ELECTROFORESIS

GENERALIDADES Y APLICACIONES CLINICAS

Marcelo Castillo Navarrrete, T.M. MsCs (C) Facultad de Medicina Carrera Tecnologa Mdica 18 de Noviembre de 2004

Fundamentos de Electroforesis
Alta sensibilidad, resolucin y versatilidad. Mtodo de separacin de
cidos nucleicos Protenas Otras biomolculas

Entrega criterio de pureza. Separa mezclas complejas Permite determinar

El peso molecular de una protena Punto isoelctrico. Nmero de cadenas polipeptdicas de una protena

Fundamentos de Electroforesis
Migracin de solutos en un campo elctrico. Se mueven las partculas en base a:
Su carga neta. Peso molecular Estructura tridimensional

Fundamentos de Electroforesis
La velocidad de migracin (V) de la partcula es directamente al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial elctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de friccin (f) relativo a la talla y forma de la molcula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio

V = qE/f

Fundamentos de Electroforesis
La Movilidad electrofortica (Me)
Es un caso particular de la migracin de un in. En un campo elctrico de 1V/cm Su signo es igual al de la carga de la partcula.

La velocidad de Migracin electrofortica

Carga de la molcula Voltaje aplicado
Exceso de voltaje = Incremento del calor. Bajo voltaje = pobre separacin (por difusin)

Porosidad del gel

Fundamentos de Electroforesis
Las biomacromolculas.
Poseen carga elctrica. Grupos catinicos y aninicos disociables.

La carga neta de una molcula

pH del medio La interaccin con otras pequeas molculas de iones. La interaccin con otras macromolculas.

Fundamentos de Electroforesis
La carga neta de una molcula (2)
El pH influye en la migracin de una molcula En el punto isoelctrico, la protena no migra.
Por debajo del pto. Isoelectrico migra hacia el ctodo. Por encima del pto. Isoelctrico migra hacia el nodo.

ADN

PROTEINAS

Fundamentos de Electroforesis
Los soportes usados
Polmeros Gel poroso
Restringe el movimiento de las molculas Disminuyen los flujos de conveccin del solvente.

Se han usado como soporte

Papel (celulosa) Almidn Poliacrilamida Agarosa Acetato de Celulosa

CELULOSA

ALMIDON

POLIACRILAMIDA

AGAROSA

Fundamentos de Electroforesis
La electroforesis presenta gran poder resolutivo
Pequea cantidad de protena Zona estrecha (carril) Gran longitud de trayecto (longitud del carril).

Fundamentos de Electroforesis
Equipamiento necesario.
Fuente de poder, Cubeta vertical u horizontal. 2 electrodos Actualmente existen sistemas automatizados de electroforesis.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

La poliacrilamida:
Soporte empleado frecuentemente (3.5 20 %) Qumicamente inerte

Electroforesis en gel de poliacrilamida

La poliacrilamida:
De propiedades uniformes
Geles transparentes Estabilidad mecnica Insolubles en agua Relativamente no inicos Rango pequeo de separacin Alta resolucin El tamao del poro, vara de manera uniforme con la cenctracin del gel.

De preparacin rpida, pero trabajosa Reproducible

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Formacin del gel
Polimerizacin vinlica
monmero de acrilamida (CH2=CHCO-NH2)
Potente neurotoxina

Monmero entrecruzador N,Nmetilen-bis-acrilamida (CH2=CH-CO-NH-CH2NH-CO-CH=CH2)

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Formacin del gel
Se inicia
formacin de radicales libres del monmero Que producen radicales libres del oxgeno Por accin de iones persulfato.

Las aminas terciarias (N,N,N,Ntetrametilen-diamina, TEMED)

Catalizadores de la reaccin Formacin de radicales libres del persulfato Se inhibe fuertemente por niveles altos de Oxgeno.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Separacin electrofortica
Funcin importante:
pH Fuerza inica Gradiente de potencial Tiempo de corrida Concentracin de acrilamida y bisacrilamida

Las condiciones ptimas

Determinadas experimentalmente

Electroforesis en gel de agarosa

Polisacrido
extraido de algas marinas Usado de 0.5 2%

Geles fciles de preparar No es txico Amplio rango de separacin Baja resolucin Usado tpicamente para ADN

Electroforesis de protenas plasmticas

En clnica
se usa normalmente acetato de celulosa Soporte Inerte Se lee en un fotodensmetro
Dibuja un trazado de absorbancia Se obtiene una curva

El proteinograma
Permite orientacin rpida y clnicamente significativas

MIELOMA MULTIPLE

GAMAPATIAS MONOCLONALES

REACTANTES DE FASE AGUDA

ENFERMEDAD HEPATICA

PATRON ELECTROFORETICO EN ENFERMEDADES GASTROINTETINALES PT

Ulcera Pptica D D

ALB.

Alfa1
Puede estar A

Alfa2
Puede estar A

Beta Gamma

Colitis Ulcerosa

Puede estar A

Puede estar A

Enteropata perdedora de protenas

D Notable

Hepatitis vrica D, aguda N

D(indica lesin hepatocelular aguda)

V, A

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Marcelo Castillo Navarrrete, T.M. MsCs (C) Facultad de Medicina Carrera Tecnologa Mdica 18 de Noviembre de 2004