Produccin de pectinasas por Aspergillus flavipes FP500

Anlisis, diseo y optimizacin

28/02/2012

Acosta Dent Andrea Arias Orozco Patricia Elizabeth Garca Alvarado Laura Garca Prez Jessica Wendolyn Hernndez Gallardo Anna Karen Jurez Yez David Guadalupe Lemus Cruz Paulina Moreno Rodrguez Eduardo Nez Pauln Jacqueline Ortiz Robles Cynthia Ramrez Mendoza Laura Arely Vzquez Ahuatzn Itzel

Contenido
1. INTRODUCCIN ............................................................................................................................... 2 1.1 Estructura y funcin de las pectinas ......................................................................................... 2 1.2 Microorganismos que producen pectinasas ............................................................................ 3 1.3 Las caractersticas de gnero Aspergillus .................................................................................. 4 1.4 Aspergillus flavipes FP-500 ........................................................................................................ 4 2. OBJETIVOS ....................................................................................................................................... 4 2.1 Objetivo General ....................................................................................................................... 4 2.2 Objetivos Particulares ............................................................................................................... 4 3 INGENIERA BSICA .......................................................................................................................... 5 3.1 Bases del Diseo ............................................................................................................................ 5 Capacidad Instalada .................................................................................................................... 5 Factor de Servicio ........................................................................................................................ 6 Sistema de Fermentacin............................................................................................................ 7 Productividad del fermentador ................................................................................................... 7 Volumen de trabajo del fermentador ......................................................................................... 7 Composicin del Medio............................................................................................................... 7 Rendimiento en la recuperacin y produccin ........................................................................... 8 3.2 Biosntesis del producto ............................................................................................................ 8 Cintica de fermentacin ............................................................................................................ 8 Modelamiento ............................................................................................................................. 9 Simulacin y optimizacin......................................................................................................... 10 3.3 Recuperacin y purificacin del producto .................................................................................. 13 a) Informacin tcnica sobre los diferentes bioprocesos existentes ............................................ 13 Recuperacin y purificacin de pectinasas ................................................................................... 15 BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................................... 17 Anexo 1.............................................................................................................................................. 18

1. INTRODUCCION
1.1 Estructura y funcin de las pectinas
La pectina es uno de los polisacridos ms complejos en la naturaleza. Su degradacin es producto de un conjunto de enzimas llamadas pectinasas. Considerando la complejidad estructural de la pectina y el tamao, resulta difcil su acceso al interior de la clula microbiana. Los microorganismos deben secretar al medio las enzimas necesarias para degradar la pectina y as poder ser metabolizada. La produccin de las pectinasas es un proceso complejo, regulado por diversos factores, de los que destacan la naturaleza y cantidad de la fuente de carbono y el valor del pH del medio de cultivo. Las pectinas es uno de los heteropolisacridos ms complejos de los que conforman a la pared celular de las plantas y especialmente de los materiales ctricos, su funcin es la de estabilizar a las microfibrillas de celulosa, as como a otros polmeros y protenas. Es el componente principal de la lamela media, y se encarga de mantener unidos a los componentes de la misma. Las sustancias pcticas comprenden del 0.5 al 40% del peso seco de la planta (Singh Jayani et al, 2005) La estructura de la pectina est constituida por dos grandes regiones homogalacturonano (Ilustracin 1) y ramnogalacturonano (Ilustracin 2). La regin homogalacturonano es la de estructura ms sencilla. Su cadena lineal esta constituida por unidades de acido D-galacturnico, unidas entre si por enlaces alfa 1-4. A lo largo de dicha cadena se encuentran grupos acetilo (en los grupos hidroxilo de los carbonos 2 y 3) o metilo (en el carbono 6), as como algunos iones de sodio, potasio o amonio (Jayani et al, 2005)

Ilustracin 1. Homogalacturano

Ilustracin 2. Rhamnogalacturano

En la regin del ramnogalacturonano, las unidades de cido galacturnico se intercalan con las de L-ramnosa, mediante enlaces beta 1-2 y beta 1-4. Esta regin se caracteriza por ramificaciones de azcar de diversos tipos, que van desde largas cadenas de arabinanos y galactanos, hasta ramificaciones ms pequeas, conformadas por xilosa, cido ferlico, apiosa y fructosa, entre otros (de Vries y Visser, 2001) La complejidad estructural de la pectina puede limitar el rendimiento de diversos procesos industriales que emplean como materia prima este elemento. Por otro lado, en la naturaleza este tipo de materia prima es los sustratos de los microorganismos saprfitos, debido a la capacidad de estos para producir pectinasas.

1.2 Microorganismos que producen pectinasas

Las enzimas pectinolticas son producidas por una extensa variedad de organismos, tales como nemtodos, protozoarios, levaduras, bacterias y hongos. De los anteriores destacan con potencial industrial los hongos filamentosos, debido a su fcil cultivo, y su alta produccin de enzimas extracelulares. La diversidad de las enzimas producidas por estos microorganismos, as como su elevada actividad, provienen de su diversidad metablica inherente, que se refleja en su habilidad para crecer sobre diversos sustratos bajo una gran variedad de condiciones. Los gneros ms utilizados para la produccin de las diversas polipectinasas de inters industrial son Trichoderma, Penicillium y Aspergillus, al ser clasificados generalmente como seguros para la salud humana (GRAS, por sus siglas en ingles).

1.3 Las caractersticas de gnero Aspergillus

Los microorganismos del gnero Aspergillus (Ilustracin 3) son hongos filamentosos que crecen en materia orgnica bajo condiciones aerobias. Se encuentran en suelo, compostas y en materiales de plantas en descomposicin. Se caracterizan por tener una estructura mrfica conformada por un conidiosporo, el cual tiene un tallo y una cabeza conidial de ms de 700 m de dimetro, que surge desde la delgada pared micelial, llamada clula pie. Los hongos del gnero Aspergillus crecen en un rango de temperaturas de 6-47 C, con una temperatura ptima entre 35-37 C y un intervalo de valores de pH de entre 1.4 y 9.8. Tiene la capacidad para crecer en diversas fuentes de carbono.

Ilustracin 3. Aspergillus

1.4 Aspergillus flavipes FP-500

El grupo de los Aspergillus flavipes (Ilustracin 4) est conformado por una sola especie. Aunque no representan una de las especies de Aspergillus ms estudiadas se ha demostrado que producen enzimas degradadoras de polisacridos como las -galactosidasas y pectinasas.
Ilustracin 4. Aspergillus flavipes

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo General

Anlisis, diseo y optimizacin de la produccin de pectinasas mediante Aspergillus flavipes FP500.

2.2 Objetivos Particulares

Determinacin de las bases de diseo para la produccin de pectinasas. Modelamiento y optimizacin de la cintica de fermentacin para la sntesis del producto.

3 INGENIERA BSICA 3.1 Bases del Diseo

Capacidad Instalada

C. I (capacidad instalada) = (

)( de AG

)(

Memoria de clculo: Conociendo que: 1U es la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1umol de Acido Galacturnico (Condiciones dadas) Entonces:

Por lo tanto: 11080 umol de AG= 0.01108 moles de AG Peso molecular AG 194 g/mol C6H10O7 0.01108 moles(
/ L*h de AG

Factor de servicio=0.96 Los das de trabajo: Ao de trabajo dura 350 das Con 3 turnos de 8 horas Por lo tanto: Se trabaja 8400 horas /ao

Factor de Servicio
De acuerdo a la Ley Federal del Trabajo (ltima reforma publicada DOF 17-01-2006), en el artculo 74, son das de descanso obligatorio: El 1 de enero El primer lunes de febrero en conmemoracin del 5 de febrero El tercer lunes de marzo en conmemoracin del 21 de marzo El 1 de mayo El 16 de septiembre El tercer lunes de noviembre en conmemoracin del 20 de noviembre El 1 de diciembre de cada seis aos, cuando corresponda a la transmisin del Poder Ejecutivo Federal El 25 de diciembre

Otros das: 24 de diciembre 31 de diciembre 1 de Enero 3 das de arranque

El artculo 78 dice que los trabajadores debern disfrutar en forma continua seis das de vacaciones. Sin embargo, la planta no dejara de laborar esos das pues las vacaciones sern asignadas en periodos diferentes para cada trabajador. Los trabajadores gozaran de un da a la semana de descanso, la ley marca de preferencia un domingo, aunque puede ser cualquier otro da, no obstante la planta tampoco dejara de funcionar ya que se manejaran turnos diferentes para los trabajadores. No se considerarn das no laborales para mantenimiento ya que este se realizara peridicamente. En base a esto el factor de servicio es:

Sistema de Fermentacin

FERMENTACIN SUMERGIDA
El cultivo sumergido tambin llamado fermentacin lquida es el qu se refiere a un sistema en el cual los sustratos estn disueltos o suspendidos en un medio acuoso y son agitados para conservar la homogeneidad del sistema (Ilustracin 5).

Ilustracin 5. Fermentacin sumergida

Productividad del fermentador

En la simulacin del proceso de produccin en el fermentador se obtuvo la siguiente productividad: Cultivo por lote 6.843 KU/L *h Cultivo por lote alimentado 11.08 KU/L*h

Volumen de trabajo del fermentador Se propuso que el volumen de operacin del fermentador de produccin ser de 50m3= 50,000 L. Composicin del Medio. Aspergillus flavipes FP-500 se hizo crecer en medio basal que contena en g/L: como
fuente de carbono pectina; K2HPO4; KH2PO4; (NH4)2SO4. El pH del medio de cultivo se mantuvo constante durante toda la fermentacin y se trabaj a 5 (se ajusto con ayuda de soluciones de NaOH o H2SO4 a 2M). El medio se esteriliz a 121C y 1.5 psi durante 20 min.

Rendimiento en la recuperacin y produccin

Tabla 1. Purificacin y recuperacin en tres diferentes procesos de separacin. (Anexo 1)

Fraccin

Protena Total (mg) 523.0 67.8 6.3

Filtrado Precipitacin con etanol Sephadex G100 (12%)

Actividad Total (U) 3818 2205 918

Actividad especfica (U/mg) 7.30 32.53 145.84

Purificacin (veces) 1.0 4.45 17.24

Recuperacin (%) 100 57.77 48.12

3.2 Biosntesis del producto

Cintica de fermentacin

La fermentacin de Aspergillus flavipes sobre pectina como fuente de carbono para la produccin de pectinasas en un cultivo en lote presenta los valores mostrados en la tabla 1 de biomasa, sustrato y producto

Tabla 2. Cintica de fermentacin

t (h) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

x (g/L) 0.1 0.15 0.2 0.25 0.5 1 2 2.7 3.1 3.2 3.25

s (g/L) 10 9.6 9.5 9.3 8.5 6.6 3.9 1.9 0.6 0.2 0.1

p (kU/L) 0 0.1 0.5 2.1 5.5 13 24.5 33 38 39 39.5

Con los valores anteriores fue posible calcular las constantes cinticas (tabla 2) necesarios para modelar la fermentacin.
Tabla 3. Constantes cinticas

Constante Ks ms Yg N

Valor 0.11h-1 0.49g/L 0.01gsust/gcel h 0.40gcel/gsust 1 10 kU/gcel 0 kU/gcel h

Modelamiento
Se modelo la cintica de fermentacin experimental utilizando el software matemtico Mathcad utilizando las constantes cinticas previamente calculadas. El siguiente grfico muestra la correlacin entre los datos experimentales y el modelo calculado. Se model la cintica de fermentacin experimental utilizando el software matemtico Mathcad utilizando las constantes cinticas previamente calculadas. La ilustracin 6 muestra la correlacin entre los datos experimentales y el modelo calculado. Podemos observar en la grfica que los datos experimentales se ajustan bastante bien a la grfica del modelo calculado.

Ilustracin 6. Relacin entre los datos experimentales y el modelo calculado. Lnea continua: modelo calculado y Lnea punteada: datos experimentales.

Simulacin y optimizacin Cultivo por lote

Se realiz una simulacin del modelo anterior en un cultivo por lote, cambiando las variables de operacin biomasa y sustrato inicial (x0 y s0 respectivamente), entre un rango de valores de 0.1 a 1 g/L, para la biomasa y de 10 a 50g/L para la pectina, los valores de esta ultima estuvieron limitados por la solubilidad de la pectina en agua. (50g/L a 25C) La funcin objetivo para optimizar el cultivo por lote fue la productividad, as los valores de x0 y s0 con los cuales se alcanza la mxima productividad son: x0=1 g/L s0=50 g/L Con los valores anteriores se alcanza una productividad de 6.843kU/L h, la cual es significativamente mayor que la alcanzada en el cultivo sin optimizar que fue de 1.018 kU/L h. Adems el tiempo del cultivo disminuyo de 37.5 horas en el cultivo sin optimizar a 28 horas en el cultivo optimizado. En la ilustracin 7 se muestra el grfico obtenido del cultivo por lote optimizado, en el que se marca el trmino del cultivo y la productividad a lo largo del mismo.

Ilustracin 7. Cultivo por lote que muestra el trmino de ste a las 28 horas despus de iniciado el cultivo.

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Cultivo por lote alimentado

Una vez que se optimiz el cultivo por lote, se procedi a la simulacin y optimizacin de un cultivo por lote alimentado. Los valores de biomasa, sustrato, producto y productividad al trmino del cultivo por lote, y por lo tanto al inicio del cultivo por lote alimentado son: Biomasa =20.161 g/L Sustrato= 0.266 g/L Producto=191.611 kU/L Productividad=6.843 kU/L h

El grfico obtenido del cultivo por lote alimentado, con una SF=50g/L y una F=1m3/h se muestra en la ilustracin 8.

Ilustracin 8. Cultivo por lote alimentado sin optimizar.

Como se puede observar el producto y por lo tanto la productividad disminuyen, esto se debe a la baja concentracin del sustrato alimentado, 50g/L, que como explicamos antes esta limitado por la solubilidad de la pectina. Al realizar la simulacin variando SF nos damos cuenta que a un valor de SF de 200g/L la productividad aumenta significativamente. Por lo tanto, se hace necesario aumentar la solubilidad de la pectina hasta mnimo 200g/L para que el uso de un cultivo alimentado sea factible de realizar. Una forma de aumentar la solubilidad de la pectina, que podramos utilizar, es mezclando la pectina con sacarosa previo a la solubilizacin. El comportamiento del cultivo cuando SF=200g/L y F=1 m3/h se muestra en la ilustracin 9. 11

Ilustracin 9. Cultivo por lote alimentado con una SF=200g/L y F=1m3/h.

Se optimiz el flujo de alimentacin del cultivo por lote alimentado con base en la misma funcin objetivo que en el cultivo por lote, es decir maximizando la productividad, el flujo optimizado es de 1.6m3/h, con el cual los valores de biomasa, sustrato, producto y productividad al trmino del cultivo son: Biomasa = 47.879 g/L Sustrato= 2.191 g/L Producto= 473.8 kU/L Productividad=11.08 kU/L h

En la ilustracin 10 se muestra el grafico del cultivo optimizado con SF=200g/L y F=1.7g/L.

Ilustracin 10. Cultivo por lote alimentado optimizado, con SF=200g/L y F=1.7m3/h.

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3.3 Recuperacin y purificacin del producto

a) Informacin tcnica sobre los diferentes bioprocesos existentes

1. Preparacin y esterilizacin del medio de cultivo y el inoculo.

2. Biotransformacin.

3. Concentracin y purificacin.

Los procesos fermentativos pueden dividirse en: Fermentaciones lquidas sumergidas (ilustracin 11) (FS) Contenido de agua del medio 90-95 % Fermentaciones en sustrato slido (ilustracin 12) (FSS) El medio son partculas hmedas con ausencia o casi ausencia de agua libre. El sustrato no est ni disuelto ni en suspensin en un gran volumen de agua. Hay dos formas bsicas de cultivos slidos. Cultivos en sustratos naturales (granos, residuos agroindustriales). Cultivos con soportes inertes impregnados con medio nutritivo (perlita, bagazo, poliuretano).

Ilustracin 12. Tipos de reactores empleados en fermentaciones en sustrato slido.

Ilustracin 11. Reactores empleados en fermentaciones lquidas sumergidas

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Tabla 4. Comparacin de dos bioprocesos existentes. Ver Anexo 1 para ms informacin

PRODUCCION DE PECTINASAS MEDIANTE FERMENTACION SLIDA A PARTIR DE Aspergillus foetidus NRRL 341, UTILIZANDO RESIDUUOS DE NARANJA, MARACUYA Y LIMON Fermentacin slida (30C). Aspergillus foetidus. Inculo 105 esporas. Residuos orgnicos: naranja, maracuya y limn. Altos niveles de actividad pectinoltica con sustratos orgnicos; RESPECTO AL USO DE PECTINA COMERCIAL. La FS permite mayor superficie de intercambio aire/sustrato y el uso de mayor concentracin de pectina en el medio favorece la sntesis de pectinasa debido a que no existe el problema de elevado viscosidad.

PRODUCCIN Y CARACTERIZACIN DE PECTINASA A PARTIR DE PENICILLIUM CHRYSOGENUM Fermentacin sumergida (35C, pH 6.5) Penicillium chrysogenum Inculo 106 esporas/mL Distintas fuentes de carbono: pectina, galactosa, sacarosa , manitol y glucosa. pH 6.5, 50C y hasta 60 minutos para la mayor actividad enzimtica. El proceso de purificacin donde se obtuvo mejor recuperacin fue precipitacin con etanol (57.7%). El proceso este proceso se especifica en la Propuesta 1 del apartado de Recuperacin y Purificacin de 14 Pectinasas.

Recuperacin y purificacin de pectinasas

Propuesta 1.

Centrifugacin (10,000 x g, 15 minutos a 4C) Recuperacin del sobrenadante

Precipitacin con etanol (3 volmenes de etanol incubado durante la noche a 4C)

Disolucin del precipitado en 10 mL de solucin tampn de citrato de sodio (pH 6.5).

Filtracin en gel (SEPHADEX G-100 12%, columna de 1.5 x 45 cm, equlibrada con solucin tampn de citrato de sodio pH 6.5 y eluida con la misma solucin, 10 mL/h) Liofilizacin a 5 mL (para mayor purificacin) Dilisis (contra agua destilada)

Propuesta 2.
Resuspensin del polvo en Solucin tampn de acetato de sodio pH 5 0.1 M, saturado a 20% sulfato de amonio

Filtracin

Dilisis contra agua destilada (24 h, 4 C)

Liofilizacin (polvo)

Dilisis Cromatografa Ultragel AcA 34 (contra agua destilada y luego contra solucin tamn de acetato de sodio)

Centrifugacin Resuspensin en el mnimo volumen de solucin tampn de acetato de sodio (8,000 x g por 30 minutos) Saturado a 80% sulfato de amonio Recuperacin precipitado centrifugacin

Cromatografa en CM Biogel-A

Cromatografa en DEAE Bio-gel A

Cromatografa en Ultragel Aca 44

Electroforesis SDS-PAGE

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Propuesta 3.

Tcnicas de extraccion y purificacion. PECTINASAS (Enzima Extracelular)

A partir del caldo de fermentacin, separado por centrifugacin y/o filtracin del micelio.

Se inici el proceso de extraccin por fraccionamiento salino, con sulfato de amonio al 80% en fro (4C) bajo agitacin.

Resuspendido en buffer Tris-HCl (pH 7,5) 20 mM; NaCl 350 mM y Glicerol al 2%; extracto parcialmente purificado.

El sobrenadante fue descartado y el sedimento fue lavado con sulfato de amonio al 80% .

Cuando se disolvi completamente la sal, se dej en reposo durante 12 horas y luego se centrifug a 6500 rpm por 30 min.

Dicho extracto fue sometido a una cromatografa de exclusin molecular, en Sephadex G-25, para eliminar el exceso de sal.

La columna fue equilibrada en el buffer de resuspensin y a las fracciones obtenidas se les determin la presencia de sulfato de amonio, la cantidad de protenas por estimacin 260280 nm y la actividad enzimtica.

Este volumen fue concentrado por ultrafiltracin usando membranas de corte en 10 kD (AMICON).

Rendimientos de purificacin ver anexo 1

El concentrado fue sometido a cromatografa en una columna de DEAE-Sephacel (Sigma) equilibrada en Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM. La elucin de la protena se efectu mediante un gradiente optimizado

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BIBLIOGRAFIA Martnez trujillo, Aurora; Aranda, Juan S

y Aguilar Osorio, Guillermo (2008). Kinetic study on inducibility of polygalacturonases from Aspergillus flavipes FP-500. Electron. J. Biotechnol. [online]. 2008, vol.11, n.4, pp. 8-9. ISSN 0717-3458.

Jayani, Ranveer Singh; Saxena, Shivalika and Gupta, Reena; Microbial pectinolytic enzymes: a review Process Biochemistry, vol 40, no. 9, pp: 2931-2944. Visser, J. and Vorgen, A.G.J. eds (1996); Pectin sans pectinases: Proceeding of an International Symposium (December 3er to 7th, 1995, Wageningen, The Netherland). Progress in Biotechnology, 1996, vol 14, pp: 915-920 A. Rasheedha Banu, M. Kalpana Devi, G. R. Gnanaprabhal, B. V. Pradeep and M. Palaniswamy (2010). Production and characterization of pectinase enzyme from Penicillium chrysogenum. Indian Journal of Science and Technology Vol. 3 No. 4 (Apr. 2010) ISSN: 0974- 6846
Elizabeth Viguria, Giuliana Noratto, David Campos (2005). PRODUCCION DE PECTINASAS MEDIANTE FERMENTACION SOLIDA A PARTIR DE Aspergillus foetidus NRRL 341, UTILIZANDO RESIDUUOS DE NARANJA, MARACUYA Y LIMON. SMBB Veracruz, Mxico.

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Anexo 1
ARTCULO 1. BIOTRANSFORMACIN. PRODUCCIN DE PECTINASAS MEDIANTE FERMENTACIN SLIDA A PARTIR DE Aspergillus foetidus NRRL 341, UTILIZANDO RESIDUOS DE NARANJA, MARACUYA Y LIMON. Elizabeth Viguria, Giuliana Noratto, David Campos. UNALM Las enzimas pectinolticas, poligalacturonasas (PG), pectinmetilesteras (PE) y pectinliasas (PL) son utilizadas en la industria para la extraccin y clarificacin de jugos. Estas son producidas a nivel industrial a partir de Aspergillus foetidus y principalmente mediante fermentacin sumergida. La tcnica de la fermentacin slida en los ltimos tiempos ha despertado el interes de muchos investigadores, ya que constituye una alternativa importante por sus requerimientos en equipos y sistemas de control menos costoso, menores gastos de energa, menor generacin de efluentes y los metabolitos son ms concentrados reduciendo costos en la purificacin. El objetivo del trabajo fue desarrollar un proceso de fermentacin en sustrato slido (FSS) para produccin de pectinasas a partir de residuos de naranja, maracuy y limn. Metodologa. Se inocul 105 esporas de Aspergillus foetidus NRRL 341/ de medio preparado con residuos de naranja, maracuy y limn, previamente acondicionados y adicin de fuente de nitrgeno y sales minerales. La fermentacin se realizo a 30C y se evalu la influencia de la humedad (60, 70 y 80%), fuente de pectina (comercial o procedente de los residuos) y concentracin (0.125, 0.5, 1 y 2 %); presencia de azucares reductores en el medio, fuente de nitrgeno y tcnica de fermentacin: FSS, respecto a la fermentacin sumergida FS. Resultados y discusin. El uso de residuos de naranja, maracuy y limn con 80% de humedad permiti obtener mayor actividad de PG, PL y PE debido a su complejidad y alto contenido de pectina con respecto a la mezcla de pectina comercial. La actividad pectoltica se incremento en proporcin a la concentracin de pectina comercial utilizada, demostrando el carcter inducible de la enzima. La presencia de azucares reductores no ejerci efecto represor en la sntesis de pectinasas, ms bien favoreci el crecimiento y ello se reflejo en la mayor produccin de pectinasas. Se logro la mayor actividad PL a las 48 hrs de fermentacin para los tres sustratos estudiados; PG entre 72 y 96 hrs y PE entre 48 y 96 hrs dependiendo del sustrato utilizado. Cuando se evalu la influencia de la tcnica de fermentacin, se encontr que con FS la produccin de PG, PL y PE fue inferior que con FSS, al respecto, menciona que esta tcnica permite 18

mayor superficie de intercambio aire/sustrato y el uso de mayor concentracin de pectina en el medio favorece la sntesis de pectinasas debido a que no existe el problema de elevado viscosidad que se genera en medio lquido lo que dificulta la agitacin del medio e incorporacin del oxgeno.

Conclusiones. El uso de residuos de naranja, maracuy y limn con 80% de humedad en FSS permite obtener elevados niveles de actividad pectinoltica; RESPECTO AL USO DE PECTINA COMERCIAL. La tcnica FSS, permite obtener mayores niveles de actividad enzimtica PG; PL y PE con respecto a la tcnica de fermentacin sumergida.

PRODUCCIN Y CARACTERIZACIN DE PECTINASA A PARTIR DE PENICILLIUM CHRYSOGENUM A. Rasheedha Banu, M. Kalpana Devi, G. R. Gnanaprabhal, B. V. Pradeep and M. Palaniswamy Department of Microbiology, Karpagam University, Coimbatore - 641 021, Tamil Nadu, India m.palaniswamy@gmail.com

La utilizacin de enzimas microbianas ha encontrado una amplia aplicacin en diferentes procesos industriales. Entre la variedad de enzimas comercializadas muchas son producto de la fermentacin de hongos filamentosos (Piccoli-valle et al., 2001). El gnero de Penicillium es mundialmente conocido por la produccin de metabolitos secundarios y enzimas extracelulares de alto valor comercial, incluyendo las pectinasas. El objetivo de este artculo era producir enzimas pectinolticas a partir de una nueva cepa aislada de Penicillium chrysogenum por fermentacin sumergida y la evaluacin de proceso. Adems, las caractersticas fsico-qumicas de la enzima tambin se reportaron.

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Especificaciones de la Fermentacin: 250 mL de medio de cultivo (Erlenmeyer 500 mL) 6 Inculo 10% (10 esporas/mL) Temperatura: 35 C pH: 6.5 Agitacin: 175 rpm Duracin: 5 das Medio de cultivo:

Compuesto Sacarosa citrus pectin (NH4)2SO4 K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O Resultados:

g/L 10 10 1.4 6 2 0.1

Distintas fuentes de carbono y nitrgeno fueron estudiadas para la optimizacin del medio de cultivo. Dichas fuentes se evaluaron respecto a la actividad enzimtica. La sacarosa y el persulfato de amonio la mejor fuente de carbono y nitrgeno respectivamente. De igual forma se estudiaron los efectos del pH y la temperatura sobre la produccin de pectinasas, siendo un pH de 6.5 y una temperatura de 35C las condiciones que optimizan la produccin (Grfica 2). Se determinaron las condiciones ptimas para maximizar la actividad enzimtica tales como el pH, la temperatura y el tiempo de incubacin con resultados de 6.5, 50C y hasta 60 minutos respectivamente. Por ltimo se determin el peso molecular de la enzima mediante SDS-PAGE siendo de 31 kDa el peso molecular de las pectinasas En forma de resumen a los resultados obtenidos se presentan en la tabla las propiedades de la enzima pectinasas y la protena total producida y recuperada despus del proceso de recuperacin y purificacin (Tabla 2). El proceso de purificacin en este proceso se especifica en la Propuesta 1 del apartado de Recuperacin y Purificacin de Pectinasas

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Tabla 1. Propiedades de la Pectinasa Propiedades pH ptimo Temperatura optima (C) Termoestabilidad (min) Vmax (U/ mg de protena) Km (mg/mL( Peso Molecular (Kda) P. chrysogenum 6.5 50 60 85 1.0 31

Tabla 2. Purificacin de la pectinasa a partir de P. chrysogenum Fraccin Protena Total (mg) 523.0 67.8 6.3 Actividad Total (U) 3818 2205 918 Actividad especfica (U/mg) 7.30 32.53 145.84 Purificacin (veces) 1.0 4.45 17.24 Recuperacin (%) 100 57.77 48.12

Filtrado Precipitacin con etanol Sephadex G100 (12%)

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