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BIOLOGA MOLECULAR
INTRODUCCIN
La habilidad para detectar y aislar genes normales y mutados, su secuencia y la expresin de sus productos proteicos ha tenido un importante impacto en la biologa y la medicina. La tecnologa del DNA recombinante ha hecho posible investigar ms a fondo la estructura y funcin de los genes, especialmente de los genes eucariticos que eran inaccesibles por otros mtodos.
INTRODUCCIN
La Tecnologa del DNA recombinante se origin en los comienzos de 1970 con el descubrimiento de las endonucleasas de restriccin, enzimas capaces de realizar el clivaje especfico del DNA en fragmentos determinados.
En estas primeras etapas se estaba trabajando sobre la posibilidad de manipular los genes, es decir:
A) tenerlos aislados, B) amplificarlos, en el sentido de tener muchas copias de la misma secuencia, C) conocer la secuencia exacta, es decir el orden de las bases de esos genes D) una vez aislado poderlo expresar fuera de su localizacin natural, lo cual tendr una enormidad de otras aplicaciones.
ACTUALMENTE
DNA molcula ms fcil de estudiar Es posible separar regiones determinadas Obtenerlas en cantidades prcticamente ilimitadas. Determinar su secuencia de nuclotidos a una velocidad de varios cientos de nucletidos al da. Un gen puede ser alterado y transferido a clulas en cultivo a la lnea germinal de animales.
A NIVEL COMERCIAL
Produccin a gran escala de hormonas peptdicas y vacunas a bajo coste y trabajo.
TCNICA
PROPSITO
Enzimas de Restriccin
ADN Ligasa Vectores Plasmidos Marcadores Genticos PCR ADNc
Sondas de ADN
Sntesis Gnica Gel Electroforsis
Secuenciacin de ADN
Aadir el bfer de lisis para romper las membranas nucleares y celulares y liberar el contenido nuclear Utilizacin de la proteasa para digerir las protenas celulares Precipitacin del ADN con alcohol fro y alta concentracin de sal.
EXTRACCIN DE ADN :
PASO-APASO
Para mejores resultados, asegrese que los alumnos empleen la suficiente cantidad de tiempo recogiendo las clulas de la mucosa bucal.
Pueda que la coleccin de muestra en el tubo de 15 mL sea difcil. Se puede utilizar un vaso pequeo para dispensar y coleccionar la muestra.
1. Obtenga del instructor un tubo de 15 mL que contenga 3 ml de agua. Marque el tubo con sus iniciales. 2. Cuidadosamente mordisquee el interior de los cachetes por 30 segundos. No sirve de nada sacar sangre! 3. Tome el agua del tubo de15 mL, y con el agua enjuague por 30 segundos. 4. Cuidadosamente escupa el liquido de regreso al tubo de 15 mL.
5. Obtenga el tubo de bfer de lisis del puesto de trabajo y aade 2 mL de bfer de lisis a su tubo que contiene el extracto celular.
6. Cierre el tubo e invirtalo suavemente para mezclar los componentes. (No lo mezcle muy duro!). Observe su tubo Ve algunos cambios? Antelos.
7. Obtenga el tubo de proteasa (marcado prot) de su puesto de trabajo. Aade 5 gotas de proteasa a su tubo.
9. Coloque su tubo en la gradilla o en un beaker en el bao de agua y djelo incubar por 10 minutos a 50C.
1. COLECCIN
DE CLULAS
EL MORDISQUEO DEL INTERIOR DE LA BOCA, EN COMBINACIN CON EL ENJUAGUE DE AGUA FUNCIONA PARA SEPARAR LAS CLULAS DEL EPITELIO ALINEANDO LA BOCA. ES CRTICO RECOGER LA CANTIDAD SUFICIENTE DE CLULAS.
2. BFER DE LISIS
QU ES EL BFER DE LISIS?
CH3
CH2 CH2
CH2
CH2
CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2
CH2
S O O Na+ O
SDS
La proteasa se utiliza para destruir las protenas nucleares que crean un enlace con el ADN y para destruir enzimas citoplasmticas que degradan y destruyen el ADN.
La solucin de proteasa ya contiene sal. Los iones de Na+ del NaCI forman enlaces con los grupos de fosfato de las molculas de ADN, neutralizando las cargas elctricas del ADN. La adicin de NaCI permite que las molculas de ADN se junten en lugar de repelerse una a la otra. De esta manera se facilita la precipitacin del ADN de la solucin al aadir el alcohol.
Na+ Na+
P O CH2
Base
O
Azcar
Na+ Na+
O
O P
Base
O
CH2
O
Azcar
OH
Las molculas del ADN precipitadas parecen un material fibroso, como los hilos blancos de una telaraa. Las burbujas microscpicas de oxgeno, que se generan al mezclar, se agregan al precipitarse el ADN. Las burbujas visibles ms grandes, levantan el ADN fuera de la solucin y lo llevan de la fase acuosa a la fase orgnica (fase del alcohol).
Pasos 10 12
PROTOCOLO
10. Lentamente aade 10 ml de alcohol fri manteniendo el tubo a un ngulo de 45. Este paso va a requerir de varias adiciones utilizando la pipeta de transferencia desechable. 11. Deje el tubo en posicin vertical en la gradilla, a temperatura ambiente y en reposo, durante 5 minutos Que ve? 12. Cierre el tubo y voltelo de lado y de regreso en posicin vertical, con mucho cuidado, unas 10 veces, hasta que las fases de agua y alcohol queden mezcladas y el ADN salga de solucin.
1. Utilizando una pipeta desechable, transfiera las fibras de ADN que ha extrado al pequeo frasco de vidrio.
Transfiera la mayor cantidad de ADN con la menor cantidad de alcohol posible.
El frasco se debe rellenar dejando por lo menos 2 mm de espacio suficiente para el tapn de plstico.
2. Introduzca el tapn de plstico recortado en el cuello del frasco y presione con firmeza para cerrarlo 3. Deslice el cordn encerado a travs del tapn de plata 4. Aplique una pequea gota de pegamento en el interior del tapn de plata.
5. Coloque el tapn de plata sobre la boca del frasquito y presione con firmeza durante 30 segundos. Deje que el pegamento se seque durante 10-15 minutos y despus compruebe que el frasquito est completamente sellado.
6. Cuando el pegamento se haya secado, ate el cordn encerado.
El ADN puede durar aos en el frasquito de vidrio. Con el tiempo puede aadir ms alcohol si la cantidad original se ha evaporado
Actividad exonucleolitica
Actividad endonucleolitica
ENZIMAS DE RESTRICCIN
Descubiertas en 1970s.
Reconocen + 3000 secuencias de nucletidos diferentes
Aisladas de mas de 100 especies bacterianas diferentes
ENZIMAS DE RESTRICCIN
Enzimas que cortan ds DNA en secuencias especificas.
a. Papel natural
Usadas para proteger las bacterias de virus (Cortando DNA Viral) DNA Bacteriano es protegido por enzimas que Modifican el DNA
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN
Sitios de reconocimiento
Usualmente secuencias entre 4-6 nucletidos de longitud (hasta 8nt) Usualmente un palndrome. Extremos cohesivos 5y 3, extremos romos
TTTAAA AAATTT
DraI
TTT AAA
AAA TTT
Extremos 3' cohesivos: La enzima corta asimetricamente, esultando una cadena sencilla que se extiende en los extremos 3.
Ej. Kpn I.
Extremos romos: Enzimas que cortan precisamente en sitios opuestaos en las dos cadenasgenerando extremos romos sin protusion.
Ej. Sma I
TCNICAS BSICAS
GEL, ELECTROFORESIS, NORTHERN, Y SOUTHERN, Y SUS APLICACIONES
ELECTROFORESIS
Es una tcnica para la separacin de molculas segn su movilidad en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, la cual se separa despues en tamaos moleculares y carga elctrica dependiendo de la tcnica que se use.
EN GEL
Se utiliza para separar molculas biolgicas especialmente ADN, ARN y protenas. Estos se separan a lo largo de un campo electrico por su tamao y su carga. En este caso el ADN tiene una carga negativa.
Esta tcnica se realiza colocando el ADN en un soporte poroso que seria gel de agarosa. Al aplicarse un campo elctrico las molculas migran de manera diferencial a travs de los poros.
La electroforesis de ADN es til para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biolgicas. As se puede usar para comparar muestras de un individuo sano frente a un individuo enfermo, para la identificacin de cidos nucleicos de agentes infecciosos. Se puede utilizar tambin para la obtencin de un fragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel, puede ser extrado para anlisis posteriores
NORTHERN Y SOUTHERN
La southern se utiliza para DNA La northern se utiliza para el RNA
Una secuencia determinada de nucleotidos se puede identificar por hibridacion de sondas especificas. Para llevar acabo esta hibridacion es necesario el paso desde gel a una membrana de nitrocelulos o nylon.
CARACTERSTICAS
Pequeas para que sean fciles de manipular. Ser capaces de proliferar en una clula vida y permitir la amplificacin de fragmento de ADN insertado. Tener dianas de restriccin convenientes para insertar el ADN que se desea clonar. Deben contener un mecanismo para la identificacin y recuperacin de las molculas recombinantes. Ej: Plsmidos, fago lambada,
PLSMIDOS
Molculas de ADN circular (generalmente bacteriano) separadas del cromosoma principal y con capacidad de replicacin independiente de la bacteria. Tamao de inserto: 20 kb.
BIBLIOTECAS
Conjunto de clones que contienen total o parcialmente secuencias genmicas de un individuo.
Clasificacin:
Genoteca Genimica: si el conjunto de clones conentien todo el genoma de un individuo. Genoteca de cDNA: si el conjunto de clones contiene slo los genes que se expresan en un tejido. Genoteca cromosmica: si el conjunto de clones contienen un fraccin del genoma. Pej: un cromosoma.
TERMOCICLADOR
La
2. Apareamiento o anneling: Los cebadores primers previamente diseados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares especficos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores segn sea el caso.
3. Polimerizacin o Extensin.
Una Polimerasa de DNA extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos primers, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTPs) de 5a 3 leyendo el DNA de 3a 5. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde
ADYUVANTES DE LA PCR
Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR.
Se usa DMSO, glicerol o BSA. El adyuvante ms utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 g/l el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya acta como una protena captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa
POLIMERASA
Se
reemplazo la enzima por la de la bacteria Thermus aquaticus conocida como Taq pol
ANLISIS DE LA MUESTRA
La deteccin del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electrofortico. Dependiendo del tamao de la amplificacin y la resolucin que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.
ANLISIS DE LA MUESTRA
La posterior visualizacin se puede realizar con bromuro de etidio (lmpara de luz UV), tincin de plata, fluorescencia, radioactividad
Ladder: pesos conocidos 1: Fragmento a 1857 pb 2 y 4: Fragmento a 800 pb 3: No hay producto 5: Multiples bandas (primers inespecficos se pegan a varios sitios)
APLICACIONES
Deteccin de agentes infecciosos como: hepatitis B y C, papiloma virus, HIV, entre otros
Investigacin forense
Pruebas de paternidad
APLICACIONES
Criminalstica Ejemplo de un caso de criminalstica resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida. Si se observan los patrones bandas podr comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantaln (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil gentico de la vctima (V)