Volumen 42 Nmero 2 Abril - Junio 2011.

Ahead of print

Trabajo Cientfico

Cuantificacin de EPO humana recombinante por Fase Reversa-Cromatografa Lquida de Ultra Resolucin
Quantification of recombinant human EPO by Reverse Phase-Ultra Performance Liquid Chromatography
Emilio Medina R, Carolina Ortiz E., Eduardo Gonzlez R., Nstor O. Prez R. Probiomed S.A. de C.V., Departamentos de Calidad e Investigacin y Desarrollo
Resumen La eritropoyetina humana recombinante (rhEPO) es producida a partir de clulas de ovario de hamster chino (CHO) mediante tcnicas de ADN recombinante. Su cuantificacin durante el proceso de produccin se lleva a cabo predominantemente mediante tcnicas de inmunoensayo, el cual presenta la desventaja de alto costo y largo tiempo de ejecucin. El presente estudio propone una metodologa para cuantificar rhEPO por fase reversa en cromatografia lquida de ultra resolucin (FRCLUR) en muestras de diversas etapas del proceso de manufactura de rhEPO. Se presentan los resultados de la validacin del mtodo que demuestran que el mtodo es preciso, exacto y especfico dentro de un coeficiente de variacin del 5%. Abstract Recombinant human Erythropoietin (rhEPO) is produced through DNA recombinant technology in Chinese Hamster Ovary cells. Its quantification during the manufacturing process is usually performed with immunoassay techniques, which is expensive and time consuming. The present study proposes a methodology to quantify rhEPO by reverse phase-ultra performance liquid chromatography (RP-UPLC) in broad media culture and clarified media. The article presents the validation of the method that demonstrates its precision, accuracy and specificity with a CV below of 5%. Palabras clave: eritropoyetina, fase reversa, CLUR, validacin. Correspondencia Dr. Nstor O. Prez R. Investigacin y desarrollo, Probiomed S.A. de C.V. Cruce de Carr. Acatzingo-Zumpahuacn S/N Tenancingo, Edo. de Mex., 52400 Tel: 01 (55) 1166 2305 e-mail: nestor.perez@probiomed.com.mx Keywords: erythropoietin, reverse phase, UPLC, validation.

Fecha de recepcin: 11 de enero 2011 Fecha de recepcin de modificacin: 28 de marzo 2011 Fecha de aceptacin: 13 de abril de 2011

Publicado en lnea: 15 de abril de 2011

Introduccin
La Eritropoyetina es una glicoprotena que promueve la generacin de glbulos rojos en el torrente sanguneo, que se utiliza en el tratamiento de pacientes con insuficiencia renal crnica.1 La eritropoyetina humana recombinante (rhEPO) es idntica en su secuencia de aminocidos a la protena nativa. Est consituida por 165 residuos de aminocidos que forman dos puentes disulfuro y presenta cuatro sitios de glicosilacin. Los diferentes patrones de glicosilacin generan ocho isoformas principales por electroforesis capilar de zona (con pesos moleculares entre 34 y 39 kD).2 Su produccin se lleva a cabo mediante tcnicas de ADN recombinante por el cultivo de clulas de Ovario de Hamster Chino (CHO). Durante esta etapa, las clulas CHO secretan al medio de cultivo rhEPO junto con otras protenas de hospedero. Debido a esto su purificacin incluye operaciones unitarias cromatogrficas y de ultrafiltracin para la separacin de las protenas presentes en el medio y la de inters. El control de este proceso requiere metodologas de cuantificacin que permitan estimar el rendimiento de manera rpida, precisa y exacta. Usualmente, la cuantificacin de rhEPO durante el cultivo y purificacin se realiza a travs de tcnicas de ELISA.3 Las tcnicas de inmunoensayo tienen la ventaja de ser especficas para la protena de inters, sin embargo, presentan el inconveniente de ser costosas y debido a la duracin del ensayo (entre 5 y 10 h) no pueden ser usadas como mtodos de control de proceso. Por otro lado, la naturaleza de la metodologa provoca que los coeficientes de variacin del anlisis (entre el 10 y el 20 %) sean mayores a los que se obtienen por mtodos cromatogrficos [4], por lo que existe la necesidad de tener mtodos ms rpidos, precisos y con menor variacin. En el presente artculo se propone una metodologa por Fase Reversa-Cromatografa Lquida de Ultra Resolucin (FRCLUR) adecuada para la cuantificacin de rhEPO, capaz de separar adecuadamente la protena de inters. Las tcnicas de CLUR tienen ciertas ventajas sobre las de alta resolucin (CLAR). Las columnas de CLUR son empacadas con partculas de 1.7 mm, 2.9 veces menores a las usadas en CLAR que son de aproximadamente 5 mm incrementando la resolucin, reduciendo los tiempos de corrida y el gasto de disolventes5 utilizados como fase mvil. Esta tcnica ha sido utilizada recientemente en la cuantificacin de muestras complejas como el Interfern alfa-2b en cuerpos de inclusin [6] y flavonoides en orina.7 Las tcnicas de fase reversa estan basadas en la separacin de sus componentes por su polaridad. La fase estacionaria est constituida por ligandos de cadenas carbonadas de entre 4 y 18 carbonos8 que retiene molculas con caractersticas hidrofbicas. La elucin de los componentes de una muestra se obtiene al hacer pasar como fase mvil un gradiente con disolventes

orgnicos (por ejemplo: acetonitrilo), que al lograr un equilibrio determinado desprenden los compuestos retenidos en la fase estacionaria.8 Estos mtodos reducen los costos por anlisis (comparados con los costos por ELISA) y tienen la ventaja de poder ser usados como mtodos para control de proceso por sus cortos tiempos de anlisis (5 a 10 minutos). La muestra slo necesita filtrarse para evitar tapar las columnas, por lo que los coeficientes de variacin del mtodo son menores al 5%. Nuestro grupo de investigacin ha reportado anteriormente la aplicacin de los criterios de validacin de las guas de la ICH9 para un mtodo espectrofotomtrico,10 ahora presentamos el montaje y la validacin de un mtodo cromatogrfico.

Materiales y mtodos
Reactivos y muestras Para la validacin se utiliz estndar de Eritropoyetina (estndar interno de Probiomed SA de CV) a una concentracin de 0.65 g/L en amortiguador de fosfatos 10 mM pH 7.0 y muestras de diferentes etapas del proceso de cultivo y purificacin, que incluyen el medio libre de clulas acondicionado y de tres operaciones unitarias del proceso de purificacin. Para la preparacin de las fases mviles se emple acetonitrilo (J.T. Baker) grado HPLC, cido trifluoroactico (TFA, J.T. Baker) y agua desionizada. Preparacin de las muestras Las muestras de las diferentes etapas del proceso y el estndar se filtraron a travs de acrodiscos (Pall) de 0.2 m previo a su inyeccin en el cromatgrafo. El estndar se diluy con agua desionizada para la preparacin de las muestras de validacin y las muestras de proceso se diluyeron con solucin amortiguadora de fostatos pH 7 y con Tris-NaCl pH 7.2 segn fuera el caso.
El medio Mock se obtuvo del cultivo de una clona transformada con el mismo vector de expresin que la clona de produccin, pero sin el gen de EPO, y se utiliz para la prueba de especificidad.

Cuantificacin de rhEPO por FR-CLUR Durante el desarrollo y la validacin del mtodo se emple un sistema de CLUR Acquity (Waters). El procesamiento de la informacin se llev a cabo con el software Empower (Waters). La separacin se llev a cabo en una columna Acquity BEH300 C18 2.1 x de 150 mm (Waters), a una temperatura de 45C. Los cromatogramas se adquirieron con un detector UV a 214 nm. El flujo de trabajo fue 0.2 mL/min. La fase mvil A (FMA) fue compuesta de 0.1% de TFA en agua desionizada, la fase mvil B (FMB) se constituy con 0.1% de TFA en acetonitrilo. El tiempo de corrida fue de 6 minutos: La separacin se obtuvo con un gradiente lineal de 30% FMB, en un minuto, posteriormente
Publicado en lnea: 15 de abril de 2011

Volumen 42 Nmero 2 Abril - Junio 2011. Ahead of print se llev al 100% de FMB en un minuto adicional y se mantuvo otro minuto, nuevamente se llev a las condiciones iniciales para equilibrar la columna durante 3 minutos.

Validacin del mtodo de cuantificacin de rhEPO por FR-CLUR El mtodo se valid considerando los parmetros establecidos para un mtodo cuantitativo en la gua de la ICH9 para la validacin de mtodos analticos. Por lo tanto se evaluaron los siguientes atributos de medicin:
Linealidad del sistema. Se prepararon por triplicado soluciones de estndar interno de EPO recombinante a una concentracin de 0.15 g/L. Se inyectaron 0.15, 0.30, 0.45, 0.60 y 0.75 g de protena. Linealidad de mtodo. Se prepararon por triplicado muestras de medio acondicionado y adicionadas con estndar interno. Se obtuvo una concentracin final de 0.15 g/L. Se inyectaron 0.15, 0.30, 0.45, 0.60 y 0.75 g de protena. Precisin del sistema. Se inyectaron 0.45 g de estndar interno por sextuplicado. Precisin del mtodo (repetibilidad). Esta prueba se evalu con 4 muestras de diferentes etapas del proceso de fabricacin de EPO. Primero se prepararon muestras de medio acondicionado adicionadas con estndar para tener concentraciones de 0.15, 0.20 y 0.25 g/L. Se inyectaron por triplicado 0.30, 0.40 y 0.50 g de protena. Como segundo paso, se utiliz una muestra proveniente de la operacin unitaria 1 y se adicionaron con muestras de un estndar a 0.65 g/L con diferentes soluciones amortiguadoras como se indica en la Tabla 1. Procedimientos similares se utilizaron para las operaciones unitarias 2 y 3. Exactitud. Se prepararon muestras de proceso (medio acondicionado y operaciones unitarias 1, 2 y 3) adicionadas con estndar para obtener concentraciones de 0.10, 0.15 y 0.20 g/ L. Se inyectaron 0.30, 0.45 y 0.60 g de protena. Especificidad. Se determin inyectando por triplicado una muestra de cultivo Mock y muestra de cultivo de EPO. Intervalo de analisis. Se determin como el intervalo evaluado en donde la respuesta cumpli con el parametro de linealidad. Limite de deteccin. Se determin usando la formula LD= 10s/m. Donde s es la desviacin estandar de la ordenada al origen de la curva tipo y m es la pendiente de la curva tipo.

Comparacin del mtodo propuesto contra el inmunoensayo Se llev a cabo una demostracin de la comparabilidad del mtodo de FR-CLUR contra el Inmunoensayo tradicional utilizando diferentes muestras, tanto de cultivo como del proceso de purificacin. El inmunoensayo se llev a cabo utilizando el kit comercial Human Erythropoietin ELISA Kit (R&D Systems).

Resultados y discusin
El mtodo descrito en el presente artculo es capaz de separar un pico definido correspondiente a rhEPO con un tiempo de retencin de 3.2 minutos. La Figura 1 muestra un cromatograma tpico del estndar de EPO. Debido a la especificidad y tiempo de anlisis, esta metodologa puede utilizarse para diferentes muestras a lo largo del proceso con diferentes grados de pureza, como muestras complejas de medio acondicionado (extracto crudo), que contienen protenas diferentes de EPO y componentes del medio de cultivo. La Figura 3 muestra cromatogramas tpicos de muestras de las diferentes operaciones unitarias, puede notarse la disminucin de picos adicionales conforme aumenta el grado de pureza de la muestra.

Figura 1. Cromatograma tpico del estndar interno de EPO recombinante humana, el tiempo de retencin es de 3.2 minutos.

La validacin del mtodo se llev a cabo evaluando los parmetros establecidos por la ICH9. La linealidad del sistema se determin con una curva estndar de 5 puntos en un intervalo de contenido entre 0.15 y 0.75 mg, mientras que para la linealidad del mtodo se construy una curva equivalente con muestras de proceso adicionadas con estndar en el mismo intervalo de concentracin. La Figura 2 muestra las curvas tipo obtenidas; ambas curvas tienen un coeficiente de correlacin superior a 0.99 y tienen la misma pendiente, por lo que la linealidad del sistema

Publicado en lnea: 15 de abril de 2011

Figura 2. Curvas tipo que demuestran la linealidad del sistema y la linealidad del mtodo ( ) Curva tipo con estndar. ( ) Curva tipo con muestra de proceso adicionada con estndar.

y del mtodo cumple de acuerdo a los criterios de aceptacin establecidos para este atributo de medicin (Tabla 2). La precisin del sistema se determin inyectando por sextuplicado 0.45 mg de estndar de EPO, el coeficiente de variacin de la prueba fue de 1.89 %. La precisin del mtodo se determin al adicionar a muestras del proceso de concentracin conocida una muestra de estndar para llevarlos a una concentracin final conocida en tres niveles diferentes (Tabla 1). Las muestras se analizaron por triplicado y se calcularon sus coeficientes de variacin. Todas las muestras, en todos los niveles de la prueba tuvieron coeficientes de variacin menores al 5 %, en el caso de las muestras del proceso de purificacin su matriz no tuvo efecto sobre la precisin (Tabla 2). La exactitud se determin por el porcentaje de recobro obtenido en muestras adicionadas con el estndar de diferentes etapas del proceso, desde la ms compleja (medio acondicionado) a la ms pura (operacin unitaria 3), en la Figura 3 se muestran cromatogramas tpicos de las 4 etapas del proceso. Los recobros cumplieron con los criterios establecidos entre 95 al 105%, exceptuando el nivel 1 de la operacin unitaria 1 que tuvo 108% de recobro, esta muestra cumple en un intervalo de concentracin entre 0.45 y 0.75 mg (Tabla 2), demostrando que el mtodo es exacto, que las matrices evaluadas del proceso

Figura 3. Cromatogramas tpicos de muestras de diferentes etapas del proceso de obtencin de EPO recombinante.

y el tratamiento de la muestra, no interfieren en la exactitud del mtodo. La especificidad del mtodo se determin utilizando una muestra obtenida de un cultivo con clulas mock, que contiene los mismos componentes del medio, pero sin EPO, el cromatograma no presenta ningn pico en el tiempo de retencin de EPO (Figura 4). La muestra mock es muy compleja ya que tiene compuestos provenientes del medio de cultivo y del metabolismo celular. Ninguno de estos interfiere con el anlisis. No se demostr interferencia mediante la adicin de otras protenas recombinantes. Por ltimo, se llev a cabo una comparacin de las estimaciones obtenidas por el mtodo propuesto en este artculo y el mtodo tradicional por ELISA de muestras de cultivo, los resultados muestran que ambos mtodos presentan estimaciones comparables, despus de convertir el resultado a sus unidades respectivas usando la equivalencia descrita en la farmacopea de EPO de 100,000 UI/mg.11 Las diferencias de cuantificacin entre los dos mtodos presenta CV entre 0.07 y 21%, estas diferencias las podemos atribuir al mtodo de ELISA que tiene coeficientes de variacin alrededor de 15%, mientras que la

70

70

70

Operacin unitaria 1 Amortiguador 0.70 g/L Tris-NaCl (L) (L) 210 210

Tabla 1. Preparacin de muestras adicionadas de la operacin unitaria 1.

Estndar 0.65 g/L (L) Amortiguador Volumen de de fosfatos inyeccin (L) (L) 103 2 2

210

110

63

17

10

57

0.60

0.45

0.25

Cantidad inyectada (g)

Publicado en lnea: 15 de abril de 2011

Volumen 42 Nmero 2 Abril - Junio 2011. Ahead of print

Atributo de Medicin Linealidad del sistema Linealidad del mtodo

Tabla 2. Criterios de aceptacin y resultados de la validacin de rhEPO por FR-CLUR.

Parmetro Criterio Resultado

Dictamen Cumple

R2 b

Relacin x/y m

FrF(gl r, gler,0.99) 0

0.98

2288819-2516383 Cumple 0.99

Estadsticamente=0 0.98

-136447-8333.87 0.99

Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Cumple

R2 Precisin del sistema Precisin del Medio mtodo Acondicionado Operacin unitaria 1 Operacin unitaria 2 Operacin unitaria 3 CV (%) CV (%)

2178580-2469603 1.89 Nivel 1 2.20 Nivel 2 1.47 Nivel 3 1.49

Verdadero Cumple

5.00 5.00

CV (%)

5.00

Nivel 2 0.45

Nivel 1 0.64

CV (%)

5.00

Nivel 3 1.04 Nivel 2 1.45

Nivel 1 1.00

CV (%)

5.00

Nivel 3 0.47

Nivel 2 3.02

Nivel 1 0.33

Nivel 3 0.48 Medio Acondicionado

Exactitud

de % del recobro

= 100 5.00%

Nivel 1 102 Nivel 2 100.3 Nivel 3 97.89 Nivel 1 2.59 Nivel 2 1.80 Nivel 3 1.29 Nivel 1 108

CV (%)

5.00 %

Operacin unitaria 1

de % del recobro

= 100 5.00%

Nivel 2 99.56 Nivel 3 97.61 Nivel 1 3.51 Nivel 2 2.20 Nivel 3 1.66

No cumple*

CV (%)

5.00 %

Publicado en lnea: 15 de abril de 2011

continuacin Tabla 2
Atributo de Medicin Exactitud (contina) Operacin unitaria 2 Parmetro Criterio Resultado Nivel 1 100.22 Dictamen Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple Verdadero Cumple

de % del recobro

= 100 5.00%

Nivel 2 97.48 Nivel 1 1.02 Nivel 2 1.52 Nivel 3 1.61

CV (%)

5.00 %

Nivel 3 96.44

Operacin unitaria 3

de % del recobro

= 100 5.00%

Nivel 2 102.44 Nivel 1 0.37 Nivel 2 1.21

Nivel 1 104.78

CV (%)

5.00 %

Nivel 3 100.39

Especificidad

Respuesta de muestra negativa

No presenta respuesta en el tiempo de retencin de EPO

Cromatograma sin pico de EPO

Nivel 3 2.08

el orden de 100,000 veces, con la finalidad de se interpole el valor de la seal dentro de la curva estndar. El mtodo de FRCLUR reportado aqu tiene un limite de deteccin mayor (0.04 mg, Tabla 2), pero % CV menores que el ELISA tradicional, los lmites de cuantificacin e intervalo de medicin son adecuados para las muestras intencionadas. Adems el tiempo de anlisis es muy diferentes, de 4.5 h para el ELISA y 5 minutos para el FR-CLUR, favoreciendo de esta forma el control de procesos.

Muestra Fig ura 4. Especif icidad del mtodo cromatog raf ico de cuantificacin de EPO por FR-CLUR. 1 2 3 4 6 7

Tabla 3. Comparacin entre el mtodo de ELISA y FRCLUR para la cuantificacin de rhEPO.

ELISA UI/mL 5089 5503 5767 3739 mg/mL 0.037 0.058 0.065 0.087 0.086 0.092 0.072 0.055 0.051 FR-CLUR Diferencia en % mg/mL 0.034 0.045 0.060 0.097 0.073 0.041 0.039 23.5 25.5 1.3 7.6 7.7 8.1

%CV 6.71

22.4

19.60 17.45 6.26 0.07 7.01 21.5

validacin del mtodo de FR-CLUR tiene coeficientes menores al 5%. As mismo las diferencias de cuantificacin medidas en % van de 1.3 al 25%. Estos resultados se muestran en la Tabla 3. La sensibilidad del mtodo de ELISA es alrededor de 25 pg/mL, esto es muy til para medir concentraciones sricas de EPO, pero incrementa el error de preparacin de muestras de procesos productivos por la dilucin que se lleva a cabo en

6502 8738

7243 9245

8636

0.099

11.5 3.4

0.089

2.129

4.83

Publicado en lnea: 15 de abril de 2011

Volumen 42 Nmero 2 Abril - Junio 2011. Ahead of print

Conclusiones
En este estudio se demostr que el mtodo de cuantificacin por FR-CLUR es adecuado para estimar la concentracin de EPO en muestras de medio acondicionado y de las operaciones unitarias 1, 2 y 3, segn los atributos de medicin evaluados de linealidad, precisin, exactitud y especificidad que cumplieron con los criterios establecidos. Adems, las diferentes matrices en las que se encuentra el analito durante su purificacin no tienen efecto sobre la exactitud y precisin del mtodo. Esta tcnica pude ser utilizada para el seguimiento del proceso y se considera factible sustituir el mtodo de ELISA por el mtodo de FR-CLUR que es ms econmico y rpido.

Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo la Direccin de Biotecnologa de Probiomed, SA de CV y la colaboracin de los grupos de Cultivo y Purificacin por las muestras utilizadas en el presente trabajo. A Maricela Cruz Soto por el medio Mock.

Referencias
1. Singh AK, Szczech L, Tang KL, Barnhart H, Sapp S, Wolfson M, Reddan D. Correction of anemia with Epoetin alfa in chronic kidney disease. N Engl J Med. 2006; 355(20):2085-2098. 2. Bietlot HP, Girard M. Analysis of recombinant human erythropoietin in drug formulations by high performance capillary electrophoresis. J Chromatogr A. 1997; 759(12):177-184.

3. Ahn WS, Jeon JJ, Jeong YR, Lee SJ, Yoon SK. Effect of culture temperature on erythropoietin production and glycosylation in a perfusion culture of recombinat CHO cells. Biotechnol Bioeng. 2008; 101(6):1234-1244. 4. Causon R. Validation of chromatographic methods in biomedical analysis viewpoint and discussion. J Chromatogr B. Biomed Sci App. 1997; 689(6):175-180. 5. Novkov L, Matysov L, Solich P. Advantages of application of UPLC in pharmaceutical analysis. Talanta. 2006; 68(3):908-918. 6. Cueto-Rojas HF, Prez NO, Prez-Snchez G, OcampoJurez I, Medina-Rivero E. Interferon a 2b quantification in inclusion bodies using Reversed Phase-Ultra Performance Liquid Chromatography (RP-UPLC). J Chromatogr B. Analyt Technol Biomed Life Sci 2010; 878(13-14):1019-1023. 7. Baranowska I, Magiera S. Analysis of isoflavones and flavonoids in human urine by UHPLC. Anal Bioanal Chem. 2011; 399(9):3211-3219. 8. Szepesi G. How to use reverse-phase HPLC. 1. Ed. New York: John Wiley & Sons. 1992, p. 356. 9. International Conference on Harmonisation (ICH). Technica l Requ irements for t he Reg ist rat ion of Pharmaceuticals for Human Use, Validations of Analytical Procedures: Text and Methodology. 2005. Q2 (R1): 1-13. 10. Medina R. E, Lpez M. CA, Prez R. NO, Ferlan I. Determinacin de Tween-20 en AgsHB por un mtodo espectrofotomtrico. Rev Mex Cienc Farmac. 2008; 39(2):11-15. 11. Directorate for the Quality of Medicines and HealthCare of the Council of Europe. Capitulo 01/2008:1216 Er y tropoietin concentrated solution In: European Pharmacopoeia 6.0. 2008. Vol. 2. p. 1813-1817.

Publicado en lnea: 15 de abril de 2011