Practica 2

Facultad de Ciencias Departamento de Qumica Analtica Prcticas de Qumica Analtica IV Grado en Qumica
Campus Universitario Puerto Real Avenida Repblica Saharaui, s/n 11510 Puerto Real (Cdiz) Tel. 956016364. Fax. 956016460
PRCTICA
2
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE PIGMENTOS DE ALGAS MARINAS
Estrella Espada Bellido, Laura Cubillana Aguilera, Gerardo Fernndez Barbero y Jos Mara Palacios Santander OBJETIVOS DE LA PRCTICA
Los objetivos fundamentales de la prctica incluyen: Aprendizaje de la tcnica de cromatografa en capa fina y su utilizacin. Conocimiento de conceptos cromatogrficos: polaridad, fase mvil, fase estacionaria, factor de retencin, etc. Identificar los pigmentos presentes en las algas a estudiar.
FUNDAMENTO TERICO Para poder captar la energa del sol, las plantas requieren de pigmentos, los cuales adems les dan el color caracterstico. Las clorofilas y carotenoides son los principales pigmentos fotosintticos, estando implicados tanto en la propia captacin de la luz como en actividades fotoprotectoras, caso de algunos carotenoides. Las clorofilas y carotenoides de algas tienen una importancia adicional, pues se utilizan como criterio taxonmico. Baste como ejemplo recordar la nomenclatura utilizada en su clasificacin (algas rojas Rhodophyta-, algas verdes Chlorophyta-, algas pardas Phaeophyta-, etc.). La simple observacin visual no es adecuada para la determinacin del perfil pigmentario del alga, debido a fenmenos de enmascaramiento, a pequeas variaciones cuantitativas y al hecho de que casi todos los carotenoides son aproximadamente naranja-amarillentos y las clorofilas, verdes. Por ello se hace necesaria utilizar una tcnica semipreparativa de separacin de los pigmentos, sencilla, rpida, eficaz y por supuesto reproducible. La cromatografa en capa fina (CCF o TLC Thin Layer Chromatography-) se ajusta a estos requisitos, y por ello es utilizada de manera general para tal fin. Posteriormente, cada banda separada puede rasparse y eluirse de la placa con un disolvente apropiado (acetona, frecuentemente), para mejorar su pureza si se cree necesario o directamente para
identificar los compuestos aislados, mediante anlisis espectroscpico y pruebas especficas. Los pigmentos de las algas. Los pigmentos son compuestos qumicos que reflejan solamente ciertas longitudes de onda de la luz visible que incide sobre ellos, circunstancia que les da su carcter coloreado. Pero lo ms interesante es su capacidad para absorber energa en el resto del espectro visible. A travs de la fotosntesis, los organismos que los poseen consiguen su alimento, siendo llamados por ello auttrofos. Entre estos se encuentran las plantas, las algas y las cianobacterias. Sin embargo, puesto que cada pigmento es reactivo slo para un estrecho margen de longitudes de onda del espectro, es comn que estos organismos auttrofos produzcan varias clases de pigmentos de distintos colores y caractersticas de absorcin. Existen tres clases de pigmentos: Las clorofilas son los pigmentos verdes, encargados de la captacin de luz y de la transformacin de sta en energa qumica (funciones fotorreceptora y fotosinttica). La molcula cuenta con 4 anillos pirrlicos unidos formando un ncleo al que se le llama porfirnico (semejante al hemo), el cual quelata un tomo de Mg central mediante puentes establecidos con los nitrgenos pirrlicos. Adems posee dos grupos ster: uno fitol (responsable del carcter hidrofbico de la molcula y de su solubilidad en disolventes orgnicos tales como ter etlico, etanol, acetona, cloroformo y benceno) y uno metilo. Los tipos de clorofilas se diferencian estructuralmente segn sea la sustitucin del grupo R-, condicionando esto el nmero de dobles enlaces conjugados y por ende, su color. La ms importante es la clorofila a, pues es la que hace posible la fotosntesis, y por ello es comn a plantas, algas y cianobacterias.
CH2 CH R CH3 H3C N Mg C H3 N H3C H H2C CH2 COOfit o l H C OOC H3 N C H3 N C2 5 H C H2 H C C CH2 (CH2 C H2 C H CH2) 3 H
Grupo fitol
Clorofila
Los pigmentos cloroflicos son de naturaleza lbil. Habituales compuestos de degradacin de las clorofilas en condiciones no drsticas son: feofitinas (magnesio central sustituido por protones, en condiciones de ligera acidez), clorofilidas (desesterificacin del grupo fitol, no prosttico, por accin de clorofilasas, lo que incrementa significativamente la polaridad del resto prosttico), y feoforbidas (por sustitucin del magnesio central de clorofilidas por protones, en medio ligeramente cido). Los carotenoides son los pigmentos rojos, naranjas y amarillos. La energa luminosa que absorben la transfieren a la ruta fotosinttica a travs de las clorofilas.
Los carotenoides suelen ser -caroteno molculas de 40 tomos de carbono, constituidas por una cadena central C18, con -caroteno 4 radicales metilo laterales, en cuyos HC OH CH CH extremos se sitan los grupos (en anillo o H C CH abiertos) que distinguen los distintos CH CH CH CH CH lutena carotenoides. Son molculas poliinsaturadas, HO con numerosos dobles enlaces conjugados, y esta caracterstica es la responsable de su intensa coloracin. La configuracin natural ms frecuente es la trans-.
C H3 H2C H2C C H3 C CH3 C H3 C H3 CH3 C H3 C H3 C H2 C H2 C C C CH3 H3C C H2 C H2
Son insolubles en agua y solubles en grasas y disolventes orgnicos. Segn sus caractersticas de solubilidad se dividen en carotenos (hidrocarburos solubles en ter de petrleo) y xantfilas (derivados oxigenados de los carotenos, solubles en disolventes ms polares, tal como etanol). Es aceptada la idea de que slo en una pequea proporcin, estos pigmentos sufren reacciones degradativas con formacin de productos tambin coloreados, no detectables en anlisis de carotenoides. Sin embargo, la destruccin del pigmento puede tener efectos cuantitativos de extensin considerable. Una dbil acidez puede provocar reacciones de isomerizacin cis/trans. La caracterstica labilidad del esqueleto C40, con alto grado de insaturacin, se ve incrementada en condiciones oxidativas, de origen enzimtico o medioambiental, conduciendo a productos oxidados incoloros. Por ltimo, las ficobilinas son pigmentos solubles en agua, menos generalizados que los anteriores. Existen en cianofitas y algas rojas. Ficocianina es el pigmento azulado que da su nombre al primer grupo, y ficoeritrina es el rojo que colorea las rodofitas. Las macroalgas (pluricelulares) que podemos encontrar en ambientes marinos pertenecen a tres grupos (dejando aparte algunos acmulos de cianofitas procariotasque pueden llegar a ser macroscpicos): verdes, rojas, y pardas. Las algas verdes tienen la misma bioqumica que las plantas superiores, y los mismos pigmentos. Aunque puede haber variaciones menores entre los grupos dentro de las algas verdes, predominan las clorofilas a y b, y como carotenoides principales la lutena y - y -carotenos. Las algas rojas tienen clorofila a y probablemente d (se sigue discutiendo si es o no un artefacto) y ficobilinas (ficoeritrina, concretamente). Las algas pardas tienen clorofilas a y c, y entre los carotenoides, adems de -caroteno, pueden presentar varias xantfilas. En las siguientes tablas se muestran las caractersticas de los pigmentos ms significativos en algas verdes y pardas, las que sern utilizadas en esta ocasin en el laboratorio, adems de sus posibles productos de degradacin.
COMPUESTO DE DEGRADACIN feofitina a feofitina b clorofilida a clorofilida b feoforbida a feoforbida b
COLOR gris marrn verde azulado verde amarillento gris marrn
UV254 Fluorescencia rosa Fluorescencia rosa Fluorescencia rosa Fluorescencia rosa Fluorescencia rosa Fluorescencia rosa
POLARIDAD ++ ++ +++ +++ +++ +++
+ ++ +++
poco polar polaridad intermedia muy polar
GRUPO Carotenos (Carotenoides)
PIGMENTO -caroteno -caroteno -caroteno -caroteno -criptoxantina diatoxantina lutena mixoxantofila oscilaxantina zeaxantina anteraxantina diadinoxantina flavacina neoxantina violaxantina astaxantina asteroidenona cantaxantina echinenona fucoxantina peridinina pirroxantina clorofila a clorofila b clorofila c
PRESENCIA ++ +++
COLOR
UV254
POLARIDAD
Amarillo-naranja
Xantfilas Hidroxiladas (Carotenoides)
amarillo amarillo amarillo-naranja rojo claro amarillo-naranja amarillo amarillo amarillo limn amarillo rojo rojo claro
++ ++
Xantfilas Epoxidadas (Carotenoides)
++ ++ ++ +++ ++ ++
Presencia: segn especies de algas + generalizada Importancia cuantitativa: + trazas ++ medible +++ mayoritario Polaridad: + poco polar ++ polaridad intermedia +++ muy polar
Xantfilas Cetnicas (Carotenoides)
rojo-naranja
++
Clorofilas
verde azulado verde amarillento verde amarillento
fluorescencia rosa fluorescencia rosa fluorescencia rosa
++ ++ +++
Extraccin de pigmentos mediante disolventes. La extraccin es el proceso de separacin de uno o ms componentes de una mezcla mediante un disolvente. Se trata de una habitual tcnica de preparacin de muestra, previa a la obtencin de la seal analtica, pues mejora la selectividad y sensibilidad del anlisis, eliminando sustancias interferentes y aumentando la concentracin de la especie de inters. Adems, la mayora de los procedimientos analticos requieren muestras en estado lquido en la etapa final de obtencin de la seal, de manera que en muestras slidas se procede, como paso primero, a la solubilizacin de los compuestos en estudio. Para ello, es necesario poner en contacto el disolvente y la sustancia a extraer. Para conseguir que la extraccin sea buena, el disolvente debe disolver bien la sustancia a extraer y nada, o en todo caso poco, a las restantes, de manera que se produzca el paso del componente soluble al disolvente. Una vez ste se ha saturado en el componente, se separa del lquido que queda (sobrenadante), generalmente por filtracin o centrifugacin. 4
En la bibliografa se encuentran descritos gran cantidad de mtodos de extraccin de pigmentos en vegetales o algas, unos encaminados a la cuantificacin, otros son estudios cualitativos y otros controles semicuantitativos en los que se consigue un adecuado grado de agotamiento en la extraccin con un mtodo sencillo y rpido. En principio, cualquier disolvente orgnico es til, sin embargo, en la mayora de los casos se recurre al empleo de metanol o acetona por ser disolventes extractantes de polaridad media-alta, escasa selectividad, y amplio margen de solubilizacin. Su carcter desecante tiende a compactar las muestras, lo cual dificulta el acceso a las estructuras internas que contienen los pigmentos, aunque en muestras disgregables esto se solventa con apropiada y repetida trituracin. Se suele poner como punto final del proceso la obtencin de extractos incoloros tras repetidas etapas de extraccin con varias y renovadas porciones de disolvente. En muestras con alto contenido en agua, sta impide la correcta evaporacin del disolvente. Existen dos soluciones en tal caso: podra utilizarse un disolvente inmiscible con el agua, de manera que fuese posible la separacin posterior por decantacin, pero estos disolventes no son muy eficaces pues tienen una escasa capacidad de penetracin. Una solucin ms sencilla y til es transferir los pigmentos extrados con un disolvente orgnico adecuado (metanol o acetona son de uso general por su espectro medio de solubilidad) a ter etlico. La adicin de NaCl favorece el proceso y rompe la emulsin que dificultara la separacin de fases. El abanico de posibilidades es amplsimo y esto hace que frecuentemente la eleccin del sistema de extraccin implique, adems de una revisin bibliogrfica, ensayos tentativos en el laboratorio de los sistemas seleccionados. Lo ms indicado es aplicar una metodologa conocida ya usada e introducir las modificaciones pertinentes para adecuarlo a nuestro caso particular. De cualquier forma, el sistema de extraccin de pigmentos adoptado ha de ser completo y reproducible, y en ningn caso debe inducir la formacin de compuestos de degradacin durante el proceso. Para evitar en lo posible estas alteraciones, la manipulacin de las muestras debe realizarse a temperatura nunca superior a 40 C, bajo luz tenue o bien con luz verde, en atmsfera preferentemente inerte (N2), en unos tiempos mnimos, empleando disolventes que no las favorezcan, e incluso adicionando sales magnsicas para minimizar la formacin de feofitinas. Las alteraciones fotoqumicas se aceleran cuando los pigmentos estn adsorbidos en las superficies cromatogrficas. Cromatografa en capa fina. La palabra cromatografa proviene del hecho de que esta tcnica se us precisamente por primera vez para separar pigmentos de plantas (del griego chroma=color, graphein=escribir). Sin embargo, el procedimiento, en cualquiera de sus variantes, es aplicable a casi cualquier separacin, y no slo a aquellas referidas a productos coloreados. A lo largo de su historia, la cromatografa se ha ido convirtiendo en una tcnica de amplsima aplicabilidad.
Cualquiera que sea el procedimiento experimental, todas las tcnicas dependen de la diferente distribucin de los distintos componentes de una mezcla problema (la muestra en estudio) entre dos fases inmiscibles: la fase mvil y la fase estacionaria. La fase mvil puede ser un lquido o un gas, y la fase estacionaria un slido o un lquido. Las distintas combinaciones de estos componentes dan lugar a los diferentes tipos de cromatografa. La cromatografa es una tcnica utilizada con frecuencia en los laboratorios de qumica. La cromatografa en capa fina (CCF) se utiliza bsicamente con fines cualitativos, mientras que la cromatografa en columna (sobre todo en las configuraciones de HPLC y CG, cromatografas de alta resolucin de lquidos y gases, respectivamente) se utilizan con frecuencia para la obtencin de datos cuantitativos. Las separaciones obtenidas usando la CCF pueden extrapolarse a los otros tipos de cromatografa, y esto la hace til, por ejemplo, a la hora de determinar el mejor disolvente de elucin para la separacin de una mezcla, que posteriormente podra ser estudiada con las tcnicas cromatogrficas que aportan informacin cuantitativa exacta y precisa pero que suponen mayores costes econmicos y de tiempo. En la cromatografa en capa fina (CCF) la fase estacionaria o adsorbente es un slido poroso capaz de retener tanto al disolvente como a los solutos. Debe cumplir adems las siguientes caractersticas: - Ser insoluble en el disolvente elegido. - No reaccionar con las sustancias a separar. - No actuar como catalizador de su descomposicin, transposicin o isomerizacin. - Tener composicin uniforme y no aportar color, para poder localizar los compuestos si stos son coloreados. Existen muchos materiales que cumplen estos requisitos. Sin embargo, los ms usados son la gel de slice (SiO2) y la almina (Al203), ambos de carcter polar. Suelen suministrarse con una sustancia fluorescente (generalmente sulfuro de zinc), que permite visualizar ciertos compuestos al exponer la placa a la luz UV. El tamao de sus partculas tambin influye en el grado de separacin de la mezcla problema: cuanto menor sea, menor ser la velocidad de migracin y mayor la separacin. No obstante, se necesita una situacin de compromiso con objeto de que el tiempo a emplear no sea excesivamente largo. Tambin la homogeneidad del dimetro de las partculas es importante. La actividad del adsorbente, es decir su capacidad para retener los compuestos, es inversamente proporcional a su contenido en agua, razn por la que, sobre todo la slica-gel, necesita ser desecado ("activado") a 120 C antes de su uso, aunque las placas comerciales se ofertan listas para ser utilizadas. El proceso de adsorcin se debe a atracciones intermoleculares tales como interacciones dipolo-dipolo o de puente de hidrgeno.
Adsorbentes diferentes atrapan tipos de molculas diferentes. Un adsorbente muy polar adsorbe las molculas polares fuertemente pero no presenta una gran atraccin por molculas poco polares como los hidrocarburos. Por esto los compuestos poco polares son eludos antes que los polares en un sistema que utilice un adsorbente polar. As pues, ya que los adsorbentes difieren en su poder de adsorcin, deben ser elegidos en funcin del tipo de producto que se va a separar. En la CCF, tal como el nombre sugiere, el adsorbente se encuentra depositado en una delgada capa sobre una superficie plana que puede ser vidrio o mejor an una lamina de aluminio o de plstico. Los disolventes de elucin o FAMILIA DE ELUYENTE eluyentes, que constituyen la fase mvil, COMPUESTOS pueden ser adsorbidos y competir con los Hidrocarburos n-pentano, n-hexano componentes de la mezcla por las posiciones saturados (ter de petroleo) Hidrocarburos ciclohexano del adsorbente. La capacidad de los distintos insaturados tetracloruro de carbono disolventes para eluir un determinado soluto teres tolueno del disolvente es prcticamente independiente benceno de la naturaleza del soluto. La serie steres ter etlico eluotrpica es la ordenacin de los cloroformo Cetonas disolventes de acuerdo a su capacidad diclorometano Aminas relativa para desplazar solutos de un acetato de etill acetona determinado adsorbente. acetonitrilo Para la eleccin de la fase mvil que Alcoholes isopropanol consiga una ptima separacin es necesaria etanol Fenoles una optimizacin experimental de la mezcla. metanol cidos Para cada componente de la mezcla, el cido actico cambio de un disolvente menos polar a otro agua de mayor polaridad, ocasionar una atraccin diferencialmente distinta por parte del disolvente, aunque todos ellos migren en mayor grado a travs del adsorbente polar en el caso del disolvente ms polar dado que ste compite por los sitios activos de la fase estacionaria. Esto se traducir en una distinta separacin al trmino del proceso cromatogrfico. En un anlisis por CCF, la muestra (en disolvente de volatilidad elevada) es depositada con ayuda de un capilar sobre la placa, la cual es a continuacin eluda en el tanque de cromatografa, donde hay una pequea cantidad de disolvente. ste subir a lo largo de la placa por capilaridad, portando en su camino los componentes de la mezcla. Al final del desarrollo, los distintos compuestos habrn recorrido diferentes alturas, segn la velocidad con la que lo haga cada uno, variable que es funcin directa del grado de adsorcin que presenten. Si hay varios componentes en la mezcla debern
entonces observarse una serie de puntos en la placa, siendo los productos ms polares aquellos que queden ms cercanos a la base de la misma. El movimiento caracterstico para cada compuesto se define mediante su constante Rf, denominada factor de retencin, que es la distancia recorrida por ste punto o banda en la placa- respecto a la distancia recorrida por el eluyente o frente de disolvente. A menos que los productos analizados sean coloreados, es necesario tratar las placas de manera que se puedan visualizar los puntos y medir las distancias que recorren. Existen numerosos agentes reveladores siendo los ms comunes, el vapor de iodo, el anisaldehido, o mezclas de H2SO4, cido actico y agua (mezcla a la que se denomina oleum). Tambin suele utilizarse la luz UV, aprovechando la capacidad de diversas familias qumicas de absorber este tipo de radiacin e incluso de re-emitir parte de ella en forma de fluorescencia.
MATERIALES Y REACTIVOS MATERIAL 3 placas (2x10 cm) slica-gel 1 vaso de precipitados de 250 mL con tapa aislado de la luz (tanque de cromatografa) Capilares de vidrio Mortero con mano 2 tubos de centrfuga Gradilla Centrfuga Papel de aluminio 2 frascos mbar de 60 mL 1 probeta de 10 mL 1 pipeta de 5 mL y pipeteador Vaso de precipitados de 100 mL 3 pipetas Pasteur de plstico Esptula Pinzas Lpiz Tijeras Regla
REACTIVOS Disolvente de extraccin: metanol MgCO3 slido Eluyentes de cromatografa: hexano (C6H14), acetona (CH3-CO-CH3) Muestras de algas marinas: verde y parda (conservacin en fro)
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL EXTRACCIN DE PIGMENTOS. Proceder como se indica a continuacin, primero con una de las algas y cuando se haya completado el procedimiento de extraccin, con la otra. 1. Tomar la muestra de alga y cortarla en trozos pequeos con la tijera. 2. Triturarla en mortero junto con 5 mL de metanol y media punta de esptula de MgCO3 durante no ms de 1/2 minuto. Esta primera etapa de extraccin tiene como objetivo eliminar el agua que de manera natural se encuentra en el alga, y que dificultara el anlisis cromatogrfico. As pues, deseche en este punto el sobrenadante y contine con el residuo slido. 3. Se realizarn 4 extracciones de pigmento sucesivas sobre el residuo (sin contar la previa de eliminacin de humedad del alga). Proceder de la siguiente manera: 3.1. Triturar el residuo de alga del mortero junto con 5 mL de metanol y media punta de esptula de MgCO3, durante unos 3 minutos. 3.2. Pasar el sobrenadante a un tubo de centrfuga y observar y anotar su coloracin (la intensidad da idea de que el proceso de extraccin se est produciendo, y el tono puede apuntar hacia la familia de pigmentos que se estn extrayendo en mayor medida en esa etapa concreta). 3.3. Repetir la extraccin sobre el residuo de alga tres veces ms (de idntica forma y anotando los datos que se han especificado) hasta obtener un volumen final aproximado de extracto metanol de pigmento de 20 mL, repartidos en dos tubos de centrfuga (aprox. 10+10 mL) 4. Finalmente, centrifugar estos tubos durante 1 minuto. Si la separacin no ha sido buena, es decir, si hay cantidad apreciable de slidos en suspensin, ser necesario centrifugar durante 1 minuto ms. 5. Verter los sobrenadantes coloreados (extracto de pigmento), y ya transparentes, en uno de los frascos mbar y homogeneizar. Identificar el bote con el tipo de alga. 6. Realizar de manera idntica todo el proceso descrito con el segundo alga que se proporciona.
SEPARACIN DE COMPUESTOS MEDIANTE CCF. En este punto, se contina el trabajo con la determinacin del eluyente que permite una mejor separacin de los pigmentos de las muestras. El estudio se realizar con los extractos obtenidos de las dos algas utilizadas. Proceder como sigue: 1. En la cmara de elucin, se aaden 10 mL de la primera mezcla de disolventes que vayamos a utilizar como fase mvil. Se ensayarn mezclas de hexano y acetona. La composicin de stas se expresar como porcentajes en volumen del disolvente citado en primer lugar. Por ejemplo, para esta primera cromatografa, se utilizar 35% hexano, lo que significa que de 10 mL de disolucin, 3,5 mL son de hexano y 6,5 mL son de acetona. 2. En una placa de 2x10 cm se dibuja con un lpiz una lnea recta paralela a la base de la placa y a una distancia de sta de 1 cm. Sobre esa lnea se marca con lpiz los
puntos (2) donde se depositarn las muestras. La separacin entre los puntos ha de ser aproximadamente de 1 cm. 3. El capilar se introduce en el bote donde se halle el primer extracto de pigmento. El lquido subir por capilaridad hasta una cierta altura. A continuacin se descarga poco a poco el capilar sobre un punto de la lnea dibujada en la placa, procurando que el disolvente se haya secado antes de cada aplicacin del capilar. Esta operacin ha de realizarse con ambas muestras, depositando cantidades aproximadamente iguales sobre los puntos adyacentes. 4. La placa con las muestras depositadas se introduce en el tanque de elucin, cerrndolo rpidamente. La fase mvil no debe cubrir el punto donde se encuentran depositadas las muestras.
Lnea de muestras Nivel de disolvente
5. El disolvente subir a lo largo de la placa por capilaridad. Cuando el frente de disolvente est a 1 cm aprox. del extremo superior de la placa, se saca sta del tanque con cuidado, utilizando unas pinzas, y se marca inmediatamente con lpiz el nivel alcanzado por el eluyente. 6. Desde este momento conviene proteger la placa de la luz cuanto sea posible. Tras esperar unos minutos a que seque, se aconseja rodear con lpiz las bandas y anotar sus caractersticas cromticas, como precaucin ante una posible degradacin de los pigmentos que pudiera dificultar su interpretacin durante el estudio posterior, que ha de realizarse, se insiste, lo antes posible. 7. El procedimiento descrito se realizar con las siguientes mezclas hexano/acetona (% hexano): 35%, 50%, 65%.
Precauciones: Manipular las placas con delicadeza, tocando lo menos posible la superficie, para evitar el desprendimiento de la slica. Los pigmentos son en general poco estables, especialmente a la luz, incluso a temperaturas moderadas. Por ello, evitar tiempos de extraccin mayor de lo necesario y protegerlos de la luz con papel de aluminio siempre que esto sea posible (empapelar los tubos de ensayo, cubrir las placas, etc.) Adsorbidos en la placa, tras la separacin, su reactividad se multiplica, razn por la que el estudio de las placas se debe realizar justo tras cada cromatografa, sin esperar a tenerlas todas.
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HOJA DE RESULTADOS (Hexano/Acetona 35%) Alga 1 N Recorrido (mm) Rf Color Recorrido (mm)
Alga 2 Rf Color
(Hexano/Acetona 50%) Alga 1 N Recorrido (mm) Rf Color Recorrido (mm)
Alga 2 Rf Color
(Hexano/Acetona 65%) Alga 1 N Recorrido (mm) Rf Color Recorrido (mm)
Alga 2 Rf Color
1. Observa alguna diferencia en la intensidad y/o tono de los extractos metanol en las sucesivas etapas de extraccin de cada alga? Considera que el material vegetal se agot en su contenido pigmentario tras la primera etapa de extraccin? Y tras la ltima? 2. Haga un intento de identificacin de las bandas por comparacin con los datos bibliogrficos de presencia, color y polaridad de los pigmentos y compuestos de degradacin (si es que detecta alguno), de acuerdo a las tablas en Fundamento Terico. Detecta algn pigmento comn a ambas? Y alguno que claramente las clasifique en su grupo? 3. Estudie sobre las placas las separaciones cromatogrficas obtenidas al variar la polaridad del eluyente. Qu mezcla de hexano:acetona seleccionara usted para estudios posteriores, esto es, qu eluyente se traduce en una mejor separacin de los pigmentos?
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CUESTIONES
1. Cul es el papel del MgCO3 durante la extraccin de pigmentos con metanol? 2. Por qu ha de permanecer el tanque de elucin cerrado antes y durante la cromatografa? 3. La identificacin de los compuestos separados en el laboratorio se llev a cabo mediante comparacin con datos bibliogrficos de pigmentos, mtodo ste poco habitual en la prctica real Qu metodologa de identificacin de bandas se usa habitualmente en CCF? 4. Si dos compuestos tienen un valor de 0.30 y 0.32 respectivamente se separarn en una placa de capa fina si el disolvente recorre 5 cm? Qu podra modificarse para lograr la separacin? 5. Podra aplicarse con fines cuantitativos o semicuantitativos la metodologa analtica ensayada en el laboratorio? En caso afirmativo, indique las modificaciones necesarias. 6. Para el anlisis cuantitativo de los compuestos separados por CCF y desorbidos mediante disolvente adecuado podra utilizarse la tcnica de .........................................................., seleccionando para ello como longitudes de onda de medida para clorofila a y lutena ............... y ............. nm, respectivamente. (Observar espectros de absorcin de luz visible).
0.8 0.6
Clorofila a
U.A.
0,6 0,4 0,2 0,0 380
Lutena
U.A.
0.4 0.2 0.0 380 445 510 575 640 705 770
445
510
575
640
705
770
nm
nm
IMPORTANTE: Recuerde la obligacin de dejar el material de laboratorio de

su puesto de trabajo perfectamente limpio y en orden. Notifique al profesor cualquier rotura o deterioro que sufra el material de su puesto u otro de uso compartido. Es obligatorio presentarse al profesor y solicitar su autorizacin antes de abandonar el laboratorio.
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COMPUESTO DE DEGRADACIN feofitina a feofitina b clorofilida a clorofilida b feoforbida a feoforbida b

COLOR gris marrn verde azulado verde amarillento gris marrn

POLARIDAD ++ ++ +++ +++ +++ +++

poco polar polaridad intermedia muy polar

GRUPO Carotenos (Carotenoides)

Xantfilas Hidroxiladas (Carotenoides)

Xantfilas Epoxidadas (Carotenoides)

Xantfilas Cetnicas (Carotenoides)

verde azulado verde amarillento verde amarillento

fluorescencia rosa fluorescencia rosa fluorescencia rosa

(Hexano/Acetona 50%) Alga 1 N Recorrido (mm) Rf Color Recorrido (mm)

(Hexano/Acetona 65%) Alga 1 N Recorrido (mm) Rf Color Recorrido (mm)

0,6 0,4 0,2 0,0 380

IMPORTANTE: Recuerde la obligacin de dejar el material de laboratorio de

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