxidacin de la cadena alqulica, mantenindose la estructura bifenlica hasta la decloracin de la molcula. El equilibrio de solubilidad del diclofenaco y el hierro, dependiente del pH, mostr ser determinante en la aplicacin del proceso foto-Fenton. A pH 7, compuestos de hierro, recin precipitados a partir de hierro en disolucin, son capaces de degradar fotocatalticamente al diclofenaco siguiendo una cintica de pseudoprimer orden. En este caso diferentes concentraciones de hierro (a partir de 0.05 mM) dan resultados similares, demostrando que una pequea concentracin de hierro es suficiente para absorber todos los fotones disponibles en el interior del fotorreactor utilizado. Los resultados del tratamiento foto-Fenton a pH 2.8 indicaron que la descomposicin del diclofenaco toma lugar en la fase homognea, y la cintica es gobernada por la continua redisolucin del diclofenaco, previamente
190 Tesis Doctoral
Conclusiones
precipitado. Como consecuencia, las diferentes concentraciones de hierro no mostraron influencia relevante en la velocidad de descomposicin del contaminante. El tratamiento foto-Fenton iniciado a un pH alrededor de 7, en agua sin capacidad de tampn, caus una disminucin del pH hasta un valor de 3.7. De esta forma la precipitacin del diclofenaco y el hierro pueden ser en parte atenuados consiguindose un tratamiento exitoso. La descomposicin del diclofenaco mediante dixido de titanio (fotocatlisis) en el mismo reactor sigui una cintica de seudoprimer orden y durante la misma no ocurri precipitacin, siendo sin embargo ms lenta que cualquiera de los diferentes procedimientos empleados para su tratamiento mediante foto-Fenton. Por tanto, aunque a primera vista los procesos de foto-Fenton y la descomposicin del diclofenaco parecen ser incompatibles, debido a la insolubilidad del compuesto a pH muy bajo, la velocidad de reaccin es significativamente alta en el proceso foto-Fenton en todas las condiciones de reaccin empleadas. A pesar de insolubilizarse, el diclofenaco se va degradando, redisolvindose y finalmente mineralizndose. La ruta de degradacin del diclofenaco en el proceso foto-Fenton se caracteriza por la hidroxilacin inicial de la molcula en posicin C-4 y subsiguiente formacin de la especie iminoquinona, la cual no haba sido reportada anteriormente, y que constituye la especie principal que conduce a la mineralizacin total de este compuesto y de los productos de degradacin formados. Esta ruta difiere de la obtenida mediante otros procesos de degradacin (fotlisis, ozonizacin, UV/H2O2) indicando que el diclofenac sigue diferentes rutas de degradacin, dependiendo del tratamiento aplicado.
191
Conclusiones
Degradacin fotoltica y fotocataltica de dipirona
Se comprob la rpida transformacin, en solucin acuosa, de la dipirona en su metabolito activo, 4-metilaminoantipirina (4-MAA), el cual se mantuvo estable por un largo perodo de tiempo (15 das). Por medio de los tratamientos de oxidacin avanzada se consigui una eliminacin de este compuesto en un tiempo muy reducido. Utilizando el tratamiento fotocataltico con TiO2, el 4-MAA fue degradado en 70 minutos y con el tratamiento foto-Fenton se necesitaron 15 minutos. Se alcanz una mineralizacin del 90% despus de 265 minutos con TiO2 y 50 minutos con foto-Fenton. Los resultados obtenidos muestran que los tratamientos fotocatalticos mediante foto-Fenton y TiO2, son adecuados para mineralizar la dipirona o dicho ms propiamente su producto de hidrlisis (4MAA). Sin embargo el tratamiento foto-Fenton es especialmente efectivo, logrando la mineralizacin del compuesto en 50 minutos, a una concentracin de Fe2+ de 20 mg/L. La evaluacin de los productos de degradacin generados durante el proceso dio como resultado la identificacin de 12 compuestos. Se propone una ruta de degradacin, basada en la formacin inicial de derivados hidroxilados, seguidos por las prdidas de los grupos metilo- y amino-, y la posterior apertura del anillo pirazlico, siendo stas las reacciones principales que se observan durante el proceso de degradacin. Una vez que los productos de degradacin de alto peso molecular desaparecen, y antes de la mineralizacin total, los cidos carboxlicos detectados prevalecen como los intermediarios ms importantes. La toxicidad de la solucin fue seguida durante ambos procesos fotocatalticos y se demostr que la toxicidad se mantiene en niveles ms bajos utilizando el proceso foto-Fenton. A su vez se demostr que el 4-MAA, el PT de mayor 192 Tesis Doctoral
Conclusiones
preocupacin ambiental, es degradado por ambos tratamientos fotocatalticos solares permitiendo hacer una descarga segura de este efluente. El tratamiento foto-Fenton a muy bajas concentraciones de hierro (Fe2+ = 2 mg/L) es un mtodo mucho ms rpido para tratar este tipo de compuestos, que cuentan con un anillo pirazlico, que la fotocatlisis utilizando TiO2. El fotoFenton con luz solar provee una manera de depurar los efluentes de las plantas depuradoras sin tener que eliminar el hierro utilizado en el tratamiento posteriormente.
Degradacin fotoltica de verde malaquita
Los resultados muestran que durante la degradacin fotoltica, el Verde Malaquita genera una gran cantidad de PTs, algunos de los cuales son ms persistentes y txicos que el compuesto inicial. Fueron identificados 28 posibles productos de trasformacin y se encontraron varias rutas de degradacin, algunas de ellas similares a las reportadas para procesos oxidativos mucho mas fuertes, como el foto-Fenton, probando que tiene lugar la formacin de radicales hidroxilo durante el tratamiento fotoltico. Tambin se observ la formacin de derivados hidroxilados, y doble protonados, escasamente referenciados en la literatura. La informacin obtenida de los productos de trasformacin identificados demuestran que el Verde Malaquita experimenta principalmente tres reacciones de transformacin: N-demetilacin, hidroxilacin y desprendimiento de la estructura conjugada formando as derivados con estructura benzofenonica. Estos procesos involucran ataques de radicales hidroxilo en el anillo fenlico, en los grupos N-N-dimetilamina y en el tomo de carbono central. Se demostr la toxicidad aguda de uno de los principales productos de trasformacin generados durante la fotlisis del VM, 4193
Conclusiones
(dimethylamino)benzophenone, por medio del test de bioluminiscencia con la bacteria V. fischeri y un estndar analtico. Las pruebas de toxicidad aguda, con Vibrio fischeri, mostraron que la solucin permanece txica despus de que el Verde Malaquita ha desaparecido por completo. Esta toxicidad puede ser adjudicada, o cuando menos en parte, a la formacin del 4-(dimetilamino)benzofenona, del cual se obtuvo un EC50,30 min de 0.061 mg/L, que se considera muy txico para organismos acuticos segn la normativa Europea actual.
194 Tesis Doctoral
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Wessel J.C., Matyja M., Neugebauer M., Kiefer H., Daldrup T., Tarbah F.A., Weber H. (2006) Eur. J. Pharm. Sci., 28, 15. Xia Y.-Q., Miller J.D., Bakhtiar R., Franklin R.B., Liu D.Q. (2003) Use of a quadrupole linear ion trap mass spectrometer in metabolite identification and bioanalysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 17, 1137. Xie, Y., Wu, K., Chen, F., He, J., Zhao, J. (2001) Investigation of the intermediates formed during the degradation of malachite green in the presence of Fe3+ and H2O2 under visible irradiation. Res. Chem. Intermed.,
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215
Referencias
216 Tesis Doctoral
GLOSARIO
GLOSARIO
ABS AOPs APCI API BPD CEPAL CI CID CIT COD COT CPCs CT DBE DPMD EC50 Absorcin Advanced Oxidation Processes (Procesos de Oxidacin Avanzada). Ionizacin Qumica a Presin Atmosfrica. Ionizacin a Presin Atmosfrica. Derivados de Benzofenona. Comisin Econmica para Amrica Latina y el Caribe. Cromatografa Inica. Disociacin por colisin inducida. Carbono Inorgnico Total. Carbono Orgnico Disuelto. Carbono Orgnico Total. Captador Parablico Compuesto. Carbono Total. Equivalencia de dobles enlaces. Derivados del Difenilmetanol. Concentracin Efectiva que causa el 50% de mortalidad en determinado organismo.
217
Glosario
EC50,
30min
EC50 a los 30 minutos de exposicin a determinada sustancia. Estacin de Depuracin de Aguas Residuales. Impacto electrnico, ionizacin por (en GC-EI-MS). Environmental Protection Agency, de USA. Ionizacin con Electrospray. Cromatografa de Gases acoplada a Espectrometra de Masas. Fondo para el Medio Ambiente Mundial. Obitales moleculares ocupados de ms alta energa. Cromatografa lquida de alta resolucin. Trampa de Iones. Unin Internacional de Qumica Pura y Aplicada. Cromatografa de Lquidos acoplada a Espectrometra de Masas. Lmites Maximos de Residuos. Extraccin Lquido Lquido. Relacin masa / carga del ion. Metilaminoantipirina. Espectrometra de Masas. Detector de Espectrometra de Masas. Espectrometra de masas en tndem. Espectrometra de masas en tndem, de orden n. Organizacin para la Cooperacin y el Desarrollo Econmico. Ionizacin Qumica Positiva (en GC-PCI-MS). Productos de Degradacin, hace referencia a un proceso de degradacin (como los POAs). Procesos de Oxidacin Avanzada. Contaminantes Orgnicos Persistentes. Productos farmacuticos y de higiene personal (Pharmaceuticals and Personal Care Products). Partes por cuatrilln. Partes por trilln.
EDAR EI EPA ESI GC-MS GEF HOMO HPLC IT IUPAC LC-MS LMRs LLE
m/z
MAA MS MSD MS/MS MSn OCDE PCI PDs POAs POPs PPCPs ppq ppt
218 Tesis Doctoral
Glosario
PTs Q Qq-LIT QqQ Qq-TOF RMN SPE t30W TOF uma VLM VM WFD
Productos de Transformacin, hace referencia a la degradacin natural o fotoltica. Cuadrupolo simple. Cuadrupolo Trampa de Iones Lineal. Triple cuadrupolo. Cuadrupolo Tiempo de Vuelo. Resonancia Magntica Nuclear. Extraccin en Fase Slida. Tiempo de iluminacin normalizado (min). Tiempo de Vuelo. Unidades de masa atmica. Verde Leucomalaquita. Verde Malaquita. Water Framework Directive.
219
Glosario
220 Tesis Doctoral
ANEXO
ANEXO: Artculos Publicados
ANEXO PUBLICACIONES EN REVISTAS CIENTFICAS INTERNACIONALES

Los resultados de la presente investigacin han dado lugar a cinco artculos en diferentes revstas cientficas interacionales, como se detalla a continuacin: Prez-Estrada, L.A., Agera, A., Hernando, M.D., Malato, S., Fernndez-Alba, A.R. (2008) Photodegradation of malachite green under natural sunlight
irradiation: Kinetic and toxicity of the transformation products.
Chemosphere, 70, 2068-2075. Indice de impacto (2006): 2.442.
Prez-Estrada, L.A., Malato, S., Agera, A., Fernndez-Alba, A.R. (2007)

Degradation of dipyrone and its main intermediates by solar AOPs. Identification of intermediate products and toxicity assessment. Catalysis
Today, 129, 207-214. Indice de impacto 2006: 2.148.
221
ANEXO: Artculos publicados
Prez-Estrada, L.A., Malato, S., Gernjak, W., Aguera, A., Thurman, E.M., Ferrer, I., Fernndez-Alba, A.R. (2005) Photo-fenton degradation of diclofenac:
Identification of main intermediates and degradation pathway.
Environmental Science and Technology, 39, 8300-8306. ndice de impacto
(2005): 4.054. Agera, A., Perez Estrada, L.A., Ferrer, I., Thurman, E.M., Malato, S., Fernandez-Alba, A.R. (2005) Application of time-of-flight mass spectrometry
to the analysis of phototransformation products of diclofenac in water under natural sunlight. Journal of Mass Spectrometry, 40, 908-915. ndice de
impacto (2005): 3.574. Prez-Estrada, L.A., Maldonado, M.I., Gernjak, W., Aguera, A., Fernndez-Alba, A.R., Ballesteros, M.M., Malato, S. (2005) Decomposition of diclofenac by
solar driven photocatalysis at pilot plant scale. Catalysis Today, 101, 219-
226. ndice de impacto (2005): 2.365.
222 Tesis Doctoral

Tesis Leonidas Perez

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UNIVERSIDAD DE ALMERA Departamento de Hidrogeologa y Qumica Analtica

DEGRADACIN FOTOQUMICA DE CONTAMINANTES EMERGENTES MEDIANTE PROCESOS SOLARES. EVALUACIN ANALTICA.

Centro de Investigaciones Energticas, Medioambientales y Tecnolgicas

DEGRADACIN FOTOQUMICA DE CONTAMINANTES EMERGENTES MEDIANTE PROCESOS SOLARES. EVALUACIN ANALTICA.

Fdo. Lenidas Armando Prez Estrada Visado en Almera a 12 de Marzo de 2008.

LOS DIRECTORES DE LA TESIS:

Centro de Investigaciones Energticas, Medioambientales y Tecnolgicas

Conocimientos correctos conducen a acciones correctas.

Leonidas Armando Prez Estrada

Leonidas Armando Prez Estrada

Leonidas Armando Prez Estrada

Leonidas Armando Prez Estrada

viii Tesis Doctoral

Leonidas Armando Prez Estrada

Leonidas Armando Prez Estrada

1.1 La contaminacin en el medio ambiente

1.2 Contaminacin del agua por compuestos orgnicos y normativa actual

Leonidas Armando Prez Estrada

Leonidas Armando Prez Estrada

(29) (30) (31) (32) (33) * **

122-34-9 688-73-3 36643-28-4 12002-48-1 120-82-1 67-66-3 1582-09-8

Solamente Pentabromobifenileter (nmero CAS 32534-81-9).

Leonidas Armando Prez Estrada

Leonidas Armando Prez Estrada

1.3 Fuentes de contaminacin en aguas

Leonidas Armando Prez Estrada

Leonidas Armando Prez Estrada

Leonidas Armando Prez Estrada

Leonidas Armando Prez Estrada

1.5 Descontaminacin de aguas mediante procesos de oxidacin avanzada

Leonidas Armando Prez Estrada

Reaccin de Fenton (Fe+2/+3/H2O2) Oxidacin electroqumica Tratamiento con haces de electrones

Plasma no trmico Ultrasonidos

Fotocatlisis Heterognea (TiO2/UV)

Leonidas Armando Prez Estrada

OH. Las propiedades qumicas de adsorcin del sustrato y las condiciones de la

Leonidas Armando Prez Estrada

(1.1) (1.2) (1.3) (1.4) (1.5) (1.6)

[ Fe 3+ (OH ) x ( H 2O) y ] hv Fe 2+ + ( x 1)OH + yH 2 O + OH [ Fe 3+ ( RCO2 )] hv Fe 2+ + R + CO2

Leonidas Armando Prez Estrada

Abstraccin de hidrgeno de tomos de carbono aliftico:

Adicin electroflica en dobles enlaces de anillos aromticos:

Leonidas Armando Prez Estrada

1.6 Reactores fotocatalticos solares

1. Tubo absorbedor 2. Superficie reflectante

Leonidas Armando Prez Estrada

Leonidas Armando Prez Estrada

60 60 Concentracin, mg/L Concentracin (mg/L) 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 Evolucin del COD

0 Desaparicin 0 Pirimetanil Desaparicin Pirimetanil

Tiempo (min) min tiempo,

Leonidas Armando Prez Estrada

m. La adicin del disolvente orgnico, adems de mejorar las caractersticas

500 5.0 4.0 3.0

Iones orgnicos (mg/L)

4.0 3.0 2.0 1.0 0.0

1.0 0.0 500

Leonidas Armando Prez Estrada

Fase reversa (ej. RP-C18)

Fase reversa endcapped (ej. con trimetilclorosilano)

Poliestireno-divinilbenzeno (ej. Lchrolut EN)

Poliestireno-divinilbenzeno hidroxilado (ej. ENV+)

Divinilbenzeno-N-vinilpirrolidona (ej. OASIS HLB)

(CH2)7CH3 (CH2)2 SO3-Na+

Divinilbenzeno-N-vinilpirrolidona sulfonado (ej. OASIS MCX)