Técnicas histológicas.

Dos de las técnicas básicas que permiten el estudio del embrión temprano de aves son: la
observación de embriones in toto (enteros) o de cortes histológicos de embriones en
diferentes estadios del desarrollo. La primera aproximación nos permite visualizar la
organización general del embrión, mientras que los cortes histológicos hacen posible
estudiar la organización interna en diferentes niveles y tiempos de desarrollo del embrión.
En este práctico intentaremos brindar una visión general sobre la organización de uno de
los modelos de estudio del desarrollo en aves. El pollo ofrece varias ventajas como modelo,
entre ellas es de fácil obtención y se puede disponer de embriones en diferentes estadios del
desarrollo simplemente incubándolos a una temperatura dada por el período de tiempo
correcto (ver gráfica I). Sin embargo es de destacar que las primeras etapas del desarrollo
(segmentación) son difíciles de observar ya que transcurren dentro del oviducto, y también
es difícil obtener embriones en gastrulación en forma reproducible ya que hay pequeñas
diferencias en el progreso de los embriones a través de estas etapas. Por consiguiente se
trabajará con embriones incubados durante tiempos de 30-38hrs, a 37ºC en un ambiente
húmedo. Los embriones se disecarán a diferentes tiempos y se procesarán para microscopía
óptica reservando algunos para obtener preparados in toto.

EXTRACCIÓN DE EMBRIONES
Los huevos se sacan de la incubadora y se los sostiene sin girarlos entre las manos, de
forma tal que queden con el extremo romo hacia arriba. Se comienza la disección
rompiendo levemente la cáscara golpeando con la parte de atrás de una pinza en la parte
superior del huevo, de manera tal que luego se pueda insertar una pinza y retirar de a poco
la cáscara.
Sobre la yema del huevo se observará el disco en el cual se desarrolla el embrión. Para
retirar este disco se pueden seguir dos procedimientos:

1. Se retira la mayor parte posible de clara para que el disco embrionario no se desplace (se
va a ir derramando a medida que se saque más cáscara). Luego con una tijera se recorta las
membranas extraembrionarias en tres o cuatro cortes por alrededor del disco embrionario.
De esta forma el embrión quedará libre, podrá ser levantado con una cuchara y colocado en
PBS. Luego, bajo lupa, se puede separar el embrión y colocarlo directamente en fijador.
2. Se vuelca el contenido del huevo en una placa de Petri intentando que no se rompa la
yema y que el embrión quede expuesto. Se prepara un anillo de papel de filtro cuyo orificio
interno sea apenas mayor que el embrión. Utilizando pinzas se apoya este anillo sobre el
embrión, de forma tal que éste se observe centrado en el orificio y quede rodeado por el
papel de filtro.

Presionando levemente se logra que el papel se adhiera a las paredes del saco vitelino. A
continuación se procede a cortar dicha membrana, cuidando especialmente el realizar esto
todo alrededor del papel de filtro. Utilizando una pinza adecuada se levanta la corona de
papel de filtro con el embrión adherido (el aro de papel de filtro oficia de bastidor). Éste se
coloca en una placa de Petri con PBS para lavar los restos de vitelo que puedan quedar.
Luego de esto podemos observar al embrión bajo lupa, el cual deberá mantenerse en PBS
para evitar su desecación. A continuación se procede a colocarlo en fijador.

TECNICA HISTOLÓGICA DE RUTINA

Una técnica histológica comprende el conjunto de procedimientos a los que se somete una
muestra para su análisis microscópico.
La elaboración de preparaciones histológicas pasibles de ser observadas tanto por
microscopía fotónica como electrónica, obedece a una serie de principios generales que son
comunes para ambas.
En este repartido nos referiremos fundamentalmente a la técnica histológica de rutina,
empleada en la realización de preparados para su observación al microscopio óptico.
Para obtener una preparación histológica es necesario procesar el material siguiendo las
etapas que se detallan a continuación:
1 - Obtención del material biológico.
2 - Fijación.
3 - Inclusión.
4 - Corte (microtomía).
5 - Coloración.
6 - Montaje.
7 - Identificación y archivo.
1 - Obtención del material biológico
Los fragmentos de órganos ó tejidos a observar, deben ser extraídos inmediatamente
después de la muerte del animal, ó mediante técnicas quirúrgicas (ej. biopsia).
Una vez muerto el animal, se inicia un proceso de autólisis que conduce a la pérdida de la
estructura propia de la materia viviente, por consiguiente es de fundamental importancia
proceder con rapidez, colocando la pieza lo más pronto posible en el líquido fijador.

2 - Fijación
Tiene por objetivo preservar la estructura celular y tisular, de modo que ésta se mantenga lo
más similar posible a la observada en el animal vivo.
La efectividad de cada líquido fijador estará dada por su capacidad para lograr esta
preservación.
FIJAR significa inmovilizar, y esto puede lograrse empleando medios físicos, químicos ó
una combinación de ambos.

* Medios físicos
a) CONGELACION: con CO2; el material puede estar previamente fijado o no.
b) CRIOSTATO: enfriamiento rápido a -20ºC.
c) CALOR: se hierve la pieza en un líquido especial durante más o menos un minuto
(biopsias extemporáneas).
d) DESECACION.
* Medios químicos
a - ACIDOS MINERALES OXIDANTES
b - SALES METALICAS FIJADORES
c - ACIDOS ORGANICOS REDUCTORES
d - REDUCTORES ORGANICOS
a - Acido crómico, ácido ósmico.
b - Bicloruro de mercurio, bicromato de potasio.
c - Acido acético, ácido tricloracético, ácido pícrico.
d - Formol, acetona, alcohol etílico, alcohol metílico.
* Cualidades de un buen fijador
- Rápida penetración.
- Penetración homogénea.
- No producir retracción de los tejidos.
- Revelar los organelos celulares.
- Evitar la desaparición de las sustancias solubles (ej. glucógeno).
- Cuidar la actividad de ciertas enzimas.
- Permitir la observación de elementos celulares visibles con coloraciones vitales.
- No crear artefactos.
- Asegurar a células y tejidos una conservación e imagen fiel.
* El fijador:
- Da a la pieza un color que no es el real.
- En general se usa a temperatura ambiente.
- Para enzimas debe actuar lentamente y a una temperatura de 0 a 4ºC.
- Lo ideal es que los fijadores actúen a pH neutro.

Desde el punto de vista químico los buenos fijadores son, por lo general, moléculas que
poseen por lo menos dos cualidades esenciales: son pequeñas de modo de poder
“acomodarse” entre las moléculas de la materia viviente y forman fácilmente enlaces,
particularmente con los grupos carboxilo y amino de las proteínas.

* Formas de fijación
a - INMERSION: se sumerge la pieza en un determinado volumen de líquido fijador.
En este caso existen una serie de reglas prácticas que son importantes:
- El volumen del líquido fijador debe ser de 20 a 40 veces mayor que el del fragmento a
fijar.
- El tiempo de fijación debe regularse empíricamente ya que depende de factores diversos,
como por ej. el tamaño de la pieza, la constitución del tejido, el poder de penetración del
líquido fijador, el objetivo final de la técnica a emplear, la temperatura de fijación, etc.
- El fijador debe estar en contacto con todas las superficies disponibles de la pieza. En el
caso de órganos huecos, la cavidad también debe rellenarse con fijador.
b - INYECCION: se realiza utilizando el sistema vascular del órgano ó por otras vías.
c - PERFUSION: el fijador se gotea a través de una cánula insertada en el sistema vascular
del animal anestesiado, a temperatura corporal, de manera que la propulsión del líquido
fijador se lleve a cabo con el propio flujo sanguíneo del organismo viviente.
* Fijadores químicos
Generalmente se emplean fijadores simples o primarios, y mezclas fijadoras. Fijadores
simples: los más utilizados son el formol, el tetróxido de osmio (OsO4) y el glutaraldehído.
Todos ellos se emplean en solución acuosa con medios que permiten regular el pH de la
solución (buffers).
Glutaraldehído tetróxido de osmio formaldehido
Las mezclas fijadoras: son en su mayoría soluciones acuosas de fijadores primarios
combinados entre sí, y en los cuales se incluyen sustancias químicas que favorecen la
penetración del fijador, o regulan el pH del líquido fijador, ó contienen determinados
mordientes que favorecen la coloración subsiguiente.

3 - Inclusión
Luego que una pieza ha sido fijada se debe proceder a impregnarla con una
sustancia plástica, que sea fácilmente manejable y que, por su mayor dureza, permita
obtener cortes finos (3 a 10 μ). Dicha sustancia debe penetrar íntimamente en el tejido u
órgano, de manera homogénea, formando con el material una masa de consistencia pareja.
Esta operación se denomina IMPREGNACIÓN ó IMBIBICIÓN.
El paso siguiente es la INCLUSIÓN, que consiste en colocar la pieza en el interior de un
bloque de la misma sustancia, tratando de ubicar los tejidos u órganos en posición adecuada
(“orientarlos”), para obtener cortes en el plano deseado. Los productos empleados para la
inclusión se denominan genéricamente “masas de inclusión”. Para que estas sustancias
penetren más fácilmente en los tejidos, deben estar en solución ó fundidas. Al enfriarse,
dichas masas plásticas recobran su consistencia, posibilitando la realización de los cortes
finos.

En microscopía óptica el más empleado es la parafina. Para microscopía electrónica se

utilizan las resinas (araldita, epon, spurr, etc.). En general, estas sustancias son insolubles
en agua y escasamente solubles en alcohol, por lo que es necesario antes de la
impregnación, deshidratar la pieza y luego embeberla con un solvente del medio de
inclusión.
Los pasos a seguir son:
a - Deshidratación.
b - Diafanización ó aclaramiento.
c - Impregnación con el medio de inclusión.
d - Inclusión definitiva de la pieza.

a - Deshidratación
En este paso la sustancia más comúnmente utilizada es el alcohol etílico. La pieza es
sometida a baños sucesivos en alcoholes de graduación creciente, de modo que la
deshidratación se realice paulatinamente, evitando la retracción de los tejidos.
Eventualmente pueden emplearse otros alcoholes
(metílico, butílico, etc.).

b - Diafanización
Consiste en la impregnación del material con un solvente del medio de inclusión.
El producto empleado en este paso se denomina “líquido intermediario”, y debe ser
miscible tanto con alcohol como con medio de inclusión.
Los productos más usados son: xilol, benzol, toluol, cloroformo y acetona.
Cuando la sustitución del alcohol por el intermediario es total, las sustancias empleadas
comunican a la pieza su alto índice de refracción, tornándola brillante.
c - Impregnación con el medio de inclusión
Luego de la diafanización, la pieza puede colocarse directamente en el medio de inclusión,
ó someterse previamente a un pasaje con una mezcla proporcional de líquido intermediario
y medio de inclusión.
En la inclusión con parafina, estos pasajes se llevan a cabo en el interior de una estufa
graduada entre 58 y 60 ºC (temperatura a la que se funde la parafina). Comúnmente se
realizan 2 ó 3 baños sucesivos con parafina, de modo de eliminar en cada uno de ellos, los
vestigios de líquido intermediario, e ir embebiendo progresivamente la pieza en el medio de
inclusión.
d - Inclusión definitiva de la pieza
Para la confección del bloque se utilizan moldes (barras de Leuckart, caja de plástico ó
papel, moldes de silicona, etc.), donde se coloca el medio de inclusión fundido.
Con una pinza se orienta la pieza de tejido en la posición adecuada; se identifica el
material, y se deja enfriar a temperatura ambiente ó en la heladera, en caso de trabajar con
parafina. Cuando se trabaja con resinas, estas generalmente se llevan a la estufa hasta
completar su polimerización.
Todos los pasos que acabamos de mencionar, variarán su duración según de que material se
trate y según el tamaño de la pieza.

4 - Corte (Microtomía)
- Fijar el bloque que se desea cortar en la platina por la cara opuesta a la cara de corte,
cuidando que quede firme.
- Colocar la platina con el bloque en el micrótomo.
- Tallar con hoja de afeitar una cara de corte que posea un margen de 2 ó 3 mm de parafina
a cada lado de la pieza.
Es conveniente procurar que los bordes superior e inferior de dicha cara sean paralelos para
facilitar la recolección de cortes seriados.
También se debe tratar de tallar una cara lo mas pequeña posible. Esto disminuye la
resistencia que ofrece el bloque a la cuchilla como también la aparición de pliegues en los
cortes realizados, permitiendo además evitar posibles melladuras de la cuchilla.
- Cuando se ha concluido con el tallado se procede a la colocación de la cuchilla en el
micrótomo.
- Siempre es aconsejable asentar la cuchilla antes de cortar. Esto se realiza con una banda
de cuero tensada y lubricada (asentador), sobre la cual se desliza el filo de la cuchilla. Se
debe avanzar con el lomo de dicha cuchilla hacia adelante (el filo queda hacia atrás), y
procurando asentar de forma homogénea todo el filo de la cuchilla.
Al finalizar se debe limpiar la cuchilla con un paño humedecido en xilol a favor del filo.
- La cuchilla se coloca en el micrótomo con una inclinación de unos 15 º a 25º respecto de
la cara del bloque (el ángulo varía según el tipo de material, cuanto más duro, menor es el
ángulo).
- La cara del bloque se orienta paralela al filo de la cuchilla.
- Regular el micrótomo para el espesor de cortes que se desea (óptimo de 3 a 5 μm).
- Desgastar el bloque hasta que la cara de corte salga entera y comiencen a observarse
muestras del material incluido.
- La tira de cortes se recoge tomando al primero de ellos con una pinza roma y al último
con un pincel humedecido. Así se los lleva hasta un baño de agua tibia cuya temperatura
sea algo menor al punto de fundición de la parafina empleada en la confección del bloque.
Esto permite estirar los cortes realizados, y su recolección sobre porta objetos de vidrio
previamente albuminados. La cara brillante de la cinta de cortes es la que se coloca en
contacto con el agua.
La aparición de pliegues puede solucionarse aumentando un poco la temperatura del agua.
- El medio de montaje sirve para pegar los cortes al vidrio. Generalmente se usa Albúmina
de Mayer, la cual disminuye la tensión superficial y aumenta la capilaridad permitiendo la
adhesión.
Para levantar los cortes del baño, se sumerge el portaobjetos albuminado inclinándolo por
debajo de los cortes que, con un pincel ó una aguja, se orientan sobre él a medida que lo
retiramos del agua.
Se centran los cortes en el vidrio, se dejan escurrir 2 ó 3 minutos y se ponen a secar.
5 - Coloración
La coloración debe ser contrastada.
La afinidad del colorante con determinada estructura va a depender de condiciones físico-
químicas. Cada estructura presenta distinta apetencia por los diferentes colorantes.
- Tinción
Es la unión molecular entre colorante y tejido.
- Impregnación
Es la precipitación de sales metálicas pesadas sobre determinadas estructuras.
- Coloración directa
La solución de colorante actúa directamente sobre el tejido ó la célula.
- Coloración indirecta
Se necesita una sustancia mordiente que puede estar en el colorante ó separada.
- Coloración en bloque
Se realiza previo a la inclusión del material.
- Coloración progresiva
Se deja actuar un colorante durante un tiempo determinado y luego se detiene su acción
(generalmente con agua).
- Coloración regresiva
Se sobrecolorea la preparación y luego se trata con un diferenciador (diferente para cada
colorante), siempre controlando al microscopio. La acción del diferenciador se detiene con
el lavado.
- Colorante ácido
La sustancia activa es un ácido que tiene un grupo básico inactivo ó incoloro.
Tiñe estructuras predominantemente básicas (por ej. citoplasma).
- Colorante básico
La sustancia activa es una base que tiene un grupo ácido inactivo. Tiñe estructuras de
naturaleza ácida (por ej. núcleo).
- Colorante neutro
Mezcla de colorantes ácidos y básicos con grandes complejos moleculares poco solubles en
agua, pero sí solubles en alcohol. Dan una coloración intermedia. Se utilizan en citología
hematológica.
La coloración de rutina se realiza con Hematoxilina y Eosina.
HEMATOXILINA
- Se extrae de la pulpa del Palo Campeche (árbol centroamericano).
- Viene en polvo ó en cristales de color amarillo pardo.
- Es soluble en agua y en alcohol, pero por sí sola no colorea, necesitando entonces de un
oxidante y de un mordiente.
Oxidantes Mordiente
- Iodato de soldio - Alumbre de potasio
- Iodato de potasio
- Permanganato de potasio
- Agua oxigenada
Hematoxilina + oxidante = Hemateína
La Hemateína por sí sola no colorea, sino que necesita un mordiente. Se forma entonces un
complejo Laca - Hematoxilina - Colorante, que sí colorea.
EOSINA
- Las eosinas son xantenos ácidos ó colorantes de ftaleína.
- Las más comunes son:
- Eosina amarilla (yellow), es la más usada.
- Eosina B (azul).
- Floxina.
- Eritrocina (está halogenada con iodo en lugar de bromo).
- Zafranina.
- Rosa de Bengala.
- El nombre “Eosina” proviene de aurora (naranja).
- Su punto de solubilidad es del 44 % en agua y del 7 % en alcohol.
- Se puede usar un acentuador del color
(por ejem. ácido acético al 0.2 % ó ácido tánico).
- Dá una buena coloración citoplasmática ó de fondo.
6 - Montaje
La preservación de las preparaciones histológicas se realiza generalmente empleando un
medio de montaje y colocando sobre ellas un cubre objeto de vidrio.
El Bálsamo de Canadá es el medio de montaje clásico, aunque existen actualmente medios
sintéticos (por ej. Entellant), con los cuales se obtienen también muy buenos resultados.
Es importante evitar la hidratación del preparado para obtener una visualización óptima.
Para ello debemos actuar con premura luego de pasar el preparado por el último pasaje con
xilol.
- Escurrir brevemente el exceso de xilol.
- Colocar una gota de medio de montaje sobre el corte ó sobre el cubre objeto.
- Colocar el cubre objeto sobre el corte dejándolo caer en ángulo agudo y tratando de evitar
la formación de burbujas.
- Presionar ligeramente con un paño limpio.
- Eliminar el exceso de medio de montaje con un paño humedecido en xilol.
7 - Identificación y archivo
- Etiquetar rotulando con lápiz la preparación.
- También se puede grabar el extremo del porta objeto con diamante.