UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA

NOMBRE: Gustavo Sandoval

CURSO: 9no. alimentos
FECHA: 28 de marzo 2011

CONTROL DE CEPAS

Para realizar procesos de investigación, producción en un laboratorio de microbiología o

biotecnología, se trabaja con cultivos de microorganismos o colecciones los cuales son de gran
ayuda, ya que, podemos preservar sus características deseadas que son útiles para nuestra
investigación, existen varios requisitos que deben ser controlados en las colecciones:

 Documentación
 Estabilidad de propiedades
 Estandarización de crecimiento
 Identificación y autenticidad de cepas
 Pureza
 Viabilidad o monitoreo
 Metodologías de preservación
 Control de condiciones ambientales
 Control y mantenimiento de equipos

El uso de los microorganismos ha sido clave en el enfrentamiento y solución de los graves

problemas de la humanidad en la agricultura y la alimentación de los pueblos, en la salud animal y
humana, en la búsqueda de nuevas fuentes de energía y en la conservación del medio ambiente.

El estudio de microorganismos aun en laboratorios con escasos recursos, involucra

frecuentemente el uso de cultivos vivos. Estos necesitan ser viables al menos durante el estudio y
los experimentos, y si se prueba su importancia deberán ser mantenidos y conservados en una
colección de cultivos microbianos para garantizar su disponibilidad. El objetivo primario para la
concepción de una colección de cultivos microbianos es mantener las cepas en un estado viable
sin cambios morfológicos, fisiológicos o genéticos. Con el desarrollo de la biotecnología y la
bioingeniería el mantenimiento de esta estabilidad y viabilidad adquiere mayor importancia.
PRESERVACIÓN

Los cultivos de microorganismos con determinadas características son esenciales para la mayoría
de los ensayos microbiológicos. Los microorganismos tienen una tendencia inherente a mutar en
cultivos de laboratorio, por lo que es muy importante el uso de procedimientos para mantenerlos
viables y genéticamente estables. Para lograr estas condiciones se han establecido varios métodos
de preservación con los cuales se trata de mantener el cultivo viable y con un mínimo de cambios
genéticos lo más cercano posible al aislamiento original. La mayoría de los métodos de
preservación logran reducir el ritmo metabólico de los organismos por retención de nutrientes,
agua y oxígeno; por reducción de la temperatura de conservación; o por combinación de ambos.

Los métodos desarrollados para la preservación de los microorganismos se pueden clasificar en:
subcultivos, desecación, liofilización y congelación.

PUREZA

Tiene como objetivo comprobar que los cultivos que conservamos se encuentran puros. Es obvio
que las cepas deben estar puras, sin embargo en ocasiones es necesario conservar cultivos mixtos,
pues existen cepas que no pueden crecer sin su simbionte u hospedero, pero esto debe estar bien
definido y registrado. Este chequeo debe realizarse y registrarse antes de la preservación,
inmediatamente después y durante el almacenamiento, y puede realizarse en la misma placa petri
con la cual se hace el chequeo de viabilidad. Estas placas son examinadas para detectar ausencia
de contaminantes.

VIABILIDAD

El chequeo de viabilidad se realiza con el objetivo de detectar el nivel de viabilidad del cultivo. Lo
cual permite que en la medida que ésta disminuya se puedan tomar medidas para impedir la
pérdida del material. Este chequeo al igual que el de identidad y pureza, debe realizarse y
registrarse antes de la preservación, inmediatamente después y durante el almacenamiento.

Este monitoreo puede realizarse por diferentes métodos; en el caso de la preservación por el
método de subcultivo, es suficiente realizar un pase de cultivo a un medio fresco, este se incuba y
posterior al tiempo de incubación se puede determinar si el cultivo está viable por la observación
de colonias típicas del microorganismo; pero este método es cualitativo. En el caso de métodos de
conservación a largo plazo como la liofilización y congelación, este control se realiza
cuantitativamente por el método de conteo en placas utilizando diluciones seriadas.

Viabilidad = número de colonias al tiempo de muestreo x 100

Número de colonias al inicio de la conservación

IDENTIFICACIÓN Y AUTENTICIDAD

Para controlar y preservar cepas se necesita saber que se esta aislando, que característica me sirve
de ese microorganismo, y una vez purificado se lo puede aislar e identificar.

Sin realizar estos procedimientos previos podemos tener un resultado negativo o equivocado. El
chequeo de la autenticidad sirve para comprobar que nuestro cultivo contiene las características
de la cepa original, es importante la determinar que no estén alteradas o hayan sufrido una
mutación.

PREUBAS BIOQUÍMICAS

Las pruebas bioquímicas se realizan para verificar que la cepa aislada sea la correcta y mantega sus
características intactas y no haya mutado o cambiado, casi siempre se realiza las siguientes
pruebas:

Primarias: nos permiten determinar el género de la cepa, ya que, son pruebas que tienen algo en
común con varias bacterias, es decir, que determina características a fines, para saber a que
género pertenecen.

 Tinción Gram
 Morfología
 Catalasa, oxidasa
 OF
 Fermentación de glucosa
 Formación de esporas
 Aerobiosis, anaerobiosis
 Movilidad

Secundarias: se utilizan para saber la especie de la bacteria, son mucho más específicas ya que nos
demuestran características únicas en ciertas bacterias.

 Producción de pigmentos
 Producción de indol
 Producción de coagulasa
 Producción de fenilalanina desaminasa
 Producción de dextrano (Leuconostoc Mesenteroides)

BIBLIOGRAFÍA

 LEVEAU J. Y., BOUIX M., “Microbiología Industrial”, Editorial Acribia, Zaragoza – España,
pág. 72 – 177, 187, 316 - 318
 GONZALES AMELIA, “Aseguramiento de la calidad en colecciones de cultivos microbiano”,
La Habana - Cuba
AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PROPGACIÓN DE LEUCONOST MESENTEROIDES

DESCONGELACIÓN
DILUCIONES

1 ml

1 ml 1 ml

AGAR MRS AGAR SACAROSA 5% AGAR TRIPTICASA SOJA (TSA)

Incubar a 30 oC Incubar a 30 oC Incubar a 30 oC

2-3 días 2-3 días 2-3 días

LEUCONOSTOC LEVADURAS, BACTERIAS

BACTERIAS LÁCTICAS
MESENTEROIDES GRAM + Y -

VIABILIDAD

Tinción Gram y
Pruebas bioquímicas
PRESERVACIÓN DE CEPAS:

Una vez confirmada la viabilidad, pureza, identificación microscópica por coloración de Gram y
actividad enzimática de los microorganismos, se procedió a preparar suspensiones de bacterias
con 10 x108 UFC/ml, Escala de Mc Farland.

Método de preservación: Congelación

 Añadir 2,0 ml del agente crioprotector estéril (caldo BHI con glicerol 20%, caldo nutritivo
con glicerol 50% o glicerol al 10%) al cultivo.

 Raspar la superficie del cultivo, utilice un aplicador de madera o perlas de vidrio estériles
para preparar una suspensión de por lo menos 107-108 cel / ml.

 Dispensar alícuotas de 0,1-0,2 ml en criotubos de 2,0 ml estériles previamente rotulados

con los datos del cultivo.

 Colocar los tubos inmediatamente a las temperaturas de congelación. Cuando el

laboratorio no dispone de equipos que alcancen temperaturas de -70, las suspensiones
deben elaborarse en caldo nutritivo con 50% de glicerol para que puedan ser almacenadas
a -20°C.

 Si el almacenamiento utilizado es de - 70ºC, se puede realizar la congelación en dos pasos,

primero a - 20 ºC y luego a - 70 º C, para evitar choque térmico.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

CATALASA:

Comprobación de la existencia de la enzima catalasa que descompones el peróxido de hidrógeno

en agua y oxígeno molecular.

KIA:

Mediodecultivo frecuentemente usado en microbiología de alimentos para la diferenciación de

enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa y lactosa, y a la producción de ácidos.

CITRATO DE SIMMONS:

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato

como única fuente de carbono y energía.
PUREZA

 Se reactiva la cepa del congelador en un medio de baja selectividad, se incuba a 37ºC

durante 24 horas.
 Se realiza siembras por técnica de vertido con diferentes diluciones en medios de baja
selectividad (TSA, PCA) y AS.
 Se elige aquellos grados de dilución con los cuales sea posible aislar colonias
independientes.
 La toma y siembra de la colonia aislada desde la placa original se lleva a cabo con ayuda de
un asa.
 Se utiliza la técnica de estriado en medios no selectivos (agar nutritivo, TSA, PCA).
 Con colonias bien aisladas se realiza una tinción gram para comprobar su purificación.