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AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y
PRESERVACION DE CEPAS PARA LA
OBTENCION DE BIOETANOL A
PARTIR DEL RECHAZO DE BANANO
Integrantes:
• Bastidas Tania
• Ibarra Danilo
• Serrano Sebastián
• Salgado David
• Benítez Vicente
QUITO – ECUADOR
2010
I. PROBLEMA:
El ecuador es catalogado como uno de los mayores productores de banano en el mundo, ya que
basándose en las estadísticas el 92% del banano ecuatoriano se utiliza para el consumo
alimenticio, generando un 8% de banano de desecho. La descomposición de una parte de este
ocasiona una contaminación ambiental debido a los gases generados por la putrefacción, como el
metano (CH4) y otros gases que se emanan directamente a la atmósfera, causando daño al medio
ambiente que en la actualidad es una problemática mundial. Otra parte del banano de rechazo
también se ha dirigido a ser utilizado como piensos de animales (porcinos, ovinos caprinos entre
otros), ya que es rico en almidón y puede ser utilizado como sustrato para procesos fermentativos
que permitan el máximo aprovechamiento energético a través de la generación de etanol.
II. ANTECEDENTES:
El Ecuador produce 3.9 millones de toneladas de banano anual, el mismo que genera un desecho
del 8% convirtiéndose en el segundo país que genera gran porcentaje de desecho en este
producto, antecedido por la India. Este producto de rechazo es causa de la mala utilización de
técnicas agrícolas y correcto manejo de producto ya sea en la cosecha o al ser empacado.
En el país la producción de banano se concentra en las regiones costaneras el cual representa el
89% de la producción y la diferencia en otras regiones que poseen características climaticas
similares que son adecuadas para la producción de esta fruta, concentrándose los mayores índices
de producción en las provincias de Los Ríos con el 35 % y Guayas con el 32%.
III. JUSTIFICACION
Utilizando el banano de rechazo como materia prima para la producción de biocombustible resulta
relativamente cómodo en cuanto a costos; con un buen rendimiento y una alternativa al
aprovechamiento de estos desechos.
Ecuador goza de condiciones climáticas excepcionales, para la producción del banano ya que la
riqueza de su suelo, ha permitido que el país se convierta en un productor agrícola de excelente
calidad, ya que esta fruta se encuentra disponible todo el año.
Ecuador no sólo es el primer exportador de esta fruta desde 1952, sino también es el segundo
mayor productor de banano a nivel mundial ocupando así el 28% de las exportaciones mundiales
de banano, la producción de banano para la exportación llega a cifras tan exorbitantes de hasta 8
000 000 de toneladas métricas de las cuales hasta el 8 % de esta producción son rechazadas por
fallas en la materia prima.
Una alternativa de disposición final de los desechos que permite tener un producto con optimas
calidades sanitarias, aplicando técnicas agrícolas en base a procesos fermentativos para dichos
sustratos que permiten obtener sustancias como alcohol etílico, convirtiéndose en fuente de
energía alternativa para el futuro.
IV. HIPÓTESIS
Las bacterias que tienen la capacidad para la obtención de bioetanol obtenidas a partir de los
desechos del banano se podrán aislar de manera segura en el medio nutritivo diseñado como
medio minimal, fuente de carbono y fuente de nitrógeno específicos.
4.2. HIPÓTESIS ALTERNA
Las bacterias que tienen la capacidad para la obtención de bioetanol obtenidas a partir de los
desechos del banano no se podrán aislar de manera segura en el medio nutritivo diseñado como
medio minimal, con fuente de carbono y fuente de nitrógeno específicos.
V. OBJETIVOS
6.1. EL BANANO
En los países tropicales, la producción de banano y plátano para autoconsumo, mercados locales y
exportación es de gran importancia socioeconómica, como fuente básica alimenticia y ramo
generador de empleo e ingresos para pequeños agricultores; a más de lo anterior, son cultivos
perennes que protegen el suelo, son aptos para ladera y no requieren cantidades grandes de agua
ni mecanización en comparación con caña de azúcar.
De las variedades de banano y plátano que pueden utilizarse para la producción de etanol, se
distinguen tres sistemas de producción:
Anota que según estudios, el rendimiento potencial es 71-78 lts de bioetanol/ton de banano de
fruta, equivalente a promedio 4.300 lts/ha anualmente. Por otro lado, un sistema de producción que
no requiere aumentar el área agrícola para la producción de bioetanol.
Los principales componentes de la cáscara son celulosa 25%, hemicelulosa el 15%, y lignina 60%
6.2. EL BIOETANOL
El bioetanol mezclado con la gasolina produce un biocombustible de alto poder energético con
características muy similares a la gasolina pero con una importante reducción de las emisiones
contaminantes en los motores tradicionales de combustión. El etanol se usa en mezclas con la
gasolina en concentraciones del 5 o el 10%, E5 y E10 respectivamente, que no requieren
modificaciones en los motores actuales.
• Dilución: Es la adición del agua para ajustar la cantidad de azúcar en la mezcla o (en última
instancia) la cantidad de alcohol en el producto. Es necesaria porque la levadura, usada más
adelante en el proceso de fermentación, puede morir debido a una concentración demasiado
grande del alcohol.
• Conversión: La conversión es el proceso de convertir el almidón/celulosa en azúcares
fermentables. Puede ser lograda por el uso de la malta, extractos de enzimas contenidas en la
malta, o por el tratamiento del almidón (o de la celulosa) con el ácido en un proceso de hidrólisis
ácida.
T óptima 30oC
pH óptimo 5,0
1) Tolera elevada concentración de glucosa y fermenta a etanol a nivel mayor que una
levadura, especialmente en cultivo continuo en la que produce una elevada concentración
de etanol
2) Genera una elevado nivel de etanol, pero bajo en biomasa en comparación con una
levadura.
6.4 Grupo Trófico:
♣ Fuente de Energía: química (quimiotrofo)
♣ Fuente de electrones: compuestos orgánicos (organotrofo)
♣ Fuente de Carbono: compuestos orgánicos (heterótrofo)
(C6H12O6) 2n C6H12O6
C6H12O6 + 2 NH3 2C2H6O + 2H2O + 2CHON + ATP
Tabla 1. Medio Mínimal para desarrollo de cepas con capacidad de obtener bioetanol a
partir de residuos de banano
Agar Banano
En tubos se coloca 4,5ml del medio anteriormente descrito y se adiciona 0,5ml de las
diluciones preparadas 10-2, 10-3, 10-5 de cada tratamiento, a cada tubo se le coloca
campanas de Durhman invertidas. Los tubos se incuban a 30°C de 24 /48 h.
CONDICIONES DE FERMENTACIÓN:
Todos los biorreactores se colocan a 300C, temperatura óptima de crecimiento de
Zymomona
J1-30 13,5 14
J2-30 9,5 10
J3-30 8 10
Q1-30 10 12
Q2-30 6 8
Q3-30 6 7
ST1-30 8,5 10
ST2-30 5 7
ST3-30 7 7
Se determinó el contenido alcohólico periódicamente, no se incluyen los datos de la
cinética de producción de alcohol de cada biorreactor.
Una vez identificadas las zymomonas en 5 cajas petri: J1-30, J2-30, Q1-30, ST1-30, ST3-
30, se resiembra por estriado en el mismo medio en placa, y se obtuvieron los cultivos
axénicos.
Las cepas purificadas se dispondrán para pruebas que consisten en someterlas al medio
diseñado a partir medio minimal con inhibidor (cicloheximida), al cual se someterán a
diferentes concentraciones de etanol para permitirles inicialmente adaptarse a las
condiciones y posteriormente se seleccionarán las mejores cepas, es decir las que han
sobrevivido a las concentraciones más adecuadas.
Las cepas aisladas se pasan a cajas con Agar Banano, adicionado de diferentes
concentraciones de etanol de 6, 8, 10 ,12 % y se obtienen los siguientes resultados
Tabla de concentraciones de etanol
Concentraciones de Etanol
Cepas (%)
6% 8% 10% 12%
J1 + + + +
J2 + + - -
Q1 + + - -
ST1 + + - -
ST3 + - - -
+ = se observa crecimiento
- = no se evidencia crecimiento
Para aislar y seleccionar las mejores cepas se debe obtener el banano de rechazo se
realizo distintos tratamientos
PRIMER TRATAMIENTO:
TERCER TRATAMIENTO:
Cada uno de las tratamientos se realiza 2 veces con cada muestra de banano ( 3
localidades)
*Se utilizó agua destilada para evitar presencia de sustancias que posiblemente pudieran
inhibir el crecimiento de las bacterias.
Los tubos positivos en la etapa anterior, se siembran en cajas de Petri con el medio de
enriquecimiento y se incuban a 30°C por 24 a 48h.
Se identifican colonias típicas de Zymomonas
Forma Bastoncillos
Color Blanca
Borde Regular
Tamaño Mediano
• Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y
colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
• Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el
microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
• Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
• Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
• Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada)
pueden producirse falsos positivos.
Oxidasa
Indol
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las
bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano
con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una
característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos.
La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol
reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio
activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en
triptófano.
Procedimiento:
Citrato
MOVILIDAD
TSI
• •FERMENTACION DE CARBOHIDRATOS
TÉCNICA DEFINICIÓN
Subcultivos
Consiste en el repique periódico del cultivo en un medio nutritivo fresco. El
intervalo de transferencia varía con el microorganismo, debiendo
considerarse el medio adecuado para cada especie. Una vez desarrollados
los cultivos se mantienen a 4 °C durante lapsos que oscilan entre 15 días y
2 meses, aunque presentan algunos inconvenientes
Consiste en cubrir completamente el cultivo después de su desarrollo en
Mantenimiento medio sólido, con una capa de aceite mineral o vaselina estéril. Los cultivos
bajo capa de aceite en esta forma se pueden conservar a temperatura ambiente o aún mejor en
heladera por períodos de varios años.
Estas se colocan en un criovial, que contiene 1ml de BHI con dimetilsulfóxido al 10%, que
según revisión bibliográfica, es el mejor medio de preservación.
El laboratorio de microbiología cuenta con todo el material disponible para realizar el trabajo de
investigación
Balanza Analítica
Estufa
Equipos Biorreactor
Congelador -80 °C
Autoclave 121°C
Erlenmeyer 500 ml
Erlenmeyer 1000 ml
Material
Cajas petri
Pipetas
Sulfato de Magnesio
Fosfato ácido de Potasio
Sulfato Ferroso
Cloruro de Calcio
Reactivos y medios
Cloruro Mangánico
Molifdato de Sodio
Extracto de Levadura
Agua
X. ANEXOS
Anexo I
Composición Química del Banano
COMPOSICION
Cantidad por Ingestas
100 gramos Recomendadas
por porción
comestible
Agua (g)1 75.1 -
Energía (kcal)1 83 3000 - 2300
Proteínas (g)1 1.2 54 - 41
Hidratos de carbono (g)1 20 450 - 350 (a)
Lípidos (g)1 0.3 90 - 80 (a)
Fibra
Fibra total (g)3 1.82 > 30 (a)
Soluble (g) 0.62 12 (a)
Insoluble (g) 1.20 18 (a)
Vitaminas
Vitamina A (Eq. Retinol) (µg)3 8.5 1000 - 800
Carotenos totales (µg)3 71 -
Alfa-caroteno (µg)3 40 -
Beta-caroteno (µg)3 31 -
Criptoxantina (µg)3 0 -
Vitamina E (mg)1 0.2 10 - 8
Vitamina B1 (mg)1 0.06 1.2 - 1.1
Vitamina B2 (mg)1 0.07 1.3 - 1.2
Niacina (mg)1 0.8 16 - 15
Vitamina B6 (mg)1 0.51 1.5 - 1.3
Folatos (µg)1 22 400
Vitamina C (mg)1 10 60
Minerales
Calcio (mg)1 9 1000 - 1200
Hierro (mg)1 0.8 10 - 15
Fósforo (mg)3 23 700
Magnesio (mg)1 38 400 - 350
Zinc (mg)1 0.23 15 - 12
Selenio (µg)3 1.4 70 - 55
Sodio (mg)1 1 -
Potasio (mg)1 350 -
Carotenos sin actividad provitamínica A
Luteína (µg)2 7 -
Zeaxantina (µg)2 0 -
2
Licopeno (µg) 0 -
Ingesta Recomendada: Recomendaciones de energía y nutrientes para
hombre-mujer de 20 a 39 años.