INSTITUTO TECNOLOGICO DE TUXTLA GUTIRREZ

ANALISIS DE LA FIJACION BIOLOGICA DEL NITROGENO Y LA PRODUCCION DE AUXINAS EN LA BACTERIA Gluconacetobacter diazotrophicus, PRESENTE EN LA CAA DE AZCAR Y DIVERSOS CULTIVOS

PRESENTAN GONZLEZ GONZLEZ BEROLINA MONSERRAT RAMIREZ PREZ JORGE IVAN VELASCO SANCHEZ YESSICA IVON VILLATORO TOLEDO ISABEL

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los microorganismos fijadores se ubican en distintos grupos taxonmicos de los dominios Eubacteria y Archaea. En cuanto a las condiciones ecolgicas en las que estos organismos llevan a cabo la fijacin de nitrgeno, ciertas especies conocidas como "simbiticas" se caracterizan por fijar nitrgeno slo cuando se encuentran en asociaciones mutualistas con plantas, posteriormente el nitrgeno fijado es transferido a la planta con la que se asocian. Esta relacin es exitosa debido a que la planta proporciona compuestos que son utilizados como fuente de carbono y energa por la bacteria. Como ejemplo de tales asociaciones se encuentra Rhizobiaceae-leguminosas. (Luis E. Fuentes R., Armando Tapia H., ethal, 2003). La fijacin de nitrgeno a partir de asociaciones Rhizobiaceae-leguminosas ha sido un trabajo de largo estudio. En base a estas investigaciones realizadas en estas bacterias se descubri su uso o beneficio que este trae para la creacin de biofertilizantes, es por esto que se pretende buscar nuevas alternativas de bacterias que cumplan con los mismos requisitos que tiene este gnero para con la fijacin del nitrgeno, necesarias para la produccin de biofertilizantes. Los gneros Acetobacter, Gluconacetobacter y Acidomonas son capaces de oxidar completamente el etanol y el lactato a CO2 y H2O. An cuando el gnero Gluconacetobacter comparte con otros miembros de la familia Acetobacteraceae la capacidad de oxidar el etanol, este es el nico gnero de la familia, que contiene especies con la capacidad de fijar nitrgeno atmosfrico. (Gillis, M., K. Kersters, J. Dbereiner, and J. De Ley, ethal. 1989). El descubrimiento de G. diazotrophicus servira como modelo pionero de bacteria endfita fijadora de nitrgeno, pero adems abrira un nuevo captulo en la investigacin sobre fijacin de nitrgeno en plantas no leguminosas. (Cavalcante, V. A., and J. Dbereiner. 1988.)

De acuerdo al criterio expuesto anteriormente, el modelo de bacteria que sugerimos para su estudio es la gluconacetobacter diazotrophicus; presente en la caa de azcar y que es cultivada en el estado de Chiapas. Sin embargo, para comprobar que esta bacteria tiene la capacidad de mejorar el desarrollo de la caa de azcar, es necesario verificar las cantidades de nitrgeno que esta es capaz de fijar. Es aqu donde radica el problema, ya que esta bacteria debe brindar los suficientes rendimientos de nitrgeno en condiciones necesarias para mejorar los cultivos de la caa de azcar en presencia de factores que impidan o alteren el proceso de fijacin biolgica del nitrgeno (FBN).

INTRODUCCIN
Los microorganismos endfitos comprenden a hongos y bacterias, que viven sin causar dao en el interior de las clulas o tejidos vegetales de plantas superiores durante un periodo considerable de su ciclo de vida y que generalmente la benefician con su actividad (DIBUT, B., ethal; 2005). La asociacin de los microorganismos endfitos con su hospedero puede ser mutualista y llegar hasta el umbral de un organismo patgeno en estado de latencia. Las bacterias endfitas podran tener algunas ventajas competitivas sobre las bacterias rizosfricas, ya que la disponibilidad de nutrientes es mayor en el interior de las plantas y el numero de microorganismos endfitos es menor que el de los rizosfricos (MUOS ROJAS, Jess, ethal; 2001). Se ha demostrado que el interior de las plantas es un ambiente propicio para la fijacin biolgica del nitrgeno. Tambin se plantea que promueven el crecimiento vegetal por la produccin de sustancias reguladoras (RIOS, Y., DIBUT, B.; 2007). Desde hace ms de diez aos se conoce la presencia del endfito Gluconacetobacter diazotrophicus, aislado por primera vez a partir de las races y tallos de la caa de azcar cultivada en distintas regiones(DIBUT, B., ethal; 2005), su descubrimiento abri un nuevo captulo en la fijacin biolgica del nitrgeno en plantas no leguminosas, potencial que se ampli cuando se demostr que libera hasta el 50% del nitrgeno fijado y produce diversas auxinas, principalmente acido indolacetico y citocinas(RIOS, Y., DIBUT, B.; 2007). Se ha demostrado que cuando se inocula la bacteria en plantas de caa de azcar, puede fijar ciertas cantidades de nitrgeno y promover el crecimiento de las plantas predominantemente a travs de mecanismos hormonales, dependiendo de la variedad de caa de azcar y del genotipo de la bacteria inoculada. Se ha planteado que es necesario llevar a cabo estudios ms profundos para esclarecer las interrogantes que existen sobre la interaccin entre los diaztrofos y la planta, lo cual es imprescindible para su utilizacin comercial (ROJAS, M., ethal; 2009). Teniendo en cuenta estos antecedentes se plante el presente trabajo donde se analiza la fijacin biolgica del nitrgeno y la produccin de auxinas de la bacteria G. diazotrophicus presente en la caa de azcar, comparando su capacidad para fijar nitrgeno con diferentes cultivos de de distintas muestras biolgicas.

JUSTIFICACIN
Los estudios sobre endfitos fijadores de nitrgeno han tomado gran auge en la actualidad, basados en las ideas pioneras sobre el potencial agrobiotecnolgico de G. diazotrophicus. Las caractersticas consideradas fueron el hbitat endfito y la capacidad de fijar N2 en la presencia de nitratos, as como el excelente crecimiento de G. diazotrophicus en condiciones in vitro similares a las encontradas en la caa de azcar. Esto significaba que al multiplicarse G. diazotrophicus en el interior de la caa de azcar existira, menor competencia por los nutrientes en comparacin con el ambiente rizosfrico y podra disponer de abundantes fuentes de carbono, producto de la fotosntesis, para llevar a cabo la fijacin de nitrgeno aun cuando los cultivos fueran fertilizados con este elemento. El nitrgeno, producto de la fijacin biolgica, sera excretado directamente en el interior de los tejidos de la planta, la cual los usara para cubrir al menos parcialmente sus requerimientos en la sntesis de macromolculas esenciales. El potencial agrobiotecnolgico se ampli cuando se demostr que G. diazotrophicus tena efectivamente la capacidad de excretar el 50% del nitrgeno fijado, as como de producir diversas auxinas, especialmente cido indol actico y citocininas las cuales podran ejercer efectos directos sobre la fisiologa de la planta e influir sobre el crecimiento de la caa de azcar. (Jess Muoz Rojas y Jess Caballero-Mellado, 2008) La realizacin de esta investigacin permitir conocer una nueva alternativa de bacteria para el desarrollo de los cultivos de la caa de azcar diferente a las bacterias del genero rizobium, adems de comprobar que en realidad cuenta con los rendimientos suficientes para llevar a cabo la fijacin biolgica del nitrgeno. Todo esto para lograr un gran impacto ambiental dentro de la produccin de caa de azcar, para obtener mejor rendimientos a menor costo y sin afectar a la riqueza del suelo sino por el contrario aprovechar los procesos biolgico de la bacteria para obtener beneficios para este y sin afectarlo o afectar otros elementos del medio ambiente.

HIPTESIS
Ser que la bacteria gluconacetobacter diazotrophicus extrada de la planta de la caa de azcar es fijadora de nitrgeno y productora de auxinas y su fijacin es ms eficiente que otras cepas extradas de diferentes muestras?

OBJETIVO GENERAL
Determinar la capacidad para fijar nitrgeno atmosfrico y conocer cmo influyen las auxinas en la actividad de la nitrogenasa en cepas diazotrophicus de gluconacetobacter

OBJETIVO ESPECIFICO
Aislar e incubar en un medio adecuado la bacteria endfita gluconacetobacter diazotrophicus de la caa de azcar. Optimizar el proceso de fijacin de nitrgeno de la bacteria. Verificar los rendimientos de fijacin de nitrgeno para posible produccin de biofertilizantes.

MARCO TEORICO
Caractersticas de la caa de azcar.
Es una planta originaria del extremo oriente (Borneo, Malasia) de donde llego a Espaa a travs del continente euroasitico. Espaa la llevo Amrica en el siglo XV. A nivel mundial es un cultivo muy importante, ya que alrededor del 50% de azcar que se consume en el mundo procede de la caa. La caa de azcar pertenece a la familia de las gramneas, del gnero saccharum. Las variedades cultivadas son hbridos de la especie officinarum y otras a fines (spontaneum, etc.).La caa de azcar es un pasto gigante emparentado con el sorgo y el maz tiene tallo macizo de 2 a 5 metros de altura con 5 y 6 cm de dimetro. El sistema radiccola est constituido por un robusto rizoma subterrneo y puede propagarse por estos rizomas y por trozos de tallo. El tallo acumula un jugo rico en sacarosa, compuesto que al ser extrado y cristalizado en el ingenio forma el azcar. En su parte superior encontramos la panocha, que mide unos 30 cm. de largo ( guerrero Garca Andrs,1998). La temperatura, la humedad y la luminosidad, son los principales factores del clima que controlan el desarrollo de la Caa. La Caa de Azcar es una planta tropical que se desarrolla mejor en lugares calientes y soleados. Es indispensable tambin proporcionar una adecuada cantidad de agua a la caa durante su desarrollo, para que permita la absorcin, transporte y asimilacin de los nutrientes. La Caa de Azcar se cultiva con xito en la mayora de suelos, estos deben contener materia orgnica y presentar buen drenaje tanto externo como interno y que su PH oscile entre 5.5 a 7.8 para su ptimo desarrollo. Se reportan buenos resultados de rendimiento y de azcar en suelo de textura franco limoso y franco arenoso. Se reproduce por trozos de tallo, se recomienda que la siembra se realice de Este a Oeste para lograr una mayor captacin de luz solar. El material de siembra debe ser de preferencia de cultivos sanos y vigorosos, con una edad de seis a nueve meses, se recomienda utilizar la parte media del tallo, se deben utilizar preferentemente esquejes con 3 yemas. La profundidad de siembra oscila entre 20 a 25 cm, con una distancia entre surco de 1.30 a 1.50 m. La semilla debe de quedar cubierta con 5 cm de suelo. La faena de la recoleccin se lleva a cabo entre los once y los diecisis meses de la plantacin, es decir, cuando los tallos dejan de desarrollarse, las hojas se marchitan y caen y la corteza de la capa se vuelve quebradiza. Se quema la plantacin para eliminar las malezas que impiden el corte de la Caa. La caa es un cultivo de aprovechamiento plurianual. Se corta cada doce meses, y una plantacin viene a durar unos cinco aos (Subirs Ruiz F.,2000.)
CARACTERISTICAS GENERALES DE AUXINAS

El nombre auxina se deriva del griego auxein, que significa aumento o incremento, designado cualquier compuesto constituido por el grupo auxinico, y a menudo se usa como sinnimo al acidoindolacetico (AIA). Qumicamente son llamadas 3-indol-acetico, y son derivados del triptfano. Su estructura qumica bsica, se compone de un grupo indol, por lo que es fcil encontrar en las plantas otros compuestos con estructura similar. Para que una sustancia exhiba accin auxinica debe de tener un radical acido o ser fcilmente convertible a l, un anillo aromtico de uno a cuatro carbonos entre el carboxilo y el anillo. Existen tres grupos auxnicos: Derivados del indol como acido indol propinico, acido indol butrico, y el acido 3- indolactico. Derivados del naftaleno, como acido naftalen-acetico, acido naftoxiacetico, acido naftilpropionico. Derivados fenoxi, usados como herbicidas selectivos y algunas veces como reguladores del crecimiento vegetal.

Se encuentran en las clulas en concentraciones de 10-6 -10-8 M, y su distribucin dentro de los tejidos est sujeto a los principios del transporte activo y polar. Si la concentracin del compuesto en el tejido aumenta, el efecto que tienen sobre la planta ser la inhibicin de la elongacin de la raz, la razn es un estimulo en la produccin de etileno, mientras que a bajas concentraciones estimula la elongacin de los brotes y las races (BAUTISTA CELIS, L.; 2008)

Historia de estudios de la bacteria

Desde hace ms de diez aos se conoce de la presencia del endfito gluconacetobacter diazotrophicus, aislado por primera a vez a partir de races y tallos de caa de azcar cultivadas en distintas regiones de Brasil. (B.Dibut, Marisel Ortega, R.Martinez, L.Fey y Yoani Ros, 2005). G. diazotrophicus es una bacteria que fue aislada por primera vez por Cavalcante y Dbereiner (1988), a partir de tejidos de caa de azcar. Esta bacteria posteriormente ha sido aislada como endfita de distintas variedades de caa de azcar localizadas en zonas geogrficas muy distantes, adems de que tambin ha sido encontrada asociada a diversos hospederos como el camote (pomoea batatas), algunos pastos de variedad Cameroon (Pennisetum purpureum), el cafeto (Coffea arabica), la pia (Ananas comosus), y la chinche harinosa (Saccharococus sacchari). En la planta se ha encontrado que la bacteria prefiere los espacios intercelulares y tejido vascular como el xilema. (Jess Muoz Rojas, 2005). La bacteria recin descubierta fue descrita como una nueva bacteria fijadora de nitrgeno tolerante al cido la cual recibi el nombre de Saccharobacter nitrocaptans. No obstante, durante el perodo de impresin del trabajo referido se incluy como addendum el cambio de nombre ya propuesto, y a la nueva bacteria se le daba el nombre de

Acetobacter nitrocaptans, sobre la base de experimentos de hibridacin RNA/DNA y DNA/DNA. Anecdticamente, el sobretiro recibido por JCM vena con una correccin, hecha de puo y letra de Johanna Dbereiner, en la que se indicaba el nombre de la especie como Acetobacter diazotrophicus. Fueron solo algunos meses despus cuando Acetobacter nitrocaptans reciba el nombre oficial de Acetobacter diazotrophicus, nombre con el cual aun hoy da se sigue reconociendo a esta especie. Sin embargo, Yamada y col., propusieron un nuevo esquema en la taxonoma de la familia Acetobacteraceae, y actualmente el primer fijador de nitrgeno descrito en esta familia es referido oficialmente como Gluconacetobacter diazotrophicus. (Jess Muoz Rojas y Jess Caballero Mellado, 2001). Su descubrimiento abri un nuevo captulo en la fijacin de nitrgeno en plantas no leguminosas, potencial que se ampli cuando se demostr que libera hasta el 50% de nitrgeno fijado y produce diversas auxinas, principalmente acido indol actico y citocinas. (Yoani Ros y B.Dibut, 2007).

Caractersticas morfolgicas de la bacteria.

Las caractersticas principales observadas en la gluconacetobacter diazotrophicus fueron su capacidad de fijas nitrgenos, el crecimiento optimo en medios acidos y la posibilidad de oxidar etanol, primero hasta acido acetico y luego hasta CO2 y agua. Este microorganismo fue descrito como bacteria gran negativa con forma de cilindro recto de extremos redondeados de 0,7-0,9um de largo y mvil con flagelacin lateral petrica. Su crecimiento es optimo a Ph 5,5 y temperatura de 30grados centgrados, produce acido 2cetoglutonico y acido 2,5 cetoglutonico a partir de la glucosa as como pigmentos solubles de color carmelita en medio GYC. Libera acido actico y forma colonias de color amarillonaranja en medio LGI solido suplementado con el indicador de PH bromotimol azul. En condiciones microanaerobias reduce N2 lo que permite crecer en medios carentes de compuestos nitrogenados. No consume nitratos debido a la ausencia de nitrato reductasa. Se ha informado que la G. diazotrophicus sintetiza las fitohormonas acido indolacetico y citocinas (Fuentes Ramrez y cols., 1993; bastian y cols.,1998; hedrych y cols.;1998). Los patrones electrofericos de las protenas intracelulares totales de diversas cepas de G diazotropicus son muy similares entre si y diferentes de los otras bacterias del mismo gnero (Gillis y cols.,1998; Ureta y cols.,1995) la mayora de los aislamientos de G. diazotrophicus se han clasificado en tipos electrofericos ET basados en polimorfismos detectados en la movilidad electroferia de enzimas deshidrogenasas, oxidasas, forforilasas y esterasas (caballero mellado y martinez romero,1994; caballero melado cols.;1996, Jimenez Salgado y cols.;1997). La bacteria G. diazotrophicus se considera endfita de caa de azcar ya que sobrevive probablemente en el suelo y necesita del ambiente de la planta hospedera ara realizar sus funciones vitales. Su interaccin con esta planta no induce reaccin patognica alguna y

brinda elevados aportes de nitrgeno fijado. Algunos autores opinan que la bacteria no debe considerarse obligada ya que la bacteria puede crecer en medios de cultivo sin extractos vegetales. Los primeros aislamientos de G diazotrophicus se realizaron en el interior de races y tallos y hojas de la caa de azcar. En la actualidad se conoce que la bacteria coloniza de igual forma otras plantas herbceas ricas en sacarosa y propagacin vegetativa como boniato, pia, la hierba camerusnesa y el sorgo. Puede utilizar diferentes fuentes de carbono como sacarosa, glucosa, fructosa, gluconato, sorbitol o glicerol y manitol. En cambio no puede consumir las cidos dicarboxilicos (succinato, fumarato y malato) debido a la falta de un sistema para transportarlos al interior de la clula. Este aspecto diferencia a esta especie de otras bacterias diazotroficas.

Caracterizacin genotpica y fenotpica de G. diazotrophicus

La familia Acetobacteraceae pertenece a la subclase -proteobacteria. Son bacterias aerbicas, gran negativas o gran variables que se caracterizan fenotpicamente por su capacidad de oxidar etanol a acido actico en medios de cultivo con pH neutro o acido. Genotpicamente la familia Acetobacteraceae puede ser distinguida de otras proteobacteria por la presencia de dos sitios de restriccin SphI Y NcoI internos en la secuencia del gen 16S ADN-ribosomal, excepto en Gluconobacter oxydans en el que falta uno de los sitios NcoI, un miembro de esta familia es digerido con la enzima de restriccin SphI y se hibrida con una sonda de los genes 16S ADN-ribosomal, se detecta una banda de hibridacin de 1.3 Kb y cuando la restriccin se hace con la enzima NcoI se encuentra una banda de 1.24 Kb. Tradicionalmente la familia Acetobacteraceae se ha dividido en los gneros Acetobacter y Gluconobacter. Sin embargo, la clasificacin de las bacterias acticas ha sido materia de controversia durante largo tiempo. Recientemente, Yamada u Col. Propusieron la divisin de la familia Acetobacteraceae en los gneros Acetobacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter y Acidomonas, sobre base del anlisis de secuencias parciales del gen 16S ARN-ribosomal y del tipo de ubiquinona predominante. De esta forma, en el gnero Acetobacter fueron incluidas las especies que tienen el tipo de ubiquinona Q, entre las que se encuentran Acetobacter aceti y Acetobacter pasteurianus, en tanto que las otras especies de Acetobacter equipadas con ubiquinona Q, incluida A. diazotrophicus, fueron transferidas al gnero tambin fueron incluidas las especies G. xylinus, G. hansenii, y G. europaeus. El nombre de Gluconoacetobacter fue corregido a Gluconacetobacter, con base en la regla 61 del cdigo internacional de nomenclatura bacteriana. Posteriormente

otras especies de bacterias acticas han sido descritas, entre ellas Acetobacter obodiens y A. pomorun, las cuales deben ser reasignadas al gnero Gluconacetobacter, y G. sacchari. Recientemente han sido descritas dos nuevas especies de Gluconacetobacter, G. johannae (en honor a johanna dbereiner) y G. azotocaptans. Los gneros Acetobacter, Gluconacetobacter y Acidomonas son capaces de oxidar completamente el etanol y el lactato a CO y HO. Aun cuando el gnero Gluconacetobacter comparte con otros miembros de la familia Acetobacteraceae la capacidad de oxidar el etanol, este es el nico gnero de la familia, reconocido actualmente, que contiene especies con la capacidad de fijar nitrgeno atmosfrico. El crecimiento ptimo de G. diazotrophicus se presenta a 30C en medios de cultivo que contienen 10% de sacarosa y pH de 5.5. Sin embargo, esta bacteria es capaz de crecer en concentraciones de sacarosa hasta del 30%. La especie G. diazotrophicus, puede usar glucosa, fructosa o sacarosa como nica fuente de carbono, produciendo cido a partir de estos substratos. Con excepcin de la sacarosa, esta especie no usa otros disacridos y no es capaz de crecer con cidos dicarboxlicos como nica fuente de carbono. G. diazotrophicus lleva a cabo la FBN con condiciones microaerofilicas a pH cido, incluso debajo de 3.0, as como en presencia de altas concentraciones de nitratos (10mM) y su actividad nitrogenasa es inhibida solo parcialmente an a concentraciones de 20 mM de (NH)SO o por aminocidos. Estas caractersticas de G. diazotrophicus, son compartidas por las especies G. johannae y G. azotocaptans. La especie de G. diazotrophicus puede ser diferenciada de las otras especies fijadoras de nitrgeno del genero por la formacin de colonias de color caf obscuro (chocolate) con bordes claros en un medio de cultivo a base de extracto de papa adicionado con 5, 10 o 15 % de sacarosa, despus de 5 a 7 das de incubacin. Las especies G. johannae y G. azotocaptans permanece de color beige o crema aun despus de 10 das de incubacin. La electroforesis de protenas totales en geles de poliacrilamida-duodecil sulfato (SDSPAGE) tambin se ha usado exitosamente en la caracterizacin de la especie G. diazotrophicus. La electroforesis de enzimas metablicas (MLEE) ha sido otra de las estrategias usadas en la caracterizacin y diferenciacin de cepas de G. diazotrophicus, as como en la diferenciacin de esta especie de otras especies de acetobacterias. Con esta metodologa se han logrado identificar 14 patrones diferentes de enzimas metablicas o tipos electroforticos (ET1 a ET14) en cepas designadas como tpicas de la especie G. diazotrophicus, con la excepcin del ET 13, el cual representa una cepa que difiere en algunas caractersticas con esta especie. Es de inters destacar que cerca del 98% de las cepas de G. diazotrophicus aisladas de plantas de caa de azcar cultivadas en diferentes regiones de Mxico han sido agrupadas en el ET 1, en tanto que numerosas cepas aisladas

de plantas cultivadas de Brasil son agrupadas en 7 ETs, aunque predominan las cepas representadas por el ET 3. Adems, el ET 1 se ha identificado entre cepas de G. diazotrophicus aisladas de todos los hospederos conocidos colectados en Mxico, Brasil y otros pases como cuba y la india. Previo a la descripcin de las especies G. johannae y G. azotocaptans se report que la caracterizacin especfica de G. diazotrophicus se lograba mediante la amplificacin del gen 16S ADN-ribosomal usando los oligonucletidos AC (5-CTGTTTCCCGCAAGGGAC.3) Y D1 (5-GCGCCCCATTGCTGGGTT-3), los cuales generan una banda de 445 pb. No obstante, con estos oligonucletidos tambin se amplifica una banda de 445 pb en las especies G. johannae y G. azotocaptans por lo que la amplificacin puede considerarse especfica para las especies fijadoras de N del genero Gluconacetobacter conocidas. La caracterizacin especifica de G. diazotrophicus pudiera lograrse mediante la amplificacin del gen 23S ADN-ribosomal, usando el oligonucletido 1440 (5-GTTGGCTTAGAAGCAGCC-3, hlice 43 a/43 b) y el oligonucletido AD (5-TGCGGCAAAAG CCGGAT-3), que generan un producto de 411 pb. La secuencia complementaria AD ha sido usada como sonda de hibridacin para la identificacin de G. diazotrophicus, as como para su diferenciacin de otras especies no fijadoras de N del genero. No obstante, es necesario determinar si con estos oligonucletidos se pueden diferenciar las otras especies fijadoras de N del genero Gluconacetobacter. Los patrones de hibridacin de los genes estructurales de la nitrogenasa (nifHDK) y de los genes 16S ADN-ribosomal de G. diazotrophicus, as como ensayos de homologa ADN-ADN han sido estrategias clave en la identificacin de G. diazotrophicus y en su diferenciacin con otras especies. En las cepas tpicas de G. diazotrophicus, se han observado tres bandas comunes de hibridacin con los genes nifNHK (1.25, 2.0 Y 9.0 kb) y 4 bandas de hibridacin con los genes 16S ADN-ribosomal (1.6, 2.3, 3.6 y 9.3 kb), con excepcin del ET 13 en el cual las 4 bandas de hibridacin con los genes nifHDK difieren en tamao (1.0, 1.20, 3.5 y 7.6 kb). Para la identificacin de G. diazotrophicus, tambin se han realizado ensayos de hibridacin con una sonda especifica al gen 16S ARN-ribosomal de esta especie. La homologa ADN/ADN que se observa entre las cepas de G. diazotrophicus analizadas en diferentes estudios se encuentra en el rango de 70 a 100%. La homologa ADN/ADN del 70% es considerada el lmite inferior para la diferenciacin de especies
(MUOS ROJAS, J.; CABALLERO MELLADO, J.; 2008)

Hbitat y rendimientos de Fijacin de la FBN de la bacteria.

El descubrimiento de esa endfita abri un nuevo captulo en la fijacin de nitrgeno en plantas no leguminosas, potencial que se ampli cuando se demostr que libera hasta el 50% del nitrgeno fijado y produce diversas auxinas, principalmente acido indolactico y citocinas. El crecimiento ptimo de la bacteria se presenta a 30C de temperatura y resulta ms abundante en medios de cultivo que contienen 10% de sacarosa y H de 5.5. Sin embargo, puede crecer en concentraciones de sacarosa hasta del 30% y fijar nitrgeno en concentraciones de oxigeno del 4%. Puede utilizar glucosa, fructosa o sacarosa, produciendo acido a partir de estos sustratos. G. diazotrophicus se ha aislado de races lavadas y del interior del tallo de caa de azcar, cultivadas en Brasil, Australia, Mxico, India, Canad y Cuba; en los tejidos internos de plantas adultas e hijuelos de pia y de la rizsfera del cafeto. Se encuentra presente en vasos de xilema de races de maz inoculadas artificialmente y tambin se ha detectado ocasionalmente en la rizsfera de la caa de azcar y cereales, as como en algunos pastos de la variedad camerum, en el cultivo del boniato y la chinche harinosa. Su rango de hospederos se ampli recientemente tras su aislamiento en los cultivos de zanahoria, rbano, remolacha, meln, papaya, flores, calabaza, yuca y malanga. Los estudios de colonizacin de la bacteria, realizados mayoritariamente en caa de azcar, demuestran que esta coloniza la superficie de las races y penetra a travs de los sitios de emergencia de las races laterales y de la zona y de la zona meristemtica, para lo cual podra involucrar estructuras similares a los hilos de infeccin formados por Rhizobium. Los sitios que colonizan el microorganismo y su distribucin en el interior de la planta de caa de azcar aun no se han esclarecido. Se ha demostrado que coloniza los espacios intracelulares de la raz y los vasos del xilema. Otros estudios sealan que se localiza en espacios intercelulares del tallo correspondientes al apoplasto de plantas adultas. Se encontraron las mayores poblaciones microbianas en la zona apical de los tallos de caa de azcar, donde existe mayor concentracin de glucosa en la planta. Algunas condiciones del entorno pueden afectar la capacidad de fijar nitrgeno de los organismos diaztrofos, por ejemplo, la presencia de oxigeno y amonio. El efecto del oxigeno sobre la actividad de la nitrogenasa depende del suplemento de carbono y de la tasa de respiracin de las clulas. Se ha observado que al aumentar la aireacin se provoca un efecto positivo sobre el crecimiento.

En el caso del nitrgeno, la proteccin podra ser explicada por la baja asimilacin de amonio que manifiestan las clulas del microorganismo cuando crecen al 10% de sacarosa. Este mecanismo resulta de gran inters, considerando que el habitad de la bacteria generalmente es rico en sacarosa, por lo que su nitrogenasa esta activa aun cuando el microorganismo se encuentre rodeado de amonio. Tambin se ha demostrado que fija nitrgeno en condiciones microaeroflicas a pH acido, incluso por debajo de 3.0, as como en presencia de altas concentraciones de nitratos (10mM), y su actividad nitrogenasa se inhibe solo parcialmente aun en concentraciones de 20mM de (NH4)2SO4 o por la presencia de aminocidos.

Condiciones que afectan la fijacin del Nitrgeno de G. diazotrophicus

Algunas condiciones del entorno pueden afectar la capacidad de fijar nitrgeno de los organismos diazotrofos, por ejemplo la presencia de oxigeno y amonio. El efecto del oxigeno sobre la actividad de la nitrogenasa depende del suplemento de carbono y de la tasa de respiracin de las clulas. Se ha observado que al aumentar la aireacin se provoca un efecto positivo sobre el crecimiento. En el caso del nitrgeno, la proteccin podra ser explicada por la baja asimilacin de amonio que manifiestan las clulas del microorganismo cuando crecen al 10% de sacarosa. Este mecanismo resulta de gran inters, considerando que el hbitat de la bacteria generalmente es rico en sacarosa, por lo que se nitrogenasa est activa aun cuando el microorganismo se encuentre rodeado de amonio. Tambin se ha demostrado que fija nitrgeno en condiciones microaeroflicas a pH cido, incluso por debajo de 3.0,as como en presencia de altas concentraciones de nitratos (10mM), y su actividad nitrogenasa se inhibe solo parcialmente aun en concentraciones de 20 mM de (NH4)2SO4 o por la presencia de aminocidos(RIOS,Y.;DIBUT, B.; 2007).

Otros estudios de la bacteria con relacin a la fijacin de nitrgeno.

El estudio de fijacin de nitrgeno por bacterias endfitas, se trat junto con la fijacin de nitrgeno que realizan las bacterias que viven en asociacin con las races de las plantas. Esto se debi a que al realizar los aislamientos de microorganismos fijadores de nitrgeno de las races y otros rganos de plantas que crecen en el campo es muy difcil distinguir si los microorganismos aislados provienen del suelo remanentes en los intersticios externos

de los tejidos, o si provienen de estructuras del interior de los rganos que se utilizan para el aislamiento. En la caa de azcar se han reportado endfitos de los gneros Gluconacetobacter, Azospirillum, Herbaspirillum y muy recientemente el gnero Pantoea en plantas cubanas de caa de azcar. Un momento muy importante para el estudio de las bacterias endfitas fijadoras de nitrgeno fue el descubrimiento del Gluconacetobacter diazotrophicus en la caa de azcar. Este microorganismo se nombr originalmente Saccharobacter nitrocaptans por sus descubridores Cavalcante y Dobereiner en 1988, ms tarde se renombr como Acetobacter diazotrophicus y finalmente se ha denominado Gluconacetobacter diazotrophicus. Aos despus del primer reporte del aislamiento de Gluconacetobacter diazotrophicus a partir de los tejidos de races y tallos de caa de azcar, Dong y col. en 1994 demostraron, al estudiar las variedades cubanas de caa ML 3-18 y Ja 60-5, que la savia del apoplasto del entrenudo de los tallos es el lugar donde se aloja este microorganismo fijador de nitrgeno en la caa de azcar. El apoplasto de los entrenudos del tallo est lleno de savia con un pH de 5.5 y altos contenidos de azcares, segn el estado del crecimiento de las plantas. El espacio apoplstico est formado por el conjunto de los espacios intercelulares y los espacios que quedan en las paredes de las clulas del tejido (Dong y col.; 1994). Se ha planteado que G. diazotrophicus se aloja en los elementos del xilema, as como en el parnquima xilemtico de las plantas de caa de azcar (James y col; 2001). Estos diferentes resultados han provocado una controversia en la literatura internacional sin que hasta el momento exista un consenso sobre las estructuras de las plantas de caa donde se alojan los endfitos fijadores de nitrgeno. El estudio de la distribucin de Gluconacetobacter diazotrophicus en las distintas partes del tallo de la caa de azcar, realizado en la variedad Ja 60-5, indic que los tejidos de los entrenudos del pice del tallo son los que albergan mayores poblaciones de este microorganismo. La distribucin de estas bacterias, parece estar ms relacionado con la concentracin de glucosa que con la concentracin de sacarosa en el tallo. Otros aspectos relacionados con la composicin de los jugos de la caa, pueden ser importantes para determinar la distribucin de diferentes cepas de G. diazotrophicus y otros endfitos fijadores de nitrgeno y la distribucin de las poblaciones de estos organismos. En la actualidad desarrollamos investigaciones para determinar la relacin entre los componentes del jugo y la presencia de estos microorganismos en las plantas. Muy recientemente se han detectado diferentes cepas de G. diazotrophicus en diferentes variedades y distribuidas en distintos rganos de la planta como los tallos y las races (Ortega-Rods; 2004). Una de las cepas (T2) es capaz de alcanzar grandes valores de fijacin de nitrgeno, lo que la hace un candidato importante para el proceso de inoculacin de plantaciones que no posean o posean cepas de bajo nivel de fijacin. Otro hallazgo interesante de esta autora es que existe una variabilidad gentica entre cepas

aisladas de diferentes variedades y de diferentes rganos y organismos no detectada anteriormente; y que difiere de la proclamada homogeneidad entre las cepas de G. diazotrophicus aisladas hasta antes de su trabajo en diferentes partes del mundo caero. Como se conoce, los tallos de caa de azcar que se emplean como semilla para la plantacin de este cultivo, deben recibir un tratamiento hidrotrmico para eliminar las bacterias causantes de la enfermedad conocida como Raquitismo de los Retoos. Esta enfermedad es responsable de grandes prdidas en la cosecha de la caa y provocan serias afectaciones econmicas al cultivo. Se encontraron, al comparar la poblacin de microorganismos y la actividad nitrogenasa de aislados de cultivos de G. diazotrophicus provenientes de tallos sometidos o no al tratamiento hidrotrmico, que ese tratamiento disminuye las poblaciones y la actividad de la enzima nitrogenasa, pero no las elimina (Ortega y col.; 2001). Adems, la menor afectacin producto del tratamiento, se encontr en los entrenudos del tercio apical del tallo de la caa. Este hallazgo tiene valor prctico porque es muy necesario controlar la enfermedad y a la vez es muy adecuado que la actividad de los organismos beneficiosos para la nutricin nitrogenada no se afecte. En los estudios cubanos sobre microorganismos fijadores de nitrgeno de la caa de azcar, un resultado muy novedoso ha sido el descubrimiento de una nueva especie de endfita fijadora de nitrgeno por Loiret y col., (2004). Estos autores descubrieron por primera vez, que la caa de azcar alberga una especie endfita del gnero Pantoea, aspecto no informado antes por ningn investigador en el mundo. Esta especie tiene una capacidad fijadora de nitrgeno que es 15 veces superior a la que tiene la cepa tipo de Gluconacetobacter diazotrophicus PAL-5. Adicionalmente a la capacidad de fijar nitrgeno, la cepa cubana de Pantoea sp. Tiene una capacidad significativa de producir hidrgeno, lo que la hace especialmente interesante y atractiva para pensar en la produccin de energa a partir de los derivados de la industria azucarera. El hidrgeno como combustible es adecuado desde el punto de vista del medio ambiente; su combustin genera una energa limpia ya que el residuo que queda es agua. Las potencialidades del estudio de los endfitos de la caa de azcar son considerables. Pudiera pensarse en aplicar tcnicas biotecnolgicas para el aprovechamiento de la fijacin de nitrgeno que estos realizan, e intentar suplir, aunque fuera parcialmente, las necesidades de nutrientes nitrogenados del cultivo. Algo ms novedoso, pero a tomar en consideracin, es la idea de aprovechar la capacidad productora de hidrgeno de algunas de estas cepas para la produccin biotecnolgica de un combustible limpio a partir de los productos o subproductos de la industria azucarera (Ortega y col., 2001). La Fijacin Biolgica de Nitrgeno en caa de azcar tiene altas potencialidades; slo se necesita trabajar fuerte y seriamente para dominarla y aprovecharla en la prctica (Eduardo Ortega, Loiret Fernndez, Patricia Ortega-Rods, y Rosa Rods).

METODOLOGIA
Materiales y mtodos Cepas bacterianas utilizadas Se utilizaron 8 cepas de referencia de la especie G. diazotrophicus aisladas de diferentes ecosistemas que se listan en la tabla 1.

Determinacin de la influencia de la fijacin de nitrgeno en la produccin de auxinas

Se midi la produccin de AIA por las cepas PAl5 (ATCC 49037) y 4-02 en el tiempo (24, 48,72 y 96 horas) a partir de lo cual se seleccion el tiempo y las condiciones adecuadas para determinar la produccin de esta auxina por todas las cepas en estudio. Se utiliz medio LGI-P lquido con las siguientes variantes en cuanto a las condiciones de nitrofijacin y la presencia de triptfano.

0,132 g.L-1 de (NH4)2 SO4 y 100 g. mL-1 de Trp 0,132 g.L-1 de (NH4)2 SO4 y sin adicin de Trp 2 g.L-1 de (NH4)2 SO4 y 100 g. mL-1 de Trp 2 g.L-1 de (NH4)2 SO4 y sin adicin de Trp

Despus del periodo de incubacin indicado se centrifugaron los cultivos a 5000 rpm a durante 10 min. A los sobrenadantes se les adicion el reactivo de Salkowski (Sawar et l., 1992) en una relacin 1:1. La mezcla se incub durante 30 min en la oscuridad, y luego se midi la absorbancia a 530 nM en un espectrofotmetro. Previamente se realiz una curva patrn empleando soluciones de 5, 10, 15, 20, 40, 60, y 80 gmL-1 de AIA sinttico. Determinacin de la produccin de auxinas de las 8 cepas en estudio Se sembraron tubos con 5 mL de medio al 5% con los preinculos preparados de cada una de las cepas en estudio y se incubaron a 30o C en condiciones de agitacin en zaranda. Para la determinacin de la produccin de auxinas se sigui la metodologa previamente descrita y se tuvieron en cuenta las condiciones seleccionadas en el experimento anterior respecto a las condiciones de nitrofijacin, la presencia de Trp y el tiempo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Determinacin de la influencia de aminocidos y hormonas en la fijacin de nitrgeno Para este experimento se utiliz la cepa 4-02 de G. diazotrophicus. Partiendo de una suspensin de clulas microbianas ajustada a la concentracin 108 ufc correspondiente al tubo 0,5 de la escala de Mc Farland (NCCLS, 1993), se inocularon frascos de 10 ml que contenan 5 ml de medio LGI-P semislido suplementado con AIA y cido giberlico por separado a las concentraciones de 0,025; 0,25 y 2,5 mg/l y se incubaron 5 repeticiones por concentracin por microorganismo a 30 C durante 48 horas. Luego se les extrajo el 12% del aire con jeringuillas y se les inyect esa misma cantidad de acetileno, se incubaron durante 96 horas y se midi la reduccin del acetileno a etileno en un cromatgrafo de gases por ionizacin de llamas acoplado a una computadora con el programa Biocrom mediante el cual se procesaron los resultados. Anlisis biomtricos Para los anlisis biomtricos se realizaron pruebas de normalidad y homogeneidad de varianza a todas las variables de los experimentos y despus del Anova se aplic el

mtodo SNK paramtrico o no paramtrico segn el caso, utilizando el programa Statistica para Window versin 6.0.

RESULTADOS
Resultados y Discusin Influencia de la fijacin de nitrgeno en la produccin de auxinas En las ltimas dcadas se ha observado que las asociaciones entre los procariotas y las plantas son de gran importancia para la agricultura como herramienta para mejorar el rendimiento de los cultivos y la preservacin del medioambiente, lo que se complementa con la reduccin de los riesgos por el uso de fertilizantes qumicos (Pedraza, 2008). G.diazotrophicus-caa de azcar representa un sistema modelo de la asociacin entre los diazotrofos y las monocotiledneas, pero an no se ha entendido totalmente dicha interaccin. Momose et l. (2009) detectaron fijacin de nitrgeno en tallos de plantas jvenes de caa de azcar y sugieren que esto se debe a la actividad de endfitos como G.diazotrophicus que se han descrito previamente en esa misma variedad (Asis et l., 2000).

G. diazotrophicus tambin produce el cido 3 indolactico (AIA), auxina natural de gran importancia y significativa actividad biolgica (Arshad y Frankerberger, 1998; Velzquez et l., 1999). Teniendo en cuenta estos aspectos, debera ser analizada y bien entendida la relacin entre la FBN y produccin de AIA para aplicar esta bacteria promotora de crecimiento vegetal (PGPB) de la manera ms eficaz en la agricultura sostenible. El triptfano (Trp) es un aminocido esencial que sirve como precursor fisiolgico para la biosntesis de auxinas en plantas y microorganismos. Muchos investigadores han informado un incremento en la biosntesis de auxinas en suelos rizosfricos suplementados con Trp (Frankenberger y Poth, 1987). En este experimento se determin cmo se afecta la produccin de AIA in vitro por la presencia de Trp como inductor y las condiciones de nitrofijacin, lo cual se puede observar en la figura 1.

En este experimento se demostr que en las dos variantes de concentracin de nitrgeno en el medio de cultivo las cepas 4-02 y PAl5 producen auxinas en presencia de Trp desde el primer da de crecimiento y de manera incrementada durante un periodo de 96 horas. Por el contrario, la produccin de auxinas en ausencia de Trp fue nula, independientemente de si existi suplemento de nitrgeno o no. Teniendo en cuenta este resultado se podra asumir que la va principal de biosntesis de AIA en G.diazotrophicus es dependiente de la presencia de Trp. Resultados contrastantes fueron obtenidos por Rojas (2005), quien emple el medio SYP para la cuantificacin del AIA para las mismas cepas de G. diazotrophicus. En este caso la bacteria produjo las hormonas en ausencia de Trp aadido, pero no escapa su presencia en el medio con extracto de levadura, la cual es una fuente de aminocidos. Se han descrito 3 vas fundamentales para la produccin de AIA para las plantas y los microorganismos las cuales son dependientes de triptfano (Normanly y Bartel, 1999). Evidentemente G. diazotrophicus debe utilizar una de ellas, segn se muestra en los experimentos realizados. De acuerdo con los resultados obtenidos para las cepas PAl 5 y 402 se decidi realizar el estudio de produccin de AIA en condiciones de nitrofijacin para todas las cepas (no se realiz este ensayo sin nitrofijacin debido a que no existieron diferencias significativas en

la produccin de AIA bajo las dos variantes de nitrofijacin). Se seleccionaron las 96 horas como el tiempo ptimo de produccin para todas las cepas del estudio debido a que existi diferencia significativa entre las concentraciones de AIA producidas entre 72 y 96 h en condiciones de nitrofijacin por la cepa PAl5, que es la cepa tipo de la especie. Los resultados expresados en la figura 2 indican que todas las cepas de G. diazotrophcus del estudio son productoras de auxinas. El rango de concentraciones vari desde 9,25 gmL-1 hasta 32,14 gmL-1, donde UAPCf 53 fue el menor productor y CFNCf 52 el mayor. La produccin de AIA se comporta para las diferentes cepas en orden decreciente como se seala a continuacin: CFNCf 52, Pal 3, UAPAc10, 4-02, PRC 1, 1-05, Pal 5 y UAPCf 53, existiendo diferencias estadsticamente significativas entre ellas, segn lo mostrado en la figura 2.

Los valores de auxinas obtenidos son comparables con los de otras bacterias como Azospirillum y Azotobacter segn lo probado por Fuentes-Ramrez et l. (1993). Igualmente, si comparamos la produccin de la hormona con otros nitrofijadores como Azospirillum y Herbaspirillum se encuentran en el mismo rango, pero siempre mayores que este ltimo gnero (Rives, 2006). Influencia de aminocidos y hormonas en la fijacin de nitrgeno Cuando se aaden aminocidos al medio de cultivo se evidencia una inhibicin parcial de la actividad enzimtica (figura 3). Resultados similares se encontraron con las cepas PAl 3 y la PAl 5 con otros aminocidos (Stephan et l., 1991; Reis y Dobereiner, 1998), aunque estos autores demostraron que la inhibicin frente a los aminocidos depende de la concentracin de sacarosa en el medio de cultivo y de la cepa en cuestin, como se puede apreciar para la asparagina, que inhibe totalmente la actividad de la nitrogenasa en la cepa PAl5, lo que no ocurre con las cepas 4-02 y 1-05. Se ha comprobado que todas las cepas tienen buen crecimiento en presencia de estos y otros aminocidos, siendo mayor estadsticamente con la asparagina (Rodrguez et l., 2002, Tejera et l., 2004).

Tejera et l. (2004) detectaron la presencia de varios aminocidos y amonio en la savia de la caa de azcar, siendo las concentraciones de amonio tanto en el fluido apoplstico como en el simplstico mucho menores que las de los aminocidos. Esto favorecera la fijacin de nitrgeno por esta bacteria, si se tienen en cuenta los resultados obtenidos respecto a la inhibicin de la actividad nitrogenasa por estos compuestos del nitrgeno y pudiera tener importancia en la interaccin planta-bacteria en sentido general, ya que se ha comprobado que la presencia de triptfano estimula la produccin de auxinas (Khalid et l., 2001).

Muchos autores han abordado la influencia que pueden ejercer las fitohormonas producidas por los microorganismos sobre las plantas, pero son muy pocos los estudios realizados donde se analice la interaccin endfito-planta en sentido contrario, respecto a la presencia de estimuladores del crecimiento vegetal. En este trabajo se prob la capacidad de G. diazotrophicus para fijar nitrgeno en presencia de varias concentraciones de auxinas (AIA) y giberelinas (cido giberlico, GA). La cepa 4-02 fija mayor cantidad de nitrgeno atmosfrico en presencia de 0,025 mg/L de AIA, respecto a las otras concentraciones ensayadas, aunque la fijacin es menor que en el medio donde no hay presencia de esta hormona (figura 4). Respecto a la presencia de giberelina, las mayores tasas de fijacin de nitrgeno se obtienen cuando est presente esta hormona al 0,025 mg/L, la menor concentracin ensayada. Pudiera ser que para la fijacin de nitrgeno esta cepa necesitara niveles menores de concentracin de la fitohormona ya que se puede observar que la fijacin de nitrgeno aumenta al disminuir tanto la concentracin de AIA como la de GA, pero en el caso de esta ltima con la menor concentracin utilizada hay una mayor actividad de la nitrogenasa (figura 4).

Los resultados son contrarios a los reportados por Christiansen-Weniger (1988) para Azospirillum brasilense, donde se muestra que el AIA a concentracin de 2,5 mg.L1 incrementa la fijacin de nitrgeno y el GA a bajas concentraciones (0,025 mg.L -1) inhibe esta capacidad. No est claro cmo las sustancias del crecimiento de la planta pueden interactuar con la actividad nitrogenasa de los microorganismos, pudiera ser un efecto realmente hormonal, comparable con el que estas sustancias realizan en la regulacin de la fisiologa de la planta. Todas estas diferencias pudieran deberse a que la cepa de Azospirillum brasilense estudiada por estos autores se aisl de la rizosfera y la utilizada en nuestro experimento proviene del interior de las plantas. Adems, es obvio que las auxinas y giberelinas producidas por el propio microorganismo pueden estar involucradas en la fisiologa de la bacteria. La medida de fijacin de nitrgeno como actividad de reduccin del acetileno por mg de protena de 11 cepas de G. diazotrophicus a las 96 h (tiempo seleccionado con base en la curva patrn realizada) se muestra en la figura 5. Estos resultados se corresponden con los encontrados por Lee et l. (2002), quienes sealan que tanto la fijacin de nitrgeno como la produccin de cido 3 indolactico pudieran contribuir a la promocin del crecimiento de la planta.

El estudio de la ecologa de la interaccin entre los endfitos y las plantas es de gran importancia. La influencia de los diferentes componentes de la planta en la seleccin y el desarrollo de la comunidad microbiana endfita es fundamental, teniendo en cuenta las perspectivas de utilizacin de estos microorganismos en el mejoramiento de los cultivos agrcolas.

CONCLUSIN
Se comprob que la bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus es ms eficiente en cepas extradas de la planta de la caa de azcar, ya que comparada con las cepas de otras muestras, la fijacin de nitrgeno es ms abundante y ms eficiente, esto causado por el medio en el que se desarrolla. Se comprob que la bacteria G. diazotrophicus es productora de auxinas, que son un grupo de fitohormonas encargadas de la regulacin del crecimiento vegetal, pero debido a que las condiciones de nitrofijacin no influyen notablemente en la produccin de auxinas de la bacteria G. diazotrophicus se necesita de un suplemento del precursor triptfano, ya que el cido indol actico y el triptfano son inhibidores parciales de la actividad de la enzima nitrogenasa que se encuentra en la bacteria G. diazotrophicus, afectando directamente la fijacin biolgica de nitrgeno presente en la bacteria, otro factor que afecta la fijacin biolgica del nitrgeno es la concentracin de las auxinas, si estas se encuentran en menor proporcin la fijacin de nitrgeno aumenta, esto comparado con la regulacin que estas realizan en la fisiologa de la planta, puede ser un efecto hormonal. La produccin de las auxinas de la bacteria G. diazotrophicus, nos da un panorama ms amplio para poder utilizar esta bacteria como material para la produccin de biopreparados, encargados del mejoramiento de los cultivos de la caa de azucar, aunque

debido a la falta de conocimiento de la interaccin entre la endfita y la planta, nos frena en la realizacin de estos biopreparados.

BIBLIOGRAFIA
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