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ISSN 1420-3049 http://www.mdpi.org

Aislamiento y explicacin de la estructura de un nuevo pigmento amarillo de la bacteria marina Pseudoalteromona tunicata
Ashley Franks 2, Peter Haywood 1, Carola Holmstrm 2, Suhelen Egan 2, Staffan Kjelleberg 2 and Naresh Kumar 1,*
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School of Chemistry and 2 School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, The University of New South Wales, Sydney NSW 2052 Australia

* Author to whom correspondence should be addressed; e-mail: n.kumar@unsw.edu.au Received: 12 December 2004; in revised form: 21 April 2005 / Accepted: 4 May 2005 / Published: 31 October 2005

Abstract: El medio marino es una de las principales fuentes de muchos nuevos compuestos naturales. Se ha aislado un nuevo pigmento amarillo de la bacteria marina P. tunicata e identificado como un nuevo miembro de la clase de compuestos tambjaminas. La identificacin estructural se logr mediante una combinacin de espectroscopia de RMN 1D y 2D, y datos de alta resolucin de espectrometra de masas. Keywords: Pseudoalteromonas tunicata, marine bacterium, tambjamines

Introduction Los miembros del gnero bacteriano Pseudoalteromonas se encuentran comnmente asociados a la vida y las superficies inertes en el medio marino [1]. La especie Pseudoalteromona produce una gran variedad de compuestos biolgicamente activos que tienen actividad contra los organismos marinos comunes. Estos incluyen compuestos para bacterias objetivo, larvas de invertebrados, algas esporas, pastos de protozoos y hongos, y se cree que proporcionan proteccin para los organismos husped marinos colonizados por especies Pseudoalteromonas. En una pantalla preliminar de diez especies Pseudoalteromonas, Holmstrm et al. [6] encontr que P. tunicata tiene la gama ms alta y ms amplia de actividades biolgicas.

1287 Molecules 2005, 10 Estas actividades estn vinculadas a la produccin de pigmentos no identificados, amarillo y morado [8]. Como parte de nuestra investigacin en curso sobre los compuestos biolgicamente activos producidos por P. tunicata, se presenta el aislamiento e identificacin de este pigmento amarillo producido por P. tunicata. Este pigmento es una nueva clase del compuesto tambjamina. Los alcaloides tambjamina han sido aislados previamente de las bacterias e invertebrados marinos, incluyendo los briozoos, nudibranquios y ascidias [9-10]. Se componen de un (2,2 '-bipyrrole) sistema de anillos que contienen un resto de enamina en la posicin C2 del anillo de pirrol, y un grupo metoxi adyacentes en el C3. El nitrgeno enamina normalmente sustituido por dos o cuatro carbonos alquilo de cadena saturada. Por otra parte, el anlogo de la tambjamina, BE-18 591, contiene una cadena de doce carbonos saturada de alquilos se ha aislado de los cultivos de Streptomyces sp [11]. Otros miembros de esta clase, que incluyen compuestos de tetra-pirrol, poseen una amplia gama de actividades biolgicas incluyendo antibiticos [12], antitumoral [13] y las actividades de inmunosupresores [14]. BE-18 591 tambin ha demostrado inhibir immuno-proliferacin y gastritis en conejos [15]. Experimental General Con un Espectro de masas de alta resolucin fue adquirido metanol mediante un Bruker BioApex IIe 7 T Transformada de Fourier Ion ciclotrn, espectrmetro de masas de resonancia con una fuente de ionizacin electrospray Analtica. Las muestras se ejecuto en modo de iones positivos en condiciones de alta resolucin (<2 ppm). 1H y 13C-NMR espectros se realizaron en CDCl3 neutralizado (preparado por pasar CDCl3 travs de una capa de carbonato de potasio anhidro) en un espectrmetro Bruker AMX300, mientras que los experimentos de RMN en dos dimensiones se realizaron en un espectrmetro Bruker DMX600. Bacterial culture conditions and isolation of the yellow pigment Se cultivo (100 litros) P. tunicata [16] en medio VNSS [17] a la fase estacionaria (12 horas) y se cosecho por centrifugacin. Las clulas se liofilizaron y se extrajo con metanol. El extracto de metanol se redujo al vaco y se dividi con diclorometano-agua (1:1 v / v). La fraccin DCM se separa, se evapora y se carga en una columna de SPE Altec con ter dietlico. La columna se eluy con incrementos de 100% de hexano, un 10% de acetato de etilo% / hexano, 100% de cloroformo, y 4 de isopropanol / cloroformo. Las fracciones pigmentada amarilla (90 mg) (en la fraccin de cloroformo 100%) fueron ms fraccionado en otra columna Altec SPE. La muestra se carg con DCM y se eluy con 2% de alcohol isoproplico (IPA) / cloroformo. La fraccin amarilla resultante se someti a cromatografa preparativa sobre placas de capa delgada de vidrio recubiertas con gel de slice para eliminar la gran cantidad de cido oleico, que co-eluyeron con el pigmento amarillo. En algunos casos se emplearon las placas de preparacin que contienen gel de slice se mezcla con acetato de sodio al 12%. La banda pigmentada amarilla fue raspada de la placa de slice, y se eluy con diclorometano. La evaporacin del disolvente al vaco produjo un compuesto como un aceite amarillo (11 mg). Una banda de color prpura tambin se aisl de la mezcla de crudo.

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El compuesto fue identificado como prpura viola-cena por comparacin, y el pigmento amarillo como un alcaloide nuevo de tambjamina. La estructura del compuesto amarillo fue identificada como sigue. Results and Discussion Un ESI-HRMS (Resolucin de espectrometra de masas) del compuesto 1 dio un in molecular de m / z 356.270484 [MH +] que corresponde a una frmula molecular de C22H33N3O (CALC: 356.269605 [MH +]). La estructura se deduce a travs de un amplio uso de los experimentos nucleares de alta resolucin espectroscopia magntica incluyendo TOCSY COSY, NOESY, HSQC, 1H-13C y 1H-15N experimentos HMBC.
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COSY (COrrelation SpectroscopY), TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY), NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation), HSQC (Heteronuclear Simple Quantum Correlation), HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation).

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1 La presencia de un sistema de anillos de 2,2 '-bipyrrole se estableci desde el TOCSY COSY, y experimentos NOESY (Figura 1, Tabla 1) y la comparacin con los desplazamientos qumicos de 1H y 13C inform de tambjaminas [9,10]. El espectro de 1H-RMN de 1 mostr seales de los protones en bipyrrole 7,06, 6,25, 6,70 y 5,95 ppm correspondiente a los protones H5, H4, H3 y H4, respectivamente (Tabla 1). La presencia de un grupo metoxi en el C3 fue confirmada por una camiseta de protones en 3,90 ppm y el carbono C3 en 163,9 ppm. El CH enamina apareci en 7,29 ppm en el espectro de protones con la seal de carbono correspondientes a 141,1 ppm. El nitrgeno enamina se encontr que ser sustituido por una cadena de carbono insaturados doce alquilo. La comparacin de los datos espectrales de la tambjamine nuevo con estructuras tambjamine inform indicaron la presencia de una cadena ms larga y un doble enlace entre C10 y C11 tomos de carbono. Figure 1:Selected 2D NMR Data

1289 Molecules 2005, 10 El grupo C8 CH2 junto a un nitrgeno enamina apareci en 3,46 ppm y mostr a travs del espacio de acoplamiento a H6 y directa a travs de la correlacin enlace a C9 CH2. La larga union constante entre C6 protn y el NH enamina (J = 14 Hz) confirm la disposicin trans-antiplanar de la enamina.Table 1: 1H and 13 C chemical shifts for 1
Yellow Pigment Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 18 19 20 1 2 3 4 5 123.5 113.0 110.5 124.1 6.70, m 6.25, m 7.06, m 51.2 28.8 124.1 134.5 27.8 26.5-27.7 14.5 58.8 3.46, m 2.46, m 5.35, dt 5.55, dt 2.01, m 1.21-1.70 0.86, t 3.90, s 155 111.3 163.9 91.6 143.4 141.1 7.29, d 132 5.95, s
13c
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15N

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Por otra parte, protones a C8 y C9 mostraron largo alcance 1H-15N acoplados al N7 confirmando la vinculacin de la cadena de alquilo (Figura 1). El doble enlace entre C10 y C11 en la cadena de alquilo se encuentro mediante experimentos COSY / TOCSY y se asigna una configuracin cis con una constante de acoplamiento J10, 11 = 10.8 Hz y una correlacin NOESY entre H9 y H12. Ambos H8 y H9 mostraron 3-enlaces heteronucleares correlacionados con el doble enlace, H8 mostro la union a C10 y H9 a C11. El CH2 en C12 mostr uniones de largo alcance a ambos tomos de carbono doble enlace. Una gran gama multiplete a 1,21-1,70 ppm representa los protones de metileno C13-C18 con el grupo metilo terminal que aparece en 0,86 ppm como un triplete.

Molecules 2005, 10 Conclusions

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El aislamiento y caracterizacin de un nuevo pigmento amarillo de la bacteria marina P. tunicata est descrito. Este es el primer aislamiento reportado de un tambjamina con una cadena insaturada de alquilo en la naturaleza. Por otra parte, la similitud de aislamiento y estructurales de 1 a tambjaminas aislados de esponjas y briozoos sugiere que estos compuestos pueden ser de origen bacteriano y en relacin con la presencia de Pseudoalteromonas ya sea dentro de los tejidos o en la superficie del organismo como es el caso de P. tunicata. cknowledgements Damos las gracias a Anthony Carroll de productos naturales Descubrimiento Universidad Griffith y Blackman Adrian de la Universidad de Tasmania por proporcionar espectros de tambjamines. Los autores tambin desean agradecer a Stender Hilda por su ayuda en la realizacin de experimentos de RMN. References 1. Holmstrm, C.; Kjelleberg, S. Marine Pseudoalteromonas species are associated with higher organisms and produce active extracellular agents. FEMS Microbiol. Ecol. 1999, 30, 285-293. 2. Burkholder, P. R.; Pfister, R. M.; Leitz, F. H. Production of a pyrrole antibiotic by a marine bacterium. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1966, 14, 649-653. 3. McCarthy, S. A.; Johnson, R. M.; Kakimoto, D. Characterization of an antibiotic produced by Alteromonas luteoviolacea Gauthier 1982, 85 isolated from Kinko Bay, Japan. J. Appl. Bacteriol. 1994, 77, 426-32. 4. Gauthier, M. J. Alteromonas citrea, a new gram-negative yellow-pigmented species from seawater. Int. J. Syst. Bacteriol. 1977, 27, 349-354. 5. Eaton, R. W.; Chapman, P. J. Formation of indigo and related compounds from indolecarboxylic acids by aromatic acid-degrading bacteria: chromogenic reactions for cloning genes encoding dioxygenases that act on aromatic acids. J. Bacteriol. 1995, 177, 6983-6988. 6. Holmstrm, C.; Egan, S.; Franks, A.; McCloy, S.; Kjelleberg, S. Antifouling activities expressed by marine surface associated Pseudoalteromonas species. FEMS Microbiol. Ecol. 2002, 41, 47-58. 7. Egan, S.; Holmstrm, C.; Kjelleberg, S. Pseudoalteromonas ulvae sp. nov., a bacterium with antifouling activities isolated from the surface of a marine alga. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001, 51, 1499-1504. 8. Egan, S.; James, S.; Holmstrm, C.; Kjelleberg, S. Correlation between pigmentation and antifouling compounds produced by Pseudoalteromonas tunicata. Environ. Microbiol. 2002, 4, 433-442. 9. Blackman, A. J.; Li, C. New tambjamine alkaloids from the marine bryozoan Bulgula dentata. Aust. J. Chem. 1994, 47, 1625-1629. 10. Davis, R. A.; Carroll, A. R.; Quinn, R. J. The synthesis of a combinatorial library using a tambjamine natural product template. Aust. J. Chem. 2001, 54, 355-359.

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