UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL QUIMICA

GUIA DE PRACTICAS DE BIOLOGA

SEMESTRE ACADEMICO 2012-1 PILAR GARCA AVELINO Jefe de Prcticas

Prcticas de Biologa

PRESENTACION
El propsito del Laboratorio es familiarizar al estudiante con la metodologa de trabajo de la biologa, proporcionarle un ambiente donde tenga oportunidad de encontrarse con sustancias e instrumentos que le motive a experimentar. Considerando al laboratorio como un lugar donde el trabajo en equipo se facilita, da lugar a un proceso de constante integracin, comunicacin, investigacin, construccin de ideas, surgimiento de nuevas preguntas, donde las actividades experimentales propician la reorganizacin de conocimientos y facilitan el alcanzar un aprendizaje significativo. Para logra tales fines, se propone esta gua que, como material de apoyo didctico, reforzara el proceso constante de enseanza aprendizaje, requiriendo a participacin y gua del profesor. Material necesario para trabajar por alumno: Individualmente: un mandil, gafas de seguridad, guantes. Por equipo: plumn marcador, papel toalla. Y el que se indique para cada prctica. INSTRUCCIONES GENERALES. 1. Busca conceptos, antecedentesprevios a la realizacin de las prcticas. 2. Construye la hiptesis de trabajo, antes de solicitar su material. 3. Lee cuidadosamente los experimentos antes de ejecutarlos. 4. Recurre a tus libros de texto y/o consulta para aclarar dudas despus de realizadas las practicas, o consulta al profesor responsable. 5. Al efectuar cada uno de los pasos del desarrollo experimental, observa minuciosamente y anota los cambios ocurridos. 6. Al concluir el desarrollo experimental, resuelve el cuestionario para su futura revisin. 7. Elabora tus conclusiones.

PRECAUCIONES PARA EL DESARROLLO DE CADA EXPERIMENTO Las medidas oportunas y la compresin de las prcticas a seguir, har del laboratorio un lugar seguro como cualquier ambiente de clases. Para ello debern tenerse en cuenta, en forma general las siguientes precauciones: 1. Observa donde dejas el material caliente, cerciorndote que este frio antes de tomarlo con la mano. 2. Cuando calientes un tubo de ensayo, no lo apuntes hacia ti o hacia tus compaeros, pude proyectarse su contenido. 3. Si cae sobre ti o en tu ropa un material corrosivo, lvate inmediatamente con abundante agua, e infrmalo al profesor del curso. 4. Nunca pruebes una sustancia. 5. Al detectar el olor de un liquido, no coloques la cara sobre la boca del recipiente, con tu mano abanica hacia ti el aroma. 6. Antes de usar un reactivo lee dos veces la etiqueta de su contenido. 7. Los tubos de ensayo no pueden calentar ser por el fondo sino por las paredes, para evitar su expulsin del contenido. 8. No arrojes cuerpos slidos en los lavaderos, no viertas directamente los cidos. 9. Rotula tu material de trabajo, as te ser fcil identificarlos. 10. Cuando trabajes con el mechero mantn tu cabello recogido. 11. Nunca emplear papel para encender el mechero.

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PRCTICA 1

RECONOCIMIENTO DE BIOMOLECULAS ORGANICAS

INTRODUCCIN En los organismos se encuentran cuatro tipos diferentes de molculas orgnicas en gran cantidad: carbohidratos, lpidos, protenas y nucletidos. Todas estas molculas contienen carbono, hidrgeno y oxgeno. Adems, las protenas contienen nitrgeno y azufre, y los nucletidos, as como algunos lpidos, contienen nitrgeno y fsforo. Se ha dicho que es suficiente reconocer cerca de 30 molculas para tener un conocimiento que permita trabajar con la bioqumica de las clulas. Dos de esas molculas son los azcares glucosa y ribosa; otra, un lpido; otras veinte, los aminocidos biolgicamente importantes; y cinco las bases nitrogenadas, molculas que contienen nitrgeno y son constituyentes claves de los nucletidos. En esencia, la qumica de los organismos vivos es la qumica de los compuestos que contienen carbono o sea, los compuestos orgnicos. El carbono es singularmente adecuado para este papel central, por el hecho de que es el tomo ms liviano capaz de formar mltiples enlaces covalentes. A raz de esta capacidad, el carbono puede combinarse con otros tomos de carbono y con tomos distintos para formar una gran variedad de cadenas fuertes y estables y de compuestos con forma de anillo. Las molculas orgnicas derivan sus configuraciones tridimensionales primordialmente de sus esqueletos de carbono. Sin embargo, muchas de sus propiedades especficas dependen de grupos funcionales. Una caracterstica general de todos los compuestos orgnicos es que liberan energa cuando se oxidan. Entre los tipos principales de molculas orgnicas importantes en los sistemas vivos estn los carbohidratos, los lpidos, las protenas y los nucletidos. OBJETIVOS Determinar cualitativamente los carbohidratos presentes en muestras biolgicas. Reconocer cualitativamente las protenas presentes en muestras biolgicas. Demostrar la solubilidad de los lpidos en diferentes tipos de solventes. MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de ensayo, mechero, placas petri, vasos de precipitado, gradillas, pipetas graduadas, propipetas, pinzas de madera, piceta, almidn Reactivo de Fehling, solucin de glucosa al 1%, solucin de almidn 1%, acetona, cloroformo, sulfato de cobre al 1%, hidrxido de sodio al 5% Por grupo: un gillette, 5 ml de leche, 5 ml de aceite, bilis de pollo (1), una manzana, una papa, un huevo.

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IDENTIFICACIN DE AZCARES REDUCTORES

FUNDAMENTO Reaccin de Fehling: Es una reaccin cualitativa que sirve para determinar la presencia de un azcar reductor que no sea sacarosa (carece de carbono anomrico y no es azcar reductor). El reactivo de fehling presenta sulfato de cobre, carbonato de sodio, citrato de sodio, y agua. En la reaccin para determinar a los azucares reductores los agentes estabilizantes de la reaccin son el carbonato y citrato, el sulfato de cobre es el reactante especficamente el Cu que va a reaccionar con los grupos qumicos de aldehdos y cetonas. Que en reacciones de oxido reduccin el Cu se convierte en CuO dando un color rojo ladrillo que precipitar posteriormente.

PROCEDIMIENTO COMPONENTES Solucin de glucosa 1% Leche evaporada Manzana rallada Reactivo de Fehling 2 ml 2 ml TUBO DE ENSAYO 2 1 ml 1 ml 2 ml

1 1 ml

Mezclar por inversin el reactivo con cada uno de sus componentes Someter a la accin del calor. Observar la formacin de un precipitado color rojo ladrillo (CH2O), en el bao de agua fra.

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RECONOCIMIENTO DEL ALMIDN

FUNDAMENTO Esta prueba se basa en la especificidad del almidn cuando est presente en solucin, la cual da un color azul en presencia del Yodo. El yodo presenta: yoduro de potasio y yodo bisublimado, mas agua (solucin de Lugol). El yodo de la solucin tiene afinidad por los enlaces 1-4 y 1-6 de la molculas de almidn, esta interaccin del yodo por dichos enlaces producen el cambio de coloracin. La amilosa en disolucin coloidal toma color azul, la amilopectina da una coloracin rojo violcea. PROCEDIMIENTO

COMPONENTES Solucin de almidn 1% Papa rallada Clara de huevo Reactivo de Lugol -

1 1 ml

TUBO DE ENSAYO 2 1 ml

1 ml 2 gotas 2 gotas 2 gotas

Observar los primeros cambios de coloracin. Mezclar por inversin

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RECONOCIMIENTO DE PROTENAS
FUNDAMENTO Reaccin de Biuret Se debe a los componentes que presenta: el hidrxido de sodio y sulfato de cobre; el cual el agente denaturante de las protenas es el hidrxido y el reactante es el sulfato de cobre. Las protenas despus de ser denaturadas facilitan la interaccin del Cu con los pares de electrones sin compartir del grupo amino del pptido mediante enlaces de coordinacin con la formacin de un complejo coloreado prpura violceo. PROCEDIMIENTO Rotular tres tubos de ensayo, en el primero agregar 1 ml de albmina (huevo), en el segundo tubo leche, y en el tercero la solucin de almidn. Aadir 0.5 ml de NaOH al 40%, y 4 gotas de sulfato de cobre al 1% a cada tubo.

COMPONENTES Huevo Leche Solucin almidn 1% NaOH 40% SO4Cu2 1%

1 1 ml

TUBO DE ENSAYO 2 1 ml

1 ml 0.5 ml 4 gotas 0.5 ml 4 gotas 0.5 ml 4 gotas

Observe la formacin del color violeta en los tubos que presentan protenas, siendo Biuret (+), caso contrario Biuret (-).

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RECONOCIMIENTO DE LPIDOS
FUNDAMENTO En este experimento la identificacin se da por el comportamiento de las molculas de aceite con el agua, las cuales no se homogenizan, debido a que estas presentan caractersticas diferenciales, mientras que el agua es polar, el aceite es no polar, esto hace que microscpicamente se note que el aceite forme micelas en solucin acuosa. Donde las colas hidrofbicas de las molculas de aceite se esconden del agua adoptando la forma de micelas. PROCEDIMIENTO TUBO DE ENSAYO 2 2 ml

COMPONENTES Aceite Agua destilada Acetona Cloroformo -

1 2 ml 2 ml

3 2 ml

Agregar por las paredes del tubo cada componente 2 ml 2 ml

Hacer la primera observacin Mezclar por inversin cada tubo, dejar en reposo por 5 minutos

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PRCTICA 2

AMILASA SALIVAL
INTRODUCCIN Propiedades del almidn. El almidn es el polisacrido de reserva ms abundante en vegetales y constituye laprincipal fuente de nutricin glucdica para la humanidad. Los almidones estnconstituidos por una mezcla de dos componentes: a-amilosa: cadena lineal de unas 200 unidades de D-glucosa unidas por enlaces (1 4) amilopectina: cadena lineal de D-glucosas unidas por enlaces tipo (1 4) con numerosas ramificaciones (1 6). El polmero contiene unas 1000 unidades de glucosa.

La proporcin en que se mezclan la a-amilosa y la amilopectina para formar el almidn depende de la especie vegetal en que aparece el almidn. La -amilosa se disuelve fcilmente en agua, adquiriendo una estructura secundariacaracterstica, de forma helicoidal, en la que cada vuelta de hlice comprende seisunidades glucosa. Esta estructura secundaria, en la que los grupos hidroxilo quedan hacia afuera, permite que el iodo, al penetrar en el interior del helicoide, confiera a la disolucin una coloracin azul violcea intensa caracterstica que permite la identificacin positiva de trazas de almidn. Como esta coloracin no es resultado de ninguna interaccin covalente, el calentamiento origina la desestabilizacin del helicoide y la prdida de color, que se recupera al enfriar lentamente la disolucin. Lavariacin en el pH tiene un efecto anlogo.

Estructura repetitiva de la amilosa.

Hidrlisis del almidn. El almidn puede hidrolizarse por medios qumicos o enzimticos.La ebullicin con cidos o lcalis hidroliza aleatoriamente los enlaces glucosdicosentre unidades de glucosa, dando polisacridos de longitud intermedia denominados dextrinas, cada vez menores hasta la obtencin de unidades de glucosa individuales. Los compuestos que se obtienen en la hidrlisis del almidn y el color que producen con el iodo son los siguientes: Almidn (azul). Amilodextrinas(violeta). Eritrodextrinas(rojo). Acrodextrinas(incoloro*). Maltosa (incoloro*). Glucosa (incoloro*).

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* Tener en cuenta el ligero color amarillo propio del iodo. El almidn tambin puede hidrolizarse enzimticamente. Uno de los enzimas que hidrolizan el almidn es la amilasa, que se halla presente enel jugo pancretico y la saliva. Este enzima ataca al azar los enlaces (1 4) del interior de la cadena. As, rinde finalmente unidades de glucosa libre y maltosa. Laamilasa no ataca los enlaces (1 6), base de las ramificaciones de la amilopectina. Estos enlaces pueden ser hidrolizados por otro enzima desramificador. La ptialina o amilasa salival es una protena enzimtica presente en la saliva. Comotodo enzima, la accin que ejerce sobre su sustrato (almidn) depende de una serie deparmetros: pH, temperatura, concentracin de enzima... OBJETIVOS Ver el efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimtica. Ver el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica. COMPARAR y DISCUTIR los resultados de la actividad de la amilasa a los diferentes pH. Deducir el pH en el cual la enzima es ms activa.
ELIMINACIN DE RESIDUOS Los residuos generados en esta prctica deben ser recogidos en el bidn de residuos acuosos.

PROCEDIMIENTO I. OBTENCIN DEL ENZIMA. 1. Tras enjuagar la boca, se mastica un trozo de papel de filtro para estimular lasalivacin. Los lquidos segregados se van pasando a un embudo con un filtrohumedecido colocado sobre un tubo de ensayo, hasta recoger la suficientecantidad de saliva para realizar la prctica. 2. La saliva as obtenida se diluye 1:10 con agua destilada, obteniendo as lapreparacin de enzima base. II. EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD AMILASA SALIVAL. 1. Tomar tres tubos de ensayo y aadir respectivamente: 1 ClH 0.1 N Almidn 2% Saliva diluida 1:10 2 ml 2 ml 2 ml 2 NaOH 01 N Almidn 2% Saliva diluida 1:10 2 ml 2 ml 2 ml 3 Agua destilada Almidn 2% Saliva diluida 1:10 2 ml 2 ml 2 ml

2. Agitar bien y medir rpidamente el pH de cada tubo. Para medir el pH, se tomauna gota de la disolucin con una varilla limpia y seca y se humedece con ella untrocito de papel indicador de pH, comparando el color obtenido con el de laescala. Los tres tubos se colocan en un bao de agua termostatizado a 37C durante 15minutos, dejando que la amilasa vaya hidrolizando al almidn. Una vez transcurridoslos 15 minutos, se sacan los tubos y se efectan las pruebas del iodo y de Benedict

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Prueba del iodo o del lugol: permite identificar la presencia de almidn que con estereactivo da un color azul-violeta caracterstico. Tomar 1 ml de muestra de cada uno delos tubos y aadirle unas gotas de la disolucin de iodo iodurada. Si la actividadenzimtica de la amilasa no se ve afectada, catalizar la hidrlisis del almidn y portanto la prueba del iodo ser negativa. Prueba de Benedict: permite identificar a los azcares reductores, obtenidos por hidrlisis del almidn, que con esta prueba dan una coloracin rojiza (el almidn notiene poder reductor). Tomar 1 ml de muestra de cada uno de los tubos y seguir elprotocolo para la reaccin de Benedict en la prctica de azcares. III. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA VELOCIDAD ENZIMTICA. 1. Preparar 8 tubos: cuatro de ellos con 2ml de almidn 2% y los otros cuatrocon 2 ml de saliva diluida 1:10. 2. Colocar dos tubos, uno conteniendo almidn y la otra saliva, a cada una de las cuatro temperaturas siguientes (marcar cada pareja de tubos segn latemperatura a la que se ensaya): en bao de hielo (OC, si se aade un poco de agua al hielo enfra ms;cuidar que los tubos no vuelquen) a temperatura ambiente (20C) en bao a 37C a ebullicin en bao Mara* (100C).

3. Mantener as los tubos durante 15 minutos para que alcancen la temperatura del experimento. 4. Aadir al tubo que contiene el almidn el contenido del tubo que tiene la saliva,agitar bien y dejar que siga a su temperatura correspondiente. Empezar a contarel tiempo (los tubos deben mantenerse bien inmersos en los respectivos baospara que la accin de la amilasa tenga lugar a las temperaturas indicadas). Transcurridos 1, 2, 3, 4, 6 y 8 minutos coger una muestra de 0,5 ml de cada tubo y ponerla en la placa de pocillos. * En el caso del bao Mara basta con 5 minutos. 5. Aadir a cada muestra unas gotas de reactivo de iodo. Una vez realizada laprueba ANALICE los distintos cambios de color observados y la razn deestos. Cuando el almidn est hidrolizado no produce ningn cambio de color a la solucinde iodo (punto acromtico). El tiempo necesario para alcanzar tal punto da idea de laactividad de la enzima. La inversa de dicho tiempo equivale a la velocidad de lareaccin enzimtica. CUESTIONARIO 1. Qu es y qu hace un enzima? 2. El enzima empleado en esta prctica se denomina: Su sustrato es: 3. Qu reactivo se emplea para la identificacin del almidn? Explicar brevemente como acta. 4. Efecto del pH sobre la actividad (en resultados)

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Tubo 1 pH Prueba de Lugol Benedict 5. Cul es el pH ptimo para la enzima? 6. Efecto de la temperatura (en resultados) 0 C 1 2 3 4 6 8 Ambiente: C

Tubo 2

Tubo 3

37 C

100 C

7. Cul es la temperatura oprima para la actividad de la enzima?

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PRACTICA N 3

CROMOSOMAS
INTRODUCCIN Los Cromosomas, durante la vida, toda clula pasa por dos periodos que constituyen un ciclo: a) Perodo de interfase b) Perodo de divisin, que conduce a la formacin de 2 clulas hijas. Este ciclo se repite de generacin en generacin celular siendo el mismo para un tipo de clula, pero pudiendo variar en funcin del tejido que se trate. Durante el ciclo celular el ncleo de la clula sufre una serie de cambios complejos: desaparicin de membrana nuclear y de los nuclelos y condensacin de la cromatina en los cuerpos llamados cromosomas. En los cromosomas, estructuras responsables de la transmisin de los caracteres hereditarios, se localizan los genes. Las clulas del cuerpo, o clulas somticas, de cualquier organismo superior tienen un nmero cromosmico definido y caracterstico de la especie, representado por el nmero cromosmico 2n o nmero diploide. Este nmero significa que los cromosomas en las clulas somticas existen formando pares, recibiendo cada miembro del par el nombre de homlogo. Los gametos o clulas reproductoras, se forman por meiosis y tienen un nmero cromosmico n o haploide (del griego: haplos que significa mitad). En las especies en las que el sexo est determinado por cromosomas se pueden distinguir: a) un par de cromosomas sexuales b) autosomas o cromosomas no sexuales Las caractersticas ms importantes que identifican los cromosomas durante la mitosis son su nmero, tamao relativo, estructura, comportamiento y organizacin interna. El cariotipoes el complemento o conjunto cromosmico tpico del individuo o de la especie en el que se describe el nmero, forma y tamao de los mismos. El cariotipo se perpeta normalmente en la progenie (Battaglia, 1953). Es decir, en trminos generales, se admite la constancia en forma, tamao y nmero de los cromosomas, en todas las clulas que componen el ncleo de un individuo y en los individuos de cada especie. En el cariotipo se ordenan los pares de homlogos en series, de acuerdo a su longitud, en forma creciente. La representacin esquemtica del cariotipo se conoce con el nombre de Idiograma. El anlisis de la morfologa cromosmica se lleva a cabo en el estado de metafase que es el momento en el que los cromosomas presentan el mayor grado de espiralizacin, y compactacin. Es en este estado tambin cuando muestra las mejores condiciones de tincin con tintes que presentan afinidad por los cidos nucleicos; razn que favorece an ms el estudio citogentico de una determinada especie en esta fase del ciclo de divisin celular. OBJETIVO El alumno observar clulas eucariticas de vegetales y animales e identificar la organizacin de genoma.

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FUNDAMENTO El estudio de los cromosomas de clulas eucariticas con el microscopio ptico se hace preferencialmente en metafase, cuando estos tienen la morfologa y estructura definida. La observacin de la estructura del genoma en interfase, est fuera de la resolucin del microscopio ptico, sin embargo, en algunas clulas es posible observar el cromosoma X heterocromatizado que se identifica como un corpsculo, el cuerpo de Barr o cromatina sexual.

MATERIALES Y REACTIVOS Races primarias de Allium cepa (cebolla), clulas del epitelio bucal, barniz de ua transparente, 2 portaobjetos, 2 cubreobjetos, 1 vidrio de reloj, 1 cuchilla, pinzas portalaminas, microscopio, HCl 1N, Ac. Actico 45%, orcena actica o orcenalactopropinica.

PROCEDIMIENTO Preparacin de los meristemos

1. Cinco das antes de la prctica, se retira con una navaja bien afilada, las races de un bulbo de cebolla, colcala en un vaso con agua sostenido por medio de palillos de dientes (la superficie del agua debe hacer contacto con el bulbo). Las races nuevas que se reproduzcan sern el objeto de observacin (ver la figura)

2. Obtencin del material: Se cortan races jvenes de cebolla, aproximadamente unos 20 mm, comprobando que conservan el pice radicular, que se distinguir por el cambio de color. 3. Fijacin: Se prepara la mezcla fijadora. 3 Etanol:1 Actico (Carnoy). Segn el fijador utilizado el tiempo y temperatura de la fijacin vara. Las raicillas de cebolla se han fijado en 3 Metanol:1 Actico a 4C. 4. Conservacin: Se lava el material varias veces con la mezcla fijadora y se conserva a 4C. 5. Preparacin: Las raicillas de cebolla que se hallan en mezcla fijadora se hidrolizan en HCl 1N durante 10 minutos a 60C.

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Transcurridos los 10 minutos de la hidrlisis, se lavan las raicillas en agua destilada y se colocan las raicillas sobre una gota de orcena actica o de orcena lactopropinica para su tincin, durante 10 a 15 minutos. A continuacin se realiza la preparacin. Primeramente, se toma una raicilla y se coloca sobre un vidrio portaobjetos y se corta el pice radicular con un bistur. Para realizar esta operacin se utiliza la lupa. Este pice radicular se corta a su vez en 4 fragmentos, se hace un corte longitudinal y otro transversal. Se separan los cuatro trozos y a continuacin se aade una gota del colorante. Seguidamente se coloca un cubreobjetos sobre el material que deseamos observar. Con la ayuda de un bastoncillo de madera se golpea y extiende el material. A continuacin se presiona con el dedo pulgar y se retira el exceso de colorante con un papel de filtro.

6. Se observa al microscopio empezando con el objetivo de menor aumento. No es necesario utilizar el objetivo de inmersin. Se deben distinguir y dibujar, tal y como se ven, todas las fases de la mitosis.
Mtodo para la cromatina sexual-cuerpo de Barr

1. En porta objetos perfectamente lavados y desengrasados (alcohol etlico-cido actico 45%, 3:1), coloque una muestra de epitelio bucal (enjuague varias veces la boca), tomando por raspado suave con un baja lenguas, haga frotis de hombre y mujer, etiqutelos. 2. Hidrolice con HCl 1N por 30-60 seg. Y absorba el cido actico por goteo, cubra con un portaobjetos y selle con barniz. Observa al microscopio a 100X RESULTADOS

PREGUNTAS 1. Con qu se fin se presiona la preparacin? 2. En la mitosis, qu diferencias existen entre la clula original y las clulas hijas? 3. Cul es el significado que la mitosis mantenga la continuidad gentica de una generacin de clulas a la siguiente?

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ANEXO 2 (PRACTICA3)

MITOSIS
La mitosis es el proceso de formacin de dos clulas idnticas (generalmente) por replicacin y divisin de los cromosomas de la original que da como resultado una "copia" de la misma. Los estructura de los cromosomas replicados y condensados tiene varios aspectos de inters. El cinetocoro es el punto donde "anclan" los microtbulos del huso. Los cromosomas replicados consisten en dos molculas de ADN (junto con sus protenas asociadas: las histonas) que se conocen con el nombre de cromtidas. El rea donde ambas cromtidas se encuentran en contacto se conoce como centrmero, el cinetocoro se encuentra en la parte externa del centrmero. Se debe hacer hincapi en que los cromosomas son cromatina (ADN ms histonas) y sealar la particularidad que en los extremos del cromosoma (que toman el nombre de telmero) se encuentran secuencias repetidas de ADN. PROFASE es el primer estadio de la mitosis. La cromatina se condensa (recordar que el ADN de la cromatina se replica en la interfase), por lo que en este punto existen dos cromtidas unidas. La membrana nuclear se disuelve, los centrolos (si se encuentran presentes) se dividen y los pares migran a los polos, se forma el huso mittico. Los centrmeros (o constricciones primarias) se vuelven claramente visibles, debido a que se le han asociados placas proteicas a ambos lados: el cinetocoro. En el citoplasma el retculo endoplasmtico y el complejo de Golgi se fragmentan en vesculas, se desorganiza el citoesqueleto por lo que la clula pierde su forma original y se hace esfrica.

METAFASE los cromosomas (que a este punto consisten en dos cromtidas mantenidas juntas por el centrmero) alcanzan su mxima condensacin y migran al ecuador de la clula donde las fibras del huso se "pegan" a las fibras del cinetocoro.

ANAFASE comienza con la separacin de los centrmeros y el arrastre de las cromtidas (los llamamos cromosomas luego de la separacin de los centrmeros) a los polos opuestos.

TELOFASE los cromosomas llegan a los polos de sus respectivos husos, la membrana nuclear se reconstituye, los cromosomas se desenrollan y pasan a formar la cromatina y el nucleolo, que desapareci en la profase se vuelve a constituir. Donde antes haba una clula ahora existen dos pequeas con exactamente la misma informacin gentica y nmero cromosmico. Estas clulas pueden luego diferenciarse en diferentes formas durante el desarrollo.

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PRACTICA N 4

OBSERVACIN DE BACTERIAS Y LA TINCIN GRAM (tincin diferencial)

INTRODUCCIN La morfologa de las bacterias puede examinarse de dos formas: observando bacterias vivas sin colorear (en fresco) y observando bacterias muertas teidas con colorantes. La observacin en fresco de las bacterias permite conocer algunas de sus caractersticas (morfologa, tamao, movimiento). Sin embargo, las bacterias vivas son casi incoloras no logrndose visualizar fcilmente al microscopio ptico normal cuando se encuentran suspendido en agua, de ah que se utilicen colorante para incrementar su contraste con el entorno que los rodea y de esa forma hacerlos ms visibles. Los colorantes son compuestos aromticos solubles en agua (generalmente en forma de sales) que contienen un ion orgnico coloreado y otro in inorgnico. Pueden dividirse en dos grupos: cidos y bsicos. El colorante es cido si la porcin coloreada tiene carga negativa, es decir, si tiene un anin coloreado, siendo en este caso repelido por estructuras de la clula que presenten la misma carga, como es el caso de la superficie bacteriana. El colorante se denomina bsico si la porcin coloreada es el catin, cargado positivamente y con afinidad por las estructuras de la clula con carga negativa, como es la superficie celular. La tincin Gram (tincin diferencial) es una tcnica que se desarrollo en 1884, por Hans Gram (bacterilogo dans) La tincin Gram permite encontrar diferencias caractersticas como la forma de las clulas bacterianas, que puede ser individual: cocos, bacilos, cocobacilos y espirilos; agrupadas: pareja, racimo, cadenas. La tincin Gram colorea selectivamente a las bacterias, los colorantes que se utilizan reaccionan de un modo diferente con las distintas bacterias, debido a las diferencias en la estructura y/o composicin qumica de la pared celular de stos. Debido al tamao de la mayora de los microorganismos, se requiere de un microscopio ptico, para hacer la descripcin morfolgica de stos. El microscopio de uso ms comn es el de campo claro, en el que la observacin de clulas vivas es limitada debido a que las celular son incoloras y permiten el paso de una gran cantidad de luz.

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OBJETIVO Conocer el fundamento y la utilidad de la tincin Gram. Aprender una tcnica de coloracin diferencial e interpretar los resultados obtenidos, distinguiendo bacterias gram positivas y gram negativas.

FUNDAMENTO Un primer colorante bsico: CRISTAL VIOLETA, se aplica sobre la muestra y reacciona con las bacterias (cargadas negativamente) colorendolas. Un mordiente: LUGOL, que incrementa la afinidad entre el primer colorante y las bacterias. El mordiente se combina con el colorante para formar un compuesto insoluble coloreado en el interior de la bacteria. Un agente decolorante: como el ETANOL de 95% o la mezcla de ALCOHOL-ACETONA (1:1), que son disolventes orgnicos capaces de eliminar el primer colorante de algunas bacterias, decolorndolas. Un colorante contraste: SAFRANINA, igualmente de carcter bsico pero de distinto color que el primer colorante. La safranina es de color rosa, que contrasta con el color violeta (del primer colorante), y que teir solo a las bacterias decoloradas en el paso anterior. Las diferencias qumicas en sus paredes celulares, son las que permiten o no la salida del complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias GRAM POSITIVAS debido a la estructura y composicin bioqumica de su pared celular retienen el complejo cristal violeta-lugol y aun despus del tratamiento con el decolorante conserva el colorante bsico, por lo que se observan al microscopio de color azul oscuro a violeta una vez concluida la tcnica de tincin Las bacterias GRAM NEGATIVAS pierden el colorante bsico cuando son tratadas con el decolorante debido a que el alcohol disuelve el contenido lipdico de la pared celular lo que aumenta la permeabilidad celular, dando como resultado la prdida del complejo cristal violetalugol. Las bacterias decoloradas captan entonces el colorante contraste, razn por la cual estas clulas bacterianas se observan al microscopio de color rosado una vez concluida la tcnica de tincin.

MATERIALES Y REACTIVOS Cultivos bacterianos, lminas portaobjetos, asa de siembra (asa de kolle), pinzas para lminas, mechero, vaso de precipitado 50 ml, pisceta con agua destilada, alcohol, microscopio, aceite de inmersin, papel tissue. Colorantes: la tincin Gram utiliza en estricto orden: - Cristal violeta : colorante bsico - Lugol: mordiente - Alcohol acetona: agente decolorante - Safranina (fucsina): colorante de contraste

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PROCEDIMIENTO 1. Se proporcionar a los alumnos cultivos slidos (placas petri con agar) y cultivos lquidos (tubos de ensayos con caldo de cultivo) de: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis. 2. Se limpia la lmina portaobjetos con alcohol y papel tissue. 3. Se prende el mechero, para esterilizar el asa de siembra en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Enfriar antes de tomar la muestra, para evitar que los microorganismos sean destruidos. 4. Acercar al mechero, la placa petri o el tubo de ensayo, para tomar la muestra 5. Preparacin de un frotis bacteriano. a. Extensin. Colocar una pequea gota de agua destilada en la lmina portaobjeto. Con el asa de siembra transferir una pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido a la gota. Remover la mezcla con el asa hasta formar una suspensin homognea y extenderlabien con la propia asa), produciendo la extensin del inculo, de 2 cm (Si el material de partida es un cultivo en medio lquido, realizar directamente la extensin). b. Fijacin. Es imprescindible para que las bacterias queden inactivadas y adheridas alvidrio, permitir la evaporacin espontnea del porta, ayudndose con la llama delmechero de manera muy leve (en ningn caso el porta debe quemar al tacto). Si elporta alcanza una temperatura excesiva a la llama, las clulas pueden deformarse oromperse.

6. Realizar la tincin cubriendo la preparacin con abundante colorante y dejarlo actuar por un determinado tiempo. a. Cristal violeta: 60 segundos. b. Lugol: 20 segundos c. Alcohol-Acetona: 10-15 segundos (moviendo el portaobjeto) d. Safranina: 20 segundos Despus de cada proceso de tincin, de acuerdo al tiempo sealado se enjuaga lentamente con agua destilada

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7. Se deja secar al aire despus del ltimo enjuague. 8. Observacin al microscopio: colocar la lmina portaobjetos en la platina, empezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X, luego pasar al objetivo de 40X. Para la observacin con el objetivo de 100X, se coloca previamente una pequea gota de aceite de inmersin sobre la preparacin. 9. Resultados. ELABORAR EL INFORME EN EL LABORATORIO

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PRACTICA N 5

METODOS DE AISLAMIENTO, SIEMBRA Y RECUENTO DE BACTERIAS

INTRODUCCION Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio para caracterizar su crecimiento, realizar su identificacin y determinar sus actividades metablicas. Se debe acondicionar a la bacteria en un medio de cultivo de acuerdo a sus exigencias, para que en condiciones ptimas de temperatura, tiempode incubacin, pueda multiplicar y desarrollarse in vitro. Un medio de cultivo est conformada por todos los elementos indispensables que requieren los microorganismo para crecer (carbohidratos, protenas, vitaminas, sales). Las bacterias son inoculadas ( introducidas) en medios lquidos (caldos) o solidificados con agar para su propagacin y/o conservacin. La inoculacin de los microorganismos en los medios de cultivo, siempre debe realizarse en zona asptica (cerca del mechero) en condiciones que limiten la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes. El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por mtodos de dilucin, donde cada clula bacteriana que se separa dar origen a una poblacin que formara una colonia caracterstica a simple vista medios slidos; por estra en placa o en medios lquidos.

OBJETIVOS Conocer las diferentes tcnicas de aislamiento en medios de cultivo slido para la obtencin de cultivos puros de bacterias Aprender diversos mtodos de siembra.

FUNDAMENTO Aislamiento: permite la separacin de las bacterias al estado de pureza a partir de una muestra. Se requiere medio solido con gran superficie para que las bacterias diseminadas sobre el medio generes su propia progenie (cepa) por formacin de colonias separadas. Un cultivo puro es aquel que contiene una solo tipo demicroorganismos. Para obtenerlo es necesario recurrir a las llamadas tcnicas deaislamiento. Aunque existen otras, las tcnicas ms utilizadas emplean un medio decultivo slido, en el que los microorganismos generan colonias separadas. La obtencin de un cultivo puro es indispensable para conocer las caractersticas morfolgicas, propiedades de tincin, actividad bioqumica, patogenicidad, sensibilidad a antibiticos e identificacin de las especies microbianas.

MATERIALES Y REACTIVOS Asa de kolle, asa de vidrio (esptulas), placas petri con agar nutritivo, bacterias, pipetas graduadas, plumn marcador, mechero.

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PROCEDIMIENTO Se proporcionar a los alumnos cultivos slidos (placas petri con agar) y cultivos lquidos (tubos de ensayos con caldo de cultivo) de: Escherichia coli, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis. 1. Estra mltiple en superficie Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una pequea muestra del cultivo de bacterias y se extiende sobre un rea pequea de la superficie de la placa con agra nutritivo, en forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no daar el agar. Se flamea el asa de kolle, se enfra despus de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estras. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada y en posicin invertida. Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado nmero de bacterias.

2. Dilucin en masa Inmersin Enunaplaca petri vaca, previamente estril, se deposita u volumen conocido de muestra y luego se adiciona el medio de cultivo: agar nutritivo fundido, atemperado aproximadamente 45C., se mezclan ambos por rotacin suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirn de forma homognea en el medio de cultivo permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar. La homogenizacin se deja enfriar en las placas hasta que solidifique el medio y posteriormente incubarlo a la temperatura adecuada.

MUESTRA

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3. Aislamiento de bacterias en placas de agar. Extensin en superficie con asa de vidrio. Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota 0.1 ml de una determinada dilucin del cultivo de bacterias y extenderlos con ayuda de un asa de vidrio (esptula), previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que est completamente seco. Incubar la placa en posicin invertida a la temperatura deseada (durante 24) segn el tipo de microorganismo. Es una tcnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado.

RESULTADOS Tras el periodo de incubacin se examinaran las placas. 1. Estra mltiple en superficie. Se observarn las colonias aisladas en alguna regin de la placa inoculada, con esta tcnica se logra la separacin de los microorganismos que se encuentren en un cultivo mixto, o bien que procedan de muestras homogneas, pero en las que existe un elevado nmero.

2. Dilucin en masa Inmersin. Aparecen las colonias distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que estn en la superficie tendrn distintas caractersticas, dependiendo del tipo microbiano, mientras que las colonias que se desarrollan en el interior, bajo la superficie del agar, tiene forma lenticular, aunque los microorganismos

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que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por lo tanto las colonias que aparecen en la profundidad del agar son siembre biconvexas. 3. Aislamiento de bacterias en placas de agar. Extensin en superficie con asa de vidrio. Las colonias aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la siembra se ha realizado en forma correcta. Podrn diferenciarse las colonias de acuerdo al tamao, forma color, textura. El recuento viable de organismo se hace en unidades formadoras de colonias (UFC) ya que cada una procede de un solo microorganismo (o un grupo de microorganismos, en algunos stos tienden a formar agregados a partir de las colonias aisladas, los microorganismos pueden transferirse a otros medios de cultivo para su posterior estudio.

RECUENTO DEL NMERO DE BACTERIAS POR MILILITRO INTRODUCCION El mtodo que vamos a utilizar consiste en realizar diluciones sucesivasde la muestra en condiciones de esterilidad con objeto de sembrar despus cantidadesconocidas de las mismas en una serie de placas de petri. Considerando que alguna delas diluciones ser tal que al distribuir una parte de ella en la placa, originar coloniasseparadas. Contando el nmero de colonias, el volumen sembrado en la placa y ladilucin correspondiente, podremos calcular el nmero de unidades formadoras decolonias presentes en la muestra inicial.

MATERIAL Y REACTIVOS Bacterias, Pipetas graduadas, Tubos de ensayo (para dilucin 9 ml), Placas de agar nutritivo.

PROCEDIMIENTO A partir de la muestra hacer una serie de 4 diluciones con tubos de agua destilada estril (9ml) Tomar 1 ml de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 en una placa, extender con el asa de vidrio e incubar toda lanoche.

RESULTADO A partir del nmero de colonias presentes en cada dilucin, calcular el nmerode bacterias por mililitro en el cultivo original, el resultado se expresa en unidad formadora de colonias por mililitro (UFC/ml)

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PRACTICA N6

RESISTENCIA DE ANTIBIOTICOS ANTIBIOGRAMA

INTRODUCCION Los antibiticos son sustancias qumicas producidas por microorganismos o derivados semisintticos de stas, mientras que los quimioterpicos son productos de sntesis qumica, pero ambos tienen la propiedad de estar dotados de actividad antibacteriana. Existen diferentes tcnicas para estudiar la actividad de los antibiticos frente a distintos microorganismos, utilizndose pruebas esencialmente cualitativas, aunque en muchos casos se requieren determinaciones cuantitativas. En esta prctica vamos a efectuar ensayos de ambos tipos. Las pruebas cualitativas o antibiograma se van a efectuar con la bacteria problema mientras que las cuantitativas las haremos con una bacteria conocida. Las pruebas que vamos a realizar se basan en la difusin del antibitico sobre una placa de medio a partir de un punto central. En este caso, una cantidad concreta del antibitico se encuentra incluido en un disco de papel que se deposita sobre una placa de agar comn, que ha sido previamente inoculada con una fuerte dosis de la bacteria a ensayar. As, el disco de papel absorbe agua de la placa, se disuelve el antibitico y se inicia el proceso de difusin de ste hacia las zonas que lo rodean, generndose un gradiente de concentracin cuyo nivel mximo se encuentra bajo el disco. Las bacterias que se inocularon crecern durante su incubacin all donde la concentracin del antibitico sea lo suficientemente baja como para no impedrselo (normalmente alejado del disco), mientras que no podrn hacerlo en las proximidades del disco donde las concentraciones del antibitico son elevadas. Puesto que los lmites de concentracin de antibitico que afectan al cultivo son por regla general muy estrechos, se suelen formar halos de inhibicin, esto es, zonas sin bacterias alrededor de los discos, de bordes bastantes definidos y cuyo dimetro tiene que ver con la concentracin de antibitico que haba en el disco y con la sensibilidad a ste de las bacterias ensayadas. Todas las bacterias no tienen la misma sensibilidad a los distintos antibacterianos. La evaluacin de esta sensibilidad nos va a ayudar en la seleccin del compuesto ms adecuado para el tratamiento de una infeccin bacteriana. Las pruebas ms utilizadas para evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente antibacteriano estn basadas en el enfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas concentraciones del agente. Concentracin mnima inhibitoria (CMI) se define como la menorconcentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de unacepa bacteriana dada. Concentracin mnima bactericida (CMB) se define como lamenor concentracin de antimicrobiano capaz de destruir una cepabacteriana dada

OBJETIVOS Determinar la sensibilidad bacteriana de la bacteria problema a distintos antibiticos.

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FUNDAMENTO El antibiograma por el mtodo de difusin en agar es una prueba en laque se enfrenta la bacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar con unasolucin antibitica absorbida en discos de papel de filtro. Este mtodo estestandarizado y los halos de inhibicin han sido obtenidos correlacionndolos con lasCMI. Hay varios factores que afectan al halo de inhibicin: la carga delantibitico en los discos, la difusin del antibitico en el medio de cultivo, el tamaodel inculo bacteriano, la composicin y grosor del medio de cultivo, la velocidad delcrecimiento bacteriano y el tiempo de incubacin. Los discos de antibiticos son adquiridos comercialmente. Debencontener la cantidad establecida de antibitico y ser conservados a 4C protegidos dela humedad. El inculo bacteriano debe tener una turbidez similar al 0,5 de la escala de McFarland, y ser preparado en solucin salinaestril o caldo de cultivo.

MATERIALES Bacteria (cepa pura de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa), antibiticos, discos de papel filtro estriles, tubos de ensayo con 3 ml de agua destilada estril, pipetas 1 ml, pinzas, placas con medio de cultivo (agar Luria-Bertini), mechero, asas de siembra, asas de vidrio/hisopos estriles, escala de McFarland.

PROCEDIMIENTO 1. Preparacin del inculo. Partiendo de un cultivo puro tomar con el asa de siembra X colonias de la bacteria e introducirlas en el caldo de cultivo. La turbidez del inculo debe equivaler al estndar 0,5 de McFarland.
Preparacin del Inoculo Turbidez del Inculo 0.5 McFarland

2.

Inocular la superficie de una placa de agar Meller Hinton con el hisopo (estril) pasndolo uniformemente por toda la superficie en tres direcciones. Por ltimo, pasar el hisopo por el reborde de la placa de agar. Dejar secar 5 minutos.

Inoculacin

Extensin con: asa de vidrio Hisopo esterilizado

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3.

Colocar los discos de antibiticos sobre la superficie del agar utilizando unas pinzas estriles y apretndolos suavemente sobre la superficie del agar. Los discos no deben estar a menos de 15 mm de los bordes de la placa y lo bastante separados entre ellos para que no se superpongan sus zonas de inhibicin. Dejar las placas 15 minutos a temperatura ambiente para que comiencen a difundir los antibiticos.
Colocacin de los discos de antibiticos

4. 5.

Incubar la placa en posicin invertida a 37C durante 18-24 horas. Medir los dimetros de los halos de inhibicin con una regla.

PRUEBA CUALITATIVA. Un mismo cultivo se enfrenta a distintas soluciones antibiticas.

PRUEBA CUANTITATIVA. Se trata de determinar el grado de sensibilidad o concentracin mnima inhibitoria (CMI) de un antibitico frente a la bacteria ensayada. Cada grupo sembrar de la forma descrita la bacteria X, y colocar cinco discos con cantidades crecientes (diferentes concentraciones) de un antibitico. Para preparar los discos, cada grupo preparar 5 diluciones seriadas (1:4 en agua estril) a partir de una disolucin valorada que se le entregar, y aadirn 25ul de cada una de stas diluciones (ug/ml) a los respectivos discos de papel estriles. Puesto que los discos no estn marcados, es imprescindible indicar su concentracin debajo de la placa. Siempre resulta conveniente mantener un orden creciente en la disposicin de los discos. Una vez colocados los discos, las placas se incuban en posicin invertida durante toda la noche a la temperatura ptima de crecimiento de la bacteria. A la maana siguiente hay que medir el dimetro de los halos de inhibicin y anotarlos en el cuaderno.

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RESULTADOS En el caso del antibiograma, se har un cuadro de sensibilidad (S) o resistencia (R) para cada uno de los antibiticos frente a esta bacteria, y posteriormente sern utilizados como criterio para la determinacin de la bacteria problema. El criterio a seguir, internacionalmente reconocido por National Committe for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), ser: Sensible: si existe una buena probabilidad de xito teraputico en el caso de un tratamiento a una dosis habitual. Resistente: si la probabilidad del xito teraputico es nula o muy reducida. No es de esperar ningn efecto teraputico sea cual fuere el tipo de tratamiento. Intermedia: cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede conseguir efecto teraputico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la dosis) Sensible (S) si el dimetro del halo es mayor de 15 mm Resistente (R) si el dimetro del halo es menor de 13 mm Intermedio (R/S) si el dimetro del halo est comprendido entre 13 y 15 mm CUESTIONARIO. 1. 2. 3. 4. 5. Para qu se emplean los antibiogramas? Qu significa la concentracin inhibitoria mnima (CIM)? Defina: bacteriostato y bactericida Qu es radio de inhibicin? Qu relacin existe entre el halo de inhibicin y eficacia del antibitico?

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ANEXO 1 (Practica 6)

ESCALA NEFELOMETRICA DE MACFARLAND

TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Cl2Ba 1% 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

SO4H2 1% 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0

Bacterias UFC/ml 3.0 x 108 6.0 x 108 9.0 x 108 1.2 x 109 1.5 x 109 1.8 x 109 2.1 x 109 2.4 x 109 2.7 x 109 3.0 x 109

Algunos Antibiticos y sus sitios de accin

Antibitico Cloranfenicol Cefalotina Tetraciclina A. Nalidxico Eritromicina Estreptomicina Trimetoprim Azotromicima Gentamicina Bactrim Eritromicina Tetraciclina Amplicilina Clindamicina

Abrev. C CR TE NA E S TMP AZT GE SX EM TE A DAL

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ANEXO 3

PRESENTACION DEL INFORME

Caratula I. Objetivos Tema central de estudio. Fundamento terico Qu teoras lo sustentan? Procedimiento experimental (Exp 1. Exp.2) Cmo se estudi dicho problema? Es el plan ordenado de la forma en que se realiz la prctica para lograr el objetivo de la misma Observaciones y datos tabulados (para c/exp) Qu se observ? Qu datos hubieron?Durante el desarrollo del experimento Resultados y Clculos Cules fueron los resultados? Se indican los resultados tal y como se dieron durante la investigacin. Se pueden presentar los datos en tablas, grficas, o figuras Discusin Es la etapa que encadena los resultados obtenidos por la investigacin. Se pone a prueba la capacidad analtica y de autocrtica del autor. La discusin pone el toque personal al trabajo. Conclusiones Qu significan los resultados? Estn relacionados con los objetivos. Es el anlisis del cumplimiento de cada uno de los objetivos de la prctica Bibliografa Qu autores se consultaron para fundamentar la investigacin? Pueden revisar: Referencias Bibliografas al estilo Vancouver, en: http://www.unap.cl/p4_biblio/docs/Normas_VANCOUVER.pdf Cuestionario Preguntas relacionadas al tema

II. III.

IV.

V.

VI.

VII.

VIII.

IX.