Cromatografia en Capa Fina de Los Componentes Del Cannabis Csif

CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE LOS COMPONENTES DEL CANNABIS
Mara Isabel Fernndez Calvo
Mara Isabel Fernndez Calvo
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INTRODUCCION GENERAL Cannabis es una de las plantas cultivadas desde la antigedad. Fue "domesticada" para la obtencin de fibra de sus tallos, aceite de su fruto y de una resina txica producida por sus glndulas epidrmicas. La asociacin histrica del hombre a la marihuana ha sido estudiada por muchos autores (Chropa, 1969). Se cree que Cannabis es originaria del centro de Asia y que su cultivo y su gran espontaneidad han favorecido su extensin. Se sabe que en el continente americano no se conoci hasta 1545 (Small, 1975). Actualmente se reconocen muchas variedades del gnero Cannabis; esta gran variedad hace difcil el establecimiento de una taxonoma completa y clara. Tres son los factores que pueden haber contribuido a la versatilidad: 1.La seleccin por el hombre para obtener fibra y droga. 2.3.El intercambio gentico entre plantas salvajes o cultivadas. La seleccin natural y la climatologa.
Taxonmicamente, Cannabis pertenece a la familia de las Cannabinaceas. Dentro de ella se conocen dos gneros: Humulus y Cannabis. Dentro del gnero Cannabis, algunos autores opinan que slo existe una especie (Small y Cronquist); otros, sin embargo, creen que existen dos. En este caso, nosotros hemos optado por la taxonoma reflejada en "Taxon" por Small y Cronquist, 1976. Estos autores consideran una sola especie, Cannabis sativa L., y a partir de ella, aparecen subespecies y variedades: Cannabis sativa L. Cannabis sativa subsp. sativa Cannabis sativa subsp. sativa var. sativa Cannabis sativa subsp. sativa var. spontanea Cannabis sativa subsp. indica (Lam.) Small y Cronquist. Cannabis sativa subsp. indica var. indica (Lam.) Cannabis sativa subsp. indica var. kafiristanica
I.- JUSTIFICACION E INTRODUCCION GENERAL
I.1.- CANNABIS. El presente trabajo tiene centrado su inters en el estudio de los principios activos ms importantes del camo indiano mediante distintos mtodos cromatogrficos de capa fina. Por ello, conviene iniciarlo con un repaso botnico, qumico y farmacolgico de la planta en cuestin. I.1.1.- Aspectos botnicos. Cannabis sativa L. es una hierba dioica, anual, con un tallo de 1 a 2 metros de altura media, estriado y ms o menos ramificado. Las hojas, opuestas en la parte inferior del tallo, son pecioladas, palmeopartidas en 5 a 6 segmentos desiguales lanceolados, elpticas y dentadas. En la parte superior son alternas, simples y de tres segmentos. Los pies masculinos son generalmente ms delgados que los femeninos. Las flores masculinas estn agrupadas formando panculos en la extremidad del tallo, con cinco spalos y cinco estambres. Las flores femeninas son cimas compactas, enmaraadas con brcteas foliceas. El cliz envuelve el ovario uniovular. El fruto es el aquenio, casi esfrico, de 2,5 a 3,5 mm de dimetro, liso, de color gris y sin albumen. La semilla ocupa la cavidad del fruto y est constituida de un embrin recurvado y ganchudo, formado por dos cotiledones gruesos y carnosos. I.1.2.- Composicin qumica. Dentro de la composicin qumica, Turner (1980) describe hasta 421 componentes distintos, agrupndolos en 18 grupos que se exponen a continuacin: 1. Cannabinoides. 2. Compuestos nitrogenados. 3. Aminocidos. 4. Proteinas, glicoproteinas y enzimas. 5. Azcares y compuestos relacionados. 6. Cadenas hidrocarbonadas. 7. Alcoholes simples. 8. Aldehidos simples. 9. Cetonas simples.
10. Acidos simples. 11. Acidos de elevado peso molecular. 12. Esteres simples y lactonas. 13. Lactonas. 14. Terpenos. 15. Fenoles no cannabinlicos. 16. Flavanoglicsidos. 17. Vitaminas. 18. Pigmentos. Dentro de estos 18 grupos descritos por Turner, los principios activos quedan limitados al primer grupo, es decir, a los Cannabinoides. De todos ellos vamos a hacer un ligero repaso de su estructura qumica y su accin farmacolgica. * Cannabigerol. (CBG). Presenta una considerable actividad antibacteriana contra los grmenes grampositivos. As mismo, este compuesto inhibe la incorporacin de la leucina y la uridina a las protenas y al cido nucleico respectivamente en el tejido nervioso.
* Cannabicromeno. (CBC). Produce sedacin y ataxia en perros, aunque es inactivo en el hombre.
* Cannabidiol. (CBD). Presenta actividad anticonvulsivante, accin antiinflamatoria y acciones sobre la conducta. El cido cannabidioico tiene actividad bactericida.
* 9-Tetrahidrocannabinol. (9THC). Presenta antiinflamatoria, broncodilatadora, accin accin analgsica, antiemtica, sobre la
temperatura corporal, acciones a nivel central, etc.
* 8-Tetrahidrocannabinol. (8-THC). Tiene las mismas acciones que el -THC, pero en menor potencia.
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* Cannabiciclol. (CBL). Tiene una farmacologa algo vaga. Provoca irritacin, que se manifiesta en la rata por una piloereccin y un exceso de respiracin.
* Cannabinol. (CBN). Presenta cierta actividad
anticonvulsivante, accin antiinflamatoria y propiedades inmunolgicas. As mismo, potencia los efectos del 9-THC.
* Cannabinodiol. (CBND). No presenta una farmacolgica y es poco conocida. accin
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* Cannabielsoina. (CBE). Su accin tampoco es conocida.
* Cannabitriol. (CBT). Accin farmacolgica poco clara.
I.1.3.- Farmacologa. Una vez expuestos los principios activos de Cannabis, presentamos a continuacin las acciones farmacolgicas ms estudiadas. Accin antiemtica. (Hollister, L.E.; 1986). Su accin es debida al 9-THC. Su uso est limitado por la toxicidad y efectos secundarios : sedacin, ataxia, hipotensin ortosttica, retencin urinaria, disforia, sequedad de boca, alucinaciones, ... Accin analgsica. La "marihuana", el "haschish" y otras preparaciones del Cannabis fueron utilizadas muchos siglos atrs para aliviar el dolor. En 1974 se demostr que este efecto era debido al 9-THC.
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Accin broncodilatadora. La "marihuana" inhalada o por va oral induce broncodilatacin en sujetos sanos y sujetos asmticos. Por ello el 9-THC podra tener un gran papel teraputico en los broncoespasmos, de no ser por la existencia de efectos secundarios fisiolgicos y psicolgicos. Mediante derivados sintticos del 9-THC se trata de mantener su accin broncodilatadora y minimizar los efectos colaterales. El CBN y el 8-THC se estn estudiando en este aspecto. (Formukong, E.A.; 1984). Accin antiinflamatoria. (Evans, A.T.; 1987). La administracin oral del 9-THC muestra que este compuesto es 20 veces ms potente que la aspirina y 2 veces ms que la hidrocortisona. As mismo el CBD y el CBN reducen el eritema experimental en rata. Accin sobre la motilidad gastrointestinal. El 9-THC inhibe potentemente el vaciamiento gstrico. 9-THC y CBN tambin inhiben el trnsito del intestino delgado. Los CBD no tienen efecto. Accin sobre el glaucoma. (Leopold, I.H.; 1986). Hepler y Frank en 1971 observaron por casualidad que fumando "marihuana" (0,9% 1,5% -THC) se reduca la presin intraocular aproximadamente en un 45% despus de 30-40 minutos. Se administr oralmente a pacientes con glaucoma un homlogo sinttico del THC.
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Desgraciadamente, adems del efecto buscado de reducir la presin intraocular, se observ tambin una hipotensin suave y otros efectos secundarios. Acciones neuroqumicas perifricas. (Dewey, W.L.; 1986). Los cannabinoides no alteran los niveles basales de dopamina, pero s aumentan la sntesis de las catecolaminas en ratn. El efecto de los cannabinoides sobre el sistema colinrgico est menos claro que en el sistema adrenrgico. Acciones a nivel del SNC. Los cannabinoides producen tanto depresin como excitacin del SNC. -Accin sedante. Uso como sedante. Las preparaciones orales de Cannabis tienen un efecto sedante y tranquilizante, acompaado de una disminucin de la ansiedad, a dosis
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menores de la dosis que posee psicoactividad. De hecho la sedacin es el sntoma ms caracterstico del THC en los ensayos clnicos. (Neumeyer, J.L.; 1971). -Accin anticonvulsivante. En especial el 9-THC y los CBD son activos en los modelos experimentales con animales en situacin convulsiva. El metabolito 11-OH-9-THC es ms potente que la forma de partida. (Martin, B.R.; 1986). -Esquizofrenia. El Cannabis afecta a los sntomas de la esquizofrenia (Andreasson, S.; 1987): causa una exacerbacin de dicha patologa. Adems, produce una psicosis txica que cursa con los sntomas esquizofrnicos haciendo que sta sea ms pronunciada. Por ltimo, el Cannabis neutraliza la accin teraputica de la medicacin antipsictica. Accin mejoradora de los Neurolpticos. Este hecho ha sido demostrado recientemente en el hombre. Se produce una accin rpida, eficaz sobre los "tics" y otros sntomas del sndrome Tourette, que no son controlados por la administracin exclusiva de neurolpticos. Accin sobre reproduccin y endocrinologa. (Mendelson, J.; 1984). Est suficientemente probado que el 9-THC y varios de sus anlogos producen efectos sobre los sistemas reproductores masculino y femenino. El 9-THC causa, entre otros efectos, descenso de la secrecin de la hormona folculo estimulante (FSH) y de la hormona luteinizante (LH), reduccin en el tamao de los testculos y regresin de las clulas de Leydig. Accin sobre el feto y recin nacido. (Wenger, T.; 1991). La "marihuana" y sus derivados atraviesan libremente la placenta y pueden inducir efectos toxicolgicos y teratolgicos directamente sobre el feto, siempre que su uso haya sido crnico y a concentraciones altas. En los ensayos desarrollados por Wenger administrando THC a ratas preadas, se ha visto que las cras nacen con un peso menor y tambin est disminuido el peso de las gnadas. As mismo, se encuentra disminuido el contenido del neuropptido Y (NPY) en el hipotlamo. Con todo ello, la administracin de THC a dosis bajas durante la gestacin causa una inhibicin transitoria del desarrollo del eje hipotlamo-pituitario-gonadal, con los consiguientes cambios en el sistema neuroendocrino. Despus de haber hecho un breve repaso de las distintas acciones farmacolgicas del Cannabis y sus compuestos, parece que la utilizacin terapetica es prometedora. Pero siempre hay que tener en cuenta los efectos secundarios producidos por la droga, especialmente a nivel
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del sistema nervioso central. Este ltimo hecho ha limitado de forma considerable el uso del Cannabis. No obstante la utilizacin de los derivados sintticos del THC como la Nabilona y el Levonantradol ya en clnica, as como el ensayo de nuevas molculas derivadas del THC, mantienen los efectos positivos y evitan los efectos psicotrpicos. Para finalizar esta introduccin dedicada al Cannabis, hay que tener presente otros dos aspectos ms que son la tolerancia y la dependencia que produce tras su administracin repetida y el cese brusco de su administracin. (Singh, N.; 1981).
I.2.- CROMATOGRAFIA. I.2.1.- Clasificacin. Se denomina cromatografa a un conjunto de tcnicas de separacin basadas en la competencia entre dos fases, una fija y otra mvil. Los componentes de una mezcla se separan por su distinta afinidad por una u otra de las dos fases. El principio de fraccionamiento cromatogrfico es esencialmente similar a los procedimientos de separacin clsicos, tales como la destilacin, extraccin y cristalizacin; en todos ellos se produce la separacin del componente deseado en una de las dos fases. La cromatografa se diferencia de estos mtodos en la existencia de una fase estacionaria y de una fase mvil. La fase estacionaria ser un slido poroso o un lquido retenido en un slido inerte, de composicin fija , dispuesto en forma de columna (cromatografa en columna, gas-lquido o lquido-lquido), en forma de placa (capa delgada) o de tira de papel. La fase mvil, es el eluyente y podr ser lquido o gas. Cuando la fase fija o fase estacionaria es slida la cromatografa se llama cromatografa de adsorcin, si es lquida recibe el nombre de cromatografa de particin o reparto an cuando esta fase lquida debe encontrarse sobre un soporte slido que no suele intervenir en el proceso cromatogrfico.
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Segn todo esto, la cromatografa se puede clasificar en cuatro tipos distintos: Adsorcin (fase estacionaria slida). Cromatografa lquido-slido (fase mvil lquida). Cromatografa gas-slido (fase mvil gaseosa). Particin (fase estacionaria lquida). Cromatografa lquido-lquido (fase mvil lquida). Cromatografa gas-lquido (fase mvil gaseosa). Pero normalmente para clasificar los mtodos cromatogrficos se acostumbra a dividirlos en dos tipos: Cromatografa de gases (gas-slido y gas-lquido). Cromatografa de lquidos (en columna y plana). As mismo, existen diversas variantes de la cromatografa lquida entre las que destaca la de intercambio inico, en la que la fase estacionaria es una resina intercambiadora de iones y su afinidad por la muestra depende de la apetencia de tipo qumico que para ella presenta la resina .
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A continuacin se expone un esquema bastante claro de la clasificacin de los mtodos cromatogrficos: C. de gas-slido C. de gas-lquido C. en papel Planar C. en capa fina C. de lquido-slido C. de lquido-lquido C. en fase-ligada Columna C. de intercambio inico C. de par inico C. gel permeable C. de exclusin C. gel filtracin
C. Gaseosa
C. Lquida
I.2.2.- Generalidades. El factor ms importante del proceso cromatogrfico es el equilibrio de distribucin de los distintos componentes de la muestra entre las fases estacionaria y mvil. La relacin entre las concentraciones de una sustancia entre estas dos fases, en estado de equilibrio, se denomina coeficiente de reparto o de particin (K) cuyo valor es:
Vs
ms y mm, son las masas respectivas de sustancia retenidas o disueltas en las fases estacionaria y mvil.
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Vs y Vm, son los volmenes de estas dos fases.
La relacin entre los coeficientes de particin de los distintos componentes permite conocer la facilidad de una separacin. Adems, el valor absoluto de estos coeficientes indica la velocidad a que se mueve cada banda en la columna, placa o tira, y la variacin del coeficiente con la concentracin establece la forma de la banda cromatogrfica. El coeficiente de distribucin puede ser independiente de la concentracin de sustancia disuelta o variar al cambiar la concentracin. La distribucin de una sustancia entre dos fases se representa grficamente mediante las llamadas isotermas de sorcin, que muestran la cantidad de sustancia sorbida en la fase estacionaria con respecto a su concentracin en la fase mvil. El trmino "sorcin" engloba los procesos de adsorcin, en los que la sustancia se concentra en el lmite de la fase estacionaria (generalmente slida), y de absorcin, en los que la sustancia se disuelve en la fase estacionaria (lquida). Las isotermas de sorcin se obtienen representando, en ordenadas las cantidades sorbidas en la fase estacionaria, para distintas concentraciones en la fase mvil que se representan en abscisas, todo ello en condiciones de equilibrio y a temperatura constante. Cuanto mayor es la concentracin de sustancia en la fase mvil, mayor ser tambin la cantidad sorbida por la fase estacionaria. Si la isoterma de sorcin es una recta que pasa por el origen (isoterma lineal) significa que el coeficiente de particin es independiente de la concentracin. Cuando el coeficiente de particin vara con la concentracin se obtienen isotermas curvadas: convexas o cncavas. En general, se logran isotermas de sorcin lineales en los procesos cromatogrficos de particin, sobre todo cuando la concentracin de la muestra en la fase mvil es bastante baja. En los procesos cromatogrficos de adsorcin, y cuando la muestra est a concentracin elevada en la fase mvil, se obtienen isotermas, en general convexa. Las isotermas cncavas son relativamente raras.
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II.- CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
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CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA II.1.- INTRODUCCION HISTORICA. La cromatografa de adsorcin, descubierta por el botnico ruso Michael Tswett en 1903, permaneci ignorada hasta el ao 1931. Tswett encontr que los pigmentos vegetales podan separarse, filtrando su solucin en ter de petrleo a travs de una columna de carbonato clcico, observando que en sta se formaban zonas amarillas y verdes. El apogeo de la cromatografa de adsorcin comenz en 1931, cuando Kuhn y Lederer, as como Kuhn, Winterstein y Lederer introdujeron el mtodo en la qumica sinttica de los colorantes polinicos. El primer trabajo trat de la separacin en sus componentes del entonces ya conocido caroteno y el aislamiento del y -caroteno. La aplicacin de la cromatografa como norma preparativa por Kuhn, Winterstein y Karrer, es lo que ms influy en el desarrollo de la qumica de los carotenoides en los aos posteriores. Tambin avanz la investigacin de los pigmentos de las hojas verdes, flavinas y otras materias colorantes vegetales, con el empleo de las tcnicas cromatogrficas. Se fue evolucionando tambin hacia la separacin de combinaciones no coloreadas, elaborndose para ello mtodos de revelado. La cromatografa de adsorcin en columna se convirti rpidamente en un procedimiento standard. La cromatografa de Tswett era apropiada principalmente para la separacin de sustancias lipfilas. Falt, sin embargo, un mtodo cromatogrfico de separacin utilizable para compuestos hidrfilos (albuminoides, polisacridos y cidos nucleicos), hasta que Martin y Synge (1941) desarrollaron la cromatografa de reparto. Utilizaron columnas de gel de slice, al que se haba incorporado una determinada cantidad de agua. Consden, Gordon y Martin sustituyen la "sustancia soporte" silicagel por tiras de papel y crean la cromatografa de papel. Despus de conseguir las primeras separaciones de aminocidos, empez el gran desarrollo de la cromatografa de papel, que introdujo el mtodo en casi todo laboratorio qumico. Pero los lmites de la cromatografa de papel no se reconocieron claramente hasta ms de diez aos despus. La cromatografa de papel era considerada como el mtodo de anlisis cromatogrfico, aunque se produjeron muchas dificultades usando este mtodo en sustancias lipfilas, que segn el mtodo de Tswett eran fcilmente separables. No exista un
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procedimiento generalmente aplicable de la adsorcin cromatogrfica aunque Izmailov y Shraiber ya en el ao 1938 describieran el principio de la cromatografa de capa fina. Estos autores esparcieron xido de aluminio sobre placas de cristal y separaron diversas sustancias en estas capas no compactas. Williams cromatografiaba en capas de adsorbentes entre dos placas de cristal, una de las cuales tena un pequeo orificio por el cual se hacan llegar a la capa las soluciones y eluyentes. Meinhard y Hall usaron por primera vez un aglutinante (almidn) para conseguir una mayor estabilidad mecnica de las capas. Kirchner, Miller y colaboradores ampliaron el procedimiento y demostraron su utilidad para la separacin e identificacin de terpenos. Mientras que estos autores trabajaron sobre placas de vidrio estrechas (chromatostrips). Reitsema utiliz placas de vidrio ms anchas (chromatoplates) sobre las cuales se podan cromatografiar varias pruebas, una al lado de la otra, pudindose operar tambin bidimensionalmente. No se reconoci la importancia general de este mtodo hasta que por los trabajos de Stahl la cromatografa de capa fina fue introducida como procedimiento de la cromatografa de adsorcin analtica.
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II.2.- GENERALIDADES. Con el nombre de cromatografa plana se distingue a un conjunto de tcnicas cromatogrficas, ampliamente difundidas por la sencillez del equipo experimental requerido, que pueden considerarse incluidas dentro de la cromatografa lquida ya que la fase mvil es un lquido, pero que se distingue de ella en que la fase estacionaria no se halla en el interior de una columna sino que se encuentra extendida sobre una superficie plana por la que, por capilaridad o por adsorcin, se desplaza la fase mvil lquida. Segn el tipo de superficie que acte como soporte se distinguen dos grupos principales de cromatografa plana: La cromatografa en papel (PC), en la que la fase estacionaria, generalmente lquida, se encuentra adsorbida entre las fibras de una tira de papel. La cromatografa en capa delgada o capa fina (TLC) ("Thin Layer Chromatography"), en la que el soporte de la fase estacionaria es un material poroso purulento extendido sobre una superficie de vidrio, plstico o metal, por el que fluye, por capilaridad, la fase mvil; el material poroso puede tambin actuar como fase estacionaria en la cromatografa de adsorcin. De estos dos tipos de cromatografa plana, el que nos interesa a nosotros en este momento es el estudio de la Cromatografa en capa fina, por lo que en lo que sigue, haremos una amplia descripcin de la tcnica, teniendo en cuenta que en el caso de la cromatografa en papel, el proceso es similar. La cromatografa de capa fina, en la separacin de sustancias lipfilas, es mucho ms ventajosa que la cromatografa de papel. Se emple este mtodo tambin, unos aos ms tarde para la separacin de combinaciones hidrfilas y en algunos casos fue comparado sistemticamente con la cromatografa de papel, demostrndose que empleando sustancias apropiadas, es tan buena o mejor que aquella. Las ventajas ms importantes de la cromatografa de capa fina son: Excelente nitidez. Alta sensibilidad. Gran rapidez. Alguna separacin, que sobre papel necesita muchas horas, se puede lograr sobre una capa apropiada en pocos minutos.
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II.3.- BASES DE LA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC). II.3.1.- Introduccin. La cromatografa en capa fina es una tcnica instrumental que ha adquirido gran importancia para anlisis de productos de inters farmacutico, ya que rene las ventajas de la cromatografa en papel, y algunas de las de la cromatografa lquida en columna. La disposicin experimental es muy similar a la de la primera con la diferencia de que el papel, como soporte de la fase estacionaria, ha sido sustituido por una fina capa de un material adsorbente tal como el gel de slice (SiO2), la almina (Al2O3) o el xido de magnesio (MgO). Las ventajas principales por las que ha alcanzado gran difusin son las siguientes: a.b.d.e.f.g.h.Sencillez del mtodo experimental. Bajo coste del equipo necesario.
c.Rapidez del desarrollo cromatogrfico. Elevada resolucin y nitidez en la separacin de la mezcla. Alta sensibilidad en la deteccin de pequeas cantidades de sustancias. Posibilidad de emplear distintos soportes estacionarios segn el tipo de sustancias a separar. Posibilidad de utilizar diversos reveladores agresivos y poder calentar la placa a temperaturas elevadas para mejor visualizacin de las manchas. Facilidad de extraccin de las fracciones para su determinacin cuantitativa. Las placas suelen ser de vidrio 20x20 cm, aunque tambin se emplean de otros tamaos y materiales (plstico, metal...) sobre las que se extiende el material adsorbente formado por una papilla mediante un aplicador especial hasta obtener una fina capa lo ms uniforme posible. El espesor puede variar, siendo el ms corriente 0,25 mm. Capas ms gruesas se utilizan en la tcnica preparativa, para conseguir cantidades apreciables de cada componente. Generalmente el adsorbente contiene una sustancia aglomerante, yeso (sulfato de calcio), que lo mantiene adherido a la placa de vidrio. La extensin debe realizarse en un tiempo mximo de cuatro minutos para evitar el endurecimiento de la suspensin por efecto del aglomerante. Despus de la extensin se procede al activado de las placas, mantenindolas en estufa
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a 100-105oC durante 2h, con lo que su poder adsorbente aumenta extraordinariamente. Cuando interesa realizar cromatografa de reparto, las placas se dejan un cierto tiempo para que adquieran humedad. Este proceso recibe el nombre de desactivado. Existen en el comercio placas de vidrio para cromatografa preparadas con el adsorbente incorporado (Cromatoplacas); tambin se encuentran en forma de lminas de aluminio o plstico (Cromatofolios), que presentan la ventaja de poderse recortar con facilidad, muy tiles para anlisis cuantitativo. Los cromatofolios de plstico no pueden calentarse demasiado y deben utilizarse con precaucin con ciertos eluyentes. La eleccin del lquido de desarrollo es fundamental para lograr una buena cromatografa. El tipo seleccionado depende de la naturaleza de las sustancias que se pretendan separar. En general, los compuestos polares requieren eluyentes con agua, mientras que los poco polares utilizan lquidos no acuosos. Para la eleccin el eluyente, resulta conveniente colocar en una placa de cromatografa una serie de manchas de la mezcla a ensayar, y en el centro de cada una de ellas una gota de uno de los lquidos de desarrollo que se pretenden utilizar (distinto para cada mancha). Una vez revelada la placa se observar fcilmente cul es el ms adecuado. Para aplicar las muestras se dispone normalmente de plantillas de plstico con una serie de agujeros que permiten marcar el punto de aplicacin e introducir una micropipeta o un capilar a 2 cm del borde inferior de la placa, en el caso de placas de 20x20 cm. El volumen aplicado suele ser de 2-10 mm3 (1 a 50 g de sustancia) y la mancha no debe tener un dimetro > a 5 mm. El revelado puede realizarse por mtodos fsicos o por mtodos qumicos: - Entre los mtodos fsicos se encuentra la pulverizacin de una sustancia fluorescente (fluorescena) sobre la placa, con lo que al iluminarla con luz UV se observan las manchas oscuras sobre fondo fluorescente. As mismo, resultan de utilidad los adsorbentes que llevan incorporada una sustancia fluorescente, lo que permite la rpida localizacin de las manchas a la luz UV sin necesidad de pulverizar. - Otras veces se recurre a procedimientos qumicos, consistentes en la pulverizacin sobre la placa de un agente revelador que d una reaccin coloreada con las sustancias problemas, o bien se introduce la placa en el lquido revelador.
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Algunas veces se realizan dos desarrollos cromatogrficos, con eluyentes distintos y en direcciones perpendiculares, para obtener una mejor separacin de los componentes de una mezcla compleja. Esta tcnica recibe el nombre de Cromatografa bidimensional. Se debe tener la precaucin de secar completamente el primer desarrollo antes de comenzar con el segundo. La determinacin cualitativa de los componentes de la muestra, una vez revelado el cromatograma, se realiza mediante la medida de la distancia recorrida por cada componente y la recorrida por el disolvente, calculando el Rf o el Rx como se indica a continuacin: * El Rf es el "Factor de Retencin" y representa la relacin entre la distancia recorrida por la sustancia y la recorrida por el frente del eluyente.
Este parmetro nos indica la afinidad relativa de la sustancia por el adsorbente o por el eluyente. El valor del Rf est condicionado por numerosos factores tales como las variaciones en la composicin del lquido de desarrollo, la temperatura, que modifica el coeficiente de reparto y la viscosidad del eluyente, as como la naturaleza del adsorbente en s y las condiciones de trabajo. Por ello, para dar el valor del Rf como una caracterstica propia de cada sustancia , hay que especificar muy claramente las condiciones en que se ha realizado el ensayo. * Actualmente se emplea otro parmetro denominado Rx, que representa la relacin entre la distancia recorrida por la sustancia problema y la recorrida por otra sustancia patrn de caractersticas similares, en el mismo cromatograma y durante el mismo tiempo.
Rx= Distancia recorrida por el problema Distancia recorrida por el patrn
Para realizar un anlisis cuantitativo se requiere desarrollar en la misma placa cantidades patrones conocidas de todos los componentes cuya valoracin se pretenda efectuar.
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Existen varios procedimientos:
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a.- Comparacin del tamao de la mancha. Se basa en que la raz cuadrada del rea de la mancha es directamente proporcional al logaritmo de la cantidad de sustancia. Si se dispone de manchas correspondientes a distintas cantidades de muestra, se puede trazar una recta de calibracin, pudiendo conocer las cantidades de sustancia para manchas de rea conocida. Este mtodo slo es vlido manteniendo constantes el tamao inicial de la mancha, el disolvente de la muestra, el espesor de la placa y el lquido eluyente. b.- Mtodo fotodensitomtrico. Es el ms empleado. La determinacin se realiza por reflexin. Se suele realizar un barrido a lo largo y ancho de la placa, registrando grficamente las intensidades de luz reflejadas. Este mtodo no es adecuado para sustancias fotolticas. c.- Mtodo de elucin. Es el ms preciso. Requiere extraer la parte del soporte adsorbente correspondiente a una determinada fraccin, disolverla en un lquido adecuado y valorarla posteriormente por cualquier mtodo espectroscpico. Debe recogerse el adsorbente sin prdidas de material; se raspar la zona del adsorbente que se desea recoger, aspirando al mismo tiempo mediante una trompa de vaco. Existen dispositivos muy adecuados para lograr un rendimiento ptimo.
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II.3.2.- Cromatografa de adsorcin. II.3.2.1.- Aspectos generales. Se define adsorcin fsicamente, como la adherencia de compuestos, en forma molecular o inica, de tipo slido, lquido o gaseosa, sobre la superficie de un slido. Los efectos causados por la adsorcin pueden comprobarse si la superficie lmite es grande. Por ello, la separacin depende mucho de la superficie del adsorbente pulverizado. Las condiciones son menos sencillas en la adsorcin de soluciones que en la adsorcin de gases, porque la sustancia disuelta y el disolvente compiten por los sitios de adsorcin de la superficie. El proceso de adsorcin lleva a un equilibrio que depende de la temperatura, presin o concentracin. Manteniendo la temperatura constante y observando la dependencia de la adsorcin con la presin o concentracin, se obtiene como isoterma de adsorcin, una curva parablica, con un tramo ascendente prcticamente lineal en las concentraciones o presiones bajas de la sustancia disuelta. En esta zona el coeficiente de adsorcin (C. adsorbido/C. disuelto) es constante. Existen dos casos extremos para las isotermas de adsorcin: - Cuando coincide con el eje de abscisas, la sustancia no es adsorbida. Ocurre cuando la sustancia se disuelve completamente en el eluyente y es arrastrada por l (Rf=1). - Cuando la isoterma coincide con el eje de ordenadas, la sustancia es completamente adsorbida. Tiene lugar cuando la sustancia no se desprende del adsorbente, se queda en el origen (Rf=0). Si la isoterma de adsorcin transcurre entre estos dos extremos, entonces la sustancia es transportada a ms o menos distancia, con relacin a la pendiente de las isotermas y el proceso total est fundado en un cambio continuo de procesos de adsorcin y desorcin. Si la curva de la isoterma est prxima al eje de abscisas, el desplazamiento de la sustancia es rpido (altos valores de Rf), si se aproxima al eje de ordenadas, se desplaza lentamente (Rf pequeos). Idealmente, la isoterma es una recta; el equilibrio de adsorcin se establece instantneamente y no se produce proceso de difusin, por lo que las manchas aparecen
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perfectamente delimitadas. Si el equilibrio de adsorcin no se establece en seguida, o si la sustancia se difunde en el medio de elucin, entonces se obtienen manchas de bordes difusos pero manteniendo la simetra, que es lo que ocurre siempre. En el caso prctico, la isoterma no es completamente lineal. Cada adsorbente slo puede adsorber cantidades limitadas; la existencia de pocos lugares ocupados ya en la superficie de adsorcin, trae consigo una disminucin de la fuerza de adsorcin, porque los sitios ms activos son ocupados en primer lugar. Adems, con pequeas cantidades de sustancias, se obtienen isotermas curvadas y cromatogramas con manchas alargadas en la direccin a la lnea de origen. Esta formacin de "cola" es menor, cuanto menos sustancia se ha aplicado en el origen, es decir, las isotermas se van acercando al comportamiento lineal ideal. Si el eluyente contiene una sustancia capaz de ser adsorbida con mayor intensidad que las sustancias a separar, y si stas adems son semejantes qumicamente y en su afinidad con respecto al adsorbente, entonces los componentes del sistema rivalizan por los mismos lugares de adsorcin, tal que las manchas de sustancias en el cromatograma se suceden sin dejar zonas "vacas". Con estos procesos de desplazamiento hay que contar siempre en la cromatografa de adsorcin en la que se cromatografa una mezcla de varias sustancias; las velocidades de desplazamiento dependen mucho ms de las impurezas que en el caso de la cromatografa de reparto. Con todo lo visto, podemos decir que la cromatografa es un sistema de tres componentes como mnimo (adsorbente, medio de elucin y compuesto cromatografiado). El comportamiento cromatogrfico depende tanto del adsorbente como del medio de elucin. Se puede predecir qu adsorbentes y medios de elucin son apropiados para la cromatografa de una determinada sustancia. II.3.2.2.- Adsorbentes. El nmero de los adsorbentes disponibles es relativamente limitado, existen normalmente ms medios de elucin. En caso de una sustancia determinada, para un adsorbente fuerte ("activo") se requiere el correspondiente disolvente de fuerte poder de elucin. Por ello, se han clasificado tanto los adsorbentes como los eluyentes en series segn
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sus actividades crecientes. En los adsorbentes, pueden obtenerse adems diferentes grados de adsorcin con un tratamiento previo adecuado. Se suelen emplear como adsorbentes, xidos, xidos hidratados o sales. Las sustancias adsorbidas, adsorbatos, son combinaciones polares o polarizables. Estn ligadas a la superficie del adsorbente por medio de fuerzas electrostticas que tambin son responsables de la cohesin de la red cristalina. "Centros activos" de adsorcin son, aristas, secciones de rotura, ngulos y lugares defectuosos de la superficie, en los que los iones estn ms o menos al descubierto. As se puede entender el paralelismo que existe entre la actividad de adsorcin y la escala de dureza, que representa una medida de la magnitud de las fuerzas reticulares. La unin del adsorbato a la superficie del medio de adsorcin est producida por fuerzas in-dipolo o dipolo-dipolo. Los puentes de hidrgeno participan tambin en la unin adsorbente-adsorbato. Las molculas que forman puentes de hidrgeno internos, se adsorben ms dbilmente en silicagel y xido de aluminio hidratado, que los compuestos ismeros que no poseen estas propiedades. Los puentes de hidrgeno, adems influyen en la movilidad entre la sustancia y el eluyente. La actividad de adsorcin de los adsorbentes cromatogrficos ms empleados, es muy diferente. Adems, se pueden variar mucho las propiedades de un adsorbente. El contenido del agua es definitivo, ya que las molculas de agua, fcilmente adsorbibles, bloquean los puntos activos de la superficie. A continuacin se presenta una tabla de adsorbentes ordenados segn su fuerza de adsorcin creciente segn H.H. Strain: Sacarosa, almidn. Inulina. Citrato magnsico. Talco. Sosa. Carbonato potsico. Carbonato clcico. Fosfato clcico. Carbonato magnsico.
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Magnesio. Acido silcico activado. Silicatos de magnesio activados. Oxido de aluminio activado. Carbn animal activado y magnesia activada. Otros autores, como G. Hesse, los clasifican de la siguiente manera: Oxido de calcio. Fluoruro clcico. Oxido de aluminio. Trixido de cromo. Oxido de aluminio alcalino. Oxido de aluminio cido. Floridina. Frankonita. Carbn animal activado. Diferentes adsorbentes presentan, en general, actividades de adsorcin similares frente a todas las sustancias probadas. Los adsorbentes de actividad muy parecida, en algunas ocasiones pueden dar distintas manchas de desplazamiento. Lo ms frecuente, sin embargo, es poder observar diferencias de mayor a menor magnitud en las velocidades de desplazamiento de las sustancias en adsorbentes diferentes. Es recomendable probar siempre varios adsorbentes. En capa fina, se optar primero por cambiar los eluyentes antes de variar el adsorbente. Ahora, pasamos a hacer una breve revisin de los adsorbentes de uso comercial ms empleados para la cromatografa de capa fina.
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II.3.2.2.1.- SILICAGEL. Es uno de los adsorbentes ms utilizados para la cromatografa de capa fina y en columna. El dixido de silicio en polvo, respirado durante largo tiempo, puede tener un efecto nocivo, llegando a producir, incluso, silicosis. Por ello, deber de tenerse en cuenta este factor en el momento de la fabricacin de las placas. En cromatografa de capa fina se ha venido empleando con mayor frecuencia el silicagel en forma de silicagel G "Merck", que contiene un 13% de yeso. El tamao de sus granos es de 5 a 25 . Para la elaboracin de capas muy finas, se tamiza el producto con un tamiz de malla 200. Una parte en peso de silicagel G se suspende en dos volmenes de agua destilada. El silicagel H "Merck" no contiene yeso ni aglutinantes orgnicos. Posee un tamao medio de granulacin de 5 a 25 . Tiene una buena estabilidad y los tiempos de recorrido son algo superiores en comparacin con los del silicagel G. Tambin pueden obtenerse silicagel H y silicagel G con indicadores de fluorescencia. La materia fluorescente inorgnica (un silicato de cinc activado con manganeso) hace innecesario tener que colorear las sustancias. Se observa el cromatograma en luz UV de onda corta, vindose las manchas oscuras sobre el fondo fluorescente. El silicagel G "TLC" contiene un 10% de yeso. Existen otros muchos tipos de silicagel comercializados que difieren unos de otros en la composicin y proporcin de yeso que presentan, as como el tamao de granulacin. Existen tambin capas de silicagel modificadas para la separacin de combinaciones cidas, elaboradas con cido oxlico 0,5 N en vez de con agua o con adicin de cido sulfrico. II.3.2.2.2.- OXIDO DE ALUMINIO. Durante muchos aos, el xido de aluminio se ha utilizado con menor frecuencia en la cromatografa de capa fina que el silicagel, principalmente porque el silcagel G era, al principio, el nico adsorbente conseguible para este fin. Autores checos como Hermanek, Shwarz y Cekan han descrito mltiples aplicaciones del xido de aluminio neutro. Es til, por
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ejemplo, en la separacin de terpenos, alcaloides, esteroides, combinaciones alicclicas, alifticas y aromticas. Existen distintas clases comercializadas para la cromatografa de capa fina. El xido de aluminio G "Merk" tiene reaccin alcalina . Presenta una actividad de adsorcin menor que la del silicagel G. As mismo es mayor la posibilidad de formacin de "colas". El xido de aluminio "TLC" no contiene aglutinante y su reaccin es dbilmente alcalina. Existen otras muchas clases de xidos de aluminio comercializados por distintas casas comerciales (Woelm, Camag, etc.) diferencindose en la proporcin de yeso y el sistema de activacin. II.3.2.2.3.- KIESELGUR. Trmino alemn que se emplea para denominar la tierra fsil silcea que procede de las diatomeas. El kieselgur G "Merck" adsorbe ms dbilmente que el silicagel G y el xido de aluminio G. Por ello es especialmente apropiado para separaciones de combinaciones polares. La cantidad de sustancia mxima que se puede aplicar sobre las placas de kieselgur es relativamente pequea. Para la separacin de azcares, son apropiadas capas de kieselgur G tamponadas. II.3.2.2.4.- SILICATO MAGNESICO, SILICATO CALCICO. El silicato magnsico para cromatografa de capa fina lo suministra la casa Woelm. Es apropiado para la cromatografa de azcares. Las capas de silicato clcico son adecuadas para la separacin de azcares y fenilosazonas. II.3.2.2.5.- HIDROXIAPATITO. Se han empleado en las separaciones de lpidos polares y de protenas. Tambin se ha recomendado para cromatografa de capa fina de detergentes, aminoazcares N-acilados, saponinas y derivados de porfirina y pirrol.
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II.3.2.2.6.- OTROS ADSORBENTES INORGANICOS. Generalmente todos los adsorbentes empleados en cromatografa en columnas pueden emplearse tambin en cromatografa de capa fina. Se han propuesto capas finas formadas por xido de magnesio, carbonato magnsico, hidrxido clcico, carbonato clcico, fosfato diclcico, Anex, Filtrol, Florisil, talco y almidn, sin que con estos adsorbentes se hayan realizado separaciones cromatogrficas de capa fina. II.3.2.2.7.- CELULOSA, CELULOSA ACETILADA. Existen varias clases de polvos de celulosa, adems de unas celulosas modificadas. Los cromatogramas de placas de celulosa, muestran manchas ms ntidas que los cromatogramas de papel, elaborados bajo las mismas condiciones. De ah que las separaciones resulten mejores. Estn comercializadas como MN 300 Ac y MN 300 G/Ac, celulosas acetiladas, con o sin yeso. II.3.2.2.8.- INTERCAMBIADORES IONICOS. Se emplearon principalmente para la cromatografa de capa fina de derivados del cido nucleco. Los ms usados son intercambiadores inicos de celulosa. II.3.2.2.9.- POLIAMIDA. Es especialmente apropiada para la cromatografa de combinaciones fenlicas. II.3.2.2.10.-POLIETILENO. El polvo de polietileno, que tambin se emplea para cromatografa en columna. Est indicado para la separacin de cidos grasos y steres metlicos del cido graso. II.3.2.2.11.- SEPHADEX, DEAE-SEPHADEX. Las capas del gel de dextrn Sephadex son apropiadas para la separacin de aminocidos, oligopptidos y protenas, a causa de sus diferentes pesos moleculares ("filtracin
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de geles"). Sobre las capas de DEAE-Sephadex, pueden cromatografiarse protenas y nucletidos. II.3.2.2.12.- OTROS ADSORBENTES ORGANICOS. Se ha hablado de capas de urea, para la separacin de cidos grasos de cadena recta y ramificada. Se han separado antibiticos sobre capas de carbn activado. II.3.2.3.- Eluyentes. Como la velocidad de desplazamiento de una sustancia en un adsorbente dado, depende del medio de elucin empleado, se pueden obtener series con poder de elucin creciente llamadas series eluotropas. Se han propuesto distintas series eluotropas; entre todas aqu presentamos dos de ellas que nos son de gran utilidad (en orden creciente de poder de elucin): n-pentano ter de petrleo n-hexano n-heptano ciclohexano tetracloruro de carbono tricloroetileno benceno diclorometano cloroformo dietilter acetato de etilo piridina acetona n-propanol etanol metanol agua ter de petrleo (p.eb. 30-50C) ter de petrleo (p.eb. 50-70C) ter de petrleo (p.eb. 70-100C) tetracloruro de carbono ciclohexano sulfuro de carbono ter dietlico acetona benceno tolueno steres de cidos orgnicos dicloroetano, cloroformo, diclorometano alcoholes agua piridina cidos orgnicos cidos + bases, agua, alcoholes, piridinas
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Estas series son de gran ayuda para la eleccin del eluyente adecuado. No obstante, no es raro encontrar alteraciones en el orden de la serie; por ello en el empleo de las mismas, se debe actuar con cautela. Las mezclas de dos o tres disolventes de polaridad distinta, muchas veces dan mejores separaciones que eluyentes qumicamente uniformes. Estos tambin se pueden ordenar en series elutropas. As por ejemplo, la accin eluyente aumenta con regularidad en la serie: ter de petrleo ter de petrleo con cantidades crecientes de benceno benceno benceno con cantidades crecientes de etanol Estas series son vlidas para adsorbentes hidrfilos. Para poderse orientar sobre la magnitud del poder de elucin de un eluyente, se puede hacer sobre la capa fina , segn la "tcnica microcircular" . La solucin de las sustancias a separar se aplica sobre la capa en puntos separados entre s unos centmetros. Despus de la evaporacin del disolvente, se vaca en el centro de cada punto el eluyente contenido en un capilar previamente cargado. El lquido emerge circularmente y si es el eluyente apropiado, separa las sustancias aplicadas. Existe tambin la "tcnica escalonada" en la que, sobre el mismo cromatograma y en la misma direccin, se emplean varios eluyentes. Un disolvente posee un poder de elucin tanto mayor cuanto ms grande es su afinidad por el adsorbente. Para obtener resultados reproducibles, en la cromatografa se deben usar slamente disolventes muy puros. Los diluyentes que se alteren qumicamente, deben prepararse de nuevo en cada ocasin. En algunos casos pueden guardarse durante algn tiempo en el frigorfico. Hay que contar con la formacin de steres, en disolventes que contienen alcohol y cido. En general, hay que procurar emplear eluyentes sencillos, de uno o de dos componentes. En caso de eluyentes de varios componentes, hay que evitar que los ms voltiles se evaporen si se emplean recipientes que no cierran hermticamente.
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Cuando se trata de mezclas de sustancias conocidas, lo mejor es emplear en primer lugar como eluyente benceno o cloroformo (con contenido de etanol). Si las sustancias se quedan durante la cromatografa cerca del origen, entonces o bien se elige un medio disolvente con accin eluyente ms fuerte o se agrega al disolvente empleado otro de accin eluyente ms fuerte. Si las sustancias se desplazan demasiado aprisa (cerca del frente) se emplear entonces un disolvente, con accin eluyente ms dbil. II.3.2.4.- Adsorcin-Constitucin qumica. Si las sustancias a separar poseen en la adsorcin con un disolvente no acuoso poca afinidad por los adsorbentes hidrfilos, entonces se trabajar con un adsorbente "fuerte" y eluyente "dbiles", es decir, los que estn al principio de la serie elutropa. Se emplearn adsorbentes "dbiles" y eluyentes "fuertes" cuando la afinidad de adsorcin de las combinaciones es grande. Por todo ello, es muy importante saber qu caractersticas qumico-constitucionales influyen en la fuerza de unin por adsorcin. - Los hidrocarburos saturados son poco o nada adsorbidos. La introduccin de enlaces dobles aumenta la afinidad de adsorcin, aumenta la facultad de polarizacin de las molculas y con ello la fuerza de unin adsortiva a la superficie de los adsorbentes hidrfilos. - Al introducir grupos funcionales con un hidrocarburo, aumenta generalmente la afinidad de adsorcin. Las combinaciones carbonlicas se adsorben ms dbilmente que las hidroxlicas y amnicas. -Si varios sustituyentes estn presentes en una misma molcula, se comportan aditivamente con respecto a su influencia sobre la afinidad de adsorcin. Hay que tener en cuenta los efectos estricos. - Generalmente, el poder de adsorcin aumenta con el momento dipolar. Para la separacin de sustancias poco polares hay que emplear un adsorbente con actividad alta y un eluyente con poco poder de elucin.
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Para la seleccin del procedimiento cromatogrfico adecuado deben tenerse en cuenta las caractersticas estructurales ms importantes de las sustancias a separar. En la cromatografa de adsorcin la influencia del tamao de la molcula es menos pronunciada que en los otros procedimientos. Sin embargo, en la cromatografa de reparto, las diferencias de solubilidad dependen totalmente del tamao de la molcula. Por ejemplo, los cidos grasos homlogos, slo se pueden separar por medio de una cromatografa de reparto; en el cromatograma de adsorcin recorren la misma distancia. Por el contrario, la cromatografa de adsorcin pone de relieve especialmente las diferencias entre clase y orden de los sustituyentes. La cromatografa de intercambio inico, aventaja a la cromatografa de reparto cuando las sustancias a separar muestran diferencias del estado de carga que depende del pH, y cuando la solubilidad no es muy diferente. Una gran ventaja de la cromatografa de capa fina, es que sta ofrece muchas posibilidades de variacin, en cuanto a adsorbentes y sustancias de soporte. Adems, en general, se logra encontrar mucho antes el procedimiento de separacin ptimo en la cromatografa de capa fina, a causa de los cortos tiempos de recorrido. II.3.2.5.- Realizacin de la cromatografa. II.3.2.5.1.- GENERALIDADES. A causa de los tiempos de recorrido tan cortos no es imprescindible para la cromatografa de capa fina un lugar de temperatura constante. Se debe cromatografiar generalmente en el mismo sitio de trabajo. La temperatura de trabajo suele ser la temperatura ambiente (20-25oC). Se debe de disponer, para facilitar el trabajo, de los siguientes tiles: Un armario desecador para activacin y secado de los cromatogramas, as como para calentamiento en casos de efectuar reacciones de comprobacin. Un secador, utilizado para el secado de los cromatogramas, y que posibilita la aplicacin rpida de las soluciones de sustancias. Una campana de ventilacin. Una lmpara de luz UV de onda corta y otra de onda larga. Una cmara fotogrfica para fotografiar los cromatogamas. Una cmara frigorfica para conservar los reactivos sensibles.
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II.3.2.5.2.- APLICACION DE LAS SUSTANCIAS. De la mezcla de sustancias a separar, se preparan segn el tipo y el mtodo, soluciones a una determinada concentracin. Como disolventes son apropiados aquellos cuya accin eluyente es pequea en el nivel de adsorcin correspondiente. Se elimina lo ms posible de disolvente antes de empezar a cromatografiar. Las cantidades que se pueden cromatografiar sin formacin de "cola", son distintas en cada caso. Depende del nivel de adsorcin total, es decir, de la clase de adsorbente y de su capacidad, que en general va paralela con la actividad de adsorcin. Para un espesor de capa de 250 , las cantidades de sustancia que se pueden cromatografiar en cada capa de silicagel asciende a unos milgramos. Las mezclas a separar, se aplican sobre la lnea de origen del cromatograma. Esta, generalmente, se encuentra a una distancia de 1,5 hasta 2 cm del borde de la placa. Para poder aplicar las sustancias perfectamente alineadas, existen plantillas especiales fabricadas por distintas casas comerciales; pero ante la falta de ellas, bastar con hacer los depsitos sobre una lnea recta trazada sobre el cromatofolio mediante una regla milimetrada. Para la aplicacin de sustancias se emplean pipetas apropiadas, como las micropipetas agudas de un volumen de 10 l. Lo ms sencillo y quiz lo ms empleado, son capilares de fino calibre, evitando la aplicacin de gotas demasiado grandes que originarn posteriormente una mala separacin. Para trabajos cuantitativos muy exactos, se emplea una microjeringa especial o una pipeta micromtrica. Tambin son apropiadas pipetas calibradas similares a las jeringas Hamilton. En trabajos de cromatografa de capa fina sintticos las soluciones no se suelen aplicar como puntos, sino en forma de banda, ms o menos ancha. Para ello existen pipetas de banda ancha especiales. Naturalmente, se pueden aplicar tambin en forma de banda con una micropipeta corriente pero la banda aplicada suele salir irregular y por ello la separacin ser tambin peor.
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Para la aplicacin de mayores cantidades de sustancias, existen tambin varios dispositivos; entre ellos existe uno con capacidad para treinta y siete pipetas que se cargan y descargan automticamente. Con el fin de acelerar la aplicacin, se suelen emplear disolventes voltiles, especialmente en estos casos de aplicaciones mayores. El dimetro de las manchas en el origen debe ser lo ms pequeo posible. Las soluciones no muy concentradas se aplican varias veces dejndose secar entre cada aplicacin. Esta operacin puede acelerarse en el caso de eluyentes menos voltiles por medio de una corriente de aire (secador) o una corriente de nitrgeno. Las sustancias lipfilas debern aplicarse en un disolvente no polar. Se puede lograr reducir el tamao de zonas grandes y bandas anchas de sustancias, antes de la cromatografa. Primero se desarrolla con un eluyente, en el cual las sustancias a separar se desplazan con el frente. Poco despus de que este eluyente ha rebasado la zona de aplicacin, se saca la placa y se seca, comenzando entonces la cromatografa. Este desarrollo previo concentra las sustancias sobre una lnea de origen estrecha. No se debe olvidar marcar la placa de forma adecuada antes de comenzar la cromatografa. En el tercio superior se realiza una inscripcin de identificacin. Lo ms sencillo es enumerar los puntos de origen de izquierda a derecha, anotando las sustancias que se aplican en un cuaderno de control, o bien sobre la misma placa. II.3.2.5.3.- CAMARAS SEPARADORAS. Las cmaras separadoras, suelen ser recipientes de vidrio rectangulares o cilndricos. Para la admisin de placas de 20x20 cm, lo mejor son las cmaras rectangulares. Tambin se pueden emplear los llamados vasos de batera con tapa esmerilada, o vasos para la conservacin de preparaciones anatmicas. Los recipientes deben poderse cerrar hermticamente. En casos de capas de intercabio inico, se puede cromatografiar en recipientes abierto, por ejemplo, vasos de precipitados. Si se quiere realizar la cromatografa en una atmsfera distinta al aire, se hace uso de
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cmaras con tapas especiales, para dejar pasar los gases. Tambin existen cmaras para cromatografa de capa fina a temperaturas bajas. Si se desea saturar la atmsfera de la cmara con vapor de eluyente, se cubren completamente las paredes interiores con papel de filtro y antes de colocar las placas se agita fuertemente la cmara que contiene el eluyente, para que el papel de filtro se impregne. Se espera una hora antes de comenzar la cromatografa. La duracin del trayecto es menor cuando la cmara est completamente saturada. Existen unas "cmaras en S" que proporcionan una saturacin muy buena. Consta de un "tanque S" en el que admite el eluyente. Estas cmaras tienen la ventaja de tener un escaso consumo de eluyente y una buena saturacin de la cmara. II.3.2.5.4.- TECNICAS CROMATOGRAFICAS EN CAPA FINA Cromatografa ascendente. Una vez aplicada y secada la solucin de sustancias sobre el origen, se coloca la placa en la cmara separadora que contiene eluyente hasta una altura de 0,5-1 cm, previamente saturada mediante un papel de filtro. Antes de introducirla se marcan las lneas de origen y de frente. En caso de que las diferencias de las velocidades de desplazamiento sean pequeas, se aumenta el trayecto o se emplea el procedimiento contnuo, que veremos a continuacin. El trayecto debe ser lo ms corto posible, pues de lo contrario se producir efecto de difusin, disminuyendo la sensibilidad. Se deben sacar las placas de la cmara separadora inmediatamente despus de llegar a la lnea lmite. La concentracin del eluyente es mucho menor en las proximidades del frente que en el origen; por ello, el transporte de lquido en la capa no cesa en el instante en que el eluyente llega a la lnea ni siquiera en el caso de saturacin completa de la cmara. Las sustancias se desplazan todava algo ms. Si se cromatografan varias placas al mismo tiempo en un recipiente, deben sacarse
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todas las placas simultneamente. No debe nunca abrirse la cmara para sacar una placa y seguir cromatografiando. Se marca el frente del eluyente inmediatamente despus de haber sacado la placa de la cmara y se secan los cromatogramas a temperatura ambiente o con un secador elctrico. Cromatografa contnua. Utilizando eluyente con accin reducida y aumentando el trayecto, muchas veces se pueden separar sustancias con pequeas diferencias en los valores Rf. Se han descrito procedimientos continuos para la capa fina. En la parte superior de la placa se coloca una chapa de cobre o una lmina de aluminio en un ngulo de 45o, obtenindose un recipiente que se llena con adsorbente seco. El adsorbente se va saturando con el eluyente ascendido. Este mtodo permite cromatografiar en sentido ascendente durante 6-8 horas o durante la noche. Combinaciones muy similares muchas veces slo es posible separarlas por el mtodo contnuo. Se elige un disolvente de accin reducida (valores de Rf< 0,1). Tcnica escalonada y cromatografa de capa fina mltiple. Muchas veces se consigue una buena accin separadora con la tcnica escalonada, en cuyo caso se recorre el cromatograma con varios eluyentes, uno tras otro, en la misma direccin. Primero se cromatografan las sustancias menos polares de la mezcla con un eluyente ms enrgico. Las sustancias menos polares se juntan en el frente. Estas se separan, despus del secado del cromatograma, con un eluyente de accin ms reducida. El segundo eluyente se desarrolla en un trayecto mayor que el primero. Contrariamente, en la cromatografa de capa fina mltiple, se aplica varias veces el mismo eluyente en la misma direccin, despus de un secado intermedio. Con esto se logra que las manchas cuyos valores Rf son muy pequeos y estn muy prximos se desplacen a mayor distancia. Sustancias que no se separan en el primer recorrido lo hacen en el segundo o tercero. Despus de recorrer varias veces se denomina a los valores Rf, valores nRf, que tambin se puede calcular mediante la frmula:
n
Rf=1-(1-Rf)n
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Cromatografa horizontal. Se ha descrito un procedimiento contnuo para la cromatografa de capa fina en el cual la capa se encuentra en una cmara separadora situada horizontalmente. La cmara presenta una abertura lateral para que el eluyente despus de haber recorrido el trayecto correspondiente, pueda evaporarse mientras se absorbe constantemente nuevo eluyente del recipiente de reserva. Cromatografa descendente. Un dispositivo para la cromatografa de capa fina descendente consta de una cubeta de reserva con eluyente, papel cromatogrfico, una barra de vidrio, una placa de capa fina y una cubeta con adsorbente. Todo ello se monta en el interior de un recipiente hermticamente cerrado. Uno mucho ms sencillo se encuentra comercializado por distintas casas comerciales. Tcnica de bandas en forma de cuas y tcnica circular. Las tcnicas de banda en forma de cuas y circular, ofrecen tambin en la cromatografa de capa fina muchas posibilidades de separacin de sustancias con valores Rf similares. En ambos mtodos, el eluyente no slamente se desplaza en direccin del movimiento de las sustancias a separar sobre el cromatograma, sino tambin perpendicularmente a esta direccin. As, las sustancias se desplazan oblcuamente a la direccin del trayecto y no se superponen en caso de pequeas diferencias en sus velocidades de recorrido. Los indicios de impurezas que en el cromatograma generalmente son ocluidos por la sustancia principal, pueden comprobarse por el cromatograma de bandas en forma de cuas. Los tiempos de desplazamiento para estos cromatogramas, son ms largos, ya que el flujo del eluyente queda reducido a estrechas vas de afluencia. Con saturacin de la cmara completa se vuelven a obtener tiempos de recorrido ms cortos. Tambin los valores Rf estn desplazados en comparacin con el cromatograma habitual.
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En la tcnica circular, se trabaja con placas de vidrio que en su punto medio presentan un orificio de un dimetro de 2 mm. Se coloca la placa de vidrio sobre una cubeta que contiene el eluyente. El eluyente se absorbe por un algodn en forma de mecha a travs del orificio. Las mezclas de sustancias a separar, se aplican en forma de puntos sobre la placa alrededor del orificio a una distancia aproximada de 1 cm. De esta forma pueden compararse sobre una placa una serie de soluciones de sustancias distintas. Cromatografa bidimensional. Si los componentes de una mezcla de sustancias no se pueden separar completamente en una direccin de desplazamiento, se procura separarlos mediante esta tcnica. La solucin a analizar se aplica sobre el cromatofolio en un punto de la diagonal de la placa, a una distancia de 2 3 cm de un ngulo y se cromatografa primero con el eluyente 1 en la direccin 1. A continuacin se saca la placa de la cmara separadora y se seca. Las sustancias estn separadas parcialmente y se encuentran en una lnea prxima y paralela a un borde de la placa. Entonces se coloca la placa en un segundo eluyente diferente al primero, que asciende perpendicularmente a la primera direccin, separndose los componentes no separados en la primera direccin de desplazamiento. Cuando se quiera comprobar cantidades muy pequeas de sustancias, debe tenerse en cuenta que el lmite inferior de comprobacin sobre un cromatograma bidimensional es mayor en comparacin con el monodimensional, ya que al ser mayor el tiempo de desplazamiento en la tcnica bidimensional, los efectos de difusin ocasionan una dilucin considerable de la sustancia. Una enorme ventaja es que en le tcnica bidemensional pueden combinarse dos procedimientos de separacin distintos (por ejemplo, cromatografa de adsorcin y de reparto o cromatografa de reparto y electroforesis). Elucin con gradientes y capas con gradiente. En algunas ocasiones, puede ser muy til ir variando continuamente la composicin del eluyente durante la cromatografa. En una capa con gradiente, Kieselgur-silicagel, existe una transicin continuada de dos soportes diferentes, puede conocerse cromatografiando perpendicularmente a la direccin del
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gradiente, qu proporcin de mezcla de los adsorbentes es la ms adecuada para la separacin de un problema determinado. Si se cromatografa en direccin del gradiente, la propiedad de la capa vara continuamente desde el origen hasta el frente. En caso de la capa Kieselgur-silicagel se puede cromatografiar en direccin Kieselgur --> silicagel (inactivo --> activo) o en la direccin inversa. Se pueden crear capas con gradiente de pH, agregando a la masa la sustancia adecuada para tal fin, durante la elaboracin de la placa. Esta tcnica en gradiente, muestra unas posibilidades de separacin muy amplias. Tcnica SRS (Separacin-Reaccin-Separacin). Mediante este mtodo, puede investigarse la estabilidad de sustancias, frente a influencias fsicas o qumicas, sobre placas de capa fina. A diferencia del mtodo bidimensional, en este caso se emplea el mismo eluyente en ambas direcciones. Despus de cromatografiar en la primera direccin, se exponen las sustancias separadas sobre la placa a factores fsicos (radiacin UV, rayos X o ) o qumicos (gases, soluciones pulverizadas). Si no se presenta reaccin alguna se encontrarn las manchas despus de cromatografiar en la segunda direccin. II.3.2.5.5.- METODOS DE COMPROBACION O REVELADO. Para productos no identificables por un color caracterstico, se necesitan mtodos especiales de comprobacin. * Muchas sustancias se hacen visibles por la absorcin o por la fluorescencia si se observa el cromatograma con una lmpara UV de onda corta o de onda larga. Agregando a la capa del 1 al 10% de una sustancia luminosa que fluoresce en la luz UV de onda corta, se facilita el reconocimiento de las sustancias absorbentes. Existen en el comercio adsorbentes con materias fluorescentes. Muy apropiados son, como indicadores fluorescentes, los derivados del pireno (3-hidroxipireno-sodio 5,8,10-trisulfnico y 3,5-dihidroxipireno-sodio
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0,10-disulfnico), que son introducidos en el silicagel durante la elaboracin de las placas. Terminada la cromatografa se secan las placas a 110oC y se observan en la luz UV de onda larga. Las sustancias aparecen sobre un fondo dbilmente fluorescente segn su estructura qumica, como zonas fluorescentes o absorbentes. La ventaja fundamental de la aplicacin de indicadores fluorescentes, est en la cromatografa de capa fina preparativa, porque las sustancias se pueden reconocer sin ser alteradas qumicamente. Productos que sean fciles de bromar (compuestos con dobles enlaces olefnicos) se reconocen fcilmente cromatografiando sobre capas de silicagel y fluorescena y bromacin. En lugar de fluorescena tambin se puede nebulizar la placa con morina o adicionarla al silicagel. Despus de haber secado se observan, mirando con luz UV de onda larga, manchas fluorescentes amarillo-verdosas o manchas de absorcin oscuras sobre un fondo verde fluorescente. Otros indicadores fluorescentes que se pueden adicionar a la capa son, rodamina 6G y 2',7'-diclorofluorecena. * Muchas combinaciones no presentan color propio, ni absorcin de UV fuerte, ni fluorescencia. Tienen que hacerse visibles con reactivos de comprobacin especiales, que se aplican principalmente con un pulverizador sobre la capa. La aspersin no debe ser excesiva, con objeto de que las manchas de las sustancias no difundan. En muchos casos , los productos de reaccin que se forman, fluorescen o absorben en la luz UV. Se debe, por tanto, observar siempre los cromatogramas asperjados en la luz UV. Todos los reactivos utilizados en la cromatografa de papel pueden emplearse en la cromatografa de capa fina. Sobre las placas inorgnicas se pueden aplicar por aspersin reactivos muy agresivos y carbonizar combinaciones orgnicas por calentamiento a temperaturas elevadas. Aadiendo el 0,5% de un aldehido (vainillina, aldehido ansico, furfurol, aldehido saliclico...) al cido sulfrico, algunas veces se obtienen, ya en fro, colores intensos. Calentando a 100-130oC se hacen visibles por accin del vapor de yodo o aspersin con solucin de yodo. El yodo se une fsicamente y se puede emplear por ello como reactivo de comprobacin antes de las determinaciones cuantitativas. Un reactivo de aplicacin general es el permanganato potsico / cido sulfrico. Oxida
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hasta la vaselina y la reaccin puede servir para la comprobacin de toda clase de hidrocarburos. El tricloruro de antimonio es un reactivo muy empleado para el revelado de carotenoides y vitamina A, as como tambin para la de esteroides y terpenoides. El pentacloruro de antimonio, sobre capas inorgnicas es excelente para terpenos, derivados y fenoles . Por todo ello estos dos ltimos reactivos son muy interesantes en la investigacin de sustancias naturales vegetales (aceites esenciales, resinas, blsamos, ceras y derivados del alquitrn). II.3.2.5.6.- VALORACION CUALITATIVA. Sobre el cromatograma terminado se puntea el contorno de las manchas con un lpiz afilado, se marcan los centros y se mide sus distancias a la lnea de origen. El cociente entre las distancias (mancha-origen) y (frente-origen) da el valor Rf. Refirindose a otra sustancia (por ejemplo, un colorante test) entonces se divide por la longitud de este trayecto de referencia. En caso de mezclas de sustancias similares, se aconseja marcar sobre un patrn de un material transparente (celofn) la lnea de origen y del frente, as como la posicin de las sustancias en cuestin. Colocando el patrn sobre el cromatograma revelado, pueden reconocerse las sustancias presentes en la muestra. Una condicin indispensable es que las condiciones del ensayo no varen, tal que los Rf de las sustancias no difieran demasiado. Como control, se puede cromatografiar una mezcla de colorantes test, cuya posicin est marcada sobre el patrn. Muchos son los factores que pueden modificar los valores de Rf, afectando a su reproducibilidad. A continuacin se citan los ms importantes: - Calidad de los adsorbentes. Como la calidad de los adsorbentes vara de un lote a otro, se debera emplear durante una serie de experimentos slamente material del mismo suministro. Los valores de Rf dependen especialmente del tamao medio de los grnulos de los adsorbentes.
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- Grado de actividad de la capa, humedad del aire. La actividad de los adsorbentes se determina por la duracin del calentamiento y de la temperatura. Por ello, las placas requieren siempre un idntico tratamiento previo. Muy importante es tambin la humedad relativa durante la aplicacin de las sustancias y la existente en la cmara separadora durante la cromatografa. - Espesor de la capa, elaboracin de la misma. Entre 0,2 y 0,3 mm la influencia del espesor de capa, es despreciable. Desplazamientos apreciables de los valores Rf se presentan al emplear capas ms gruesas (> 0,5 mm). El espesor de la placa debe ser prcticamente constante a lo largo de una placa. Sobre placas irregulares, se obtienen manchas deformadas y desplazadas. Tales placas no se deben utilizar. Si esta irregularidad se presenta slamente en los bordes, puede aprovecharse todava la placa, pero debe cuidarse la uniformidad en la direccin del trayecto. Los valores Rf en las capas elaboradas mediante vertido presentan menor reproducibilidad que las capas extendidas, y las capas de silicagel G secadas al aire, mejor que sobre capas activadas. Estos problemas en la elaboracin de las capas hoy en da cada vez se presentan con menos frecuencia, debido a que se encuentran comercializadas y es muy raro que aparezcan estas alteraciones de fbrica. - Calidad del eluyente. Como ya hemos comentado en otras ocasiones, para lograr resultados reproducibles se deben usar eluyentes muy puros. La preparacin debe ser en el momento del ensayo y a ser posible se deben utilizar eluyentes sencillos. - Saturacin de la cmara separadora. La saturacin de la atmsfera de la cmara, con vapor del eluyente, influye considerablemente sobre los valores Rf. Si la atmsfera de la cmara no est saturada, el eluyente se evapora de la capa durante la cromatografa, as que para un trayecto determinado, se requiere ms cantidad de eluyente. La duracin de la cromatografa aumenta notablemente y los valores Rf, tambin. En el caso de eluyentes de varios componentes, se evaporan los componentes ms
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voltiles. Como la velocidad de evaporacin disminuye desde el borde de la placa hacia el centro de la misma, se pueden observar los "fenmenos laterales". Los valores Rf van aumentando desde el centro hacia los bordes. Esto se evita saturando uniformemente la atmsfera de la cmara con vapor del eluyente. Se cubren completamente las paredes interiores de la cmara con papel de filtro y se impregna ste con el eluyente, antes de la colocacin de la placa. Aunque trabajando sin saturacin de cmara, se obtienen mejores separaciones, se prefiere generalmente la cmara saturada por la mejor reproducibilidad de los resultados. - Tcnica. Se pueden observar diferencias en las velocidades de desplazamiento, cuando se pasa del mtodo ascendente acostumbrado al mtodo horizontal o al mtodo descendente. -Trayecto y distancia desde el punto de origen a la superficie del eluyente. Cuando se emplean eluyentes formados por varios componentes, se puede observar una relacin entre los Rf y el trayecto, aun cuando la atmsfera de la cmara est saturada. Este efecto es causado, por una parcial separacin del eluyente en sus componentes durante el trayecto. Esto ocasiona que el valor Rf dependa de la distancia entre el punto de origen y la superficie del eluyente. Debe permanecer constante la relacin de las distancias Superficie del eluyente punto de origen Superficie del eluyente - frente
- Cantidad de sustancia. Los valores de Rf dependen de la cantidad de sustancia aplicada. Las diferencias se aprecian en concentraciones muy pequeas y especialmente en concentraciones muy elevadas. El valor lmite superior depende de la sustancia y se tiene que determinar en cada caso particular. - Sustancias acompaantes. Especialmente en el caso de mtodos de cromatografa de adsorcin los valores Rf dependen de la presencia de otras sustancias presentes y de las impurezas existentes.
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- Temperatura. La constancia en la temperatura no es tan importante para la cromatografa en capa fina como para la cromatografa en papel. Como los tiempos de recorrido son cortos no hay que contar por una parte con variaciones de temperatura notables y por otra parte un aumento de temperatura de 10 15oC en cromatografa de capa fina no ocasiona cambios significativos en los valores de Rf. Por todo ello, podemos concluir que la temperatura no es un factor prioritario, a la hora de afectar a la reproducibilidad de los valores Rf, no obstante, es un factor a tener en cuenta. II.3.2.5.7.- VALORACION CUANTITATIVA. Los cromatogramas de capa fina pueden valorarse cuantitativamente, teniendo en cuenta siempre la posibilidad de errores, sin embargo, en la mayora de los casos, se obtiene una aclaracin suficiente sobre la composicin cuantitativa de las mezclas de sustancias desconocidas. A continuacin se hace un breve desarrollo de los distintos mtodos para la valoracin cuantitativa. Tamao de las manchas (mtodo de comparacin). La medida de la superficie de las manchas representa un mtodo sencillo de determinacin semicuantitativa, ya que dicha superficie depende de la cantidad aplicada. Se cromatografa con saturacin de cmara. Para unos lmites de concentracin media en la capa fina, existe una proporcionalidad ya conocida en la cromatografa de papel, entre la superficie de las manchas y el logaritmo de la cantidad de sustancia.
S = a log c + b Siendo S, la superficie de la mancha; c la cantidad de sustancia aplicada y a y b unas constantes.
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Para la medicin de las manchas, se transfiere el cromatograma a un papel milimetrado transparente, donde se encuentran los milmetros cuadrados. Sobre una curva calibrada se anotan las cantidades de sustancia, en funcin de las superficies. Como la superficie absoluta depende del espesor y la actividad de la capa separadora, se obtienen resultados ms exactos, cromatografiando tambin cantidades conocidas y comparando el tamao relativo de las manchas. En vez de curvas calibradas se pueden hacer patrones para cada sustancia. Se practican orificios del tamao correspondiente en lminas o papel milimetrado, anotndose al lado la cantidad de sustancia correspondiente. Para la valoracin, se coloca el patrn sobre el cromatograma de forma que coincidan lo ms exactamente posible, la superficie de las manchas con los orificios. Tambin pueden medirse manchas con un planmetro, o con plantillas ya comercializadas. Mtodo de dilucin. Se elabora una serie de diluciones de la sustancia a investigar, determinndose el lmite inferior de comprobacin por medio de la cromatografa de capa fina. De la solucin desconocida se cromatografa tambin, a ser posible sobre la misma placa, una serie de diluciones, determinndose para qu dilucin puede comprobarse todava la sustancia. Del lmite inferior de comprobacin y del factor de dilucin se puede calcular la cantidad desconocida. Fotometra. Se tienen que confeccionar curvas calibradas con cantidades conocidas de la sustancia a determinar. Se cromatografa con saturacin de cmara. Las manchas se pueden valorar con un fotmetro, despus de haber sido coloreadas con un reactivo apropiado. El cromatograma se pasa por una ventana delante de una clula fotoelctrica, anotndose grficamente las oscilaciones medidas. Aun cuando no se desee una valoracin cuantitativa de los cromatogramas, pueden ser valiosas las curvas densitomtricas. El poder resolutivo del densitmetro es mayor que el del ojo humano, de tal forma que manchas que a simple vista parecen ser uniformes, pueden
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ordenarse densitomtricamente como dos o ms sustancias superpuestas. As mismo, las curvas densitomtricas pueden emplearse tambin para la documentacin. Tambin se puede realizar una valoracin cuantitativa fotodensitomtrica, recortando el cromatofolio en tiras y midindolo en un fotmetro espectral. Se presentan los valores medios en funcin de la distancia de las manchas al punto de origen con un registrador de compensacin. Las superficies de extincin se determinan mediante un planmetro. Mtodo de elucin (extraccin). Los valores ms exactos se obtienen extrayendo (eluyendo) del adsorbente las combinaciones a analizar con disolventes apropiados y determinando a continuacin colorimtricamente o con un fotmetro espectral. Es posible efectuar reacciones cromticas en presencia del adsorbente. Esto es especialmente deseable cuando se trata de sustancias sensibles que se descomponen durante la extraccin. Para localizar la posicin de las manchas, existen diferentes procedimientos. El caso ms sencillo es el de las combinaciones coloreadas o comprobables en la luz UV. Muy til son los adsorbentes con material fluorescente. Como la sustancia fluorescente inorgnica no se eluye, generalmente no dificulta la determinacin. En la mayora de los casos no es posible revelar con reactivos de comprobacin porque con stos se alteraran las sustancias. Los valores Rf slo pueden emplearse para la determinacin de la posicin de las manchas cuando son suficientemente reproducibles. Si las sustancias pueden slo comprobarse por aspersin, se aplica entonces la solucin de la misma en varios puntos de origen del mismo cromatograma, destinndose una banda a la comprobacin. Despus de determinar la posicin de las manchas, se desprenden de la placa, se eluyen las sustancias y se determinan por un mtodo apropiado. Para la elucin de combinaciones hidrfilas, se emplean disolventes polares. Como en general, el adsorbente influye en el resultado de la medicin, se determina bajo idnticas condiciones y paralelamente al valor principal, el denominado "valor ciego" (o blanco), que se descuenta del valor principal.
El desprendimiento de las zonas de la capa puede ser realizado por dos procedimientos:
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a.- Con un bistur o una hoja de afeitar se desprende de la placa de vidrio o plstico las zonas del cromatograma donde hay sustancia, como en una zona libre, cuadrados o rectngulos del mismo tamao y se les coloca en recipientes apropiados para el anlisis, donde se efectuar la elucin. Una correccin de la extincin del valor ciego aumenta la exactitud de los resultados. b.- Las zonas en cuestin de la capa se transfieren con ayuda de un microaspirador a los recipientes de elucin. Por este mtodo, apropiado para el anlisis en serie, se obtienen los resultados ms exactos, con la mayora de los disolventes orgnicos. Sin embargo, no se puede aplicar en caso de placas con capas de gran adherencia (por ejemplo, capas de celulosa o empleo de almidn como aglutinante). En estos casos es mejor utilizar el mtodo anterior. Sin duda,este es el mtodo ms preciso de todos los comentados. Determinacin por calcinacin. Este mtodo se utiliza principalmente, para anlisis de productos orgnicos con contenido en fsforo. Debido al uso tan restringido, no nos extenderemos ms en este aspecto.
II.3.2.5.8.- CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA CON ISOTOPOS RADIOACTIVOS. La cromatografa de capa fina es tan apropiada como otras tcnicas cromatogrficas para la separacin de elementos radioactivos y sustancias marcadas radioactivamente. Junto a las ventajas analticas generales de la cromatografa en capa fina, es esencial que debido a la gran capacidad de la capa separadora, puede trabajarse "micropreparativamente", en las separaciones cromatogrficas de adsorcin. Por su gran sensibilidad de comprobacin, se requieren para el trabajo menores cantidades de sustancia radioactiva que en los mtodos cromatogrficos de papel y columna. Los istopos radioactivos ms importantes son los emisores de radiaciones :14C, 3H, 32 P, 35S.
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Entre los mtodos de comprobacin y medicin, vamos a enumerar los ms empleados: - Autorradiografa. - Valoracin con aparatos contadores. - Mtodos de anlisis radioqumico. * Anlisis por indicadores. * Anlisis por activacin. * Mtodo de dilucin de istopos. * Mtodo de radiorreactivos.
II.3.2.5.9.- DOCUMENTACION DE CROMATOGRAMAS DE CAPA FINA. Para la documentacin de cromatogramas de capa fina se hacen fotografas, fotocopias u ozografas. Los dibujos sencillos de los cromatogramas no poseen valor documental, pero pueden ser muy tiles, especialmente cuando se emplean sucesivamente varios mtodos de comprobacin. Despus de un tratamiento previo se puede desprender toda la capa de la placa de vidrio y conservarla como un cromatograma de papel, o bien, los cromatofolios se pueden revelar con productos adecuados para su conservacin. Fotografa, Fotocopia, Ozalid. Las fotografas en luz diurna de los cromatogramas, es conveniente realizarlas a una distancia de 40 hasta 50 cm. La fotografa en luz UV est indicada si las combinaciones cromatografiadas o los productos de reaccin que se forman durante la aspersin, absorben luz UV o fluorescen en la misma. En la mayora de los casos, se emplea luz UV de onda larga para activar la fluorescencia. Lo ms recomendado es la fotografa en color. Para fotocopiar los cromatogramas pueden emplearse los aparatos de uso comercial. Se obtienen copias fieles al original y a escala de los cromatogramas, pudindose observar por tiempo limitado. Las ozografas o copias ozalid son tambin tiles. Se emplea papel ozalid corriente.
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Para la iluminacin, se emplea un tubo fluorescente. La distancia de la luz hasta la placa y los tiempos de exposicin, son en cada caso diferentes . Para obtener resultados comparables deben ser exactamente iguales los tiempos de exposicin e intensidad luminosa. Desprendimiento de la capa fina. Por aspersin de una dispersin de plstico preparada para este fin se puede desprender la capa de la placa de vidrio y convertirla en una pelcula consistente parecido a papel. Si esta pelcula se conserva al abrigo de la luz, los colores y fluorescencias de las manchas se conservan durante algn tiempo en buenas condiciones. Los cromatogramas de capa fina desprendidos, deben protegerse de la luz y para la documentacin, pueden conservarse preparados sobre papel o colocados entre pliegos de papel. II.3.2.5.10.- CROMATOGRAFIA PREPARATIVA. Para la cromatografa de capa fina preparativa, son apropiadas capas de un espesor de 0,5-1 mm 1-2 mm empleando adsorbentes inorgnicos. Se tarbaja con un nmero mayor de placas o con placas mayores. Hay en el comercio placas de 20x40 y 20x100 cm, as como cmaras separadoras para el revelado simultneo de varias placas de estos tamaos. Las ventajas de la cromatografa de capa fina comparada con la cromatografa en columna son: - Rapidez. - Escaso consumo de eluyente. - Fcil deduccin de los eluyentes apropiados, por medio de ensayos previos en capas ms finas. - Zonas de sustancias ntidas y fcilmente comprobables. - Aislamiento sencillo de las manchas del cromatograma. Una desventaja supone el hecho de que sustancias sensibles pueden alterarse sobre la gran superficie de la capa. Aunque con este mtodo se pueden separar series de placas hasta la escala de gramos,
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se prefiere para estas separaciones la cromatografa de columnas. En muchos casos, puede pasarse directamente del micromtodo (cromatografa de capa fina) al macromtodo (cromatografa de columnas). Sin embargo hay que tener en cuenta que los buenos resultados de separacin, en la cromatografa de capa fina dependen y no en ltimo grado, de la cantidad relativamente grande de adsorbente empleado respecto a la sustancia (1000:1 hasta 10000:1). Esta proporcin en la cromatografa de columnas habitual es de 50:1 adsorbente / sustancia. En la cromatografa de capa fina la enorme superficie especfica de los adsorbentes produce un efecto adicional (tamao de grnulo < 0,08 mm). Por esto debe intentarse una reproduccin, lo ms exacta posible, de las condiciones de la capa fina, en la columna. La pregunta que se plantea, por tanto, ser que si para similares velocidades de desplazamiento cromatogrficas de capa fina de dos sustancias, en la columna se obtendran una separacin con el mismo eluyente. La respuesta se puede dar con cierto matiz. Si Rfa representa el valor Rf de la sustancia a con un desplazamiento ms rpido, y Rfb, el valor Rf de la sustancia b con un desplazamiento ms lento, puede esperarse una separacin en la columna cuando
r= Rfb + 0,1 Rfa
Rfa
.> 1
Si r < 1, no se obtiene separacin en la columna o se origina una superposicin de las dos sustancias en el eluato. En caso de valores Rf cromatogrficos de capa fina similares de las dos sustancias, la proporcin adsorbente / sustancia debe ser por lo menos de 500:1 hasta 1000:1, si se desea obtener una separacin por medio de una columna. Esta relacin slo es vlida para valores Rf absolutos pequeos. El anlisis cualitativo y control de pureza de las fracciones obtenidas por la cromatografa de columna, se efecta por medio de la cromatografa de capa fina. Un procedimiento prcticamente anlogo a la capa fina es la cromatografa de
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columna horizontal en un tubo de celofn. Se emplean los adsorbentes usuales finamente pulverizados. La proporcin en peso adsorbente / sustancia es aproximadamente 1000:1 (silicagel, xido de aluminio) hasta 500:1 (celulosa). Usando estos adsorbentes de granulado fino, la resistencia al paso del lquido en la columna aumenta tal que las sustancias no se eluyen en la columna en la forma acostumbrada. Por ello se cromatografa en tubos de celofn en posicin horizontal, que se puede cortar fcilmente, para aislar las distintas zonas. Estas se localizan observndolas en luz visible o UV con la posibilidad de adicionar sustancias fluorescentes en el relleno de la columna. Empleando eluyentes muy poco voltiles, se pueden trasladar los valores Rf de la capa a la columna. Las cantidades de sustancias separables estn comprendidas entre 100 mg y 1 g.
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METODOS CROMATOGRAFICOS EN CAPA FINA PARA EL ESTUDIO DE CANNABIS. Despus de haber profundizado un poco en la tcnica cromatogrfica de capa fina, pasamos a continuacin a subrayar los distintos mtodos encontrados en la bibliografa aplicados a la separacin de los principales componentes de Cannabis sativa. III.1.- METODO DE EL-DARAWY, A.; RIZEK, A.M.; MOBARAK, Z.M. (1972). En este artculo se recogen mtodos colorimtricos, cuantitativos y cromatogrficos para la determinacin de azo-derivados de los cannabinoles. En la cromatografa de capa fina, la metodologa seguida por los autores fue: * Droga. Resina "hashish". * Placas. Silicagel G. * Solvente. Eter de petrleo (40-60o) / acetato de etilo (95:5). Desarrollo del frente aproximadamente 15 cm.
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* Determinacin colorimtrica de los cannabinoles. Los cromatofolios se revelaron mediante un "spray" de reactivo diazotado o tetrazotizado: - p-nitroanilina. - benzidina. - o-tolidina. - o-dianizidina. Las manchas obtenidas en los cromatofolios fueron extradas con cido actico glacial / metanol (1:2) y se ley la absorbancia en un espectrofotmetro en la regin visible a unas longitudes de onda comprendidas entre 380-700 nm. Los picos de absorcin permiten una aproximacin a la posible identificacin de los distintos componentes. Los colores obtenidos fueron: Color Amarillo Marrn-rojizo Rosado Violeta
P-nitroanilina Benzidina O-tolidina O-dianisidina
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III.- METODOS CROMATOGRAFICOS EN CAPA FINA PARA EL ESTUDIO DE CANNABIS
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III.2.- METODO DE TURNER, C.E.; HADLEY, K.W. (1974). * Extracto. 1g de muestra se extrae con 40 ml de cloroformo, refrigerada a * Placas. Silicagel G (0,25 mm de espesor), pretratada con dimetilformamida en de carbono. * Condiciones. Temperatura 20oC. Humedad relativa de 50-60% . * Sistema de desarrollo. Eter de petrleo / ter (4:1). * Revelador. Azul slido B al 0,5% en una solucin acuosa. tetracloruro 6oC.
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* Resultados. Color Naranja Rojo Rojo Rojo Rojo Violeta Naranja Violeta Violeta Rojo Naranja
Acido cannabigerlico Acido 9-Tetrahidrocannabivarnico Acido 9-Tetrahidrocannabinlico 9-Tetrahidrocannabivarina 9-Tetrahidrocannabinol Cannabicromeno Cannabigerol Cannabivarina Cannabinol Cannabiciclol Cannabidiol
(En el mtodo recogido, el autor no recoge los valores Rf obtenidos).
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III.3.- METODO DE KRISOL, L.; HANUS, L.; YOSHIBA, T. (1975). * Extracto. Extraccin con ter de petrleo. *Adsorbente. Silicagel G (Merck). * Sistema de desarrollo. - N-hexano / etilacetato (72:18) o bien, - Metanol /hexano /dioxano (1:2:7). * Deteccin. Solucin de Benzidina bis-diazotada. 0,18 g de benzidina disuelta en 50 ml de cido clorhdrico 0,5 N (solucin I). Se mezclan 2 ml de la solucin I con 2 ml de nitrito sdico al 1% . A los 3-5 minutos, desaparece la coloracin. Entonces, aadir 2 ml de urea al 5% y el volumen final se lleva hasta 20 ml con agua destilada. * Estabilidad. El cromatograma es estable entre 1-2 horas.
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* Resultados. Color Amarillo Amarillo Rojo Rojo Violeta Violeta
Cannabidiol (CBD) Acido Cannabidilico (CBDA) 9-Tetrahidrocannabinol (9-THC) Acido 9-Tetrahidrocannabinlico (9-THCA) Cannabinol Acido cannabinlico (CBNA)
(El autor no recoge los valores Rf obtenidos)
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III.4.- METODO DE RAO, N.G.S. Y POKLIS, A. (1978). * Extracto de la planta. Eter de petrleo en Soxhlet. Concentrado hasta 1 g/ml. * Estndares usados. Cannabidiol, tetrahidrocannabinol y cannabinol. * Placas cromatogrficas. Silicagel F254 * Muestra. 30 l del extracto, a 1,5 cm del borde inferior y 3 cm entre cada botn. * Frente del solvente. Se deja correr unos 15 cm. * Sistema de desarrollo. 30 ml de una mezcla de ter de petrleo (60-80o) / cloroformo preparada cada da. * Revelador cromognico. Solucin de Sal de Azul slido B (FBB) al 0,1% en agua. (60:40), 20x20 cm y con un espesor de 0,25 mm.
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* Resultados. Rf 0,17 0,26 0,33 Color prpura rojo naranja Sensibilidad 0,05 g 0,05 g 0,05 g
Cannabinol Tetrahidrocannabinol Cannabidiol
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III.5.- METODO DE BAKER, P.B.; GOUGH, T.A.; TAYLOR, B.J. (1980). * Placas. Silicagel 10x20 cm y de 0,25 mm de espesor. * Sistema de desarrollo. Cloroformo (exento de etanol)/1,1-dicloroetano (15:10), * Resultados. Rf 0,63 0,60 0,55 0,50 0,45 0,41 0,38 0-0,25 Color Amarillo Rojo Prpura Rojo Prpura Naranja Prpura Rojo-naranja ascendente.
Cannabidiol Tetrahidrocannabinol Cannabinol Tetrahidrocannabivarina Cannabivarina Cannabigerol Cannabicromeno Acidos cannabinoides
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III.6.- METODO DE TEWARI, S.N.; SHARMA, J.D. (1983). CROMATOGRAFIA CAPA FINA BIDIMENSIONAL. * Extraccin. 0,5 g de "ganja" (sumidades floridas de Cannabis sativa L.) en 50 ml de cloroformo + X gotas de cido actico glacial. Se deja media hora a temperatura ambiente. Filtrar. Evaporar a una temperatura menor de 50oC hasta lograr un residuo con 0,5 ml. Evaporar luego a residuo seco con aire caliente. Disolver el residuo en 1 ml de cloroformo (preparado para las aplicaciones). * Placas. 20x20 cm. Gel slice G (30 g + 6,5 ml H2O) con un espesor de 0,25 mm. Activarlas a 110oC 40 minutos antes de usarlas. * Muestra. Aplicacin de 80 g a 2,5 cm a ambos lados de la placa en el plano diagonal. * Patrones. 5 g de cannabinol, cannabidiol, cannabicromeno, 8-THC, 9-THC. * Direccin I (ascendente). Heptano/diclorometano/butan-2-ona (83:5:12), previa saturacin de la cmara o 1 hora. Frente 12 cm. Secar a temperatura ambiente. Rotacin de 90 .
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* Direccin II. N-hexano / acetona (86:14). * Revelado. - Luz ultravioleta (254 nm). - Solucin al 0,1% de sal de azul slido B en 45% de etanol. * Resultados. 254 nm Oscuro Oscuro Oscuro Azul slido B Amarillo Naranja Violeta Magenta Violeta intenso
Cannabicromeno (CBC) Cannabidiol (CBD) Cannabinol (CBN) 8-THC 9-THC
(El autor no proporciona los valores Rf). * Conclusiones del autor. El desarrollo con el sistema de solventes utilizado separ hasta 47cannabinoides diferentes. Slo se identificaron los cinco mayoritarios. La solucin de azul slido B 0,1% en 45% de etanol es un reactivo cromgeno sumamente eficiente y especfico. Los mejores resultados se observaron a una temperatura de 25oC.
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III.7.- MEYODO DE MOHAMED, M.I.; HAKIN, M.A.; EL KHEIR, Y.M. (1985). * Extraccin. Se parte de 500 mg de la resina y se extraen con 20 ml de cloroformo. * Placas. Silicagel G F254 (Merck). * Sistema de elucin. Benceno / n-hexano / dietilamina (75:30:3). * Resultados. Rf 0,43 0,31 0,21
Cannabidiol Tetrahidrocannabinol Cannabinol
(El autor no indica el sistema de revelado empleado).
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III.8.- METODO DE WIN PE (1985). * Extraccin. Extracto con ter de petrleo. * Sustancias de referencia. Cannabinol, cannabidiol, 9-THC y 8- THC. * Placa. 10x20 cm impregnadas con gel de slice F254 con un espesor de 0,20 mm. Se roca la placa con dimetilformamida y se seca con un secador de pelo durante 10 minutos. * Solvente eluyente. Tolueno. * Desarrollo del frente. 11 cm en la direccin en que la placa meda 20 cm, descendente. * Revelador. Solucin salina B metanlica rpida.
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* Formas de las placas utilizadas. a.- Placa cromatografa descendente de particin lenta.
b.- Placa cromatografa descendente de particin rpida.
c.- Placa cromatografa descendente doble, rpida y lenta.
* Resultados
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Ester cannabitriol de a. cannabidilico Cannabidiol Cannabidivarol Cannabivarol Cannabinol 9-THC 8-THC 6-THC Cannabigerol (CBG) Cannabicromeno (CBch) Cannabiciclol (CBC)
Color Violeta Naranja Naranja-marrn Violeta-marrn Violeta Carmes Carmes Naranja-carmes Naranja Naranja Naranja-carmes
(El autor no recoge los resultados de los valores Rf obtenidos). * Conclusiones del autor. La ventaja de la cromatografa de capa fina descendente de particin bidimensional es que muestra manchas de cannabinoides ms definidas que las de la cromatografa de capa fina ascendente de adsorcin bidimensional, que utiliza tolueno como eluyente en una direccin (primer frente) y hexano / dioxano (9:1) como eluyente en direccin perpendicular (segundo frente).
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III.9.- METODO DE BRAUT-BOUCHER, F. (1986). * Etracto de la planta. Extraer con metanol a ebullicin. * Fase estacionaria. Placas de Silicagel G (Merck). * Sistema de desarrollo. - Hexano / ter etlico (80:20), para las formas neutras. - Hexano / dioxano (80:20), para las formas cidas. * Revelador. Pulverizacin con una solucin acuosa de azul slido B al 0,8% .
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III.10.- METODOS RECOMENDADOS POR LA ONU. (1987). La ONU recomienda distintos solventes para la cromatografa de capa fina, as como distintos reveladores. A continuacin aparecen reflejados todos ellos: * Extraccin. A partir de 1 g de hierba, 0,5 g de resina 0,1 g de "hashis" lquido, solucin final de 0,5 mg/ml. Disolventes a emplear: a. Extraen formas neutras y cidas: Tolueno Cloroformo Metanol Metanol:cloroformo (9:1) Acetona b. Extraen slo formas neutras: N-hexano Eter de petrleo Se extrae la muestra con 20 ml del disolvente elegido, durante 30 minutos a temperatura ambiente y en agitacin. Se filtra el extracto y se completa con el solvente hasta 25 ml, lavando el papel de filtro. * Estndares. Las soluciones estndar se preparan tal que la concentracin final sea 0,5 mg/ml de metanol y deben guardarse en la oscuridad en un sitio fresco preferiblemente refrigerado. * Sistemas de desarrollo. Sistema A: Eter de petrleo / ter dietlico (80:20). Sistema B: Ciclohexano / ter diisoproplico / dietilamina (52:40:8). obtener una
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Sistema C (para cidos): N-hexano / dioxano / metanol (70:20:10). * Revelador. Solucin de Sal Azul slido B. Esta solucin se puede preparar de dos formas: a.- 5o mg de Azul slido B disueltos en 20 ml de NaOH 0,1N. b.- 50 mg de Azul slido B disueltos en 1ml de agua y 20 ml de metanol. La
disolucin se facilita disolvindolo primero en el agua y luego aadir el metanol. La solucin de Azul slido B debe ser reciente, tal que se debe da. * Placas. Para una buena visualizacin de las manchas, las placas deben estar alcalinizadas. Esto se logra, bien empleando como sistema revelador, el mtodo a con NaOH 0,1 N, o bien, pulverizando la placa con dietil amina, permaneciendo intactas durante aos. preparar en el
* Resultados. Rf x 100. Sist.A 24 27 27 32 32 36 * * Sist.B 17 24 28 35 39 44 * * Sist.C 68 73 62 28 20
Cannabicromeno (CBch) Cannabivarina (CBv) Cannabinol (CBN) Tetrahidrocannabivarina (THv) Tetrahidrocannabinol (THC) Cannabidiol (CBD) A.tetrahidrocannabinlico (THCA) Acido cannabidilico (CBDA)
* Aparece una lnea, no una mancha, en el cromatofolio.
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III.11.- METODOS PROPUESTOS POR EL MINISTERIO DE SANIDAD Y CONSUMO (IBAEZ, M.L. 1990). * Extraccin. - Cannabis herbcea (Marihuana): Agitar 5g de la planta pulverizados, con 80 ml de metanol durante 1 hora. Filtrar en vaco y lavar el residuo utilizando una pequea cantidad de solvente, hasta completar el volumen filtrado a 100 ml. - Resina ("Hachis"): Triturar 1g de resina con una pequea cantidad de metanol, hasta formar una pasta. Transferir a un matraz, utilizando 80 ml de metanol aproximadamente y agitar 1 hora. Filtrar en vaco y lavar el residuo hasta completar el volumen a 100 ml. - Cannabis lquido (Aceite de hachish): Disolver 0,1g en 100 ml de metanol. As se logran soluciones finales de aproximadamente 0,5 mg de THC/ml. Como los cannabinoides son fcilmentesolubles en la mayora de los disolventes orgnicos, se pueden emplear para la extraccin: - Eter de petrleo. - N-hexano. - Tolueno. - Metanol. - Metanol-cloroformo (9:1). Los dos primeros extraen slamente los cannabinoides neutros, mientras que los dems extraen igualmente los cidos cannabinoides.
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* Fase estacionaria. Placas de Silicagel G Merck de 0,25 mm de espesor. * Eluyentes. - Sistema I: Benceno / n-hexano / dietilamina (25:10:1). - Sistema II: Eter de petrleo / ter etlico (80:20). - Sistema III: N-hexano / dioxano / metanol (70:20:10). * Patrones. Soluciones patrones de cannabinoides preparadas a una concentracin de 0,5 mg/ml en metanol. Conservar en lugar fro y oscuro. * Mtodo. Sembrar el extracto de la muestra y de los patrones, en el extremo inferior de la placa (a 2,5 cm de la base aproximadamente). Colocar la placa en la cuba saturada del solvente. Dejar ascender aproximadamente 14 cm (para una placa de 20x20 cm, se emplean 30-40 minutos). Retirar la placa y secarla a temperatura ambiente. * Visualizacin. a.- Solucin de Azul Slido B. - Disolver 50 mg en 20 ml de NaOH 0,1 N - Disolver 50 mg en 1ml de agua y 20 ml de metanol. En este caso debe pulverizarse la placa previamente con dietilamina para alcalinizar. b.- Bencidina diazotada. 5 g de bencidina en cido clorhdrico (14 ml) y hasta 1 litro de agua. Mezclar el volumen deseado de esta solucin con un volumen igual de nitrito sdico al 10% . c.- Acido sulfanlico. Disolver 10 mg de cido sulfanlico diazotado en 20 ml de carbonato sdico al 5% .
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d.- Reactivo de Beam. Solucin alcohlica al 5% de KOH. Este reactivo desarrolla lentamente el color, slo para el cannabidiol a temperatura ambiente. La reaccin es ms rpida calentando la placa en estufa a 105oC durante 5 minutos. e.- Reactivo de Duquenois. Aadir a una solucin de 0,5 g de vainillina en 20 ml de etanol, unas gotas de paraaldehido. Pulverizar con cido clorhdrico concentrado y calentar a 105oC 5 minutos.
* Resultados.
I Cannabidiol THC Cannabinol 0,45 0,35 0,25
Rf II 0,36 0,32 0,27
III 0,44 0,39 0,28
Azul slido B Amarillo-rosa Violeta-rosa Violeta-rojo
Reacciones Bencidina diazotada Amarillo-naranja Rojo-naranja Rojo-pardo
de coloracin A. sulfanlico diazotado Amarillo claro Amarillo brillante Amarillo
R. Beam Violeta -
R.Duquenois Azul Violeta azulado Violeta azulado
Con el sistema III de solventes, se pueden separar los cannabinoides cidos. N-hexano / dioxano / metanol (70:20:10). Los resultados obtenidos son: Acido cannabidilico (CBDA) Acido tetrahidrocannabinlico (THCA) Cannabidiol (CBD) Tetrahidrocannabinol (THC) Cannabinol (CBN) Rf 0,20 0,28 0,62 0,73 0,68
Los valores de Rf estn siempre sujetos a variaciones que dependen de las condiciones del laboratorio (Temperatura, humedad, corrientes de aire) y otros parmetros (por ejemplo, antigedad y calidad de los materiales).
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IV.- EXPERIMENTACION
EXPERIMENTACION La parte experimental de este trabajo, se basa en la comprobacin y modificacin de la mayora de los mtodos cromatogrficos encontrados en la bibliografa para el estudio de Cannabis sativa, haciendo una comparacin entre ellos y evaluando con cules dan los mejores resultados. De los once mtodos recogidos en esta Tesina, se desarrollan en las pginas siguientes, ocho de ellos que son los que han sido estudiados experimentalmente, siendo todos, mtodos de cromatografa en capa fina ascendente monodimensional. Los otros tres no han sido estudiados, bien por la complicacin del mtodo o bien por tratarse de mtodos bidimensionales o espectrofotomtricos. A continuacin pasamos a desarrollar los materiales empleados y los distintos mtodos, as como los resultados obtenidos y una discusin de los mismos. IV.1.- MATERIALES. - En todos los mtodos realizados se han empleado placas de silicagel F254 con 0,25 mm de espesor, de la casa comercial SCHLEICHER & SCHUELL y con unas dimensiones de 4,7x10 cm. - El margen inferior de la placa se puso a 1 cm y el sistema eluyente para todos los mtodos se ha dejado correr aproximadamente entre 8,5 y 8,6 cm. - Los reactivos empleados para la preparacin de los distintos sistemas eluyentes y de los extractos, son de las casas comerciales de MERCK, PANREAC, PROBUS y SCHARLAU. - El revelador cromognico utilizado principalmente, Azul Slido B (o-dianisidina tetrazotizada), fue suministrado por la casa SIGMA. - Las resinas ensayadas fueron proporcionadas por el Servicio de Restriccin de Estupefacientes del Ministerio de Sanidad y Consumo. - Los patrones, igualmente, fueron proporcionados por el Servicio de Restriccin de Estupefacientes del Ministerio de Sanidad y Consumo, siendo stos CBD, THC y CBN por ser los principios activos mayoritarios en la resina de Cannabis.
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- La temperatura ambiental media del laboratorio durante las experiencias era de 231oC - Para la documentacin de los cromatogramas se han realizado fotografas en color con una cmara reflex CANON A E-1.
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IV.2.- METODOS Y RESULTADOS. IV.2.1.- METODO DE TURNER, C.E. & HADLEY, K.W. (1974). * Extraccin. 0,5 g de la resina se extrae con 20 ml de cloroformo. * Placas. Placas de silicagel F254 pretratadas con dimetilformamida en tetracloruro de carbono (6:4). Se dejan secar totalmente antes de empezar a trabajar con ellas. Margen inferior de 1 cm. * Eluyente. Eter de petrleo / ter etlico (8:2). * Frente. 8,6 cm. * Patrones. CBD, THC y CBN (0,5 mg/ml de metanol). * Muestra. Resina vieja, es decir, con un almacenamiento prolongado, y resina fresca o reciente (Rv y Rn). * Revelador. Azul Slido B al 0,5% en una solucin acuosa. nueva,
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* Estabilidad. Al poco tiempo del revelado, las placas se van oscureciendo, pero los colores se conservan bastante bien. * Resultados.
CBD THC CBN
Rf 0,29 0,25 0,19
Color naranja-marrn rosa intenso violeta
aparece CBD, Como se puede observar en la fotografa, en la resina vieja (Rv) CBN y una ligersima cantidad de THC. Por el contrario, en la resina nueva o fresca (Rn), la banda mayoritaria es la del THC y la minoritaria la del CBN. Se aprecian otras manchas que no se han podido identificar por no disponer de patrones.
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IV.2.2.- METODO DE KRISOL, L.; HANUS, L. & YOSHIBA, T. (1975). * Extraccin. 0,5 g de resina con 20 ml de ter de petrleo. * Placas. Silicagel F254 de 4,7x10 cm y margen inferior 1 cm. * Eluyente. N-Hexano / etil acetato (72:18). * Frente. 8,6 cm. * Patrones. CBD, THC y CBN (0,5 mg/ml en metanol). * Muestra. Rv y Rn . * Revelador. Benzidina bis-diazotada (ver preparacin en pg. 68).
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* Estabilidad. Los cromatofolios una vez revelados, se amarillean con el tiempo, de las manchas se mantienen durante bastante tiempo. * Resultados. pero los colores
CBD THC CBN
Rf 0,63 0,63 0,55
Color amarillo naranja violeta
Con este eluyente, CBD y THC no se separan pues presentan el mismo Rf, como se puede apreciar en la fotografa, lo nico que los diferencia es el color. Observamos que en la Rn (resina nueva) se separa el CBN y el THC; el CBD queda solapado por el color del THC que es ms intenso y mayoritario. Por el contrario en la resina de almacenamiento prolongado (Rv), se observan CBD y CBN y no THC.
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IV.2.3.- METODO DE RAO, N.G.S. & POKLIS, A. (1978). * Extraccin. Resina (0,5 g) en ter de petrleo (20 ml). * Placas. Silicagel F254 de 4,7x10 cm y 1 cm de margen inferior. * Eluyente. Eter de petrleo / cloroformo (60:40). * Frente. 8,5 cm. * Patrones. CBD, THC y CBN (0,5 mg/ml en metanol). * Muestra. Rv y Rn . * Revelador. Azul Slido B al 0,1% en agua. * Estabilidad. Las placas mantienen su color durante un largo perodo de tiempo. * Resultados.
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CBD THC CBN
Rf 0,40 0,30 0,27
Color naranja-rojo rosa violeta
Se obtiene una separacin muy clara de los componentes mayoritarios. En la resina vieja, vemos la presencia de CBD y CBN, no detectndose THC. En la resina nueva observamos que el mayoritario es THC, encontrndose CBN en muy pequea cantidad.
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IV.2.4.- METODO DE BAKER, P.B.; GOUGH, T.A. & TAYLOR, B.J. (1980). * Extraccin. En este caso, el autor no indica el solvente de extraccin. Nosotros hemos escogido para la extraccin de la resina (0,5 g), el metanol (20 ml). * Placas. Silicagel F254 de 4,7x10 cm y con un margen inferior de 1 cm. * Eluyente. Cloroformo (exento de etanol) / 1,1-dicloroetano (15:10). El cloroformo fue destilado para eliminar el etanol que contena como estabilizador, logrndose as unos valores Rf ms idneos. * Frente. 8,6 cm. * Patrones. CBD, THC y CBN (0,5 mg/ml en metanol). * Muestras. Rv y Rn . * Revelador. Para este caso el revelador empleado por nosotros fue una solucin acuosa de Azul Slido B al 0,8%.
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* Estabilidad. Es importante fotografiar las placas inmediatamente despus del revelado, pues enseguida se oxida oscurecindose rpidamente y por lo tanto aprecindose peor los colores. * Resultados.
CBD THC CBN
Rf 0,75 0,70 0,68
Color rojo rosa violeta
Con el eluyente empleado en este caso, se observa que las bandas migran mucha distancia, de ah que los valores Rf sean mayores. En las resinas viejas se observan claramente CBD y CBN. En las resinas frescas, por el contrario, vemos que el mayoritario es THC, aprecindose ligeramente el CBD y no observndose la banda correspondiente a CBN. Por ello podemos decir que quizs sea un mtodo menos sensible.
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IV.2.5.- METODO DE MOHAMED, M.I.; HAKIN, M.A. & EL KHEIR, Y.M. (1985). * Extraccin. 0,5 g de resina en 20 ml de cloroformo. * Placas. Silicagel F254 con unas dimensiones de 4,7x10 cm y dejando en el borde inferior 1 cm. * Eluyente. Benceno / n-hexano / dietilamina (75:30:3). * Frente. 8,5 cm. * Patrones. CBD, THC y CBN (0,5 mg/ml en metanol). * Muestra. Rn y Rv . * Revelador. Azul Slido B al 0,1% en agua (el autor no indica el revelador). * Estabilidad. En este caso las placas son estables en el tiempo. * Resultados.
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CBD THC CBN
Rf 0,38 0,35 0,30
Color naranja rosa intenso violeta
Con este sistema eluyente las bandas migran poco y quedan muy prximas unas de otras, pero la nitidez es muy buena. Se aprecia adems, una pequea banda muy plida de THC en la resina vieja, cosa que no ocurre con otros mtodos. Podemos decir que el eluyente es muy eficaz. Adems, detecta una ligera descomposicin del patrn THC en CBN por oxidacin.
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IV.2.6.- METODO DE BRAUT-BOUCHER, F. (1986). * Extraccin. Resina (0,5 g) en metanol (20 ml). * Placas. Silicagel F254 de 4,7x10 cm de dimensiones. Margen inferior 1 cm. * Eluyente. Hexano / ter etlico (80:20). * Frente. 8,6 cm. * Patrones. CBD, THC y CBN (0,5 mg/ml). * Muestra. Rv y Rn . * Revelador. Solucin acuosa de Azul Slido B al 0,8% * Estabilidad. Las placas se oscurecen al poco tiempo de ser reveladas al ser expuestas al aire y a la luz.
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* Resultados.
CBD THC CBN
Rf 0,48 0,44 0,37
Color rojo rosa violeta
En la fotografa adjunta podemos observar (como hemos podido comprobar en otros mtodos), que en la Rv slo aparecen bandas correspondientes a CBD y CBN. Por el contrario, en la Rn el predominante es el THC, dibujndose dbilmente las otras dos bandas.
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IV.2.7.- METODOS RECOMENDADOS POR LA O.N.U. (1987). * Extraccin. La O.N.U. propone diversos disolventes. el elegido por nosotros es el metanol. Se extrajo la resina tal y como indica el mtodo (ver en pg. 80). * Placas. Silicagel F254 de dimensiones 4,7x10 cm. Borde inferior 1 cm. * Eluyente. De los tres sistemas de desarrollo propuestos por la O.N.U., hemos empleado dos de ellos, pues el tercero es para las formas cidas de las que fue imposible disponer de patrones. - Sistema A: Eter de petrleo / ter dietilo (80:20). - Sistema B: Ciclohexano / diisopropilter / dietilamina (52:40:8). * Frente. - Sistema A: 8,6 cm. - Sistema B: 8,5 cm. * Patrones. CBD, THC y CBN (0,5 mg/ml en metanol). * Muestra. Rv y Rn .
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* Revelador. Solucin de Azul Slido B en NaOH 0,1N (preparacin, ver pg.81). Esta solucin debe prepararse en el momento de ser utilizada, pues si no, se oxida con la luz rpidamente y el revelado de las manchas es notablemente peor. * Estabilidad. Las placas son estables durante un largo perodo de tiempo. Cabe sealar la posibilidad de la aparicin de unas pequeas manchas marrones sobre la placa, debido a la mala disolucin del Azul Slido B en NaOH. Es importante preparar el revelador justo en el momento en que se vaya a revelar las placas, pues la solucin alcalina de este reactivo, se oxida con el aire y la luz rpidamente, perdiendo su poder cromognico. * Resultados.
CBD THC CBN
Rf A 0,55 0,48 0,40
Rf B 0,55 0,51 0,42
Color naranja rosa violeta
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Ambos sistemas de desarrollo proporcionan una buena separacin de los principales componentes de Cannabis. Quiz podramos decir que el eluyente B sea ms sensible, pues se detectan unas bandas muy dbiles correspondientes a una ligera oxidacin del patrn THC. Se observan bandas muy claras de CBD y CBN para la resina vieja, mientras que en la resina nueva la mayoritaria es la de THC.
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IV.2.8.- METODOS RECOMENDADOS POR EL MINISTERIO DE SANIDAD Y CONSUMO. (IBAEZ, M.L. 1990). * Extraccin. 0,5 g de la resina con 20 ml de metanol. * Placas. Silicagel F254 de 4,7x10 cm y con un margen inferior de 1 cm. * Eluyente. Se proponen tres sistemas. - Sistema I: Benceno / n-hexano / dietilamina (25:10:1) (es el mismo propuesto por MOHAMED, M.I. 1985). - Sistema II: Eter de petrleo / ter etlico (80:20), equivalente al sistema A propuesto por la O.N.U. (1987). El sistema III, el ms idneo para separar las formas cidas, no lo hemos ensayado, pero se encuentra recogido en la parte general. * Frente. - Sistema I: 8,5 cm. - Sistema II: 8,6 cm. * Patrones. CBD, THC y CBN (0,5 mg/ml en metanol). * Muestras. Rv y Rn .
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* Revelador. El ministerio de Sanidad y Consumo revelado.Nosotros hemos probado tres de ellos: a.- Azul Slido B en NaOH 0,1N. b.- Benzidina diazotada. d.- reactivo de Beam (KOH al 5% en metanol). Los reveladores (c) y (e) no han sido probados. * Estabilidad. Con el Azul Slido B las placas permanecen estables en cuanto a su coloracin; con benzidina, despus del revelado, las bandas pierden color y las placas se oscurecen rpidamente. Con el tiempo. * Resultados. reactivo de Beam, el color violeta se va perdiendo poco a poco con el recoge varios mtodos de
CBD THC CBN
Rf I 0,36 0,32 0,30
Azul slido B naranja rosa-rojo violeta
CBD THC CBN
Rf II 0,53 0,45 0,41
Benzidina naranja-amarillo rosa-rojo violeta
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CBD THC CBN
Rf II 0,50 -
Reac. Beam violeta -
Podemos observar en las fotografas siguientes, la diferencia que existe entre los tres reveladores empleados. Con Azul Slido B en NaOH (a), se obtienen unas bandas de colores ntidos. Se observa tambin, que el sistema eluyente empleado en este caso, consigue separar unas pequeas bandas en que se ha descompuesto el patrn THC.
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Con la benzidina (b), se obtienen unas placas que inmediatamente se oscurecen y los colores pierden nitidez. El sistema eluyente en este caso (II), consigue una separacin bastante buena. Por ltimo, empleando el revelador de Beam (d), slo se detecta CBD.
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IV.3.- DISCUSION DE LOS RESULTADOS. Dado el inters social, econmico y farmacolgico mostrado por Cannabis sativa en los ltimos aos, nos pareci oportuno realizar un estudio comparativo de su composicin mediante un mtodo sencillo pero efectivo: CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA. Los mtodos cromatogrficos de nuestro inters encontrados en la bibliografa consultada, se basan en la cromatografa en capa fina ascendente monodimensional. Por comodidad y para facilitar la medida de los Rf, decidimos trabajar siempre con placas de idnticas proporciones (4,7x10 cm) y estandarizar as mismo el frente de desarrollo (8,5-8,6 cm) y el volumen aproximado de las muestras (entre V y VI gotas) para todos los mtodos ensayados. Es importante sealar tambin que los valores Rf han estado sujetos a las condiciones ambientales del laboratorio (T, humedad, etc.). De ah que para un mismo sistema de desarrollo, sea normal que encontremos modificacin del Rf para una misma sustancia, al repetir el mtodo en distintas pocas del ao y en distintos momentos del da. En cuanto a las resinas de Cannabis sativa utilizadas, hay que decir que los cannabinoides mayoritarios en la resinas frescas o recientes son THC, CBD y CBN en orden decreciente. Por el contrario, y como hemos podido comprobar a lo largo de este trabajo por diferentes mtodos, las resinas de almacenamiento prolongado (durante aos) que nosotros hemos denominado como "resinas viejas" (Rv), no presentan THC o presentan una pequesima cantidad, pues este compuesto con el tiempo sufre un proceso de oxidacin pasando a CBN. Por lo tanto, cuanto ms fresca es la resina , mayor cantidad de THC contiene, y cuanto ms vieja , esta cantidad va disminuyendo para ir engrosando la proporcin de CBN. Del primero de los mtodos ensayados (TURNER, C.E.; HADLEY, K.W. 1974), podemos decir que presenta una gran sensibilidad, pues se detecta una pequea banda de THC en la resina vieja, cosa que no ocurre con otros sistemas. No obstante las placas requieren un pretratamiento, con lo cual no puede ser considerado como mtodo rpido, pues antes de iniciar el proceso cromatogrfico la placa debe estar completamente seca. Con el segundo mtodo probado (KRISOL, L.; HANUS, L.; YOSHIBA, T. 1975), no
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se logra separar las bandas correspondientes a CBD y THC pues las dos presentan el mismo Rf. Por ello, podra dar falsos negativos de CBD, al colorearse ste con un color menos predominante (amarillo) y el THC con un color ms intenso (naranja) quedando el CBD enmascarado por el THC. Observando los resultados del tercer mtodo (RAO, N.G.S.; POKLIS, A. 1978), podemos ver que se obtiene una buena separacin de los componentes mayoritarios. Adems, el revelador utilizado no se oxida fcilmente, permaneciendo la placa cromatogrfica prcticamente igual que en el momento del revelado. En el siguiente mtodo (BAKER, P.B.; GOUGH, T.A.; TAYLOR, B.J. 1980), el mayor problema que se plantea es la poca estabilidad que presenta la placa una vez revelada, pero la separacin de los componentes mayoritarios se observa muy bien. Quiz podramos decir que sea uno de los sistemas eluyentes menos eficaces de todos los utilizados, pues no separa la banda correspondiente al CBN en las resinas frescas (en las que el CBN se encuentra aunque en muy ligera cantidad, como hemos podido demostrar mediante otros mtodos). De todos los empleados, este es el eluyente con mayor poder de elucin, de ah que los Rf resultantes sean tan elevados. Siguiendo con la valoracin de los resultados obtenidos en cada uno de los mtodos, podemos decir que el sistema de desarrollo empleado en el mtodo de MOHAMED, M.I.; HAKIN, M.A.; EL KHEIR, Y.M. (1985), da lugar a unas bandas bien definidas pero muy prximas unas de otras. Quiz sea este sistema el que presente menor poder de elucin; de ah que los valores Rf obtenidos sean tan bajos. Pero hay que decir sin embargo, que se consigue detectar una ligera banda de THC en las muestras de resina de almacenamiento prolongado, que como ya hemos dicho anteriormente, no se logra detectar en la mayora de los mtodos ya comentados. Del mtodo siguiente (BRAUT-BOUCHER, F. 1986), destacar nicamente el oscurecimiento tan inmediato que sufre la placa al poco tiempo de ser revelada. Esto no es mayor problema, pues se podra solucionar utilizando el Azul Slido B ms diluido, como se hace en otros mtodos. Como ya hemos comentado anteriormente, de todos los mtodos de elucin y revelado recomendados por la O.N.U. (1987), nosotros slo probamos dos sistemas: A y B. Con ambos
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se llega a resultados semejantes en cuanto nitidez y separacin de los componentes mayoritarios; si bien, cabe decir que el sistema de elucin B resulte algo ms sensible, detectndose en el patrn THC una ligera oxidacin hacia CBN. Por ltimo, vamos a repasar el mtodo de IBAEZ MARTIN, M.L. del MINISTERIO DE SANIDAD Y CONSUMO (1990). Proponen tres sistemas de desarrollo: El sistema I, es el mismo utilizado y descrito por MOHAMED, M.I (1985); el sistema II, es equivalente a uno de los recomendados por la O.N.U. (1987) y el III, es el empleado para separar las formas cidas. Todos ellos ya han sido comentados. De los tres reveladores probados en este caso, el (a) azul Slido B, da muy buenos resultados. La benzidina (b), es igualmente un buen revelador, con la salvedad del rpido oscurecimiento que sufre la placa. Por ltimo, el reactivo de Beam (d) slo detecta CBD, con lo cual dara falsos negativos a la hora de buscar THC en una muestra problema. Por otro lado, decir que el resto de las bandas separadas en la resina no hemos podido identificarlas por no disponer de patrones. En cuanto a los distintos reveladores empleados, podemos decir que tanto el Azul Slido B como la Benzidina diazotada, son adecuados para la deteccin de cannabinoides. Resaltar que la solucin de Azul Slido B en NaOH 0,1N es eficaz y concede estabilidad a la placa, obtenindose un buen desarrollo de los colores debido al medio alcalino. Requiere por el contrario ser preparado justo en el momento de su utilizacin. Las soluciones acuosas de azul Slido B son igualmente especficas y eficientes para detectar los cannabinoides. En funcin de la concentracin a la que se prepare el revelador, se obtendr una mayor o menor estabilidad de la placa posteriormente. Las concentraciones aqu empleadas son 0,1%, 0,5% y 0,8%, obtenindose muy buenos resultados con la solucin ms diluida, mientras que con la ms concentrada, la placa inmediatamente despus de ser revelada sufre un oscurecimiento, perdindose nitidez de los colores. Para terminar, al usar benzidina diazotada o benzidina bis-diazotada, tambin se observa diferencia en cuanto a la estabilidad, siendo ms estable el revelado con benzidina bis-diazotada, aunque con ambas existe oscurecimiento de la placa.
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V.- CONCLUSIONES
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CONCLUSIONES 1.- Con los estudios realizados, hemos podido confirmar la variacin en la composicin de la droga en funcin de su antigedad. Para obtener resultados reales hay que trabajar con resinas frescas; el THC con el tiempo se oxida pasando a CBN, llegando a desaparecer por completo en las resinas de almacenamiento prolongado. 2.- Los sistemas eluyentes con los que se logra una buena separacin de las formas neutras de los cannabinoides son: a.- Eter de petrleo / cloroformo (60:40). b.- Eter de petrleo / ter etlico (80:20). c.- Ciclohexano / ter diisoproplico / dietilamina (52:40:8). d.- Benceno / n-hexano / dietilamina (75:30:3). 3.- De todos los sistemas de revelado probados, el Azul Slido B (o-dianisidina tetrazotizada) ha resultado ser el ms especfico y eficaz para detectar los cannabinoides, y en especial la solucin acuosa al 0,1% y la solucin alcalina en NaOH 0,1N. 4.- Las tcnicas con las que hemos obtenido mejores resultados sin ser modificadas son: a.- El mtodo propuesto por RAO, N.G.S. y POKLIS, A. (1978). b.- Los mtodos recomendados por la O.N.U. (1987). 5.- Podemos afirmar que la cromatografa en capa fina es un mtodo sencillo, rpido y efectivo para el estudio cualitativo de los principales cannabinoides.
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VI.- BIBLIOGRAFIA
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CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE LOS COMPONENTES DEL CANNABIS

Mara Isabel Fernndez Calvo

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I.- JUSTIFICACION E INTRODUCCION GENERAL

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* Cannabicromeno. (CBC). Produce sedacin y ataxia en perros, aunque es inactivo en el hombre.

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temperatura corporal, acciones a nivel central, etc.

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* Cannabinol. (CBN). Presenta cierta actividad

* Cannabinodiol. (CBND). No presenta una farmacolgica y es poco conocida. accin

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* Cannabielsoina. (CBE). Su accin tampoco es conocida.

* Cannabitriol. (CBT). Accin farmacolgica poco clara.

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Vs y Vm, son los volmenes de estas dos fases.

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II.- CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

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Rx= Distancia recorrida por el problema Distancia recorrida por el patrn

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Existen varios procedimientos:

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S = a log c + b Siendo S, la superficie de la mancha; c la cantidad de sustancia aplicada y a y b unas constantes.