Biotecnología

El desarrollo de la ciencia
básica y el entendimiento
de los procesos que
gobiernan la biología
y a los seres vivos es
fundamental.
Las tecnologías de ADN
recombinante constituye una
mezcla de técnicas, que
permiten, la fragmentación,
la separación, secuenciación,
hibridación de ácidos
nucleicos, clonaje de ADN y
la ingeniería genética .
 El ADN se puede fragmentar
mecánicamente, si se hace pasar varias
veces la suspensión de ADN a través de la
aguja de una jeringa
 La obtención de fragmentos específicos fue
posible tras el descubrimiento de enzimas
de restricción ( endonucleasas ). Estas
enzimas pueden aislarse de bacterias,
cortan la molécula de ADN de doble cadena
en lugares definidos por la secuencia de
nucleótidos
 Las enzimas de restricción pueden
generar extremos: rombos o cohesivos
 estas moléculas de ADN producidas se
denominan moléculas de ADN
recombinante.
En los siguientes dibujos puede verse como actuarían estas enzimas.

En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción. Se

aprecia la actuación en ambas hebras.

En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima de

restricción.
Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos bordes cohesivos por
donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie
diferente
Molécula A Molécula B

Digestión de ambas moléculas con la

misma enzima de restricción, BamHI

Extremos
cohesivos

Mezclar

Tratar con ADN-ligasa

ADN recombinante
 las secuencias de reconocimiento de las enzimas de
restricción frecuentemente tienen 6 pares de bases. Algunas
enzimas como EcoRI y HindIII escinden el ADN dando como
resultado extremos “pejagosos”. Las enzimas de restricción
generalmente se obtienen de bacterias y su nombre deriva del
nombre científico de esas bacterias: Hpal es de Hemophilus
parainfluenzae; EcoRI es de E.coli y HindIII es de Hemophilus
influenzae
 Sirve para determinar con exactitud el
tamaño de una molécula de ADN
 En la electroforesis, se colocan
partículas cargadas en un campo
eléctrico y se les permite que migren
hacia los polos positivo o negativo.
 Las moléculas se separan porque se
mueven a diferentes velocidades en
función de su carga y su tamaño.
Las bandas de ADN serán invisibles a
menos que el ADN esté marcado o
teñido de alguna manera. Un método
sensible de tinción del ADN consiste en
sumergir el gel después de la
electroforesis en el colorante bromuro
de etidio que cuando se encuentra
unido al DNA, es fluorescente con luz
ultravioleta.
Para marcar moléculas de ADN
aisladas se utiliza la enzima
polinucleótido quinasa para transferir
 Electroforesis en gel de ADN
En la figura (a) se muestra Diagrama de un aparato de gel vertical
que muestra sus componentes (b) Equipo comercial de electroforesis
en gel. (c) Carril que contiene una serie de fragmentos de ADN de
tamaño conocido. Los números indican el número de pares de pases
que contiene cada fragmento. Los fragmentos más pequeños se
desplazan una mayor distancia. El gel de la derecha muestra los
fragmentos que se originan cuando el fago lambda es digerido con la
enzima de restricción Hind III.
 
Electroforesis de DNA

20 min
 Secuenciación de una molécula de
ADN
Se desarrollaron métodos que permitieron
determinar de manera simple y rápida la secuencia
nucleotídica de cualquier fragmento de ADN
purificado. Uno de los métodos más utilizados es el
de Maxam y Gilbert o también conocido como el
método químico.
Este proceso se inicia con la obtención de un
conjunto de moléculas de ADN de doble hebra
marcadas en un extremo con P 32. en la primera
etapa las hebras de ADN se disocian y se someten
a un tratamiento suave con un agente químico que
destruye una de las cuatro bases. Solo se destruye
una de las bases, al azar. Esto genera distintos
fragmentos de ADN de distintas longitudes, que
Los fragmentos se separan en un gel y se
detectan por autorradiografía. Para
determinar la secuencia completa, se
realizan procedimientos similares a
cuatro muestras separadas de la misma
molécula de ADN, utilizando compuestos
químicos que rompan el ADN de forma
preferente por T en la primera muestra,
por C en la segunda, por G en la tercera y
por A en la cuarta. Los fragmentos
resultantes son separados en carriles
paralelos del mismo gel, obteniéndose un
patrón de bandas de ADN radiactivas a
partir de las cuales se lee la secuencia de
ADN.
La secuenciación del ADN permite

determinar de manera simple y rápida __la

__
La secuencia nucleotídica. __
__
T C G A
__
Al realizar la electroforesis se obtienen__
__
un patrón de bandas de ADN radiactivas __
__
a partir de las cuales se lee la secuencia. __

La lectura es del extremo 5’ a 3’ ( desde__

__
abajo hacia a arriba). __
__
En este caso la secuencia seria
__
5’- AGTTAGCCTTAGGCT-3’
 
 electroforesis
 
 
 
 Hibridación de ácidos nucleicos.
Cuando se tienen una doble hélice que se
disocia en dos hebras separadas, estas se
pueden volver a renaturalizar o hibridizar,
siempre que ambas cadenas tengan una
secuencia de nucleótidos complementarias.
Para hibridizar se requiere un fragmento
puro de una cadena sencilla de ADN cuya
secuencia sea complementaria a la del
ácido nucleico (ADN o ARN) que se desea
detectar. El ADN debe estar marcado
radiactivamente. La molécula de ADN de
cadena sencilla utilizada de esta forma
como indicador se denomina sonda de ADN
 Clonaje de ADN
Mediante esta técnica un fragmento de
ADN que contiene un gen de interés se
inserta en el genoma de ADN purificado de
un plásmido o virus. Por ejemplo es posible
unir, en el tubo de ensayo, un fragmento
de ADN que contiene un gen humano con
el cromosoma de un virus bacteriano, e
introducir la nueva molécula de ADN
recombinante en la célula bacteriana. El
plásmido o virus (vector) utilizado de esta
forma se conoce como vector de clonaje, y
se dice que el ADN propagado mediante
Plásmido
 Librerías de ADN

Para clonar un gen se empieza construyendo

una librería de ADN, una colección de
fragmentos de ADN, clonado. La genoteca
puede construirse utilizando como vector
tanto virus como plásmidos, y en general se
mantienen en una población de células
bacterianas.
 Los vectores plasmídicos
utilizados son pequeñas
moléculas circulares de ADN de
doble hebra. Los vectores se
cortan con una enzima de
restricción, y los fragmentos se
Plásmido añaden a los plásmidos cortados
y se cierran, formando moléculas
circulares de ADN recombinante.
gen de resistencia Plásmidos
Son unidas mediante la enzima
a la ampicilina
ADN ligasa.
2 3

Extremos cohesivos

Molécula de ADN recombinante

 Tecnología de DNA recombinante

El DNA se corta con enzimas Endonucleasas

El DNA se une a plásmidos Ligasa T4

Ensamblaje
El siguiente paso consiste en introducir las
moléculas circulares de ADN recombinante en
bacterias; se dice que estas células han sido
transfectadas con el plásmido. A medida que
estas células se dividen , los plásmidos
también se van replicando y produciendo un
enorme de copias de ADN circulares que
contienen el ADN foráneo.
Muchos plásmidos bacterianos
transportan genes que les
confieren resistencia a los
antibióticos, una propiedad que
sirve para seleccionar las células
que han sido transfectadas con
éxito; si la bacteria se hace
crecer en presencia del
antibiótico, solamente
sobrevivirán las células que
contengan los plásmidos. Cada
una de las bacterias que fue
transfectada contendrá, en
general, un fragmento de ADN
insertado diferente; este inserto
será heredado por las células de
El procedimiento de cortar el genoma
completo de una célula mediante
enzimas de restricción y colocarlo en
diferentes plásmidos constituye una
librería genómica. Por lo tanto la
colección completa de plásmidos se
denomina una librería de ADN
genómica.
Genoma de hongos: 44 millones de pares de bases
Huesped: Escherichia coli
Vector: Bacteriófagos
capacidad: 20 mil pares de bases

Genoma humano: 3000 millones de pares de bases

Huesped: Saccharomyces cerevisiae
Vector: YAC (cromosoma artificial de levadura)
MegaYAC (capacidad: 1 millón de pares de
bases)
Obtención de proteínas de interés médico, comercial, etc...
(insulina, hormona del crecimiento, factores de coagulación antes se
Obtenían a partir de los tejidos que las producen o fluidos
corporales)
Obtención de vacunas recombinantes
(aternativa al uso de organismos patógenos inactivos)
Extracción del ADN
del virus

Integración del
plásmido híbrido
en el núcleo de una
ADN célula de levadura

plásmido
bacteriano

La levadura fabrica las

proteínas víricas
con poder inmunológico

Inyección de proteínas
víricas en un chimpancé
 Mediante ingeniería genética
se construye una sonda de
Diagnóstico de enfermedades de origen genético ADN, marcada (marcaje
fluorescente), con la
secuencia complementaria del
ADN enfermo
ADN sano

ADN enfermo
ADN complementario
del ADN enfermo
Conocimiento previo de
la secuencia de ADN DIAGNÓSTICO
enfermo

Si aparecen bandas
fluorescentes
demuestra que la
persona presenta la
Biochip anomalía
Microarray
¿Hibridación? Renaturalización Desnatura ADN de la
DNAchip
¿No hibridación? del ADN con la lización persona que se
sonda del ADN quiere diagnosticar
fluorescente
Plantas transgénicas Agrobacterium tumefaciens es patógena de plantas.Produce tumores

Agrobacterium
Transgénesis= introducción núcleo
de ADN extraño en un Plásmido Ti
cromosoma
inductor de tumores
genoma, de modo que se contiene oncogenes
mantenga estable de (genes onc)

forma hereditaria y
afecte a todas las células
en los organismos cromosoma

multicelulares. célula
vegetal

Ingeniero tumores
genético
Proliferación de
natural tras hormonas
sustitución crecimiento. Se
de genes onc forman tumores en
por genes de las zonas de la
interés lesión
Clonación de animales
(TRANSFERENCIA NUCLEAR DE CÉLULAS EMBRIONARIAS)
Clonan cerdos destinados a trasplantar sus
órganos a humanos

La empresa escocesa PPL Therapeutics

logra retirar de los cerditos el gen que
provoca el rechazo en transplantes a
humanos "alfa 1,3 galactosil transferasa"

Enero 2002. AP Photo/Roanoke Times, Gene Dalton (IDEAL-EFE)

Paso importante en favor del xenotrasplante (transferencia

de células u órganos de una especie a otra)

Ayudará a superar la escasez de órganos humanos para hacer

trasplantes de todo tipo