La cromatografia y sus aplicaciones

Bibliografa de consulta: Cromatografia sobre papel y capa fina. Electrofresis. (I. Smith y J. Feinberg) Quimica Analtica Cualitativa. (Burriel) Vnculos Web en Internet

Qu es la cromatografia? Es la tcnica ms desarrollada en los ltimos aos, empleada en la qumica analtica. Su empleo presenta notables ventajas: 1. Es sencilla, rpida y no requiere aparatos complicados. 2. Abarca escalas microanalticas hasta escalas industriales. 3. Es una tcnica poco o nada destructiva que puede aplicarse a sustancias lbiles. Constituye una metodologa imprescindible en estudios bioqumicos, toxicolgicos, estructurales, etc. No solo utilizando como tcnica de separacin e identificacin, sino como mtodo preparatorio, incluso a escalas industriales. La palabra cromatografia proviene de kromatos, color y graphos, escrito. Una de las definiciones de la tcnica ms correcta seria, la dada por Keulemans: "Mtodo fsico de separacin en el que los componentes a separar se distribuyen en dos fases, una de las cuales constituye un hecho estacionario de gran desarrollo superficial y la otra un fluido que pasa a traves o a lo largo del lecho estacionario (fase mvil)." En todo proceso cromatografico la fase mvil es la que provoca un movimiento de las distintas especias para que abandonen el medio soporte, y la fase estacionaria la que suministra el efecto retardador, selectivo para cada componente, que condiciona que cada uno de ellos se desplace con distinta velocidad.

CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS: Son clasificados segn el estado fsico de la fase, el mecanismo de separacin y el tipo de soporte. La fase mvil puede ser un gas o un lquido, y la estacionaria u lquido o un slido. Se pueden establecer cuatro tipos de cromatografia: gas-lquido, lquido-lquido, gas-slido, lquido-slido. Los mecanismos por los que los diferentes componentes son separados en los procesos cromatograficos son variados. En algunos casos participan ms de un mecanismo en un mismo proceso de separacin por lo que dificulta la

clasificacin. Los principales mecanismos que intervienen en la separacin cromatografica son: Adsorcin: Gases o lquidos contenidos en la fase mvil son retenidos por una adsorcin selectiva en la superficie del slido que constituye la fase estacionaria. En la interfase slido-fase mvil hay un aumento de concentracin respecto a la inicial. Este mecanismo controla la cromatografia gas-slido y lquido-slido. Reparto: Los componentes de la fase mvil son retenidos por la fase estacionaria liquida en funcin de su solubilidad en ella. Si las dos son liquidas se tiene un proceso de extraccin en continuo. Intercambio Ionico: La fase estacionaria constituida por un slido intercambiando iones con iones contenidos en la fase mvil, liquida. El intercambio de iones slido-solucin esta regulado por la afinidad quimica de los iones con ambas fases y por sus respectivas concentraciones. Tamao Molecular: Especies neutras de alto peso molecular pueden ser separadas en virtud de su tamao donde la fase estacionaria es un gel hidrofilico altamente poroso que retiene las molculas de menor tamao al de los poros. Las molculas de mayor tamao son retardadas en su paso por pequeas fuerzas de adsorcin de la superfie externa del gel que luego son excluidas de la fase estacionaria. Migracin Elctrica: Los componentes inicos de una muestra son separados por su diferente velocidad y sentido con que se desplazan en un campo elctrico. La fase estacionaria puede ser un papel saturado por un electrolito. La aplicacin de un campo provoca un movimiento diferencial de los iones dependiendo de su carga y de su movilidad ionica. CROMATOGRAFIA EN PAPEL Qu es la cromatografia en papel? La cromatografia en papel es la tcnica de separacin e identificacin de sustancias qumicas mediante un disolvente que se mueve sobre hojas o tiras de papel de filtro. Se toma una pieza de papel de filtro y cerca de uno de sus extremos se deposita una gota de la solucin que contiene la mezcla de las sustancias que se quieren separas. Se deja secar la gota y quedara la mancha de las sustancias mezcladas. El extremo del papel mas proximo a la mancha se introduce en un disolvente apropiado, pero sin que la mancha llegue a introducirse en l. Existen muchos tipos de cromatografia sobre papel, una primera divisin de las variadas clases podra ser: 1- Cromatografia ascendente: el disolvente se encuentra en el fondo del recipiente que sostiene al papel y va subiendo a traves de el por capilaridad. 2- Cromatografia descendente: el disolvente esta en un recipiente esta en un recipiente del que cuelga el papel, fluye por l hacia abajo por una combinacion de capilaridad y gravedad.

En ambos casos el disolvente avanza a lo largo del papel pasando por encima de la mancha, al avanzar disuelve y arrastra las sustancias de la mancha, cada una de ellas se mueve, por lo general a distinta velocidad que las otras. Se deja actuar el disolvente un tiempo determinado, se seca el papel y se observan las sustancias separadas si tienen color, o en caso de no tener color se procede al revelado por una reaccin quimica apropiada. Esta tcnica se conoce como cromatografa monodimencional y el papel resultante recibe el nombre de cromatograma monodimencional.

La resultante de las fuerzas: Cuando el disolvente avanza sobre las manchas de las sustancias, comienzan a actuar dos tipos de fuerzas opuestas: unas que arrastran y otras que retardan. Las fuerzas propulsoras actan apartando las sustancias de su punto de origen y desplasandolas en direccin del flujo de origen. Las fuerzas retardantes tratan de impedir el movimiento de las sustancias, llevndolas fuera del disolvente que fluye y hacia atrs en el papel. La distancia recorrida por cada sustancia a partir del origen, en un tiempo dado, es la resultante de estas dos clases de fuerzas. Fuerzas propulsoras: Cuando se realiza un cromatograma en papel, las fuerzas propulsoras ms importantes son: el flujo de disolvente y la solubilidad de cada sustancia en le disolvente. Flujo del disolvente:

Si la sustancia cromatografiada fuera completa e instantneamente soluble en el disolvente que avanza, por ejemplo agua y azcar, y no actuaran fuerzas de retardo la sustancia ascender desde el origen hasta donde llega el diluyente. En cambio si la sustancia fuera completamente insoluble en el disolvente en movimiento no se movera del origen. La corriente del disolvente es la misma para todas las sustancias de la mancha, as pues, si el disolvente fuese capaz de disolver instantnea y completamente todas las sustancias, estas avanzaran juntas hasta el final de la trayectoria del disolvente y terminaramos donde empezamos con todas las sustancias juntas. Solubilidad: Una fuerza diferencial es, en efecto, la solubilidad. Pocas son las sustancias que ofrecen la misma solubilidad en cualquier disolvente. La particular solubilidad de una sustancia en la corriente del disolvente es una fuerza propulsora que tiende a desplazarla, manteniendola en movimiento a lo largo del papel. Fuerzas retardantes: Hay tambin dos fuerzas retardantes principales: la adsorcin y el reparto. Adsorcin: La celulosa de la que esta hecho el papel de filtro, posee propiedades adsorbentes. Las sustancias depositadas en el papel, en cromatografa, pueden ser ms o menos adsorbidas en el papel. La adsorcin es otra de las fuerzas diferenciales, esto significa que unas sustancias son adsorbidas ms que otras y, por consiguiente, la liberacin de las sustancias de las manchas variar de una sustancia a otra. Esto contribuye de nuevo a la separacin. Mientras que se va realizando el cromatograma, las sustancias mas fuertemente adsorvidas se van quedando atrs, mientras que las adsorvidas con menos fuerza avanzan hacia el frente. Reparto: La cormatografia se basa, en una medida considerable, en la presencia de dos fases liquidas individualizadas. Una de ellas es la corriente del disolvente circulando por el papel de filtro. La otra es la fase acuosa contenida en el mismo papel de filtro. Una hoja de papel de filtro aparentemente seca contiene entre un 6 y 12% de agua firmemente adherida a la celulosa. Aqu es donde entra en funcin el reparto. Cuando una sustancia que es soluble en dos disolventes no mezclados es expuesta al mismo tiempo a ambos, se repartir entre ellos. La cantidad que se encuentre en cada disolvente depender de la relativa solubilidad del soluto en cada uno. El grado de reparto, una vez conseguido el equilibrio, se llama coeficiente de reparto o razon de distribucin. Constante Rf: El ltimo punto alcanzado por el disolvente en su avance se denomina frente del disolvente. Puede usarse como punto de referencia para expresar las distancias relativas recorridas por las diferentes sustancias en un cromatograma. El smbolo utilizado para designar esta distancia relativa es Rf y se define mediante:

distancia recorrida por el compuesto desde el origen Rf = Distancia del origen al frente del disolvente Como el denominador es siempre mayor que el numerador en Rf debera ser un decimal. Por razones de conveniencia se suele expresar como un porcentaje. Asi un Rf de 50 indicara que el compuesto avanzo la mitad de la distancia del frente del disolvente.

Cromatografa de adsorcin en columna La fase estacionaria est constituida por un slido que se empaqueta en una columna, normalmente de vidrio. Los componentes a separar se aaden en forma soluble por la parte superior de la columna, quedando retenidos en la misma. Posteriormente los componentes se desplazan arrastrados por una fase mvil lquida. Dependiendo de la absorcin selectiva de cada uno de ellos por la fase estacionaria se desplazan a distinta velocidad, efectundose la separacin. Para que haya una separacin efectiva de los componentes, su velocidad a travs de la columna debe ser suficientemente diferente y la longitud de la columna, adecuada. Por ejemplo, si por una columna con almina como absorbente se introduce una disolucin conteniendo nitratos de Fe (III), Cu (II) y Co (II) y posteriormente se pasa agua ligeramente acidulada con cido ntrico se observa la separacin de tres zonas diferenciadas (de arriba abajo) pardo- rojiza de Fe (III), azul de Cu (II) y rosa de Co (II). Si se desean apreciar mejor las distintas bandas se puede introducir una solucin de ferrocianuro potsico como revelador. Se observan entonces coloraciones ms intensas; azul oscuro de Fe4 [Fe (CN)6]3, pardo- rojiza de Cu2 [Fe (CN) 6] y verdosa de Co2 [Fe (CN) 6]. a) Anlisis frontal.- Supongamos una disolucin conteniendo tres componentes A, B y C, que se introduce continuamente en una columna en la que la adsorcin sigue el orden C, B, A. La especie menos adsorbida, A, emerge la primera por la parte inferior de la columna, y sigue saliendo indefinidamente. Despus de un perodo en que slo sale A, comienza a salir tambin B, obteniendo una mezcla A + B. Finalmente sale el componente ms retenido C, junto con A y B. b) Anlisis por desplazamiento.- La mezcla a ser separada se absorbe en una pequea zona en la parte superior de la columna. Posteriormente se introduce un disolvente (o una disolucin) que sea ms fuertemente absorbido que cualquiera de los componentes. El efecto resultante es que los componentes son desplazados de la columna por el disolvente- desplazante y, adems, cada uno de ellos desplaza al inmediatamente menos absorbido. A la salida de la columna van saliendo consecutivamente todos los componentes y el desplazador, separados pero uno junto al siguiente.

c) Anlisis por elucin.- Despus de fijar los componentes en la parte superior se pasa un disolvente puro que no se adsorbe. Los componentes van avanzando por la columna dependiendo de la fuerza con que son adsorbidos; cada uno de los cuales es distribuido en una pequea zona. Si la columna es suficientemente larga y los valores de Rf difieren bastante, se puede lograr la separacin de mezclas bastante complejas. En la Fig. VIII-12 se muestra un cromatograma desarrollado por este mtodo. Cada componente puede ser recogido y analizado a la salida de la columna. Adsorbente y eluyentes Son muchos los slidos que se han utilizado como fase estacionaria en cromatografa de adsorcin. Los ms importantes son almina, silicato de aluminio, silicagel, xido, silicato y carbonato de magnesio, xido, carbonato y fosfato de calcio, como inorgnicos; y carbn, almidn y azcares como orgnicos. Normalmente deben ser sometidos a un proceso trmico de activacin superficial antes de su utilizacin. Como eluyentes se utilizan agua, alcoholes, cetonas, steres, cloroformo, tetracloruro de carbono, etc. Su capacidad de elucin depende de su polaridad, del absorbente y de las especies a eluir. Cromatografa de reparto en columna Esta tcnica es semejante a la mencionada anteriormente en cuanto a materiales utilizados, mtodos operativos, etc. La diferencia reside en la fase estacionaria utilizada y, en consecuencia, en el mecanismo de separacin. En cromatografa de reparto la fase estacionaria es un lquido, poco miscible con la fase mvil. Los solutos se distribuyen entre las dos fases dependiendo de su solubilidad en cada una de ellas, es decir, segn su coeficiente de reparto. Aunque el mecanismo fundamental de la separacin es la extraccin o reparto, es prcticamente imposible evitar adsorciones por parte del slido soporte, por lo que muchas de las separaciones son empricas, no pudiendo realizarse un exacto tratamiento terico. Los slidos soportes ms utilizados son el silicagel, el polvo de celulosa y la tierra de diatomeas; menos aplicacin tienen el almidn y el relleno de bolas de vidrio. Cromatografa sobre geles porosos Es un tipo de cromatografa que se aplica, fundamentalmente, a la separacin de productos macromoleculares sobre geles hinchables por agua o por cualquier otro lquido previamente escogido. El fundamento de este tipo de cromatografa consiste en que al hincharse el gel queda una cadena muy abierta con grupos terminales generalmente polares que son capaces de adsorber agua u otros disolventes polares. Segn el nmero de ligaduras entre las grandes cadenas existe un tamao crtico (lmite de exclusin) de molcula que puede entrar en el interior del gel, mientras que las
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molculas de mayor tamao pasarn a travs del mismo, con lo que, en principio, se origina una separacin de molculas de acuerdo con su diferente tamao. El fenmeno puede considerarse como una filtracin a travs de un tamiz molecular y por eso a esta tcnica se la llama tambin cromatografa con tamiz molecular (ctm); as mismo se la ha denominado, Penetracin sobre gel, exclusin molecular y tamizado molecular. Cromatografa de capa fina La llamada capa fina consiste en una placa de vidrio, rectangular o cuadrada, denominadas cromatoplacas, o simplemente placas sobre cuya superficie se deposita una capa uniforme muy delgada (en ocasiones de algunas micras de espesor) de una substancia absorvente, casi siempre silicagel o almina, en condiciones tales que resulte uniformemente extendida y suficientemente adherida. En general, de hace una papilla acuosa con el adsorbente, que se deposita sobre la placa mediante un aplicador adecuado. Las placas se secan en estufa para activar la superficie del adsorbente y se encuentran aptas para efectuar la cromatografa. A las ventajas de resistencia a la temperatura y a los reactivos agresivos de la cromatografa en capa fina, hay que aadir una mayor nitidez y sensibilidad de los cromatogramas, as como una mayor rapidez en su desarrollo. Adems, los cromatogramas obtenidos pueden conservarse indefinidamente y archivarse si se pulveriza la placa revelada con una dispersin de un plstico transparente y especial donde quede grabado el cromatograma sobre la pelcula endurecida del plstico, que se separa fcilmente del soporte. Las aplicaciones son semejantes a las de la cromatografa de papel. Electroforesis El fundamento de la tcnica consiste en depositar sobre un medio poroso una mezcla de especies cargadas (algunas pueden ser neutras). Por aplicacin de un campo elctrico entre los extremos del soporte poroso las especies se separan en funcin de su carga y su movilidad inica en ese medio. Para favorecer el paso de la corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos), que son generalmente disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el soporte poroso, debidamente escogidas para que no formen precipitados con las especies del problema. Como soportes se han utilizado almina, lana de vidrio, almidn, agar- agar, gel de silice, etc. tanto en columna como en capa fina, pero quizs el mtodo ms utilizado es el que emplea como soporte papel. Se suelen utilizar tiras de acetato de celulosa, casi transparentes, que por poseer una estructura ms uniforme y un poro menor que el del papel filtro, tienen un mayor poder de resolucin. A estas ventajas del acetato de celulosa se aade su fcil solubilidad en cidos, lo que facilita la posterior determinacin de las especies separadas. La emigracin de las distintas especies en el papel depende de la magnitud y signo de su carga, del tamao de la partcula, de las propiedades adsorbentes del

soporte (que deben atenuarse en lo posible), del voltaje aplicado y de la intensidad de corriente.

CROMATOGRAFIA DE GASES Esta tcnica es similar a la cromatografia de columna, con la diferencia de que el sistema es cerrado y la fase mvil es un gas. La separacin de los componentes gaseosos se produce por adsorcin selectiva sobre un slido (C.G.S.) o por reparto entre un gas inerte y un lquido no voltil que constituye la fase estacionaria (C.G.L.). En la actualidad esta tecnica (C.G.L.) es la ms empleada, aplicandose el analisis de gases o de lquidos y slidos que puedan volatilizarse a temperatura no superior a 400C. L C.G.S. es anloga a la C.L.S. Los componentes del gas problema son sostenidos selectivamente por un slido absorbente dispuestos en columna metlica, recta o en espiral. El gas problema es inyectado en la corriente de un gas inerte que le conduce hasta la columna y que hace la fase mvil. En la distribucin de los componentes del problema entre el gas portador y el slido absorvervente se verifica una separacin por lo que emergen de la columna a distintos tiempos pasando finalmente por un detector que los identifica y cuantifica. En la C.G.L. la fase estacionaria es un lquido no voltil absorbido en un soporte slido que rellena la columna. Los componentes del gas problema son desplazados selectivamente, como en la cromatografia de reparto, por el gas portador que fluye de manera continua. Los componentes de la muestra se separan de acuerdo con sus coeficientes de reparto entre las dos fases.

INSTRUMENTACION Esta cromatografia es tan sencilla como las dems, necesita un montaje instrumental ms complejo debido al trabajo con gases, lo que obliga a trabajar en sistema cerrado y a controlar caudales, presin y temperatura. FASES MOVILES: como gases inertes portadores se utilizan H, He, N y aire. La eleccin del gas portador depende del sistema en estudio y sobre todo del detector que se utilice. FASE ESTACIONARIA: en C.G.S. los absorbentes mas utilizado son carbn, alumina, silicagel y tamises moleculares. En el C.G.L. es necesario un slido soporte adsorvente y un lquido no voltil, el slido soporte mas utilizado es la tierra diatomeas. Los lquidos que constituyen la fase mvil son muchos, depende de la mezcla a separar y de la temperatura de operacin (esteres, polioles, aceite de silicona, etc.).

DETECTORES: son muchos tipos de detectores, estos actan siempre por comparacin de alguna propiedad fsica o quimica (densidad, calor de combustin, etc.) del gas portador solo (antes de la introduccin de la muestra) y de la mezcla de gas portados y componentes de problemas. Los detectores se diferencian principalmente por su selectividad y sensibilidad, por destruir o no la muestra y por ser integrales o diferenciales, los primeros miden continuamente la muestra acumulada desde el principio del analisis y los segundos miden concentraciones instantneas. Se utilizan ms los detectores diferenciales.

EVALUACION DE LOS CROMATOGRAMAS Los distintos componentes de la muestra emergen de la columna a tiempos diferentes dependiendo de su retencin en la misma, definido como volumen de retencin el volumen de mezcla gaseosa que emerge de la columna entre la introduccin de la muestra y la aparicin de un componente. Se calcula a partir del tiempo transcurrido y de flujo gaseoso. V r = tr F El volumen de retencin, asi como el tiempo de retencin (para un flujo constante) son variables cualitativas que permiten la identificacin de especies. Normalmente se utilizan los valores respecto al mximo del aire (V'r) o valores relativos frente a una especie patron. Estas variables cualitativas solo son constantes cuando se producen exactamente las condiciones, por lo que no son muy utilizadas para identificaciones directas. Utilizando muestra patrones, la cromatografia de gases constituye el mtodo rpido y excelente para confirmar la presencia concreta en una muestra. Adicionando un patrn al problema, no deben aparecer nuevos picos en el cromatograma y deber observar el rea que constituye la muestra patrn. La evaluacin cuantitativa se basa en que, en determinadas condiciones, el rea del pico (detector diferencial) y la altura del escaln (detector integral) son proporciones a la concentraciones de especies.

APLICACIONES La cromatografia de gases constituye el mejor mtodo analtico ideado para la separacin de gases, lquido o slidos que pueden pasar fcilmente al estado de vapor o transformndolos previamente en otros estados voltiles Ej. metilacin de cidos grasos en el analisis de aceite y a resuelto problemas de muy difcil solucin para la quimica analtica empleada hace una dcada. Por eso su utilizacin es indispensable en analisis industriales, forenses bromatologicos, toxicologicos, clnicos y de contaminacin ambiental.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

En las cromatografas clsicas, en las que la fase mvil es un lquido que fluye a traves de un slido por el efecto de la gravedad para alcanzar alta resolucin seria necesario emplear columnas excesivamente largas, lo que se traducira en un desarrollo muy lento de los cromatogramas. Estos inconvenientes se han resuelto con la cromatografia de alta resolucin, en la que se trabaja con pequeas columnas, muy empaquetadas y forzando el paso de la fase mvil mediante elevadas presiones, con lo que se consiguen separaciones muy efectivas en un plazo muy corto de tiempo. Dependiendo de la fase estacionaria, el mecanismo de separacin puede ser reparto, adsorcin, tamao molecular (geles) e incluso cambio ionico, aunque los mtodos mas utilizados estn basados en reparto y adsorcin. El esquema fundamental de un cromatografo de alta resolucin esta constituido por un deposito y un dispositivo de bombeo de la fase mvil que opera a elevada presin (hasta 500 atm.), un sistema de inyeccin de la muestra, columnas resistentes, generalmente e acero inoxidable, rellenas de fase estacionaria, un detector y un sistema de registro grfico. La columna y los detectores van introducidos en termostatos. Los detectores ms utilizados en esta tcnica estn basados en absorciometria UV y en medida de ndices de refraccin, siendo los cromatogramas obtenidos semejantes a los de cromatografia gaseosa con detector diferencial.

APLICACIONES 1. 2. 3. 4. 5. 6. Concentracin de trazas Separacin de iones interferentes en analisis clsico Separaciones de iones de caractersticas similares Desmineralizacin del agua Preparacin de disoluciones patrn Disolucin de sustancias insolubles.

CLASIFICACION DE LAS CROMATOGRAFIAS

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA ABIERTA
Nombre de la Tcnica C. slido-lquido C. lquido-slido C. sobre geles Electroferesis Fase estacionaria Fase mvil Sol. absorbente Lquido Liq. Absorbido en Lquido soporte sol. Sol. Gel poroso Lquido Sol. polmero Liq. ionico Desplazamiento fase mvil Gravedad Gravedad Gravedad Mecanismo de separacin Adsorcin Reparto, Adsorcin Tamao

Emigracin inica Emigracin inica Gravedad Afinidad quimica

C. intercambio Sol. Cambiador Lquido ionico ionico

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CROMATOGRAFIA EN COLUMNA CERRADA

C. de gases Sol. Absorbente Gas Liq. Absorbido en soporte sol. C. liquida de alta Sol. Diversos y Liq. resolucin liq. Absorbidos en soporte sol. Presin Adsorcin

Presin

Adsorcin, reparto, afinidad quimica, tamao

CROMATOGRAFIA EN PAPEL
C. adsorcin en Slido (papel) papel Lquido polar Capilaridad (gravedad) Capilaridad (gravedad) Capilaridad (gravedad) Emigracin inica Adsorcin Reparto (adsorcin, af. Quimica) Afinidad quimica Emigracin inica

C. de reparto en Liq. Polar Lquido no polar papel absorbido en papel slido C. cambio inica Slido Lquido en papel Electroferesis en Slido (papel) Lquido inico papel

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