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InformacionessobreAnlisisMicrobiolgicosporPCR

EneroFebrerode2009

La extraccin y purificacin del ADN para el anlisis por PCR. Mitos y realidades
De los tres pasos Introduccin En PCR, el cido desoxirribonucleico (ADN) es crticos que comel analito. Por tanto, una buena muestra impliponen el anlisis de ca siempre un correcto proceso de obtencin de esta molcula a partir de material biolgico. patgenos por La extraccin de ADN consta de una etapa de PCR, la extraccin lisis, que consiste en romper las estructuras el medio de ADN es quizs que confinanotracitoplasma y liberar alimplica su contenido y de purificacin, que la el ms desconoci- retirada de la solucin final de la mayora de elementos que pueden interferir en la PCR. do... ...las suspensiones densas de bacterias gramnegativas pueden liberar su ADN en condiciones bastante suaves...

Lavado del pellet. Se realiza con alcohol fro volviendo a centrifugarse Recuperacin. El sedimento se puede resuspender en agua o tampn Tris tras ser secado completamente.

La confirmacin de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de agarosa i posterior tincin con bromuro de etidio y observacin con luz UV o directamente al espectrofotmetro mediante espectro de absorcin de 200 a 350 nm. El ADN purificado De los tres pasos crticos que componen el an- se puede cuantificar con un espectrofluormetro lisis de patgenos por PCR (Fig. 1), la extrac- mediante el uso de fluorforos especficos cin de ADN es quizs el ms desconocido y (Picogreen, Molecular Probes) sobre el que ms control podemos ejercer. El paso 3 puede realizarse con la ayuda de mi-

Enriquecimiento

ExtraccinADN

DeteccinPCR

Figura1.LaextraccindeADNesunpasoclaveenlosanlisismicrobiolgicosporPCR

La extraccin del ADN de las clulas o virus donde se halla confinado es un paso previo en muchos procedimientos analticos y diagnsticos.

EtapasenlaextraccindeADN

nicolumnas equipadas con una membrana de slica que retiene especficamente el ADN permitiendo el paso de las molculas y sales que acompaan la reaccin de lisis. Finalmente se lava con alcohol y se eluye el contenido

La incorporacin de controles internos de amplificacin en los kits permite el control del nivel de inhibicin de las reacciones...

Los pasos necesarios para una correcta extrac- InhibidoresdelaPCR cin y purificacin del ADN mediante un proce- Se trata de substancias que interfieren con las dimiento qumico son: ADN polimerasas termoestables ya sea mediante el bloqueo directo total o parcial de su activi1. Lisis de las clulas o virus. Las sales caotr- dad cataltica o mediante la unin directa al picas ayudan a romper la estructura tridi- ADN de doble cadena. Por ejemplo, algunas mensional de macromolculas como las substancias interaccionan con los iones Mg2+ protenas o los cidos nucleicos consiguiendo su desnaturalizacin. La adicin de un Tabla 1. Principales substancias inhibidoras de la PCR detergente como el SDS es necesaria a meInhibidor Origen nudo para eliminar las membranas. 2. Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adicin de una proteasa. La fraccin proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sdico. 3. Purificacin. Consta de 3 fases:
Sales biliares Polisacridos complejos Colgeno Grupo hemo cidos hmicos Melanina y eumelanina Mioglobina Proteinasas Iones de calcio Urea Hemoglobina, Lactoferrina Inmunoglobina G (IgG) Heces Heces, material vegetal Tejidos Sangre Suelo, material vegetal Pelo, piel Tejido muscular Leche Leche, huesos Orina Sangre Sangre

Precipitacin del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol fro o isopropanol i recuperar mediante una centrifugacin. El alcohol del sobrenadante se llevar las sales aadidas previamente.

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(un cofactor crtico de la actividad cataltica) o disminuyen su disponibilidad pudiendo inhibir la PCR. En la tabla 1 se recogen algunas de las principales substancias inhibidoras conocidas. Otra importante fuente de inhibicin son los propios reactivos que se usan en el proceso de extraccin de ADN, como por ejemplo, el exceso de KCl, NaCl y otras sales, detergentes inicos, etanol e isopropanol, fenol y otros. Los inhibidores pueden eliminarse mediante purificacin qumica del extracto (pasos 3 a 6) o fsica mediante columnas de slica.

do, pero muy poco eficacia en bacterias grampositivas. 2. Ebullicin (combinado con congelacin). Algunos fabricantes incorporan un paso de ebullicin de la muestra previo a la PCR como nica accin para extraer el ADN de la muestra. Si bien esto puede ser usado en suspensiones con nmeros elevados de bacterias gramnegativas, su baja eficiencia especialmente con organismos grampositivos, reduce notablemente el nivel de deteccin del mtodo. 3. DNAready (Microbial) Se trata de un tampn de lisis que incorpora los elementos necesarios para buscar un equilibrio entre eficiencia y pureza que adems est desarrollado para ser especialmente efectivo con bacterias grampositivas.

ExtraccindeADNensuspensionesbacterianas
De todas las muestras biolgicas que podemos someter a un proceso de extraccin de ADN, las suspensiones bacterianas, son quizs las que ofrecen menos problemas por la homogeneidad y riqueza del material. En particular, las suspensiones densas de bacterias gramnegativas pueden liberar cantidad suficiente de ADN en condiciones bastante suaves como pueden ser una simple ebullicin, congelacin o una combinacin de ambas (frezze & thaw).

Conclusiones
En Microbiologa de los alimentos, los inhibidores de la PCR provienen principalmente de la matriz alimentaria analizada o de los medios utilizados para el enriquecimiento. La incorporacin de controles internos de amplificacin en los kits permite conocer el nivel de inhibicin de las reacciones.

EsnecesarialapurificacindeADNenladeteccin depatgenosenalimentosporPCR?

Las bacterias no suelen contener substancias inhibidoras, por lo que en la mayora de casos una extraccin primaria (lisis y liberacin del ADN) es suficiente para tener resultados satisEl laboratorio de Microbiologa que decide incorporar la PCR factorios. Esto no significa necesariamente que se puedan a sus mtodos de investigacin de bacterias patgenas en siempre usar mtodos poco drsticos, pues stos no son efectialimentos, lo hace buscando rapidez y simplicidad. La purifi- vos para extraer el ADN de las bacterias grampositivas. cacin del ADN tras el proceso de lisis y liberacin tiene como ventaja la obtencin de un analito sin inhibidores a cambio de La utilizacin de mtodos de purificacin post-extraccin un sensible aumento del tiempo de anlisis y de los pasos de como por ejemplo las minicolumnas de slica implica un aumento en el coste y en el nmero de manipulaciones (Tabla 2) manipulacin. lo que hace que slo sea aconsejable en aquellas matrices en Analizar directamente un caldo de enriquecimiento tras un las que los mtodos primarios no pueden eliminar los inhibiproceso de extraccin primaria de ADN (lisis celular) suele dores. producir resultados satisfactorios para la mayora de matrices alimentarias por lo que un paso Tabla 2. Comparacin del material, tiempo y costes asociados a diferentes mtodos de extraccin de de purificacin no es estricta- ADN comnmente utilizados. mente necesario. Adems, los kits de anlisis de patgenos por PCR incorporan detectores Caracterstica Macherey-Nagel DNAready Chelex F&T de inhibicin (controles inter6 1 2 2 nos de amplificacin). Sola- Pasos centrifugacin mente aquellas matrices cuya Pasos pipeteo 10 2 3 3 presencia de inhibidores no 3 1 2 2 pueda ser contrarrestada dilu- Cambios de tubo yendo el extracto de ADN obli- Coste por reaccin () >3 <1,5 <1,5 <1,5 garn a plantear la adopcin de 2h 30min 1h 1h 20min 1h 30min tcnicas de extraccin de ADN Tiempo (h)* que aseguren un extracto puro. Cambios T 2 3 3 7

Cada casa comercial acompaa a sus detectores con un mto- Bibliografa Rdstrm, P. et al. (2004) Pre-PCR processing: Strategies to do de extraccin de ADN. stos son fundamentalmente tres: generate PCR-compatible samples. Mol. Biotechnol. 26, 133 1. Chelex. El uso de una resina de slica ayuda a separar 46. selectivamente el ADN de la solucin. Es un mtodo rpi-

ObtencindeADNsinpasodepurificacin.

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