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Biotecnologa de la reproduccin y conservacin de especies en peligro de extincin

Eduardo R. S. Roldn y J. Julin Garde

Museo Nacional de Ciencias Naturales (CSIC), Madrid e Instituto de Investigacin en Recursos Cinegticos (CSIC-UCLM-JCCM) Albacete

14.1. Introduccin
La biodiversidad en Espaa est descendiendo a un ritmo considerable, al igual que sucede en el resto del planeta (Wilson, 2002). Nuestro pas tiene una posicin privilegiada dentro del contexto europeo por constituir un reservorio nico de biodiversidad. Aproximadamente la mitad de la biodiversidad europea se localiza en Espaa (Ministerio de medio Ambiente, 1999). Adems, nuestro pas forma parte de la cuenca Mediterrnea, uno de los 25 puntos calientes (hotspots) identificados en el mundo por la riqueza de fauna y flora (Mittermeir et al., 1999). Por estos motivos tenemos una gran responsabilidad a la hora de poner en marcha medidas que aseguren la proteccin de nuestro patrimonio natural. La mejor estrategia de conservacin de la biodiversidad es la preservacin del medio natural. Posiblemente existe acuerdo generalizado sobre este principio. Pero es importante resaltar que, en ocasiones, la preservacin del medio natural no es una estrategia posible, al menos al nivel que sera deseable. Por ejemplo, dado el grado de desarrollo de poblaciones urbanas o agrcolas puede no ser viable la conexin de poblaciones fragmentadas o puede no ser posible destinar a conservacin reas que tienen otros usos. Por otra parte, los problemas de conservacin pueden a veces no estar relacionados con un deterioro del medio.
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En este caso, la disminucin del tamao de una especie (o poblacin) puede ser independiente de una reduccin del hbitat. Existen situaciones en las que el deterioro de una especie se ha dado por un exceso de caza (por la actividad de furtivos), o por problemas sanitarios en la especie en cuestin o en la fuente de su alimentacin. Por estos motivos, es importante reconocer que existen estrategias complementarias de conservacin de biodiversidad. Entre ellas se incluyen la cra en cautividad (que, a veces, se convierte en la nica disponible), el desarrollo de bancos de recursos genticos, y el uso de biotecnologas reproductivas (tambin llamadas de reproduccin asistida). La reproduccin es un fenmeno esencial para la supervivencia de las especies y, por tanto, la biologa y la tecnologa de la reproduccin tienen un papel esencial en la conservacin de la biodiversidad. Existe en la actualidad mucho debate a nivel internacional sobre el papel de los programas de cra en cautividad en los esfuerzos de conservacin. Las opiniones se estn decantando a favor de la utilizacin de estos programas para conocer y comprender mejor los mecanismos de la reproduccin de las especies silvestres y el desarrollo de tcnicas de reproduccin asistida. Solo en situaciones extremas, la cra en cautividad ser la nica esperanza para salvar una especie mediante la reproduccin y reintroducciones subsiguientes. En estas circunstancias, la reproduccin en cautividad de especies muy amenazadas se deber enfrentar a limitaciones en el nmero de individuos disponibles, a problemas de reducida variabilidad gentica y sus consecuencias negativas sobre la futura viabilidad y reproduccin de estos individuos, y a los inciertos resultados de posibles reintroducciones. Sera deseable poder estudiar la biologa de la reproduccin, y desarrollar biotecnologas reproductivas, antes de que las especies silvestres lleguen a una situacin crtica. Esto quiere decir que no debe intervernirse slo cuando las poblaciones estn ya mermadas y las posibilidades de xito son muy reducidas. La World Conservation Union (IUCN) ha reconocido desde hace tiempo el papel de la cra en cautividad como parte de los esfuerzos de conservacin y ha recomendado que los taxones de

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vertebrados con un nmero menor a 1.000 individuos en la naturaleza deben ser considerados como candidatos para la cra en cautividad (IUCN, 1987). En algunos casos, sera deseable abordar el estudio de la reproduccin de especies silvestres antes de que lleguen a este umbral. Adems, esto permitira establecer bancos de germoplasma y de otros recursos genticos que lograran capturar y preservar el mximo de variabilidad gentica de la especie. La cra en cautividad hace posible un buen conocimiento de la biologa de la reproduccin (por ejemplo, la endoncrinologa de los ciclos sexuales y la gestacin, o las caractersticas del semen y el funcionamiento de los espermatozoides), que no son fcilmente accesibles cuando los animales estn libres en la naturaleza. Sin embargo, un programa de cra en cautividad no necesariamente involucra el desarrollo de tcnicas de reproduccin asistida. A pesar de ello, es aconsejable desarrollar estas tecnologas como parte de un programa de cra en cautividad para poder emplear recursos genticos (gametos y embriones) conservados y para estar en posicin de abordar dificultades que puedan existir por incompatibilidad de individuos y en casos de infertilidad. Tambin puede recurrirse al uso de biotecnologas de la reproduccin sin disponer de un sistema de cra en cautividad. Por ejemplo, en casos en los que sea de inters realizar un manejo gentico de poblaciones naturales fragmentadas o en la repoblacin de ambientes en los que hay problemas sanitarios (Roldan, 2003).

14.2. Biotecnologas reproductivas

Las tcnicas reproductivas se han usado desde hace muchos aos en animales domsticos y en seres humanos. Tcnicas como la inseminacin artificial, y la conservacin de semen mediante refrigeracin o congelacin, se emplean de rutina en la industria ganadera desde hace ms de 50 aos. La primera transferencia de embriones se realiz con xito en conejos a finales del siglo XIX. El inters en un uso ganadero llev a un incremento en las investigaciones sobre esta tecnologa en la dcada de los 50s

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con un desarrollo considerable en los 60s y 70s. Es hoy una tcnica de rutina en la industria ganadera. La congelacin de embriones y otras tcnicas relacionadas de manipulacin de los mismos tambin se han puesto a punto hace ya varios aos, con los primeros intentos en animales de laboratorio a comienzos de la dcada de los 70s. La fecundacin in vitro se desarroll en los aos 60 en animales de laboratorio y se emple con xito por primera vez en 1978 en seres humanos y en 1982 en bovinos. La microinyeccin de espermatozoides comenz a experimentarse en los 70s en animales de laboratorio y se emple con xito por primera vez en humanos en el ao 1992. La clonacin por transferencia de ncleo, que comenz a investigarse con anfibios hace ms de 50 aos, se ha ido desarrollando lentamente en animales domsticos durante los 80s y 90s. Estas investigaciones han culminado con el nacimiento de Dolly, el primer animal clonado a partir de clulas obtenidas de un animal adulto (Wilmut et al., 1997), y la clonacin de casi todas las especies domsticas. El uso de estas tecnologas en especies silvestres ha sido limitado, y de ms reciente introduccin. En parte esto se debe a la dificultad de acceder a y manejar estas especies, pero tambin al desconocimiento de aspectos bsicos de su biologa. Los estudios comparados de biologa de la reproduccin han demostrado que existe una gran variabilidad en los patrones reproductivos masculinos y femeninos de diversas especies (incluidos los casos de especies emparentadas). Se observan diferencias entre especies en las caractersticas del semen (por ejemplo, en el nmero de espermatozoides producidos y eyaculados), o en la composicin lipdica de las membranas de los espermatozoides y su susceptibilidad a la congelacin, o la variabilidad en las condiciones que preparan a los espermatozoides para la fecundacin. En cuanto a las hembras, existen variaciones en las caractersticas de los ciclos estrales (ciclos hormonales) y en la maduracin de los oocitos en el ovario, la induccin de la ovulacin, los mecanismos de fecundacin y activacin del desarrollo embrionario, y en la fisiologa de la gestacin. En mamferos, de un total de ms de 4.600 especies, solo se conoce la biologa o patrones reproductivos de una pequea proporcin (tal vez 20 30 especies).

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Por estos motivos, es generalmente difcil extrapolar de una especie a otra a la hora de aplicar tecnologas reproductivas como en el caso de la congelacin del semen, la sincronizacin de los ciclos estrales de las hembras, o la inseminacin artificial (Loskutoff, 1998; Wildt, 1990; Wildt et al., 2001). A pesar de ello, se ha utilizado con xito el principio de los modelos animales con el fin de usar especies ms conocidas de animales domsticos como punto de partida en el desarrollo de tecnologas reproductivas de especies silvestres. Son bien conocidos los casos en los que se han utilizado protocolos de congelacin de semen de bovino para ungulados silvestres, o de gato domstico para felinos en peligro de extincin (Wildt, 1992, 1995). De cualquier manera, es de destacar que no es posible transferir directamente una tecnologa reproductiva de unas especies animales a otras y se hace necesario un proceso de experimentacin preliminar para adecuarlas.

14.3. Cules son las biotecnologas reproductivas que pueden utilizarse para conservar la biodiversidad?
Existe una gran variedad de biotecnologas reproductivas desarrolladas hasta el presente o en proceso de desarrollo. Se presenta a continuacin un resumen de las biotecnologas que se han empleado en animales silvestres (especialmente aquellos en peligro de extincin). Se considerarn estas tecnologas en tres grupos: Primero se resumirn las que pueden denominarse clsicas, pues se encuentran bien desarrolladas en animales domsticos y de compaa, o en la especie humana, y se estn aplicando a especies silvestres desde hace ya varios aos. A continuacin se describirn aquellas nuevas biotecnologas que se encuentran en desarrollo en animales domsticos, y que poseen un enorme potencial en especies silvestres. Finalmente, se presentarn tecnologas futuras que se encuentran en una etapa experimental en animales de laboratorio o domsticos y que, posiblemente, sean de utilidad en la conservacin de especies amenazadas.

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14.3.1. Biotecnologas de la reproduccin clsicas Las tecnologas ms desarrolladas en animales incluyen la obtencin y congelacin del semen, la inseminacin artificial, la transferencia de embriones, incluyendo en este ltimo caso la posibilidad de congelar los embriones y la fecundacin in vitro. 14.3.1.1. Obtencin y congelacin de semen La obtencin de semen en animales silvestres representa en s misma una considerable dificultad. En animales domsticos se ha recurrido al entrenamiento de los machos para poder obtener semen de forma rutinaria mediante el empleo de una vagina artificial. En animales no acostumbrados al manejo humano es necesario recurrir a la obtencin de semen mediante tcnicas de electroeyaculacin bajo anestesia quirrgica. Esta tcnica es segura, con riesgos mnimos, y se ha empleado ya en muchas especies animales. En nuestra experiencia con ungulados no se ha encontrado inconveniente alguno y se ha utilizado en forma reiterada sobre los mismos machos sin consecuencias negativas (Cassinello et al., 1998; Garde et al., 2003), lo cual es importante ya que interesa realizar recolecciones repetidas de cada macho con el fin de conservar un elevado nmero de muestras para su utilizacin futura. Es tambin posible obtener espermatozoides a partir de animales muertos. Pueden recuperarse espermatozoides viables del epiddimo hasta varias horas (o unos pocos das) despus de la muerte. Esta posibilidad tienen grandes ventajas a la hora de conservar material gentico de especies muy amenazadas (como, por ejemplo, el lince ibrico) en las que lamentablemente no es inusual encontrar animales atropellados en las carreteras. Tambin puede ser de gran utilidad para disponer de una buena representacin de germoplasma de especies de las que se obtienen muestras como resultado de actividad cinegtica (por ejemplo, el ciervo ibrico). Los espermatozoides obtenidos del epiddimo pueden suspenderse en una solucin salina o en medio de cultivo y se procesan y emplean de manera similar a los obtenidos mediante electroeyaculacin. Dentro de esta lnea, nuestro grupo de investigacin ha obtenido descendencia viva en ungulados silvestres mediante la aplicacin por inseminacin artifi-

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cial de dosis seminales recuperadas del epiddimo de machos que llevaban muertos ms de 40 horas (Garde et al., 1995). El semen o los espermatozoides obtenidos del epiddimo pueden conservarse mediante congelacin (figura 14.1). Existen diferencias entre especies en la composicin de los lpidos y protenas de las membranas plasmticas de los espermatozoides y ello se traduce en diferencias en la capacidad de los espermatozoides de sobrevivir al proceso de congelacin-descongelacin. Por este motivo, es necesario adecuar los protocolos de congelacin a cada especie mediante ensayos rigurosos en los que se han de examinar los factores que afectan a la crioconservacin, tales como los componentes de la solucin crioprotectora (diluyente) que se adiciona a los espermatozoides (solucin tampn, azcares, glicerol, yema de huevo), el sistema de envasado (pajuelas o pastillas), y las curvas de congelacin y de descongelacin (Garde et al., 2003). La congelacin del material espermtico presenta un gran nmero de ventajas. Entre ellas destacamos las siguientes: preservacin y uso de germoplasma sin limitaciones en el tiempo y en el espacio, prevencin de riesgos sanitarios al poder transportar germoplasma congelado en lugar de trasladar animales vivos, y mejor manejo del espacio ya que permite la conservacin indefinida del material gentico sin necesidad de ocupar grandes espacios en los programas de cra (Watson y Holt, 2001). Adems, permite el intercambio de material gentico entre individuos que estn muy alejados geogrficamente, siendo este hecho de especial inters de cara a disminuir la consanguinidad en poblaciones fragmentadas de especies en peligro de extincin (Gomendio, 2003). Existen programas de investigacin sobre criopreservacin de gametos en zoolgicos y centros de investigacin en varios pases del mundo (Watson y Holt, 2001). Sin embargo, hay solo unas pocas iniciativas de desarrollo integral de bancos de germoplasma (o de recursos genticos) asociados a programas ms amplios de preservacin de variabilidad gentica y de uso de estos recursos genticos como parte de un plan de conservacin de especies silvestres y amenazadas. En la actualidad existe una iniciativa liderada por la Universidad de Monash (Australia) relacionada con

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F IG URA 14.1:

Congelacin de semen de gacela

El semen, obtenido mediante electroeyaculacin bajo anestesia general, es evaluado macro y microscpicamente para estimar su calidad y la cantidad de espermatozoides. Los espermatozoides se diluyen en una solucin con tampn, azcar(es), glicerol y yema de huevo, se envasan en pajuelas, se enfrian y equilibran a 5 C y se congelan en vapores de nitrgeno. Las pajuelas con el semen congelado se almacenan en tanques de nitrgeno lquido.

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conservacin de marsupiales. En Sudfrica, el Wildlife Breeding Research Centre desarrolla un plan de conservacin de gametos de fauna silvestre, mientras que en Namibia, la Smithsonian Institution gestiona un programa de conservacin de gametos de guepardos. En Italia, se ha desarrollado un programa integral de reproduccin asistida y conservacin de recursos genticos en el mufln de Cerdea (Ptak et al., 2002). En Espaa, se encuentran en curso varias iniciativas para desarrollar bancos de recursos genticos de especies silvestres de mamferos. El CSIC tiene en desarrollo un banco de recursos genticos de 3 especies de gacelas norteafricanas. Se han puesto a punto protocolos de congelacin de semen para dos de estas especies (gacela dorcas y gacela dama) y se han de desarrollar investigaciones adicionales para mejorar los mtodos de congelacin de gacela de Cuvier ya que la elevada consanguinidad de esta especie influye negativamente en la calidad del semen (Cassinello et al., 1998; Roldan et al., 1998; Gomendio et al., 2000) y en su criopreservacin (Garde et al., 2003). De igual forma, la Universidad de Castilla-La Mancha lleva trabajando desde el ao 1994 en la mejora de los protocolos de congelacin del semen de ciervo Ibrico de cara a la implementacin de un banco de semen de dicha subespecie (Soler y Garde, 2003; Soler et al., 2003) con el fin de facilitar el intercambio de material gentico entre poblaciones que se encuentran aisladas por vallados. Tambin se encuentra en desarrollo un banco de recursos genticos del lince ibrico como parte del Programa de Cra en Cautividad del Lince Ibrico gestionado por el Ministerio de Medio Ambiente. Adems, y como resultado de una iniciativa conjunta del CSIC y del Ministerio de Medio Ambiente, se est implementando un banco de recursos gentico de especies silvestres prestando especial atencin a mamferos amenazados espaoles. 14.3.1.2. Inseminacin artificial El mtodo ideal de inseminacin artificial consiste en la utilizacin de tcnicas no invasivas para depositar el semen en el tracto genital femenino (vagina o tero). La eficacia de esta tcnica es baja en especies silvestres, especialmente cuando se emplea semen congelado. Presenta adems el inconveniente de ser difcil de emplear en estas especies debido al estrs que se ocasiona con el ma-

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nejo de los animales. Por este motivo se prefiere realizar la inseminacin mediante laparoscopia bajo anestesia general, depositando el semen directamente en los cuernos uterinos (figura 14.2). Para esta tcnica se emplea habitualmente semen congelado. Aunque es posible emplear semen refrigerado (a 5 C), ste puede emplearse slo durante pocos das despus de su recoleccin. La limitacin principal que presenta la aplicacin de la inseminacin artificial en animales silvestres es la escasa informacin existente sobre fisiologa reproductiva femenina. Con el fin de lograr una mejor organizacin de trabajos de inseminacin artificial se recurre a la sincronizacin de los ciclos hormonales de las hembras. Para ello se emplean dispositivos vaginales de liberacin de hormonas esteroides (progesterona), tratamiento luteoltico con prostaglandinas, y gonadotrofinas que inducen la ovulacin. Hay una serie de factores que influyen en el xito de este procedimiento de sincronizacin de celo e inseminacin artificial tales como la duracin del tratamiento, las dosis hormonales y el intervalo entre la finalizacin del tratamiento hormonal y el momento de la inseminacin. Hasta la fecha se ha obtenido descendencia viva mediante el empleo de inseminacin artificial con semen congelado en unas 30 especies diferentes de mamferos, siendo 16 de estas especies silvestres (Holt, 2001). As, se ha conseguido el nacimiento de individuos mediante inseminacin artificial en diferentes especies de ciervos como, por ejemplo, el ciervo de Eld (Monfort et al., 1993), en el que se consigui el nacimiento de gabatos mediante inseminacin artificial laparoscpica. De igual forma se ha empleado la inseminacin artificial unida a la congelacin del semen para la conservacin del turn de patas negras. Por medio de la inseminacin laparoscpica se obtuvieron nuevos individuos en esta especie (Wildt et al., 2001). En cuanto a los felinos salvajes, tan solo se ha obtenido descendencia mediante inseminacin artificial en tres de ellas: puma, tigre y leopardo. La inseminacin vaginal ha sido muy poco satisfactoria en estas especies (Wildt et al., 2001), habiendo reportado mejores resultados la intrauterina. En esta especies la inmovilizacin farmacolgica se hace totalmente necesaria para poder aplicar estas tcnicas de reproduccin artificial, pero ejerce efectos negativos sobre la reproduccin.

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F IG URA 14.2:

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Inseminacin artificial en el ciervo ibrico (Cervus elaphus hispanicus)

La inseminacin de hembras, cuyo ciclo sexual se ha sincronizado mediante tratamiento hormonal, se realiza empleando laparoscopia bajo anestesia general. Los cuernos uterinos se localizan mediante el laparoscopio y el semen descongelado se deposita en ellos utilizando una sonda con inyector. La inseminacin artificial en el ciervo ibrico ha conducido al nacimiento de numerosos gabatos; en la fotografa de la derecha, primer macho obtenido mediante inseminacin artificial con semen congelado.

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14.3.1.3. Obtencin, conservacin y transferencia de embriones La obtencin, conservacin y transferencia de embriones ofrece una ventaja sobre la inseminacin artificial ya que incrementa la contribucin gentica de las hembras al producto final de la gestacin, adems de reducir notablemente el intervalo generacional, de modo que permite de una forma potencialmente ilimitada la renovacin de animales. En especies silvestres, si bien existen trabajos que demuestran la existencia de nacimientos de nuevos individuos despus de la obtencin y transferencia de embriones, particularmente en algunas especies de ungulados, la mayora de estos hechos representan casos aislados. La mayor limitacin de esta tcnica en animales silvestres ha sido la necesidad de recurrir a tratamientos de superovulacin (para incrementar el nmero de embriones obtenidos) lo que se logra utilizando gonadotrofinas exgenas. La respuesta ovrica a estos tratamientos es muy variable en especies silvestres, probablemente debido al estrs ocasionado sobre los animales durante las manipulacin antes de la recoleccin de los embriones. Adems, en algunas especies el empleo de estos tratamientos de superovulacin ocasiona la produccin de anticuerpos neutralizantes que atenan la respuesta ovrica a los tratamientos posteriores. Asimismo, la tcnica de transferencia de embriones involucra otros aspectos tales como la recoleccin de los embriones, que ha de hacerse por va quirrgica, o laparoscopia, bajo anestesia general, la manipulacin, evaluacin y seleccin de los embriones, en condiciones e instalaciones adecuadas, y la transferencia a hembras receptoras sincronizadas hormonalmente con las hembras de las que se obtienen los embriones. A pesar de estos inconvenientes, en algunas especies la transferencia de embriones se presenta como la nica posibilidad para mantener la variabilidad gentica dentro de las poblaciones de animales. En particular, y cuando el nmero de individuos existentes es muy limitado, ha de recurrirse a la transferencia de embriones a una especie diferente (transferencia embrionaria interespecfica). El xito de la transferencia interespecfica depende, en gran medida, de que la eleccin de la combinacin donante-receptora sea la acertada. Se

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han obtenido nacimientos en un variado nmero de especies de animales salvajes mediante la aplicacin de esta tcnica. As, se han transferido embriones de gaur o de banteng a vacas domsticas, de bongo a eland, de mufln y ovejas de Armenia a ovejas domsticas, de zebra de Grant y de caballo de Przewalski a yeguas domsticas, de gato del desierto de la India y gato salvaje africano a gatos domstico, de cabras salvajes a domsticas, y entre distintas familias de antlopes africanos (figura 14.3) (revisiones en Garde et al., 1996; Loskutoff, 2003). A pesar de estos xitos, se han observado casos de reabsorciones tempranas de los embriones heterlogos, abortos tardos de los fetos (Summers et al., 1987), algunas malformaciones en fetos abortados (Buckrell et al., 1990), o problemas en las hembras receptoras durante la gestacin. Una parte de estas prdidas en la gestacin puede estar relacionadas con incompatibilidades inmunolgicas. Por ello, un mejor conocimiento de los mecanismos bsicos responsables de los fallos de la transferencia embrionaria interespecfica ayudar al desarrollo con xito de estos programas de reproduccin asistida. Este conocimiento tambin sern de utilidad en futuros programas de clonacin en los que ha de emplearse una transferencia interespecfica. La congelacin permite la conservacin de embriones de varias especies de mamferos sin que pierdan su potencial de desarrollo. El uso de embriones congelados permite emplear eficientemente donantes y receptoras, otorgando mayor flexibilidad en la utilizacin de las hembras. Tambin posibilita transferir algunos embriones, una vez recolectados, y conservar el resto en bancos de germoplasma. Se puede con esto tambin controlar aspectos sanitarios. Existe abundante experiencia en congelacin de especies domsticas (ver Cabodevila y Teruel, 2001) y una experiencia algo ms limitada en especies silvestres (Leibo y Songsasen, 2002; Loskutoff, 2003).

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F IG URA 14.3:

Transferencia embrionaria interespecfica

Arriba, transferencia entre bongo y eland. Abajo, transferencia de embriones de gato salvaje a gato domstico (Fotos: Audubon Nature Institute, New Orleans, Louisiana, USA).

14.3.1.4. Fecundacin in vitro Aunque podra pensarse que la fecundacin in vitro es una tcnica demasiado compleja para aplicar a animales silvestres, su desarrollo presenta un gran nmero de ventajas frente a las biotecnologas reproductivas mencionadas en los prrafos precedentes. Por una parte, reduce la necesidad de controlar la reproduccin de la hembra para obtener oocitos, permite la obtencin de un mayor nmero de embriones que con la superovulacin de las hembras donantes, posibilita la obtencin de descendencia a partir de animales con ciertos problemas de infertilidad, y reduce el nmero de espermatozoides viables necesarios para fecundar en comparacin con la inseminacin arti-

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ficial o la monta natural. Adems, y no menos importante, permite la fecundacin de gametos (conservados en forma congelada) cuya combinacin se estime ms oportuna segn los programas de conservacin de recursos genticos. Se ha obtenido descendencia viva a partir de embriones generados in vitro en felinos, en primates y en ungulados (Donoghue et al., 1990; Wildt et al., 1990; Loskutoff, 2003). En varios casos, los embriones fueron generados in vitro a partir de oocitos madurados in vitro. Tambin se ha conseguido la obtencin de nuevos individuos a partir de la transferencia de embriones producidos mediante fecundacin, y criopreservados. La produccin in vitro de embriones de especies no domsticas est en la actualidad pendiente de la adaptacin de los modelos desarrollados para tal fin en el hombre y en los animales domsticos y de laboratorio (Loskutoff y Betteridge, 1993). Una de las limitaciones ms importantes para la aplicacin con xito de esta tecnologa en animales silvestres es la consecucin de mtodos adecuados para mimetizar in vitro el proceso que prepara al espermatozoide para participar en la fecundacin (proceso conocido como capacitacin) y que tiene lugar en el tracto genital femenino. Las condiciones fisiolgicas necesarias para la fecundacin varan entre especies y por tanto son difciles de mimetizar en una incubacin in vitro. Otro factor limitante en la produccin in vitro de embriones es que stos son mucho ms sensibles a los procesos de criopreservacin que los obtenidos in vivo (Leibo y Loskutoff, 1993; Leibo y Songsasen, 2002) lo que puede limitar su utilizacin futura. 14.3.2. Nuevas biotecnologas de la reproduccin Existen biotecnologas reproductivas que se han comenzado a utilizar con animales domsticos en forma experimental y que, aunque no tienen an una utilizacin generalizada, se muestran muy atractivas para un uso futuro. La posible utilizacin en animales silvestres redundar en beneficios para programas de reproduccin asistida.

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14.3.2.1. Preseleccin de sexo, mediante separacin de espermatozoides X e Y Existe desde hace dcadas un inters marcado por lograr la eleccin del sexo de la descendencia (Seidel y Johnson, 1999). En especies domsticas, este logro contribuir sustancialmente a facilitar el manejo y hacer ms eficiente el uso de los recursos ganaderos ya que se lograra producir animales del sexo de inters (por ejemplo, hembras en ganado lechero) (Seidel, 2003). En un programa de cra en cautividad de especies silvestres, la posibilidad de seleccin el sexo de las cras podra contribuir sustancialmente a un mejor aprovechamiento del espacio disponible para alojamiento del animales y a una mejor programacin gentica de conservacin. No se han presentado, hasta el presente, resultados de seleccin de sexo en especies silvestres. Si bien es posible seleccionar el sexo de los embriones antes de la transferencia (mediante biopsia de blastmeros y diagnstico empleando tcnicas de biologa molecular), este mtodo presenta muchos inconvenientes para su uso en especies silvestres por la necesidad de infraestructura compleja y la baja eficiencia del mtodo. Por otra parte, la preseleccin de sexo mediante separacin de espermatozoides portadores de cromosomas X o Y, y su uso posterior en inseminacin artificial o fecundacin in vitro, presenta una opcin ms atractiva y accesible. La determinacin del sexo est relacionada con la presencia de los cromosomas sexuales. En mamferos los vulos portan un cromosoma X, mientras que la mitad de los espermatozoides portan un cromosoma X y la otra mitad un cromosoma Y. La formacin de un embrin con un complemento XX resulta en una hembra, mientras que un embrin <SXY da origen a un macho. Existen diferencias en el tamao, y por tanto, en la cantidad de ADN que tienen los cromosomas X e Y. El cromosoma X es mayor que el Y, y esta diferencia puede llegar a ser de ms de un 10% en algunas especies. Sobre esta base, los espermatozoides pueden separarse midiendo la cantidad de ADN (mediante tincin con un colorante fluorescente) y clasificacin mediante un equipo de citometra de flujo. Esta es la nica tcnica que, en la actualidad, permite una separacin fiable de espermatozoides con un tipo u otro de cromosomas y que ha de-

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mostrado la posibilidad de obtener descendencia del sexo deseado en animales y seres humanos (Johnson y Welch, 1999; Fugger, 1999). Existen an algunos problemas tcnicos relacionados principalmente con la velocidad a la que se realiza la separacin de espermatozoides, lo que limita el uso que puede hacerse de ellos y se debe recurrir a la inseminacin artificial por laparoscopia. Se encuentran en desarrollo mtodos para realizar inseminacin artificial convencional con un nmero reducido de espermatozoides preseleccionados. Adems, existe la posibilidad de emplear estos espermatozoides preseleccionados a travs de fecundacin in vitro, o microinyeccin de espermatozoides. 14.3.2.2. Microinyeccin de espermatozoides Existen situaciones en las que slo se dispone de pocos espermatozoides o de espermatozoides de mala calidad (con anormalidades morfolgicas o motilidad limitada) con escasas posibilidades de fecundar si se emplean en inseminacin artificial. Estas situaciones pueden darse con machos muy consguineos que tienen mala calidad seminal (Roldan et al., 1998; Gomendio et al., 2000), o cuando el semen de un macho tiene una supervivencia reducida a un proceso de criopreservacin (Garde et al., 2003). Tambin existen procedimientos, como la preseleccin de sexo, que resultan en un nmero limitado de espermatozoides. A su vez, en el caso de emplear maduracin in vitro de oocitos (ver ms abajo), o la congelacin de oocitos maduros, han de emplearse mtodos de fecundacin asistida in vitro para generar embriones. La microinyeccin intracitoplsmica de espermatozoides (ICSI, en su acrnimo en ingls), permite la inyeccin de un solo espermatozoide en el interior del vulo (figura 14.4). Adems de permitir un aprovechamiento considerable de los escasos espermatozoides que pueden estar disponibles, tiene la ventaja adicional de que para su empleo no es necesario preincubar los espermatozoides para que experimenten los procesos de preparacin para la fecundacin que tienen lugar en el tracto genital femenino (capacitacin), y que son necesarios para la fecundacin in vitro.

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F IG URA 14.4:

Inyeccin intracitoplasmtica de un espermatozoide (ICSI)

El espermatozoide es aspirado en una micropipeta y es inyectado en el interior del vulo. El vulo est sujetado por otra pipeta de mayor tamao y se le ha despojado del cumulus oophorus antes de la micromanipulacin. La puncin con la micropipeta activa al vulo para completar su meiosis y formar el proncleo femenino. La cabeza del espermatozoide se descondensa y forma el proncleo masculino.

La tcnica de microinyeccin de espermatozoides se ha aplicado con xito en animales de laboratorio (Yanagimachi, 2001), animales domsticos (Iritani et al., 1998; Pope, 2000) y en seres humanos (Van Steirteghem et al., 1993). An no se ha empleado esta tecnologa en animales no domsticos, con excepcin de algunos primates (Iritani et al., 1998). 14.3.2.3. Congelacin de oocitos. Maduracin in vitro de oocitos As como la congelacin espermatozoides permite la conservacin de los recursos genticos masculinos, la congelacin de vulos permitira conservar y utilizar los recursos genticos femeninos. Pero, si bien la produccin de espermatozoides es abundante y ms o menos continua (excepto en los casos de una disminucin por reproduccin estacional) en las hembras la produccin de gametos es limitada y tiene un carcter cclico controlado por ciclos hormonales. Esto lleva a la necesidad de cono-

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cer y manipular los ciclos sexuales con el fin de incrementar la produccin de gametos femeninos. Tambin se ha de considerar la posibilidad de conservar trozos de ovarios (por ejemplo, de animales muertos) para lo que ser necesario disponer de mtodos de maduracin in vitro de oocitos. En la actualidad, existen dificultades para la criopreservacin de vulos (oocitos maduros) de las especies de mamferos, con excepcin de ratones (Shaw et al., 2000) y posiblemente humanos (Critser et al., 2003; Gosden 2003), y se considera an una tcnica en experimentacin. La supervivencia de los oocitos maduros es extremadamente variable, segn las tcnicas utilizadas, y est influida por una serie condiciones (por ejemplo, tipo de crioprotector, presencia de clulas foliculares). Los principales factores que afectan la congelacion estn relacionados con un deterioro del citoplasma o la produccin de anormalidades cromosmicas durante el proceso de criopreservacin. Es posible, como en el caso de criopreservacin de espermatozoides, que existan diferencias entre especies en la susceptibilidad de los oocitos a la congelacin-descongelacin y se anticipa que ser necesario realizar estudios para conocer las mejores condiciones de congelacin de vulos de las diversas especies. Se ha postulado que la congelacin de los gametos femeninos en estadios ms tempranos del desarrollo podra evitar los daos cromosmicos. Adems, en ocasiones, es posible que los nicos gametos femeninos disponibles sean aquellos obtenidos de hembras jvenes, o muertas y que por ello sean inmaduros. Esto crea la necesidad de disponer de un sistema eficiente de maduracin in vitro de los oocitos y de fecundacin in vitro o microinyeccin de espermatozoides. La maduracin in vitro de oocitos puede realizarse empleando diversos mtodos segn el objetivo buscado y el estadio de desarrollo folicular del que se parte (Eppig, 2003). La maduracin in vitro puede, de hecho, realizarse desde estadios muy tempranos (folculo primordial), completando todo el proceso de maduracin in vitro; sin embargo, es posible que el cultivo in vitro durante un periodo tan prolongado ocasione anormalidades en la vida postnatal (Barnes, 2003). Tambin existe la posibilidad de congelar trozos de tejido ovrico y, en lugar de madurar los oocitos in vitro, realizar un in-

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jerto en otra hembra de la misma especie o de otra especie (debiendo, en este caso, solventar los problemas de rechazo inmunolgico mediante el uso de ratones o ratas inmunodeprimidos). Pueden conservarse los ovarios enteros (en casos de rganos de pequeo tamao) o trozos finos en casos de tamao mayor. La mejora en los procesos de congelacin automtica, en los conocimientos tericos sobre criopreservacin y la disponibilidad de nuevos crioprotectores ha conducido al xito en la congelacin de tejido ovrico de varias especies de laboratorio, ovejas, vacas, y humanos (Gosden, 2003). Se han obtenido cras vivas en ratas, ratones y ovejas mediante concepcin natural despus de trasplante de tejido ovrico criopreservado (Shaw y Cox, 2003). Adems, se ha realizado xenotransplante de tejido ovrico de animales silvestres (elefantes, marsupiales) a ratones o ratas inmunodeficientes con un subsiguiente desarrollo de folculos ovricos y maduracin de oocitos in vivo (Gunasena et al., 1998; Mattiske et al., 2002). En modelos animales se ha demostrado que los oocitos obtenidos despues de un xenotransplante y maduracin in vivo, pueden fecundarse mediante microinyeccin espermtica y desarrollar a trmino (Snow et al., 2002). Estas opcin de conservacin de recursos genticos femeninos tiene evidentemente un gran potencial en especies silvestres. 14.3.3. Biotecnologas de la reproduccin futuras Existen nuevas tcnicas, an en fase experimental, que son potencialmente de inters o utilidad y que se estn ensayando con animales de laboratorio, o en animales domsticos. 14.3.3.1. Obtencin, conservacin y trasplante de espermatogonias. Espermatognesis in vitro Una reserva de espermatozoides congelados puede agotarse si se usan todas las dosis de semen existentes. En determinados programas de conservacin puede interesar conservar por muchos aos el material gentico de los fundadores o de algunos individuos en particular, y la limitacin de las dosis de semen puede ser un problema. Adems, cuando se accede a material proveniente de animales muertos, solo existe una cantidad limitada de espermatozoides que pueda conservarse. Por otra parte,

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el material preveniente de animales muertos puede haberse obtenido (en caso de atropellos en carretera) en epoca no reproductiva (si la especie tiene reproduccin estacional) y no ser posible en estos casos obtener espermatozoides. En los casos anteriores sera deseable poder conservar clulas primitivas, espermatogonias o espermatocitos, de la lnea germinal masculina que se encuentran en el testculo (las espermatogonias son las clulas madre de la lnea celular que dar origen a los espermatozoides). Para ello, sera necesario aislarlas del testculo y congelarlas en condiciones adecuadas. Para su empleo existiran varias posibilidades. Por una parte, las espermatogonias se podran transplantar al interior de los tbulos seminferos de los testculos de animales huspedes de su misma especie (aunque esto presenta dificultades si la especie est amenazada, y el riesgo de un rechazo inmunolgico) o se podran trasplantar a los tbulos seminferos de los testculos de otra especie diferente. En este ltimo caso sera necesario evaluar cul es la especie ms adecuada. Hay experiencias en roedores de laboratorio en los que ha sido posible trasplantar espermatogonias de rata o hamster a ratn y lograr produccin de espermatozoides de stos en el husped (Clouthier et al., 1996; Ogawa et al., 1999). En animales menos relacionados genticamente, las posiblidades de xito son menores (Reis et al., 2000; Dobrinski et al., 1999, 2000; Nagano et al., 2001), aunque se ha informado sobre algn xito (Sofikitis et al., 2003). Otra posibilidad, segn investigaciones recientes, es la de trasplantar trozos de tejido testicular (sin necesidad de separar y aislar las espermatogonias) al testculo de individuos de la misma o de otra especie (Honaaramooz et al., 2002; Schlatt et al., 2002, 2003). Estos estudios han demostrado que es posible obtener espermatozoides a partir de un testculo transplantado y que dichos espermatozoides son capaces de fecundar y generar cras vivas. Otra opcin posible es el cultivo de las espermatogonias o espermatocitos en el laboratorio, bajo condiciones que permitieran la diferenciacin in vitro, es decir, la especializacin y formacin de las clulas espermticas, incluyendo el proceso de meiosis in vitro. Se ha logrado mantener en cultivo espermatogonias de ratn durante varios meses (Nagano et al., 1998) y tam-

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bin es posible conservarlas mediante criopreservacin (Avarbock et al., 1996). En cuanto a la posibilidad de lograr una meiosis y diferenciacin in vitro, se presentan ms complicaciones y el xito es an limitado (Jegou et al., 2003; Parks et al., 2003). Investigaciones muy recientes han logrado, mediante la utilizacin de nuevos procedimientos, mantener en cultivo durante varias semanas a clulas germinales (pre-espermatogonias) procedentes de terneros recin nacidos; estas clulas lograron experimentar la meiosis in vitro y dar origen a espermtidas (Lee et al., 2001). Cuando estas espermtidas se microinyectaron a vulos, se obtuvieron blastocistos diploides (Parks et al., 2003). 14.3.3.2. Clonacin por transferencia de ncleo Esta tcnica ha despertado mucho inters recientemente (Critser et al., 2003). Tiene evidentes aplicaciones en industria ganadera, ya que permitira la propagacin de individuos genticamente superiores, o en la produccin de animales modificados genticamente para produccin de frmacos de uso humano. Existe abundante debate sobre la posible aplicacin de la clonacin a la conservacin de especies en peligro de extincin. Se ha planteado su posible uso para rescatar o resucitar especies ya extinguidas como el tigre de Tasmania, el mamut, o el bucardo. En los primeros casos, el planteo es, incluso desde el punto de vista conceptual, muy arriesgado porque propone utilizar ADN conservado en museos o en muestras congeladas para regenerar estas especies siguiendo el estilo de Parque Jursico. Esta posible solucin es tcnicamente muy difcil, dado el mal estado de conservacin del ADN y la necesidad de restaurar ese ADN para que sea funcional. En el caso del bucardo, existen clulas congeladas, lo que hace factible, desde el punto de vista tcnico, la posibilidad de obtener clones empleando vulos y nodrizas de una especie de cabra emparentada genticamente. Pero, en este caso, existen clulas conservadas slo de una hembra (la ltima sobreviviente) y, por tanto, el futuro que se propone es el de un rebao de animales idnticos de un solo sexo. Por tanto, si bien tcnicamente sera posible lograr algunos clones y regenerar la especie el valor de este esfuerzo para la conservacin es muy cuestionable.

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Dejando a un lado los casos mencionados anteriormente, que constituiran en realidad un ejemplo de artilugio cientfico, merece la pena considerar si existe algn mrito en la propuesta de utilizar la clonacin en especies en peligro de extincin. El debate sobre este tema se centr inicialmente alrededor del argumento de que esta tcnica podra conducir a una reduccin de la variabilidad gentica. Esto podra ser as si solo se utilizara la tcnica para producir, como se ha mencionado en el caso del bucardo, rebaos de animales idnticos. Sin embargo, las opiniones actuales reconocen que la clonacin podra ser de enorme utilidad en los esfuerzos de conservacin, justamente para preservar e incluso incrementar la variabilidad gentica de las poblaciones. Mediante la clonacin se podra evitar que se pierdan genotipos nicos o muy valiosos, o para reproducir animales sin extraerlos de la naturaleza (ver Lanza et al., 2000a; Amato, 2002; Wilson, 2002). Imaginemos una especie en la naturaleza con pocos individuos, o un programa de cra en cautividad con un nmero lmitado de animales. Para el momento en que seamos capaces de corregir los problemas relacionados con el hbitat, o conozcamos cmo reproducirles en cautividad, pueden haber pasado muchos aos y durante ese tiempo varios animales habrn muerto. Si se conservan clulas de esos animales, se podrn recuperar en un futuro los animales perdidos, recuperando tambin un patrimonio gentico valioso. Tambin cabe otra alternativa dentro de un programa de cra en cautividad. A travs de la clonacin podran establecerse varios ncleos reproductivos en diferentes lugares (lo que adems servira de prevencin contra catstrofes). Esto permitira incrementar el nmero de descendientes e intercambiar animales mediante un adecuado programa gentico de apareamientos o reproduccin asistida. En los casos de especies en estado crtico, en las que no es deseable extraer muchos individuos de las poblaciones naturales, podran obtenerse clulas de los animales en libertad y generar clones para introducir en los programas de cra en cautividad y para generar nuevas poblaciones all donde desaparezcan. Finalmente, en aquellas especies en inminente peligro de extincin, la clonacin permitira recuperar a los individuos que mueren antes de poder reproducirse, como es el

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caso de los machos jvenes de lince que al dispersarse mueren con frecuencia atropellados. Se han clonado ya varias especies de animales domsticos y de laboratorio (Cibelli et al., 2002): ovejas, ratones, vacas, cabras, cerdos, gatos, conejos, y equinos (caballo y mula). Se ha demostrado que es posible otener clones de especies amenazadas mediante la utilizacin de la transferencia de ncleo interespecfica. Con este mtodo se ha logrado obtener clones de gaur (Lanza et al., 2000b) y de mufln de Cerdea (Loi et al., 2001) (figura 14.5), adems de intentos en otras especies como el oso panda (Chen et al., 1999) y el argali (White et al., 1999). Una de las dificultades principales para poder implementar la clonacin en especies silvestres es la limitacin en la provisin de vulos, por lo que debe recurrirse a la utilizacin de vulos de otras especies. La compatibilidad entre las especies puede limitar considerablemente el xito de la transferencia de ncleo (Dominko et al., 1999). Antes de poder utilizar esta tecnologa en forma generalizada quedan por resolver varios aspectos metodolgicos. La tcnica consiste en la obtencin de clulas somticas (por ejemplo, de piel o msculo) del individuo que se desea clonar y la transferencia de los ncleos de estas clulas a vulos a los que previamente se les ha extrado su dotacin cromosmica (figura 14.6). Las clulas somticas pueden emplearse frescas y cultivarse brevemente in vitro, o pueden provenir de colecciones de tejidos de bancos de recursos genticos. Los vulos pueden obtenerse mediante superovulacin de hembras donantes o mediante maduracin in vitro de oocitos obtenidos de ovarios provenientes de matadero. La transferencia del ncleo puede hacerse mediante microinyeccin, directamente en el interior del vulo, o mediante electrofusin entre la clula somtica y el vulo. El desarrollo embrionario se activa mediante estmulos qumicos o elctricos. Los embriones obtenidos se incuban unos pocos das para verificar su desarrollo y se transfieren a una madre nodriza para que continen su desarrollo. El xito de la tcnica es an muy bajo: suelen nacer aproximadamente un 2% de cras (calculado a partir del total de vulos microinyectados). Tambin se han verificado anormalidades en algunos de los clones que han sobrevi-

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F IG URA 14.5:

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Clones de especies amenazadas obtenidos por transferencia de ncleo interespecfica

Arriba, izquierda, clon de gaur (Bos gaurus) obtenido utilizando vulos de vaca y gestado por una vaca nodriza (Foto: Advanced Cell Technology, Worcester, Massachusetts, USA). Arriba, derecha, clon de banteng (Bos javanicus) (Foto: Advanced Cell Technology, Worcester, Massachusetts, USA), Abajo, izquierda: clon de mufln (Ovis gmellini musimon) concebido empleando vulos de oveja y gestado en un oveja domstica (Foto: Paqualino Loi y Grazyna Ptak, Universit di Teramo, Italia). Abajo, derecha: clon de gato salvaje africano (Felis sylvestris) (Foto: Martha Gomez, Audubon Nature Institute, New Orleans, Lousiana, USA).

vido. Existen una serie de factores que afectan al desarrollo de los clones, tanto tcnicos como biolgicos. Se espera que una mejora de los mtodos de preparacion de ncleos y de micromanipulacin y activacin, as como un mejor conocimiento de los procesos de reprogramacin del ncleo una vez transferido al vulo, incrementarn el xito de esta tcnica.

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F IG URA 14.6:

Tcnica de clonacin por transferencia de ncleo

14.4. Conclusiones
Existen en la actualidad una variedad de biotecnologas reproductivas que pueden aplicarse a la conservacin de especies en peligro de extincin. La conservacin de germoplasma, principalmente espermatozoides, mediante congelacin, hace posible el establecimiento de bancos que permiten preservar la variabilidad gentica actual. La congelacin de vulos es una opcin muy atractiva para el futuro porque nos dar la oportunidad de maximizar la conservacin de los recursos genticos incluyendo tambin los gametos femeninos. La utilizacin de gametos criopreservados podr hacerse a travs de una variedad de tcnicas, tales como la fecundacin in vitro o la microinyeccin de espermatozoides, adems de la transferencia de los embriones obtenidos. Para el futuro un poco ms distante se vislumbran otras tecnologas que ayudarn enormemente en el esfuerzo de conservacin. Entre ellas pueden considerarse la preseleccin de sexo mediante separacin de espermatozoides X e Y, la transferencia de espermatogonias o el trasplante de injertos testiculares, la maduracin in vitro de oocitos o el trasplante de ovario. Finalmente, la clonacin por transferencia de n-

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cleo proveer una herramienta muy valiosa para el manejo gentico de las poblaciones amenazadas. Para la utilizacin posible de estas tecnologas reproductivas habr que tener presente que es necesario conocer en ms profundidad la fisiologa de la reproduccin de las especies silvestres y, en este sentido, los programas de cra en cautividad estn llamados a desempear un papel muy importante en la adquisicin de este conocimiento. Sera vano pensar que las biotecnologas reproductivas pueden resucitar especies ya extinguidas. Tambin sera un error creer que las biotecnologas reproductivas pueden ayudar a evitar la desaparicin de especies mediante la sustitucin extensiva de poblaciones naturales por poblaciones mantenidas en cautividad. Sin embargo, dichas biotecnologas ya han demostrado su utilidad a la hora de recuperar especies que no podan salvarse por s mismas de la extincin, ya sea porque haban alcanzado un nmero muy bajo de individuos, o porque la fragmentacin de las poblaciones en ncleos pequeos y aislados haba conducido a un aumento de la consanguinidad tal que impeda la reproduccin natural. Es bien conocido, por ejemplo, del uso de biotecnologas reproductivas en el programa de cra en cautividad y reintroduccin del turn de patas negras (Howard et al., 2003) que ha permitido recuperar exitosamente una poblacin sostenible a partir de tan solo 18 individuos rescatados al borde de la extincin. De cualquier manera, el desarrollo y la aplicacin de las biotecnologas reproductivas es an limitado, por lo que es de esperar que su potencial para recuperar especies en peligro de extincin genere un mayor reconocimiento y apoyo al papel que pueden jugar en la conservacin de la biodiversidad.

14.5. Agradecimientos
El trabajo de los autores est financiado por el Ministerio de Ciencia y Tecnologa, el Instituto Nacional de Investigacin Agraria y Alimentaria, la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha, la Comunidad de Madrid y el Consejo Superior de Investigaciones Cientficas.

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