GUIA LABORATORIO BIOQUIAMICA Rubrica2014 PDF

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD
ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA

GUIA COMPONENTE PRCTICO DEL CURSO: 201103 BIOQUMICA
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A

DISTANCIA
GUA COMPONENTE PRCTICO
201103 BIOQUMICA
BUCARAMANGA
2014

1. ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

El presente material en primera instancia fue diseado por el Ingeniero Rubn
Daro Munera en el 2008, quien en ese entonces era el director de curso, era y es
tutor de la UNAD Cead Palmira. El ingeniero Rubn Munera recopilo adems las
guas de laboratorio que estn contenidas en el material impreso de la Unisur
Bioqumica de Gerardo Prez y Yolanda Navarro publicado en 1992.
Este material ha tenido tres actualizaciones, la primera en el 2008 el Ingeniero

Rubn Daro Munera, la segunda en el 2009 r y la tercera en agosto de 2010
por Q.A de alimentos Golda Meyer Torres, tutor de la UNAD del Cead de
Duitama, y quien se desempea actualmente como directora del curso.
El proceso de revisin de estilo del material y aportes disciplinares, didcticos y

pedaggicos en el proceso de acreditacin de material didctico desarrollado en el
mes de JULIO de 2009, ENERO y AGOSTO de 2010 se hizo por parte del
Bilogo Alberto Garca, tutor del Cead de Bucaramanga y se mantiene la vigencia
para el 2011.

3. INDICE DE CONTENIDO
INTRODUCCIN
JUSTIFICACIN
PRCTICA No. 1: METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE

AMINOCIDOS Y PROTEINAS
11
PRCTICA No. 2: FRACCIONAMIENTO DE PROTENAS EN SEMILLAS DE

LEGUMINOSAS Y CEREALES POR SOLUBILIDAD
22
PRCTICA No. 3: ENSAYOS ENZIMATICOS CUALITATIVOS
33
PRCTICA No. 4 :ESTUDIO CINTICO DE LA UREASA
48
PRCTICA No. 5: DETERMINACIN DE VITAMINA C
64
PRCTICA No. 6: AISLAMIENTO DEL ARN EN LEVADURA
71
PRCTICA No. 7: AISLAMIENTO Y DETERMINACION DE CIDOS NUCLEICOS
76
PRCTICA No. 8- PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS 84

PRCTICA No. 9- HIDRLISIS DE POLSACARIDOS, MTODO DEL REACTIVO
3,5-DINITROSALICILATO
91
PRCTICA No. 10: RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE CARBOHIDRATOS:

RECONOCIMIENTO DEL GLUCGENO A PARTIR DEL ALMIDN.
99
PRCTICA No. 11- RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE LPIDOS
110
PRCTICA No. 12- FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS PRINCIPALES

CONSTITUYENTES: CARBOHIDRATOS, LPIDOS, PROTENAS Y CIDOS
NUCLEICOS (Opcional, puede hacerse en lugar de las prcticas #1, 6, 7, 8,10 y
11.
119
FUENTES DOCUMENTALES
143
ANEXOS
SEGURIDAD INSUTRIAL
144
PREPARACIN DE REACTIVOS
147
3

4. LISTADO DE TABLAS
Tabla 1: reactivos prctica 114
Tabla 2: Marcha de la prctica 1.19
Tabla 3: Rbrica de la prctica 121
Tabla 5: batera de tubos mtodo Biuret para la cuantificacin de protenas...28
Tabla 6: batera de tubos mtodo Folin Lowry cuantificacin de protenas...29
Tabla 7: Rbrica de la prctica 2...31
Tabla 9: Marcha de la prctica 3.37
Tabla 10: Marcha de la prctica 3 alfa- amilasa..........40
Tabla 11: batera de tubos efecto de la concentracin, alfa-amilasa...42
Tabla 12: batera de tubos efecto del pH, alfa-amilasa..43
Tabla 13: batera de tubos efecto de la temperatura, alfa-amilasa..44
Tabla 14: Rbrica de la prctica 3.46
Tabla 15: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa tubos blanco...52
Tabla 16: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa, tubos problema.53
Tabla 17: resultados pH ptimos de la ureasa, tubos problema.......53
Tabla 18: resultados pH ptimos de la ureasa, mtodo espectrofotomtrico.54
Tabla 19: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa tubos blanco mtodo 2.56
Tabla 20: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa tubos problema mtodo 256
Tabla 21: expresin de resultados pH de la ureasa tubos problema mtodo 2..57
Tabla 22: bateras de tubos variacin concentracin de sustrato, tubos problema58
Tabla 23: expresin de resultados variacin concentracin de sustrato..58
4

Tabla 24: bateras de tubos variacin de la temperatura60

Tabla 25: bateras de tubos extraccin de ureasa de leguminosas.61
Tabla 27: reactivos prctica 5..66
Tabla 28: bateras de tubos cuantificacin de vitamina C..68
Tabla 32: reactivos la prctica 778
Tabla 36: reactivos de la prctica 9..93
Tabla 37: bateras de tubos cuantificacin de glucosa DNS hidrlisis qumica..95
Tabla 38: bateras de tubos cuantificacin de glucosa DNS hidrlisis enzimtica.96
Tabla 40: reactivos de la prctica 10.101
Tabla 41: Marcha de la prctica extraccin de glicgeno103
Tabla 42: Marcha de la prctica extraccin de disacridasas105
Tabla 43: Marcha de la prctica accin de disacridasas106
Tabla 44: Rubrica prctica 10..108
Tabla 45: Reactivos prctica 11.112
5

4.1 LISTADO DE GRFICOS Y FIGURAS
Figura 1: fraccionamiento de protenas en semillas de leguminosas y cereales por

solubilidad 27
Figura 2: Extraccin de biomolculas.132
Figura 3: Extraccin de lpidos de la tema de huevo..135
Figura 4: Montaje para destilacin en el mtodo de Micro Kjeldahl..138

5. CARACTERSTICAS GENERALES
Introduccin
Uno de los cursos fundamentales es la Bioqumica, el cual permite comprender los

mecanismos de formacin y transformacin de los nutrientes que componen un
determinado alimento.
La presente gua de prcticas de laboratorio contiene una serie de experimentos
bsicos que complementan los conceptos fundamentales.
El trabajo de laboratorio utiliza como materiales de experimentacin, materias
primas de uso comn como harinas de cereales y leguminosas, fculas, frutas y
verduras, tejidos de origen animal, que ayudan al estudiante a asimilar las tcnicas
de uso comn en la investigacin bioqumica con fuentes alimenticias o
potencialmente alimenticias.
La investigacin no es completa sino se divulgan los resultados obtenidos en la
experiencia. Es importante que el estudiante aprenda la forma de reportar sus
datos y a saber interpretar las conclusiones obtenidas por otros investigadores, con
el fin de evaluar su propia investigacin. Esto hace necesario que elabore un
informe donde presente sus datos, resultados y conclusiones obtenidos durante el
trabajo experimental.
En esta gua de prcticas de laboratorio, equivales a 125/500 que corresponde al
25% de la nota. En la gua se describen 12 prcticas, pero las mismas se pueden
ajustar a las prcticas 1, 6, 7, 8,10 y 11. Todo disponiendo de los recursos de cada
CEAD, de las indicaciones que d el tutor encargado de la prctica.
La prctica de laboratorio del curso de bioqumica, se programan
independientemente en cada uno de los centros, en donde el estudiante realiza la
matricula, por eso se requiere estar pendiente de la programacin de esta
actividad.
Justificacin
Un curso de bioqumica sin experiencia prctica es un curso incompleto, slo con

el desarrollo de laboratorios, los estudiantes asimilan los complejos conceptos que
encierra una bioqumica general.
EL desarrollo de los laboratorios, conlleva a los estudiantes adquirir competencias
acadmicas al argumentar
en los anlisis de resultados, al interpretar los
resultados y a proponer aplicacin de dichas experiencias en los contextos
regionales.

Intencionalida PROPSITOS
des
Reconocer mediante el uso de reacciones coloreadas y cualitativas la presencia de
formativas
aminocidos, protenas, carbohidratos, cidos nucleicos y lpidos, como
constituyentes de las biomolculas.
Cuantificar fracciones proteicas y glcidos mediante las tcnicas de anlisis
instrumental, volumtrico y gravimtrico.
Interpretar los resultados obtenidos en cada observacin para argumentar los
resultados en el anlisis de resultados y proponer posibles aplicaciones en los
contextos regionales.
Reconocer a las biomolculas como unidades fundamentales y su importancia en
los diferentes procesos metablicos
Complementar con cada prctica los conceptos fundamentales de las 45 lecciones
del mdulo.
OBJETIVOS
Que el estudiante reconozca mediante el uso de reacciones coloreadas y
cualitativas
la presencia de aminocidos, protenas, carbohidratos, cidos
nucleicos y lpidos, como constituyentes de las biomolculas.
Que el estudiante cuantifique fracciones proteicas y glcidos mediante las tcnicas
de anlisis instrumental, volumtrico y gravimtrico.
Que el estudiante interprete los resultados obtenidos en cada observacin para
argumentar los resultados en el anlisis de resultados y proponer posibles
aplicaciones en los contextos regionales.
Que el estudiante reconozca a las biomolculas como unidades fundamentales y
su importancia en los diferentes procesos metablicos
Que el estudiante complemente con cada prctica los conceptos fundamentales de
las 45 lecciones del mdulo.
COMPETENCIAS
El estudiante reconoce mediante el uso de reacciones coloreadas y cualitativas la
presencia de aminocidos, protenas, carbohidratos, cidos nucleicos y lpidos,
como constituyentes de las biomolculas.
El estudiante cuantifica fracciones proteicas y glcidos mediante las tcnicas de
8

anlisis instrumental, volumtrico y gravimtrico.

El estudiante interpreta los resultados obtenidos en cada observacin para
argumentar los resultados en el anlisis de resultados y proponer posibles
aplicaciones en los contextos regionales.
El estudiante reconoce las biomolculas como unidades fundamentales y su
importancia en los diferentes procesos metablicos.
METAS
El estudiante presentar y sustentar un informe personal (pre informe) y un trabajo
grupal (informe de laboratorio) como resultado del estudio, aplicacin y anlisis
sistemtico del desarrollo de cada prctica de laboratorio, presentando un anlisis
de resultados utilizando un lenguaje amplio relacionado con la temtica.
El estudiante describir a las diferentes biomolculas identificadas en las pruebas
cualitativas cuantitativas.
El estudiante resolver los cuestionarios planteados en cada una de las prcticas
de laboratorio.
El estudiante aprender el manejo de las principales tcnicas bioqumicas
generales para la identificacin de biomolculas.
Denominaci 1. Prctica 1. Mtodos cualitativos para la identificacin de aminocidos y
n de practicas protenas.
2. Prctica 2: fraccionamiento de protenas en semillas de leguminosas y
cereales por solubilidad.
3. Se Unen en una sola la prctica 3 y 4: Ensayos enzimticos cualitativos y
estudio cintico de la ureasa.
4. Hidrlisis de polisacridos, mtodo del reactivo 3,5-Dinitrosalisilico.
5. Reconocimiento cualitativo de carbohidratos.
6. Reconocimiento cualitativo de lpidos.
Nmero de
horas
18 H
Porcentaje
25% que equivale a 125/ 500 puntos
Curso Evaluado
por proyecto
SI x
Seguridad
industrial
El trabajo en el laboratorio requiere la observacin de una serie de normas de de seguridad que

eviten posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se est haciendo. (Ver Anexo).
NO_

6. DESCRIPCIN DE PRCTICAS
PRCTICA No. 1: METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE
AMINOACIDOS Y PROTEINAS
Tipo de practica
Presencial
Autodirigida
Remota
Otra Cul
Horas de la practica
Temticas de la prctica
Intencionalidades
formativas
2H
Unidad 1: Biomolculas, especficamente el captulo 1, aminocidos y captulo 2,
pptidos y protenas.
Propsitos
Reconocer a los aminocidos como unidades estructurales de las protenas y su
Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas la presencia de aminocidos y
enlaces peptdicos en las muestras.
Establecer relaciones entre la estructura y la funcin de las proteinas y prdida de esta
al variar su pH y solubilidad (precipitacin y desnaturalizacin).
Objetivos
Que el estudiante reconozca los aminocidos como unidades estructurales de las
protenas.
Que el estudiante analice, mediante reacciones cualitativas coloreadas la presencia de
aminocidos y enlaces peptdicos en las muestras.
Que el estudiante establezca la relacin entre la estructura y la funcin de las proteinas
y prdida de esta al variar su pH y solubilidad (precipitacin y desnaturalizacin).
COMPETENCIAS
El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados observados en cada
prueba cualitativa y relaciona el marco terico y los resultados para dar el respectivo
anlisis.
El estudiante conceptualiza en forma precisa la relacin que tiene cada prueba y la
estructura de aminocidos y protenas.
El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a a travs de la elaboracin de
informes escritos.
Metas
Al finalizar la prctica #1:
10

El estudiante obtendr su calificacin
resultado del estudio independiente.
del respectivo pre informe personal como
El estudiante resolver los respectivos cuestionarios dados.

El estudiante presentar en forma escrita el informe del respectivo laboratorio en forma
grupal en donde sobresalga el anlisis de resultados.
Fundamentacin Terica
El estudiante como parte de su autogestin en el desarrollo de su aprendizaje autnomo, se servir investigar antes de
la prctica y a manera de pre informe los siguientes temas:
1. Captulo 1 y 2 de la Unidad 1: Biomolculas del mdulo del curso, enfatizando en: Clasificacin de aminocidos,
Enlace peptdico, Niveles de estructuracin, Solubilidad de protenas: desnaturalizacin por calor y pH extremos.
Precipitacin por metales pesados, Precipitacin acdica
2. Pruebas cualitativas: enfatizar en las reacciones qumicas que tienen lugar y el principio del mtodo: Reaccin de la
ninhidrina, Reaccin xantoproteica, Reaccin de milln, Reaccin del cido glioxlico, Prueba de Pauly, Prueba del
Nitroprusiato, Reaccin de Sakaguchi prueba de Biuret.
Bibliografa de Consulta:
Baynes, J. Dominiczak, M (2011). Bioqumica Mdica. Tercera Edicin.. Barcelona, Espaa.: Elsevier, Mosby. Ubicacin:
Google libros.
Voet, V. (2004). Bioqumica, tercera edicin. Montevideo, Uruguay.: Editorial Mdica panamericana. Ubicacin: Google
libros/ biblioteca virtual UNAD.
Baynes, J. Dominiczak, M (2011). Bioqumica Mdica. Tercera Edicin.. Barcelona, Espaa.: Elsevier, Mosby. Ubicacin:
Google libros.
Campbell, M. Farrell, S. (2003). Bioqumica. Mxico. Thomson Editores. Cuarta Edicin.
Ubicacin: Google libros/ biblioteca virtual UNAD.
Descripcin de la practica:
En esta prctica mediante pruebas coloreadas, se identifica los aminocidos que componen las protenas de los
extractos utilizados basados en las reacciones de los grupos R cadena lateral.
Se desarrolla pruebas para analizar el comportamiento y la solubilidad de protenas en tratamientos de precipitacin y
desnaturalizacin.
Estas prcticas corresponde a los temas que se tratan en la Unidad 1: Biomolculas, especficamente el captulo 1,
aminocidos y captulo 2, pptidos y protenas.
Es de vital importancia para los estudiantes de la formacin profesional y tcnica de los programas de ingeniera de
alimentos, agroforestal, agronmica, zootecnia, produccin animal y regentes de farmacia, el desarrollo de estas
prcticas, ya que profundizan y analizan la relacin e importancia que guardan los aminocidos y la funcin biolgica de
las proteinas en los tejidos biolgicos.
11

Recursos a utilizar en la prctica (Equipos / instrumentos)
Material de vidrio
Material biolgico y otros

(estudiantes)
Reactivos
Equipos
Tubos de ensayo
Alimento de origen vegetal o Reactivo de milln

animal: concentrados, protena
crnica, hgado, huevo, etc.
Estufas ( 5)
gradillas
tapabocas
Agua destilada, Solucin de CuSO4

1%
pHmetro (1)
esptulas
Libros de bioqumica
Solucin NaOH 30% y 40%, Solucin

saturada de NaCl
Centrifuga
Pipetas 1, 5 y 10
ml
Marcador de vidrio
HNO3 concentrado, Cristales de

sacarosa
Balanza analtica
Mallas de asbesto
Cinta para rotular
HCl concentrado, Acido triclorcetico

10%
Termmetros 120
C
Papel filtro
Cuaderno de laboratorio
Solucin cido pcrico saturada,

Etanol 95%
mecheros
Embudos
Bata blanca
Solucin de (NH4SO4) al 50%,

acetona
Agitador de vidrio
Marcador para vidrio
Solucin de acetato de plomo 0.5 %
Erlenmeyers 100
y 250 ml
Reactivo de sakaguchi, cido actico

glacial
Vasos de
precipitado 250 ml
HSO4 concentrado, Acido actico al

30%
Vasos precipitado
500 ml
Aminocidos: glicina, tirosina,

triptfano, aminocidos azufrados,
leucina
Probeta 100 ml
Ninhidrina (2 g/l) preprese en fresco,

Hidrxido de amonio.
Pinzas para tubos

en madera
cido sulfanilico (10 g/l en solucin

de HCl 1 mol/l).
Vidrios reloj
grandes
Nitrito de sodio, Carbonato de sodio
Mortero con
mango
Acetato de plomo, Nitrato de mercurio.
12

Soporte para
embudos
Nitroprusiato de sodio (20 g/l,

preprese fresco).
Pinzas para tubos

de ensayo
metlicas
Alfa- naftol, Agua de bromo
Vasos de
precipitado de
1000 ml plstico
cido fosfrico, Molibdato de sodio
Vasos de
precipitado de 600
plstico
Tungsteno de sodio, Sulfato de cobre,

Nitrato de sodio
Tabla 1: reactivos prctica 1.

Software a utilizar en la prctica u otro tipo de requerimiento para el desarrollo de la prctica
Video Tutorial. Dar clic en los archivos Index html. Descargarlo en:
https://dl.dropboxusercontent.com/u/51764879/Parte%201_%20proteinas.zip
https://dl.dropboxusercontent.com/u/51764879/Parte%202_proteinas.zip
Objeto de Aprendizaje (OA): pruebas cualitativas para determinar aminocidos y protenas partes 1 y 2.
Ubicacin: Aula Virtual del Curso.
Seguridad Industrial
REACTIVO
PROTECCION
cidos inorgnicos
concentrados.
Gafas de seguridad, tapabocas. Lo

que estipula el reglamento de
laboratorio.
RIESGO
Metodologa
Conocimiento previo para el desarrollo de la prctica:
Se requiere que el estudiante tenga conocimiento de las temticas de la Unidad 1 : Captulo 1 y 2 del mdulo del
curso.
Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuacin encontrar los pasos a seguir para el desarrollo de la prctica #1
del curso.
La metodologa es la siguiente:
Preinforme:
1. Observe los siguientes recursos dando Clic sobre el enlace:
13

Presentacin aminocidos.
https://dl.dropboxusercontent.com/u/51764879/Presentaci%C3%B3nAminoacidos.ppsx
Pruebas cualitativas de aminocidos parte 1:
https://dl.dropboxusercontent.com/u/51764879/Parte%201_%20proteinas.zip
Pruebas cualitativas de aminocidos parte 2:
https://dl.dropboxusercontent.com/u/51764879/Parte%202_proteinas.zip
2. Desarrolle el siguiente taller ( despus de revisar el punto 1) y entrguelo a su tutor de laboratorio en formato
Word ( no se debe evidenciar copias tcitas de internet) a mano alzada.
3. Defina aminocido: Que grupos funcionales estn presentes
relacionados con las propiedades cido bsicas.
en los aminocidos? Cmo ellos estn
1. Algunos autores clasifican los aminocidos de varias formas, por ejemplo, en esenciales y no esenciales, en
alifticos y aromticos, o quiz la ms acertada; de acuerdo a la polaridad, presencia de cargas y composicin
qumica de la cadena lateral R de los aminocidos. De un argumento vlido de sta ltima clasificacin en
dnde se explique el porqu de esta.
2. Qu implicaciones tiene la Cadena lateral de los aminocidos en sus propiedades qumicas y en los mtodos de
identificacin en el laboratorio?
3. En este laboratorio, Usted va a identificar algunos aminocidos que estn dentro de la composicin de un tejido
biolgico. Explique brevemente, que pruebas usara para identificar los siguientes aminocidos y porque?:
Tirosina, Fenilalanina, Aminocidos aromticos, Triptfano, Metionina y cistena, Grupos aminos libres.
4. Que es el enlace peptdico, represntelo. qu prueba usa en el laboratorio para identificarlos? en qu se
fundamenta?
5. Que es un protena
6. Complete el siguiente cuadro, relacionada con protenas
Niveles de estructuracin que puede tener una protena
Clasificacin de las protenas segn su

solubilidad
7. Cul es la diferencia de precipitar y desnaturalizar una protena.

8. Elabore el diagrama de flujo de la marcha de la prctica y tablas de resultados en blanco.
Trabajo grupal
En grupo de trabajo (mximo 4 estudiantes), todos los estudiantes realizan la prctica #1 de laboratorio, para ello
previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que el desempeo individual como grupal,
sern tenidos en cuenta en la rbrica de evaluacin del informe de laboratorio.
Producto a entregar:
14

Hay dos formas de presentar el informe de laboratorio. La forma definitiva deber ser concertada entre el tutor
asignado y el grupo de estudiantes:
Informe escrito: mediante entrega personal al tutor de laboratorio: el contenido ser: objetivos, introduccin,
marco terico (mximo 2 hojas), resultados (tabulados, se puede incluir registros fotogrficos), anlisis de
resultados, conclusiones, bibliografa.
Sustentacin Oral con ayudas audiovisuales: el contenido ser: objetivos, resultados (tabulados, se puede incluir
registros fotogrficos), confrontacin de resultados y marco terico para dar el respectivo anlisis de resultados,
conclusiones, bibliografa.
Procedimiento:
1. Pruebas Cualitativas
1. 1 Obtencin de los Extractos:
-En el caso de alimentos en polvo, coloque unos 30 gramos en un vaso de precipitado, agregue 100 ml de agua destilada,
agite durante 10 minutos y filtre a travs de tela limpia. Conserve el lquido (filtrado) para las pruebas de las protenas.
-En el caso de los alimentos concentrados slidos, mulala o macrelas por separado y recoja el molido en vasos de
precipitado. Agregue 100 ml de agua destilada, agite durante 10 minutos y filtra a travs de tela. Recoja los filtrados en
vasos de precipitado o en Erlenmeyers previamente marcados. Deseche los residuos.
-En el caso de la solucin de clara de huevo: Haga un pequeo orificio en uno de los extremos del huevo y vierta por l la
clara en un vaso precipitado, dejando dentro la yema. Luego agregue a la clara 100 ml de agua destilada y agite con el fin
de disolverla.
Marcha de la prctica parte 1:
prueba
procedimiento
cantidad a
adicionar:
en un tubo de ensayo colocar:
extracto problema
milln
Biuret
NaOH
al 30% (cuidado,
quemaduras).
Anote
aqu el
resultado
Obtenido.
Realice aqu apuntes

importantes para el
anlisis
de
resultados.
2 ml
provoca
2 ml
Mezclar e ir aadiendo gota a gota el

sulfato cprico al 1% (CuSO4), agitando
despus de cada adicin, hasta la
aparicin de un color violeta, azul o
amarillo. El color violeta indica la reaccin
positiva.
extracto problema
2 ml
Reactivo de milln
0.5 ml
15

reaccin
del cido
glioxlico
sakachi
Grupos SH
Lieberman
xantoproteica
Llevar a bao de agua hirviendo por

5min.Un color rojo oscuro es resultado
positivo.
extracto problema
2 ml
HNO3 concentrado por las paredes del

tubo, (cuidado, provoca quemaduras).
1m
Mezclar bien, calentar a la bao mara y

observar un color amarillo claro.
Adicionar solucin de NaOH al 40%
lentamente sin agitar y observar un
naranja intenso como resultado positivo.
2 ml
extracto problema
2 ml
Cristales de sacarosa
Una pizca
HCl concentrado, (cuidado,

quemaduras).
provoca
5 ml
Calentar a en bao de agua hirviendo

por 5 a 7 min. Un color rojo intenso, es
prueba positiva.
extracto problema
1 ml
Hidrxido de sodio al 40 % (NaOH),

(cuidado, provoca quemaduras).
1ml
Acetato de Plomo al 0.5 %
1 ml
Mezclar bien, calentar a bao de agua

hirviendo por 4 min, un precipitado negro
es prueba positiva.
extracto problema
2 ml
Reactivo de sakaguchi
0.5 ml
Mezcla bien y observar.

extracto problema
2 ml
cido actico glacial, (cuidado, provoca

irritacin en piel y fosas nasales).
2 ml
16
prueba de Pauly
reaccin de
la ninhidrina

H2SO4 concentrado, (cuidado, provoca
quemaduras). Dejar caer lentamente por
las paredes del tubo inclinado, hasta que
se formen dos capas. NO AGITE.
Observe el cambio de color en la
interfase. Si se forma un anillo violeta en
la interfase de los dos lquidos, la
reaccin se considera positiva
2 ml
Extracto problema, ajustar pH a 7.0
1 ml
Solucin de ninhidrina, hervir a bao

mara por 2 min. Observar coloracin
violeta o morado intenso.
1 ml
Acido sulfanlico
1 ml
Extracto problema
2 ml
prueba del
Nitroprusiato
Enfriar en hielo
Agregar solucin de NaNO2
enfriar por 3 min.
y dejar
1 ml
Adicionar Na2CO3.
formados.
colores
2ml
Anotar
Solucin de nitroprusiato de sodio
0.5 ml
Mezclar con el extracto problema
2 ml
Adicionar Hidrxido de amonio (cuidado,

provoca quemaduras y es irritante para
piel y fosas nasales), deje reposar por 5
min.
0. 5 ml
Marcha de la prctica parte 2:

prueb
a
procedimiento
Precipit
acin
acdicae
xtracto problema
cido pcrico saturado
cantidad
a
adicionar
:
Anote
aqu
resultado
Obtenido.
el
Realice aqu apuntes

importantes para el
anlisis
de
resultados.
2 ml
1 ml
17

Sulfato de amonio
Solventes
orgnicos
Solventes
orgnicos
precipitacin
acdica
Precipitacin acdica
Agite y observe
(enturbamiento)
la
formacin
precipitado
extracto problema
2 ml
cido actico al 30%
0.5 ml
Agite y observe
(enturbamiento)
la
formacin
precipitado
Solucin saturada de Cloruro de sodio (NaCl)
1 ml
Mezclar bien y calentar a la llama por 1 min. se

presenta un enturbamiento ms o menos intenso
que persiste al enfriamiento, tambin puede
observarse pequeos grumos en las paredes del
tubo. Observe el tubo sobre un fondo oscuro.
extracto problema
2ml
cido tricloroacetico al 10%
2 ml
Agite y observe
(enturbamiento)
la
formacin
precipitado
extracto problema
2ml
Etanol al 95%.
2 ml
Observe
la
formacin
(enturbamiento)
de
precipitado
extracto problema
2ml
Acetona
2 ml
Observe la formacin de precipitado

(enturbamiento)
extracto problema
2ml
Solucin de Sulfato de amonio al 50 %
2 ml
Mezclar bien. Dejar en reposo durante 10 min.

Observe si se forma un Precipitado. Centrifugar
a 3000 r.p.m. por 10 min., observar. La reaccin
positiva se manifiesta por la formacin de un
precipitado, dependiendo directamente de la
concentracin de albmina presente en la
muestra.
18
Metales
pesados
Desnaturalizacin
por calor

extracto problema
2ml
Caliente en agua hirviendo durante 10 minutos

asegurndose que la temperatura interna llegue
a los 95 100C. Observe la formacin de
precipitado (enturbamiento).
Extracto problema
2 ml
Gotas del metal
5 gotas
Calentar suavemente a bao mara si no

observa reaccin inmediata.
Tabla 2: Marcha de la prctica 1.
Cuestionamientos que sirven de gua para la redaccin del anlisis de resultados:
1. Cules son los fundamentos qumicos de las pruebas estudiadas para el reconocimiento de aminocidos. En
esta parte Usted tiene que analizar el fundamento terico de la prueba y el resultado obtenido ( de donde se
obtiene el color obtenido, que indica cada prueba?.
2. Qu relacin qumica tiene la cadena R de los aminocidos y las pruebas realizadas?.
2. Explique con argumentos vlidos el comportamiento observado de las proteinas en cada una de las pruebas de
precipitacin. Que indica la presencia de precipitado?
3. Determine mediante graficas el extracto que ms pruebas positivas obtuvo y analice esta situacin.
Sistema de Evaluacin
Evaluacin individual:
cada estudiante debe presentar en forma escrita lo solicitado en el preinforme.
Asistencia, desempeo y desenvolvimiento durante la sesin de laboratorio
Evaluacin grupal:
el grupo de trabajo debe presentar un informe de

descripcin de producto a entregar.
laboratorio
en la fecha acordada por el tutor. (ver
la
Informe o productos a entregar

Informe escrito: mediante entrega personal al tutor de laboratorio: el contenido ser: objetivos, introduccin,
marco terico (mximo 2 hojas), resultados (tabulados, se puede incluir registros fotogrficos), anlisis de
resultados, conclusiones, bibliografa.
Sustentacin Oral con ayudas audiovisuales: el contenido ser: objetivos, resultados (tabulados, se puede incluir
19

registros fotogrficos), confrontacin de resultados y marco terico para dar el respectivo anlisis de resultados,
conclusiones, bibliografa.
PRACTICA No. 2 FRACCIONAMIENTO DE PROTENAS EN SEMILLAS DE

LEGUMINOSAS Y CEREALES POR SOLUBILIDAD 1
Tipo de practica
Presencial
Autodirigida
Remota
4H
Unidad 1: Biomolculas, especficamente el captulo 2, pptidos y
protenas, leccin 10: Clasificacin y Propiedades Fisicoqumicas.
Intencionalidades formativas
Propsitos
Comprobar la teora con la prctica en relacin al comportamiento
segn la solubilidad de protenas.
Obtener las fracciones de albminas, globulinas, prolaminas y
glutelinas a partir de tejidos biolgicos.
Calcular mediante espectrofotometra, la concentracin de proteinas
en cada una de las fracciones anteriores.
Objetivos
Que el estudiante compruebe la teora con la prctica en relacin al
comportamiento segn la solubilidad de protenas.
Que el estudiante obtenga las fracciones de albminas, globulinas,
prolaminas y glutelinas a partir de tejidos biolgicos.
Que el estudiante calcule mediante espectrofotometra, la
concentracin de proteinas en cada una de las fracciones anteriores.
COMPETENCIAS
El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados del
fraccionamiento de protenas con cada uno de los solventes utilizados.
El estudiante conceptualiza en forma precisa la relacin que tiene
cada fraccin de protena y el solvente usado.
El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a travs de la
elaboracin de informes escritos.
Metas
Prez, G. Navarro, Y. (1992). Bioqumica. Santa Fe de Bogot DC: Unisur.
20

El estudiante obtendr su calificacin del respectivo pre informe
personal como resultado del estudio independiente.
El estudiante presentar en forma escrita el informe del respectivo
laboratorio en forma grupal en donde sobresalga el anlisis de
resultados.
El estudiante como parte de su autogestin en el desarrollo de su aprendizaje autnomo, se servir investigar
antes de la prctica y a manera de pre informe los siguientes temas, enfatizando en la reacciones qumicas que
tienen lugar y el principio del mtodo:
1. Solubilidad y precipitacin de las protenas
2. Clasificacin de Osborne de las protenas, por el criterio de solubilidad
3. Mtodos cuantitativos para la determinacin de protenas (Biuret, Folin- Lowry, Bradford).
Nota: algunas de las temticas las encuentra en el mdulo del curso.
Como fuentes documentales consulte:
Prez, G. (1992). Ciclo de krebs. En G. Prez, BIOQUIMICA (pg. 163). Bogot DC: Unisur.
Rodney, B. (1999). El ciclo del cido ctrico. En B. Rodney, Conceptos de Bioqumica (pgs. 489-494). Mxico:
International Thomson Editores S.A de C.V.
Rawn, J (2005). Bioqumica. Madrid: Interamericana-McGraw_Hill.
Descripcin de la practica
En esta prctica mediante prueba cuantitativa, se identifica y se calcula
la extraccin fraccionada de los
componentes protenicos de las semillas de leguminosas y cereales, utilizando para ello la diferencia de
solubilidades de los diferentes tipos de protenas.
Cuantificar cada una de las fracciones obtenidas utilizando el mtodo de Folin- Lowry Biuret.
Se desarrolla pruebas para analizar el comportamiento y la solubilidad de protenas
precipitacin y desnaturalizacin salina.
en tratamientos
de
Esta prctica corresponde a los temas que se tratan en la Unidad 1: Biomolculas, especficamente el captulo 2,
pptidos y protenas, leccin 10: Clasificacin y Propiedades Fisicoqumicas.
Es de vital importancia para los estudiantes de la formacin profesional y tcnica de los programas de ingeniera de
alimentos, agroforestal, agronmica, zootecnia, produccin animal y regentes de farmacia, el desarrollo de esta
prctica, ya que identifican a partir de un tejido vegetal los diferentes tipos de protenas de acuerdo a su
21

solubilidad y analizar a partir de ello, la relacin que guarda dicho comportamiento y su funcin biolgica.
Material de vidrio Material biolgico y otros
(estudiantes)
Reactivos
Equipos
Tubos de ensayo
Harinas
de
diferentes Reactivo de folin.
cereales y leguminosas:
soya, arveja, trigo y frijol.
Estufas ( 5)
gradillas
tapabocas
Solucin de sulfato de cobre tartrato

sdico de potasio (5g/l de
CuSO4.5H2O en tartrato sdico
potsico 10 g/l).
Espectrofotmetro
esptulas
Libros de bioqumica
Carbonato de sodio en NaOH 0.1 mol/l. Centrifuga
Pipetas 1, 5 y 10
ml
Marcador de vidrio
NaCI al 1%,
Balones aforados
de 25 ml
Cinta para rotular
Etanol al 75%,
Vasos de
precipitado de
1000 ml plstico
Cuaderno de laboratorio
NaOH 0.1 N,
Vasos de
Bata blanca
precipitado de 600
plstico
Solucin patrn de albmina de huevo

de concentracin conocida. (0.25
mg/ml).
Agitador de vidrio
Reactivo de Biuret.
Marcador para vidrio
Balanza analtica
Erlenmeyers 100
y 250 ml
Vasos de
precipitado 250 ml
Vasos precipitado
500 ml
Probeta 100 ml
Vidrios reloj
grandes
22

Software a utilizar en la practica

Documento tutorial sobre el procedimiento de obtencin del a ecuacin de la recta a partir de la curva patrn de
BSA.
https://dl.dropboxusercontent.com/u/51764879/ORIENTACIONES%20%20PARA%20EL%20DESARROLLO%20EJ
ERCICIO%20FRACCIONES.pdf
Se recomienda observar el siguiente video sobre el uso del espectrofotmetro u otro material multimedia
semejante:
http://www.youtube.com/watch?v=4KU8eqcjNeQ
Las situaciones o eventos de peligrosidad se pueden presentar en el manejo del reactivo de Folin, se recomienda
usar guantes, tapabocas y gafas de seguridad.
Metodologa
Conocimiento previo para el desarrollo de la prctica.
Unidad 1: Biomolculas, especficamente el captulo 2, pptidos y protenas, leccin 10: Clasificacin y
Propiedades Fisicoqumicas. Mtodos cuantitativos para la determinacin de protenas (Biuret, Folin- Lowry,
Bradford).
Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuacin encontrar los pasos a seguir para el desarrollo de la
prctica #2 del curso.
Quiz de laboratorio individual #1:
En esta prctica no hay preinforme, en su lugar el estudiante se prepara para un Quiz escrito.
La temtica a evaluar es: Modulo: Leccin 10: Clasificacin y Propiedades Fisicoqumicas 10.1 Clasificacin de
protenas (albminas, globulinas, prolaminas y glutelinas).
El contenido y forma de pregunta queda a disposicin del tutor asignado de los laboratorios del curso.
Trabajo grupal
Informe escrito: mediante entrega personal al tutor

de laboratorio: el contenido ser: objetivos,
introduccin, marco terico (mximo 2 hojas), resultados (tabulados, se puede incluir registros
fotogrficos), anlisis de resultados, conclusiones, bibliografa.
Sustentacin Oral con ayudas audiovisuales: el contenido ser: objetivos, resultados (tabulados, se puede
incluir registros fotogrficos), confrontacin de resultados y marco terico para dar el respectivo anlisis
23

de resultados, conclusiones, bibliografa.
Procedimiento:
Preparacin de la muestra
Pesar 2.0 g de muestra (en cada caso ser una de las harinas de: arveja, soya, frjol, haba, trigo, cebada, etc.);
pasarla a un tubo de ensayo, agregar 10 ml de H2O desmineralizada, agitar manualmente durante 10 minutos y
centrifugar la suspensin a 2500 rpm por 3 minutos. Vaciar el sobrenadante a un baln aforado de 25 ml. Al residuo
agregar de nuevo otros 10 ml de H2O desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior.
Despus de centrifugar, el sobrenadante de esta segunda extraccin se adiciona al baln que contiene al primer
sobrenadante. Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase. As se tiene separada la
fraccin de las albminas:
figura 1: fraccionamiento de protenas en semillas de leguminosas y cereales por solubilidad

Sobre el residuo que queda de la separacin de las albminas, se repite ahora todo el proceso anterior, pero
agregando esta vez NaCl al 1%. Despus de centrifugar, los sobrenadantes de la primera y segunda extraccin
24

con NaCl al 1%, se llevan a otro baln aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1%.
Esta es la fraccin de las globulinas.
Sobre el residuo anterior se extrae en idntica forma la fraccin de las prolaminas, usando esta vez alcohol etlico
al 75% y una temperatura de extraccin cercana a 60C.
Por ltimo sobre el mismo residuo, con la adicin de solucin de NaOH 0.1 N y aplicando el mismo procedimiento
general, se separa la fraccin de las glutelinas.
Mtodo de Biuret :
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo proceder a la determinacin
de protenas, aplicando el mtodo de Biuret.
La curva de calibracin se har utilizando como patrn una solucin de albmina de huevo de concentracin
conocida.
Para las muestras de soya, arveja y frjol, de las fracciones de albminas y glutelinas deber tomarse para cada
una y por aparte, una alcuota de 0,5 ml y llevarse a un volumen de 5 ml (dilucin 1 a 10) con agua desmineralizada
para las albminas y con NaOH 0,1 N para las glutelinas. Estas diluciones se usarn como extractos problemas
para dichas fracciones.
En 15 tubos de ensayo rotulados pipetear en c/u las cantidades de reactivos que se indican en el siguiente cuadro.
Tubos
Condiciones
B
10
11
12
13
14
Sol. patrn
albumina, ml
0.
1
0.
3
0.
5
0.
7
0.
9
1.
2
Fraccin
albuminas, ml
0.
5
1.
0
Fraccin
globulinas, ml
0.
5
1.
0
Fraccin
prolaminas, ml
0.
5
1.
0
Fraccin glutelinas,
ml
0.
5
1.
0
H2O destilada, ml
1.
9
1.
7
1.
5
1.
3
1.
1
0.
8
1.
5
1.
0
1.
5
1.
0
1.
5
1.
0
1.
5
1.
0
Reactivo de Biuret en todos los tubos: 4 ml

Tabla 5: batera de tubos mtodo Biuret para la cuantificacin de protenas
Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o introducir los tubos en un bao de agua a
30C durante 10 minutos para desarrollo del color. Leer en cada tubo porcentaje de transmitancia a 540 nm usando
25

el tubo B para ajustar el 100% de transmitancia.
2. Clculos y resultados
Consultar tablas de conversin para pasar porcentajes de transmitancia a los correspondientes valores de
absorbancia o calclelos utilizando la frmula:
A = 2 - log (%T)
Trazar en papel milimetrado la grfica de calibracin (absorbancia en ordenadas vs. concentracin (mg/mI) en
abcisas) e interpolar las Absorbancias de los tubos problemas; proceder, teniendo en cuenta las diluciones de cada
caso, a calcular los porcentajes de cada fraccin protenica.
Debern compararse los valores obtenidos con los que se hallen en la literatura consultada.
Mtodo de Foln- lowry :
Preparacin de los reactivos:
1. Solucin alcalina de carbonato de sodio (Na2CO3 20 g/l en NaOH 0.1 mol/l).Se debe preparar primero el NaOH
al 0.1 M y luego el carbonato se debe disolver en este, preparar 200 ml.
2. Solucin de sulfato de cobre tartrato-sdico potsico: Preparar una solucin de sulfato de cobre SO4Cu en
tartrato sdico potsico 10 g/l) preparar de esta solucin 300 ml.
3. El da de la prctica se debe preparar la solucin salina: mezclar 50 ml de (1) y 1 ml (2).
4. El reactivo de Folin se debe diluir: en un volumen igual de agua, el mismo da que se va a utilizar. 1:1
5.Patrn de protena: 0.25 mg/ml
Procedimiento: a 1 ml de muestra agregue 5 ml de una solucin alcalina (mezclar 50 ml de la solucin alcalina de
carbonato de sodio ms 1 ml de solucin de sulfato de cobre tartrato sdico potsico). Mezcle vigorosamente y
deje reposar a temperatura ambiente por 10 min o ms. Agregue 0. 5 ml del reactivo de Folin en forma rpida y
mezclando inmediatamente. Despus de 30 minutos lea la Absorbancia a 750 nm. Utilice un blanco de reaccin.
REACTIVO
BLANCO
T1
T2
T3
T4
H 2O
1 ml
0.9
ml
0.8 ml
0.7ml
0.6
ml
T5
T6
M1
M2
0.5
-0
ml
PATRON ml
---
01
0.2
0.3
0.4
0.5
----
---
PROBLEMA
------
---
---
---
---
---
--
1ml
1ml
SOLUCION
ALCALINA (
Folin A+C)
5 ml en todos los tubos: agitar bien y esperar 10 minutos.
REACTIVO DE
FOLIN DILUIDO
0.5 ml, esperar 30 minutos en la oscuridad luego leer la absorbancia a 500

750 nm.
26

1:1
1:2
Tabla 6: batera de tubos mtodo Folin Lowry para la cuantificacin de protenas .
Determine la concentracin de protenas de una solucin problema despus de preparar una curva patrn con
BSA (albmina srica bovina).
Expresin de resultados:
Complete la siguiente tabla:
tubo
Absorbancia
(nm= )
Concentracin de protena (
mg/ml)
T1
T2
T3
T4
T5
T6
M1
M2
Tabla 7: presentacin de resultados prctica 2.
Para hallar la concentracin del patrn en mg/ml, debe realizar el respectivo anlisis de la concentracin de la
solucin patrn: 0.25 mg/ml y el volumen que se toma de la solucin patrn.
5. Con los valores de Absorbancia y Concentracin graficar:
Concentracin de protena en las abscisas (X) y Absorbancia en la ordenadas (Y).
6. Obtenga la ecuacin de la recta por regresin lineal y el coeficiente de regresin. Ecuacin del tipo y = m x
+ b. Se recomienda que el valor del coeficiente de correlacin sea como mnimo de 0.995.
La ecuacin encontrada, servir para realizar los clculos de concentracin de protena en mg/ml de M1 y M2.
cada estudiante debe presentar en forma escrita u oral lo solicitado en el pre informe.
desempeo y desenvolvimiento durante la sesin de laboratorio
Evaluacin grupal:
El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que contenga: portada,
introduccin, objetivos, tabla de resultados, anlisis y confrontacin de resultados, desarrollo de cuestionarios.
Conclusiones y bibliografa.
27

Pre informe antes de la prctica e Informe de laboratorio finaliza da la prctica.
Rbrica de evaluacin
Tabla 7: Rbrica de la prctica 2.
Nota: La puntuacin anterior puede ser ponderada de acuerdo al # de sesiones en cada Cead, de acuerdo a los
recursos disponibles, para lo cual dicha ponderacin debe guardar relacin proporcional con los tems de la
rbrica general que se presenta.
Retroalimentacin
El tutor de la prctica tendr diez (10) das hbiles para enva o entregar la respectiva retroalimentacin del
informe de laboratorio siguiendo lo estipulado en la rbrica de evaluacin.
28

PRACTICA No. 3 ENSAYOS ENZIMATICOS CUALITATIVOS
Tipo de practica
Presencial
X Autodirigida
Remota
1H
Unidad 1: Biomolculas, especficamente el captulo 3,
Enzimas.
Propsitos
Entender el papel de las enzimas como catalizadores de los
diferentes procesos bioqumicos y su importancia en los
diferentes procesos metablicos.
Analizar, mediante reacciones
cualitativas la actividad
enzimtica de la sacarasa y alfa-amilasa.
Establecer relaciones entre la estructura y la funcin de las
enzimas y prdida de esta al variar al variar su temperatura
ptima de trabajo.
Objetivos
Que el estudiante entienda el papel de las enzimas como
catalizadores de los diferentes procesos bioqumicos y su
Que el estudiante analice mediante reacciones cualitativas
la actividad enzimtica de la sacarasa y alfa-amilasa.
Que el estudiante establezca relaciones entre la estructura y
la funcin de las enzimas y prdida de esta al variar al variar
su temperatura ptima de trabajo.
COMPETENCIAS
El estudiante describe y analiza de manera eficiente los
resultados observados en cada prueba cualitativa y relaciona
el marco terico y los resultados para dar el respectivo
29

anlisis.
El estudiante conceptualiza en forma precisa la relacin que
tiene la prueba para carbohidratos y la actividad enzimtica.
El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a travs
de la elaboracin de informes escritos.
Metas
El estudiante obtendr su calificacin del respectivo pre
informe personal como resultado del estudio independiente.
El estudiante presentar en forma escrita el informe del
respectivo laboratorio en forma grupal en donde sobresalga
el anlisis de resultados.
El estudiante como parte de su autogestin en el desarrollo de su aprendizaje autnomo, se
servir investigar antes de la prctica y a manera de pre informe los siguientes temas:
1. Captulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomolculas del mdulo del curso. Adicionalmente
realizar la siguiente investigacin:
2. Qu es la sacarasa, cual es su sustrato, a qu clase de enzima pertenece, cules son sus
productos de hidrlisis. En qu consiste la prueba de Fehling y para qu clase de carbohidratos
es indicativa, Por que se usa la prueba anterior en la actividad de la sacarasa?
3. Estructura qumica del substrato para la alfa-amilasa., enlaces que rompe o hidroliza la amilasa, clase de enzima que es la - amilasa, Productos de la hidrlisis de la - amilasa. En
qu consiste la reaccin de lugol el almidn? que entienden por temperatura ptima de una
enzima, en el cuerpo humano donde se encuentra esta la - amilasa?, que se entiende con pH
ptimo de una enzima?.
4. estructura del almidn y su mecanismo de hidrlisis: enzimas implicadas.
30

En esta prctica mediante pruebas coloreadas, se identifica los productos de hidrlisis de la

accin de la sacarasa sobre la sacarosa, y la accin de la alfa- amilasa sobre el almidn.
Inicialmente se debe eatraer la enzima sacarasa o sucrasa de la levadura mediante mtodos
utilizados en la separacin de protenas y determinar tanto su presencia como su actividad
enzimtica.
Demostrar que en la saliva existe actividad - amilsica. Comprobar el efecto de la
concentracin de la enzima sobre la velocidad de la reaccin. Determinar el pH ptimo de la
enzima - amilasa Comprobar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica.
Estas prcticas corresponde a los temas que se tratan en la Unidad 1: Biomolculas,
especficamente el captulo 3, Enzimas.
Es de vital importancia para los estudiantes de la formacin profesional y tcnica de los
programas de ingeniera de alimentos, agroforestal, agronmica, zootecnia, produccin animal y
regentes de farmacia, el desarrollo de estas prcticas, ya que profundizan y analizan la relacin
e importancia que guardan las enzimas, las cuales son de naturaleza protena, por lo tanto su
la funcin biolgica debe ser afectada por los mismos factores que las protenas.
Material de vidrio
Vaso de precipitado de 50
ml
Material biolgico (
estudiantes)
Reactivos
Equipos
Levadura granulada
comercial. (No sirve
pulverizada).
300 ml Acetona
Estufa a 38C
Solucin de saliva.
Agua destilada
Balanzas (5)
ml( para el grupo 2)
Mortero con mango

esptula
100 ml de Solucin de Estufas (4)

sacarosa al 5%
Vidrio reloj
Reactivo de Fehling
Mallas (4)

ml
Hielo
Termmetros (4)

ml
100 ml TCA al 10%
Bao termostatado a 38C

previamente.

ml
200 ml Solucin de
almidn 2%.
Papel filtro ( 5 para cada

grupo)
31

Vaso de precipitado plstico
de 1000 ml
100 ml de KCl al 1.0% pHmetro ( 2)
Vaso de precipitado plstico

de 600 ml
100 ml de solucin de hielo

lugol.
Agitador de vidrio
50 ml Solucin cido
tartrico al 1%
Termmetro de mercurio(
grupo 2)
Pipeta pasteur
50 Solucin de
NaOH al 0.1 N
Equipo de filtracin al vacio.
Probeta de 100 ml
50 Solucin de
NaOH al 0.5 N
Embudos y soporte
50 ml de buffer
fosfato pH 6.9-7.0
Erlenmeyers 250 ml
50 ml de cido
clorhdrico al 10%
Erlenmeyers 50 ml
100 ml de solucin de
glucosa al 5%
Tubos de ensayo
Reactivo de
selliwanoff
gradillas
150 ml de
tartrico al 1%
Pipetas 1, 5,10 ml
150 ml de NaOH 0.1

M
Pinzas para tubos de

ensayo
Solucin de HCl al
5%,
Solucin
de
NaOH al 5%
Hielo y agua caliente
Pinzas de madera para

tubos de ensayo
acido

Ninguno.
REACTIVO
PROTECCION
RIESGO
32

cidos inorgnicos
concentrados
Gafas de seguridad, tapabocas.
Metodologa
Captulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomolculas del mdulo del curso.
Forma de trabajo:
Estimado estudiante a continuacin encontrar los pasos a seguir para el desarrollo de la
Trabajo individual: el estudiante obtiene las guas de laboratorio, prepara un pre informe que
contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la prctica y
tabla de resultados en blanco.
Trabajo grupal: En grupo de trabajo, todos los estudiantes realizan la prctica #3 de laboratorio,
para ello previamente deben identificar los materiales que se requiere. Tenga presente que el
desempeo individual como grupal, sern tenidos en cuenta en la rbrica de evaluacin del
informe de laboratorio.
Producto a entregar: Informe escrito de laboratorio mediante entrega personal al tutor.
Procedimiento:
1. Experimento No. 1 Sacarasa
1.1 extraccin de la enzima:
Tome 17 gramos de levadura granulada (no utilice levadura molida) en un mortero y tritrela.
Una vez reducida a polvo, transfirala a un vaso de precipitado que contenga 100 ml de agua
destilada y agite durante 10 minutos. Filtre a travs de tela y luego a travs de papel de filtro en
un embudo.
Vierta el filtrado en un vaso de precipitado y agregue 50 ml de acetona. Mezcle bien y deje la
mezcla quieta durante 10 minutos. Decante parte del lquido cuidando de no perder el
precipitado porque es donde esta la enzima sucrasa, colquela en hielo para evitar la
desnaturalizacin. Marque el recipiente como SOLUCIN DE ENZIMA.
1.2 marcha de la prctica:
33

prueba
PROCEDIMIENTO
V (ml)
RESULTAD
O
ANALISIS
DE
RESULTADOS
actividad
enzimtica
enzima
hervida
Solucin de enzima
3 ml
Agua destilada
3 ml
Disuelva el precipitado y lleve a

ebullicin a 95 C internamente por
10 minutos. a bao mara.
Deje enfriar, adicionar sacarosa en
solucin fresca.
2 ml
Colocar el tubo a 38C durante 30

minutos
Realizar prueba de Fehling
prueba de
Fehling
En un tubo aparte colocar:

Solucin A de Fehling
1 ml
Solucin B de Fehling
1 ml
Agua destilada
3 ml
Solucin enzima hervida
3 ml
Colocar el tubo en una solucin de

agua hirviendo por 5- 10 minutos
Observar
seliwanoff
Enzima hervida
5 ml
Reactivo de selliwanoff
5 ml
Caliente a bao Maria

Observar.
actividad
enzimtica
enzima
cruda
Solucin de enzima
3 ml
Agua destilada
3 ml
adicionar sacarosa
2 ml
Colocar el tubo a 38C durante 30
34

minutos
Realizar prueba de Fehling
prueba de
Fehling

1 ml
1 ml
Agua destilada
3 ml
Solucin enzima hervida
3 ml

Observar ..
Repita la prueba de Fehling usando
en vez de la solucin de enzima
cruda glucosa al 5%
Observar
seliwanoff
Enzima cruda
3ml
Reactivo de seliwanoff
1 ml
Caliente a bao Mara y observar

Repetir el procedimiento de la
prueba de selliwanoff pero en lugar
de la enzima hervida colocar
fructosa al 5%
3 ml
Observar en los dos tubos si hay

formacin de un color rojo intenso
indicativo de
cetosas como
fructosa proveniente de la Hidrlisis
de la sacarosa.
Tabla 9: Marcha de la prctica 3.
Cuestionario:
1. Por qu se utiliza acetona para precipitar la enzima?
2. Diga cules son los fundamentos qumicos de las pruebas estudiadas para el
reconocimiento de la hidrlisis de la sacarosa. En esta parte Ud tiene que analizar el
fundamento terico de la prueba y el resultado obtenido ( de donde se obtiene el color
obtenido, que indica cada prueba?
35

3. Qu le sucede a la sacarosa al ser tratada con la enzima sucrasa?

2. Experimento No. 2: -amilasa
2.1 Obtencin de la enzima:
Se debe recolectar una muestra de saliva para obtener una solucin de enzima. Para ello
enjuguese varias veces con agua de bolsa y proceda a recoger en un beaker de 50 ml
aproximadamente 10 ml de saliva.
Adicione a la saliva 10 ml de agua destilada y mezcle bien. Filtre la solucin de saliva y rotule el
erlenmeyer como SOLUCIN DE ENZIMA - AMILASA, mantngala incubada a 37 - 38C.
2.2 Marcha de la prctica
Pruebas
PROCEDIMIENTO
V(ml)
RESULTADO

Preparacin de
la solucin de
reaccin
ANALISIS DE
RESULTADOS
Alistar cuatro tubos de ensayo

( marcar del 0-4):
Adicionar Acido tricloroacetico
al 10%
0.5 ml
Aparte en un beaker de 50 ml
Preparara r una solucin de
reaccin:
Solucin de almidn (hervir
durante 2 minutos).
Enfriar
y
destilada
agregar
Cloruro de potasio
incubar a 38C.
6.0 ml
2.0 ml
agua
1.0 % e
2.0 ml
ACTIVIDAD
ENZIMATICA
DE LA
Solucin de reaccin*
10 ml
solucin alfa- amilasa*
6 ml
- AMILASA.
tiempo : cinco
minutos
tomar de esta solucin
3 ml
Agitar y tomar
inmediatament
e
Colocarla en el tubo 0 con

cido tricloroacetico
Gotas reactivo de lugol gota a
gota hasta coloracin rojiza o
Gotas
36

caf.
ACTIVIDAD
ENZIMATICA
DE LA
Solucin de reaccin+ amilasa

*( la misma cantidad
de
arriba)
- AMILASA.
tiempo : 10
minutos
tomar de esta solucin a los 10

minutos
3 ml

Gotas reactivo de lugol
ACTIVIDAD
ENZIMATICA
DE LA
- AMILASA.
tiempo : 20
minutos

*( la misma de arriba)
minutos
- AMILASA.
tiempo : 30
minutos
de
Gotas
5

*( la misma de arriba)
minutos
3ml

caf.
Prueba
Fehling
3 ml

caf.
ACTIVIDAD
ENZIMATICA
DE LA
Gotas
Gotas

1 ml
1 ml
Agua destilada
2 ml
Solucin restante de reaccin

+ amilasa*
3ml
37

Colocar el tubo en una
solucin de agua hirviendo
por 5- 10 minutos
Observar
Tabla 10: Marcha de la prctica 3 alfa- amilasa.
Cuestionario:
Explique y analice los resultados obtenidos

cuando reacciona con el lugol, que resultados se obtiene?
Que coloracin produce los productos de la hidrlisis del almidn y cuales son?
2.2 preparacin de la solucin de enzima y Efecto de la concentracin de la enzima
sobre la velocidad de reaccin
Se debe recolectar una muestra de saliva para obtener una solucin de enzima. Para ello
enjuguese varias veces con agua de bolsa y proceda a recoger en un beaker de 50 ml
aproximadamente 10 ml de saliva.
Adicione a la saliva 10 ml de agua destilada y mezcle bien. Filtre la solucin de saliva y rotule el
erlenmeyer como SOLUCIN DE ENZIMA - AMILASA e incube a 38C.
Prepare cuatro tubos de ensayo de la siguiente forma:
Tubo
reactivo
Cloruro
potasio
de
0.2 ml
0.2 ml
0.2 ml
0.2 ml
Solucin
almidn
de
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
1.2 ml
1.1ml
1.0
0.9
Agua destilada
Tabla 11: batera de tubos efecto de la concentracin, alfa-amilasa.
Adicione a cada tubo: (no se olvide agitar)

Tubo
0.5ml
2 ml
3.5 ml
5 ml
reactivo
enzima
38

Coloque cada tubo a incubar a 38C por 20 minutos. Transcurrido 20 minutos en cada tubo de
ensayo adicionar 0.2 ml de acido triclorcetico al 10% y adicione de manera inmediata a cada
tubo (o hasta el 4) t gotas del reactivo de lugol.
Cuestionario:
Cul es la relacin del efecto de la concentracin de la enzima sobre la velocidad de

reaccin en la enzima segn el experimento?
Cul es el papel del acido tricloroacetico?
2.3 Determinacin del pH ptimo de la - amilasa salival
Mida el pH de:
cido tartrico al1%. Tomar pH ________
Acido clorhdrico al 10%. Tomar pH
NaOH al 0.1 N Tomar pH ____
NaOH al 0.5 N Tomar pH ____
Prepare cinco tubos de ensayo as:
Tubo
reactivo
cido
clorhdrico al
10%
cido
tartrico
1%
1.0 ml
1.0 ml
al
Buffer fosfato
pH 6.9
1.0 ml
NaOH 0.1 N
1.0 ml
NaOH 0.5 N
KCl
Solucin
almidn
Agua
de
1.0 ml
0.2 ml
0.2 ml
0.2 ml
0.2 ml
0.2 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
39

destilada
Tabla 12: batera de tubos efecto del pH, alfa-amilasa.
Adicione a cada minuto a cada tubo: (no se olvide agitar)

Tubo
4y5
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
reactivo
enzima
ensayo colocar 0.2 ml de acido triclorcetico al 10% y adicione de manera inmediata a cada
tubo (o hasta el 4) tres gotas del reactivo de lugol.
Cuestionario:
Explique y analice los resultados obtenidos

Cul es el papel del lugol en la reaccin
de acuerdo a los resultado grafique el comportamiento de la enzima frente a los
cambios de pH.
Escriba el valor ptimo de pH de la enzima y explique como llega Ud. A esa
conclusin.
2.4 efecto de la temperatura sobre el efecto de la actividad enzimtica.

Prepare tres tubos de ensayo as:
Tubo
Agua destilada
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
KCL
0.2 ml
0.2 ml
0.2 ml
Solucin de almidn
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
reactivo
Tabla 13: batera de tubos efecto de la temperatura, alfa-amilasa.
Coloque el tubo #3 en bao con hielo por 20 minutos

Coloque el tubo # 1 por 10 minutos a 90C
Coloque el tubo # 2 a temperatura ambiente.
Anote las temperaturas respectivas en cada tubo. Despus de este tiempo aada a cada tubo:
40

Tubo
2 ml
2 ml
2 ml
reactivo
enzima
ensayo aadir 0.2 ml de acido triclorcetico al 10% y adicione de manera inmediata a cada tubo
(o hasta el 4) tres gotas del reactivo de lugol.
Cuestionario:
Cul es el papel de cloruro de potasio (KCL) presente en todo los experimentos al igual
que el cido tricloroacetico?
de acuerdo a los resultado grafique el comportamiento de la enzima frente a los
cambios de temperatura.
Escriba el valor de la temperatura ptima de la enzima y explique cmo llega Ud. A esa
conclusin
Experimento No. 3: Degradacin Enzimtica De Polisacridos2
1. Coloque 3.0 mL de solucin de almidn y 2 gotas de saliva en tres tubos de ensayo
previamente marcados A, B y C.
2. Determine el pH en cada tubo, utilizando un pHmetro o papel indicador universal.
Registre los resultados.
3. Agregue al tubo A 1.0 mL de cido clorhdrico al 5%; al tubo B 1.0 mL de NaOH al 5%; y
al tubo C 1.0 mL de agua.
4. Prepara un bao Mara con una temperatura de 37 C y coloque los tres tubos de ensayo
durante 10 minutos.
5. Retire los tubos de ensayo del bao Mara y aada cinco gotas de lugol a cada uno.
Registre los cambios de color, olor, temperatura, etc. En otros tres tubos de ensayo,
previamente marcados como D, E y F, adicione tres mL de almidn y dos gotas de saliva,
a cada uno.
6. Durante diez minutos coloque el tubo D en hielo, el tubo E en el bao Mara a 37 C y el
tubo F en agua hirviendo.
7. Retire los tubos de ensayo D, E y F de las anteriores condiciones y agregue cinco gotas
de lugol a cada uno. Registre todos los cambios que observe.
Cuestionario:
1. En qu situacin se registr la mayor actividad enzimtica y como la evidencia?
Munera, R: (2008). GUA PARA PRCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA. Palmira: Universidad

Nacional Abierta y a Distancia.
41

Evaluacin grupal: El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada
por el tutor, que contenga: portada, introduccin, objetivos, tabla de resultados, anlisis y
confrontacin de resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografa.
42

PRACTICA No. 4 ESTUDIO CINTICO DE LA UREASA3
Tipo de practica
Presencial
X Autodirigida
Remota
1H
Unidad 1: Biomolculas, especficamente el captulo 3,
Enzimas.
Propsitos
Entender el papel de las enzimas como catalizadores de los
diferentes procesos bioqumicos y su importancia en los
Evaluar la capacidad enzimtica de la ureasa frente a
cambios de pH, concentracin de enzima y temperatura.
Comparar mediante dos mtodos (espectofotometrico y
volumtrico), la capacidad enzimtica de la ureasa frente a
cambios de pH.
Objetivos
Que el estudiante entienda el papel de las enzimas como
catalizadores de los diferentes procesos bioqumicos y su
Que el estudiante evale la capacidad enzimtica de la
ureasa frente a cambios de pH, concentracin de enzima y
temperatura.
Que el estudiante compare mediante
dos mtodos
(espectrofotomtrico y volumtrico), la capacidad enzimtica
de la ureasa frente a cambios de pH, concentracin de
enzima y temperatura.
43

COMPETENCIAS
resultados obtenidos en cada mtodo de anlisis
((espectrofotomtrico y volumtrico) y relaciona el marco
terico y los resultados para dar el respectivo anlisis.
tiene cada prueba y el mecanismo enzimtico de la ureasa.
El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a
travs de la elaboracin de informes escritos.
Metas
1. Captulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomolculas del mdulo del curso. Adicionalmente
realizar la siguiente investigacin:
ureasa
2. presencia de grupos SH.
3. Oxidacin de los grupos SH
En esta prctica, se va a evaluar la presencia de la ureasa en leguminosas y tortas de
oleaginosas midiendo su actividad biolgica, mediante la hidrlisis de la urea. Se determinar su
actividad, a travs de dos mtodos: el espectrofotomtrico y por titulacin con HCl
44

En esta seccin de laboratorio hay dos prcticas: ensayos cualitativos y ensayos cuantitativos.
De los ensayos cualitativos, el tutor de prctica tomar la decisin de realizar la prctica 1 o 2.
Esta decisin estar basada en el tiempo y recursos disponibles.
En las experiencias cuantitativas, el tutor de prctica tomar la decisin de realizar la prctica
1 o 2. Esta decisin estar basada en el tiempo y recursos disponibles.
Es importante que durante la sesin se realice un ensayo cualitativo y un ensayo
cuantitativo.

100 gramos de habas verdes (grupo 1)
100 gramos de frijoles verdes (grupo 2)
100 gramos de habichuelas verdes (grupo 3)
100 gramos de frijol de soya (grupo 4).
Hojas de papel milimetrado, regla, borrado y lpiz.
Buffer fosfato, a pH 5.0; 6.0; 7.2; 8.0 y 10.0
a 0.05 M
Solucin de Urea 0.25 M

Solucin de HgCI2 1%
Indicador de tashiro
Solucin de HCI
0.1 N
Buffer fosfato, a pH 4.0, 5.5, 7.0, 8.5,10.0

Solucin de NaCl
0.1 M 50 ml de c/u
1%
Solucin fenol nitroprusiato de sodio : 4,7g fenol y 6mg de nitroprusiato de sodio en 100ml de
agua desionizada
Disolver 2g de NaOH en 100ml de agua desionizada y agregar 7,5ml de hipoclorito de sodio
comercial al 5%. Guardar en frasco mbar.
45

Solucin de HCI
1.0 M (titulada exactamente). Mortero con mango
Agitadores de vidrio, Tubos de ensayo, gradillas, Baln aforado de 25 ml , Vasos de precipitado

,1000 ml de vidrio , Vasos de precipitado, 50 ml , 200,600., Vasos de precipitado, 200, 600,1000
ml plsticos., Pipetas 1, 10 y 5 ml, Probetas 100 ml y 50 ml, Estufas con mallas, esptulas,
espectrofotmetro, Centrifuga, Erlenmeyers de 50 y 250 , Incubadora o estufa entre 50-60C,
Vidrio reloj, Balanzas analticas, Tablas de diseccin, Bureta de 25 ml , Pinzas y soporte para
titulacin
Programa Excel.
REACTIVO
PROTECCION
cidos inorgnicos
concentrados
RIESGO
Metodologa
Captulo 3: enzimas, de la Unidad 1: Biomolculas del mdulo del curso.
Forma de trabajo:
46


Procedimiento:
Extraccin de la ureasa
Pesar 5 g de muestra (en cada caso ser una de las harinas de leguminosas o de las tortas de
oleaginosas), pasarla a un erlenmeyer, agregar 10 ml de NaCl 1%; agitar mecnicamente
durante 15 minutos y centrifugar la suspensin a 2.500 rpm por 15 minutos; transferir el
sobrenadante a un baln aforado de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 mI de NaCI
1% y repetir exactamente el procedimiento anterior.
Reunir los dos sobrenadantes y completar a 25 ml con NaCI 1%. Este es el extracto que
contiene ureasa. Dejar en bao con hielo
Determinacin de la actividad a diferentes pH: pH ptimo de una enzima:
Mtodo 1:
Preprese 2 series de 5 tubos: 5 servirn como blanco y 5 para determinar el efecto de pH.
(Tubos p) rotulados claramente. Agregue lo indicado en el cuadro, incubndolos como se indica.
Terminada la incubacin transfiera el contenido de cada tubo a un erlenmeyer diferente,
agregando a cada uno 3 gotas de indicador de tashiro; finalmente titule con HCI de normalidad
conocida.
Primera Serie
TUBOS BLANCO
Tubo
Condiciones
1
Buffer Fosfato pH 5, ml
4.5
4.5
Buffer Fosfato pH 7.2, ml
4.5
4.5
4.5
HgCl2 1%, gotas
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Urea 0.25 M, ml
Incubar a 50 C durante cinco minutos agitando.

Extracto de Ureasa, ml
47

Incubar a 50 C durante 25 minutos. Titular con HCl 0.1 N
Volumen de HCl gastado en la titulacin
Tabla 15: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa tubos blanco
Segunda Serie
TUBOS PROBLEMA
Tubos P
Condiciones
1p
2p
3p
4p
5p
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Urea 0.25 M, ml

HgCl2 1%, gotas
Titular con HCl 0.1N

Tabla 16: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa, tubos problema
Expresin de resultados
Tabular los resultados obtenidos as:
Tubo nmero
ml de HCl gastado
Titulacin corregida
Micromoles /ml de
HCl gastado
1p
2p
3p
4p
5p
48

Tabla 17: resultados pH ptimo de la ureasa, tubos problema
El valor corregido de la titulacin es la diferencia entre el volumen de HCl 0.1 N gastado en el

blanco y el gastado en el problema (p) al mismo pH.
Tubo nmero
Micromoles de urea hidrolizada
pH correspondiente
1p
2p
3p
4p
5p
Tabla 17: resultados pH ptimo de la ureasa, tubos problema
Determinacin de la actividad a diferentes pH: pH ptimo de una enzima:

Mtodo 2:
Extracto enzimtico de material vegetal:
El extracto que contenga la ureasa se puede obtener de una serie de leguminosas, las
recomendadas son: frijol, habas, habichuela y frijol soya. Pese aproximadamente 5,0 g del
material vegetal a utilizar, colquelo en un mortero y macere con 20ml de NaCl 1% previamente
enfriado en un bao de hielo-agua y realice la extraccin por 15 minutos; luego Centrifuge por
10min a 2500 rpm.
Transfiera el sobrenadante a un baln aforado de 50ml y el residuo transfiralo nuevamente al
mortero y realice una segunda extraccin con 10ml de NaCl al 1% y fro, por 15 min. Centrifuge
a 2500 rpm por 10 min y coloque el sobrenadante en el baln aforado y complete a volumen con
NaCl al 1%. Guarde el extracto enzimtico refrigerado en un bao agua-hielo.
Marque doce tubos de ensayo y adicione a cada uno las siguientes soluciones:
49

Tabla 18: resultados pH ptimos de la ureasa, mtodo espectrofotomtrico.
Mezclar bien el contenido de los tubos de ensayo y colocarlos en un bao termostatado entre 50
y 60o C por 10 min para el desarrollo del color. Dejar enfriar y leer la absorbancia a 630 nm; si la
absorbancia es mayor a 2.0, realizar la dilucin adecuada y volver a leer.
Cuestionarios:
Del mtodo 1: exprese grficamente en papel milimetrado, los micromoles de urea hidrolizados
(en las ordenadas Y) Vs el pH en las abscisas (X). , para ello debe buscar resultados del
grupo que realice dicha determinacin.
Del mtodo 2: Haga una grfica de pH vs Absorbancia y de temperatura vs Absorbancia e
identifique el pH ptimo de la ureasa, para ello debe buscar resultados del grupo que realice
dicha determinacin.
Compare los resultados del mtodo 1 y 2 y realice su propio anlisis y conclusiones.
Que efecto tiene el pH sobre la actividad biolgica de una enzima?
Mtodo 3:
El trabajo experimental se har en dos sesiones consecutivas de laboratorio as:
En la primera sesin se determinar el efecto del pH, concentracin de sustrato, temperatura

sobre la velocidad de la reaccin enzimtica.
En la segunda sesin se determinar la presencia de ureasa en leguminosas y tortas de
oleaginosas midiendo su actividad por el mismo mtodo utilizado en la sesin anterior.
1. Primera sesin
50

1.1 Determinacin de la actividad a diferentes pH

Preprese 2 series de 5 tubos: 5 servirn como blanco y 5 para determinar el efecto de pH.
(Tubos p) rotulados claramente. Agregue lo indicado en el cuadro, incubndolos como se indica.
Terminada la incubacin transfiera el contenido de cada tubo a un erlenmeyer diferente,
agregando a cada uno 3 gotas de indicador de tashiro; finalmente titule con HCI de normalidad
conocida.
Primera Serie
TUBOS BLANCO
Tubo
Condiciones
1
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
HgCl2 1%, gotas
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Urea 0.25 M, ml
Incubar a 50 C durante cinco minutos agitando.


Volumen de HCl gastado en la titulacin
Tabla 19: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa tubos blanco mtodo 2
Segunda Serie
TUBOS PROBLEMA
Tubos P
Condiciones
Urea 0.25 M, ml
1p
2p
3p
4p
5p
4.5
51

4.5
4.5
4.5
4.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5

HgCl2 1%, gotas
Titular con HCl 0.1N

Tabla 20: bateras de tubos pH ptimo de la ureasa tubos problema mtodo 2
1.1.1 Expresin de resultados

Tabular los resultados obtenidos as:
Tubo nmero
ml de HCl gastado
Titulacin corregida
Micromoles/ml
HCl gastado
de
1p
2p
3p
4p
5p
Tabla 21: expresin de resultados pH de la ureasa tubos problema mtodo 2
El valor corregido de la titulacin es la diferencia entre el volumen de HCl 0.1 N gastado en el

blanco y el gastado en el problema (p) al mismo pH.
Exprese grficamente (grfica 1 de su informe) en papel milimetrado, los micromoles de urea
hidrolizados (en las ordenadas) vs el pH (en las abscisas). De acuerdo con los resultados de su
grfica, deduzca el pH ptimo, con el cual va a trabajar en las siguientes etapas.
Tubo nmero
Micromoles de urea hidrolizada
pH correspondiente
1p
2p
52

3p
4p
5p
1.2 Efecto de la concentracin de sustrato en la velocidad de reaccin enzimtica

En 8 tubos de ensayo marcados, pipetear en cada uno las cantidades de reactivos que a
continuacin se indican:
Tubos
Condiciones
B
Urea 0.25 M, ml
1.0
1.5
2.0
3.0
6.0
8.0
9.5
Buffer de fosfato pH ptimo, ml
8.5
8.0
7.5
6.5
3.5
1.5
HgCl2, gotas
Colocar todos los tubos en un bao mara a 50 C por cinco minutos y sin sacarlos
agregar:
Ureasa, ml
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Dejar en bao mara a 50 C durante 25 minutos y al final agregar:

HgCl2 1%, gotas
Mezclar y sacar los tubos del bao

Tabla 22: bateras de tubos variacin concentracin de sustrato, tubos problema
Transferir cuantitativamente el contenido de cada tubo a un erlenmeyer marcado, agregar a

cada uno 3 gotas de indicador, titular con el HCI (normalidad conocida) y comparar las
diferentes titulaciones con el blanco.
1.2.1 Expresin de resultados :Tabular los resultados obtenidos as:
Tubo
nmero
Micromoles
de urea
ml de HCl
gastados
Titulacin
corregida
Micromoles de
HCl gastados
1
2
3
4
53

5
6
7
Titulacin corregida, corresponde a: ml de HCl gastados - ml de HCl del blanco.

Tubo
nmero
Micromoles
de
urea
hidrolizada
Velocidad en
moles/min
1/v
[S] moles de
urea inicia/ml
1/[S]
1
2
3
4
5
6
7
Tabla 23: expresin de resultados variacin concentracin de sustrato
En papel milimetrado y con datos de la tabla anterior construir las siguientes grficas:
Grfica No. 2 de su informe: En ordenadas datos de y o sea micromoles de urea hidrolizados

por minuto. En abscisas datos de [S] o sea micromoles de urea iniciales/ml.
Grfica No. 3 de su informe: Siguiendo el procedimiento Lineweaver-Burk, en ordenadas
datos de 1/v y en abscisas 1 / [S].
De estas dos grficas, deducir la constante de Michaelis y la velocidad mxima para esta
reaccin. El valor de Km (constante de Michaelis) debe expresarse en moles/litro.
1.3 Determinacin de la actividad a diferentes temperaturas
Se usarn cinco baos de agua a diferentes temperaturas y cada tubo se incubar como se
indica a continuacin:
Tubo nmero
Incubar en:
bao de agua con hielo
bao de agua a temperatura ambiente aproximadamente 16 C
bao de agua a 37 C
54

4
bao de agua a 60 C
bao mara (92 C)
Luego proceda a agregar los reactivos y a mantener las condiciones que se indican enseguida:
Tubos
Condiciones
B
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
HgCl2, gotas
Temperatura de incubacin, C
16
16
37
60
92
Urea 0.25 M, ml
Buffer de fosfato pH ptimo, ml
Colocar cada tubo en bao de agua a la temperatura indicada por cinco

minutos y sin sacarlos agregar.
Solucin de ureasa, ml
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Agitar e incubar por 25 minutos a la temperatura correspondiente

HgCl2 1%, gotas
Titular con HCl (normalidad conocida)

Resultados, ml de HCl
Tabla 24: bateras de tubos variacin de la temperatura
1.4 Expresin de resultados

Con los resultados de la anterior serie de temperaturas y el obtenido a 50 C (ver determinacin
de la actividad a diferentes pH, tubo No. 3p), grafique en papel milimetrado (grfica No. 4 de su
informe) los micromoles de urea hidrolizada (ordenadas) vs temperatura C (abscisas). Explique
el efecto de cada temperatura en la actividad de la ureasa.
2. Segunda sesin
2.1 Extraccin de la ureasa
Pesar 5 g de muestra (en cada caso ser una de las harinas de leguminosas o de las tortas de
oleaginosas), pasarla a un erlenmeyer, agregar 10 ml de NaCl 1%; agitar mecnicamente
durante 15 minutos y centrifugar la suspensin a 2.500 rpm por 15 minutos; transferir el
sobrenadante a un baln aforado de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 mI de NaCI
1% y repetir exactamente el procedimiento anterior.
55

Reunir los dos sobrenadantes y completar a 25 ml con NaCI 1%. Este es el extracto que
contiene ureasa.
En 5 tubos de ensayo marcados pipetear en cada uno las cantidades de reactivos como en la
tabla siguiente se indica.
Mezclar y sacar los tubos del bao. Transferir cuantitativamente el contenido de cada tubo a un
erlenmeyer marcado, titular con el HCI (normalidad conocida) y comparar las diferentes
titulaciones con el blanco.
Tubos
Condiciones
Urea 0.25 M, ml
Buffer de PO4 pH ptimo, ml
4.5
2.5
HgCl2 1%, gotas
Colocar todos los tubos en bao mara a 50 C por cinco minutos y

sin sacarlos agregar:
Extracto de ureasa, ml
0.5
0.5
1.5
Dejar en bao mara a 50 C durante 25 minutos y al final agregar:

HgCl2 1%, gotas
Tabla 25: bateras de tubos extraccin de ureasa de leguminosas
Nota: Si la actividad de la enzima es muy baja con las alcuotas utilizadas, repetir el ensayo
usando una alcuota del extracto de ureasa mayor. Por el contrario si la enzima presenta una
actividad afta repita el ensayo utilizando una dilucin del extracto de ureasa (por ejemplo: 1:5
v/v).
Determine la actividad uresica de la leguminosa o la torta analizada, expresndola como
micromoles de urea hidrolizado / ml del extracto de ureasa.
Compare la actividad uresica de su extracto con los obtenidos por los dems grupos y con los
datos bibliogrficos.
Cuestionario
1. Qu tipo de inhibicin enzimtica se presenta con el uso de metales pesados?
2. Qu representan los valores de Vm y Km?
3. Qu entiende por metalo-enzimas? D ejemplos.
56

4. Qu sucedera si se reemplaza el HgCl2 por CaCI2? Explique su respuesta.

5. Todas las enzimas tienen CySH en su sitio activo? Especifique cules son los aminocidos
presentes en el sitio activo de las enzimas cuyos sitios activos usted conoce.
57

PRACTICA No. 5- DETERMINACIN DE VITAMIAN C4
Tipo de practica
Presencial
Intencionalidades
formativas
Autodirigida
Remota
1H
Esta prctica no se deriva de ninguna de las
contenidas en el curso, pero esta indirectamente
relacionada con la Unidad 1, en la parte de
biomolculas.
Propsitos
Reconocer la presencia de vitamina C en diferentes
muestras de alimentos.
Cuantificar el contenido de vitamina C en las
muestras analizadas y comparar su valor con datos
tericos.
Establecer la importancia biolgica de la vitamina C
en los procesos metablicos.
Objetivos
Que el estudiante reconozca presencia de vitamina
C en diferentes muestras de alimentos.
Que el estudiante cuantifique
el contenido de
vitamina C en las muestras analizadas y comparar
su valor con datos tericos.
Que el estudiante establezca la importancia biolgica
de la vitamina C en los procesos metablicos.
COMPETENCIAS
El estudiante describe y analiza de manera eficiente

58

los resultados observados en cada prueba cualitativa

y cuantitativa; relaciona el marco terico y los
resultados para dar el respectivo anlisis.
El estudiante conceptualiza en forma precisa la
relacin que tiene cada prueba y la funcin biolgica
de la vitamina C.
El estudiante comunica los conocimientos adquiridos
a travs de la elaboracin de informes escritos.
Metas
El estudiante obtendr su calificacin del respectivo
pre informe personal como resultado del estudio
independiente.
El estudiante resolver los respectivos cuestionarios
dados.
El estudiante presentar en forma escrita el informe
del respectivo laboratorio en forma grupal en donde
sobresalga el anlisis de resultados.
1. estructura de la vitamina C cido ascrbico.
2. Funcin biolgica de la vitamina C.
3. estabilidad de la vitamina C.
En esta prctica, se va a evaluar la presencia cualitativa y cuantitativa de vitamina C en frutas
y vegetales. La determinacin cualitativa se realiza por observaciones directas y la forma
cuantitativa, se realiza por el mtodo espectrofotomtrico.
59

Material de vidrio
Material biolgico
Reactivos
Equipos
gradilla
Jugo de naranja,
limn,
tomate,
zanahoria y durazno
Solucin de almidn
al 5%
termmetros
Tubos de ensayo
Tabletas de Vitamina
C.
Lugol
Papel indicador
Pipetas de 5 y 10 ml
2-nitroanilina 0.16%
en actico HCI
Espectrofotmetro
Tapones de caucho
Nitrito de sodio
0,08% en H2O
mecheros
Probetas de 100 ml
Etanol 96%
mallas
Acido oxlico 0.15%

y
Solucin
de
vitamina C, recin
preparada
(0.2
mg/mI).

Ninguno.
No hay riegos en el desarrollo de la prctica.
Metodologa
Todo lo relacionado con vitaminas.
Forma de trabajo:
60

contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la marcha de la prctica y tabla

de resultados en blanco.
Procedimiento 1: forma cualitativa
1. Disuelva 0.5 g de almidn en 10.0 mL de agua.
2. En un tubo de ensayo adicione 2.0 mL de la solucin de almidn y 1.0 mL de lugol.
Adicione media tableta de vitamina C. Registre sus observaciones. La decoloracin de la
mezcla es una indicacin de la presencia de vitamina C; tenga en cuenta este resultado
como patrn de referencia.
3. Identifica cinco tubos de ensayo como A, B, C, D y E y coloca en cada uno de ellos 1.0 mL
de la solucin de almidn y 1.0 mL de lugol. Aada unas gotas de jugo de naranja al tubo
A; unas gotas de jugo de limn al tubo B; 1.0 mL de jugo de tomate al tubo C; 1.0 mL de
jugo de zanahoria al tubo D; y 1.0 mL de jugo de durazno al tubo E. Tape cada tubo con
un tapn de caucho y agtelos. Registre sus observaciones para cada tubo.
Cuestionario:
1. Identifique cual de los alimentos empleados contiene mayor cantidad de vitamina C.
2. Consulte un mtodo sencillo de laboratorio para identificar otras vitaminas diferentes a la
C.
Procedimiento 2: forma cuantitativa
Cada grupo traer una fruta y una verdura de acuerdo con lo convenido previamente con el
profesor.
Para obtener el extracto problema se procede de la siguiente manera: En el caso de las frutas
ctricas se toma 1 ml de jugo, se pesa y luego se agregan 4 ml de cido oxlico al 0,15%, se
mezcla bien y se filtra, el filtrado se conserva para hacer la determinacin colorimtrica.
Para otras frutas y verduras, se pesa lg que se macera en mortero lo mejor posible con 4 ml de
solucin de cido oxlico al 0,15%. Despus de filtrar completar el filtrado con la solucin de
oxlico hasta un volumen final de 5 ml. De ah tomar 1 ml de cada extracto problema para tubos
D1 (fruta) y D2 (verdura).
Si la extraccin se va a hacer en licuadora, se recomienda pesar 6 g y adicionar 30 ml de cido
oxlico al 0.15%.
61

Si el extracto exhibe coloracin se recomienda adicionar una pequea cantidad de carbn

activado (aproximadamente 1 g por cada 10 mI de extracto coloreado) se agita y luego se
centrifuga a 2500 rpm durante 10 minutos. La solucin patrn de cido ascrbico contiene 0.2
mg/ml y debe estar recientemente preparada.
El nitrito de sodio tambin debe estar fresco y debe asegurarse que la 2-nitro anilina se diazotice
bien. Esto se logra cuando al mezclar esta con el nitrito se decolora la solucin.
Rotular 9 tubos de ensayo y adicionar los siguientes reactivos:
Tubos
Condiciones
Fruta
D1
Verdura
D2
2-nitroanilina, ml
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
Nitrito de sodio, ml
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
Mezclar y esperar la decoloracin

Etanol 96%, ml
3.8
3.8
3.8
3.8
3.8
3.8
3.8
3.8
3.8
Patrn vitamina C, ml
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
cido oxlico, ml
1.0
0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
Extracto problema, ml
1.0
1.0
Mezclar bien y dejar en reposo cinco minutos

NaOH 10%, ml
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
Agua destilada, ml
3.8
3.8
3.8
3.8
3.8
3.8
3.8
3.8
3.8
Tabla 28: bateras de tubos cuantificacin de vitamina C.
Se mezcla bien el contenido de cada tubo y se lee en el espectrofotmetro las Absorbancias

correspondientes a una longitud de onda de 540 nm.
Elabore la curva de calibracin e interpole las Absorbancias de sus muestras.
2. Expresin de resultados
De acuerdo con los resultados calcular el contenido de vitamina C en la fruta y verdura
correspondiente, expresndolo como mg/100 g de fruta o verdura o como mg/100 ml de jugo.
Finalmente compararlo con el valor reportado en la bibliografa.
Cuestionario
62

1. Compare el mtodo que utiliz con otro mtodo de determinacin de la misma vitamina.
2. Qu ocurrira si no se decolora por completo la solucin de 2-nitroanilina al adicionar nitrito
de sodio?
3. Cul es la funcin del hidrxido de sodio en la determinacin de la vitamina C?
4. Cmo se afectara la determinacin si la muestra ha sido tratada previamente con calor?
5. Cmo se encuentra la vitamina C generalmente en los materiales vegetales?
6. Cite seis alimentos (verduras, frutas, leguminosas, tubrculos) ricos en vitamina C.
63

PRACTICA No. 6- AISLAMIENTO DEL ARN EN LEVADURA5

Tipo de practica
Presencial
Horas de la
practica
Temticas de la
prctica
Intencionalidades
formativas
Autodirigida
Remota
1H
Captulo 4 y 5 de la unidad 2: cidos nucleicos y bioenergtica.
Propsitos
Extraer el ARN de los dems componentes celulares
levadura.
a partir
de
la
Analizar, los reactivos con laso cuales se separa el ARN de los dems
componentes celulares
Analizar la composicin qumica del ARN
Objetivos
Que el estudiante aprenda a extraer el ARN de los dems componentes
celulares a partir de la levadura.
Que el estudiante analice , los reactivos con los cuales se separa el ARN
de los dems componentes celulares
Que el estudiante analice la composicin qumica del ARN
COMPETENCIAS
El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados
observados en la prueba y relacionar el marco terico y los resultados para
dar el respectivo anlisis.
El estudiante conceptualiza en forma precisa
prueba y la estructura del ARN.
la relacin que tiene
la

Plummer, D. (1981). Bioqumica Prctica. Londres: Editorial McGraw-Hill.
64

Metas
El estudiante obtendr su calificacin del respectivo pre informe personal
como resultado del estudio independiente.
laboratorio en forma grupal en donde sobresalga el anlisis de resultados.

1. Captulo 4 y 5 de la unidad 2: cidos nucleicos y bioenergtica del mdulo del curso.
Adems se servir investigar:
2. composicin qumica del ARN
3. Tipos de ARN
En esta prctica, se va a extraer e identificar la composicin qumica del ARN en clulas de

levadura.
Estas prcticas corresponde a los temas que se tratan en la Captulo 4 y 5 de la unidad 2: cidos
nucleicos y bioenergtica.
Es una prctica cualitativa para identificar la extraccin de este tipo de sustancias. Una vez
obtenido el Acido Nucleico se puede aplicar tcnicas de identificacin de pentosas y bases
nitrogenadas
Es de vital importancia para los estudiantes de la formacin profesional y tcnica de los programas
de ingeniera de alimentos, agroforestal, agronmica, zootecnia, produccin animal y regentes de
farmacia, el desarrollo de estas prcticas, ya que profundizan y analizan la relacin e importancia
que guardan las funciones de loa cidos nucleicos y su relacin con la conservacin de la
expresin gentica.
65

Material de vidrio
gradilla
Material biolgico
Levadura seca.
Reactivos
Equipos
Solucin de fenol
termmetros
Tubos de ensayo
Acetato de
potasio
Centrifuga
Pipetas de 5 y 10
ml
Etanol absoluto
Tapones de caucho
Etanol absoluto
Probetas de 100 ml
Vasos
de
precipitado de 250,
600 ml.

Ninguno.
Seguridad Industrial: No hay riegos en el desarrollo de la prctica
Metodologa
Captulo 4 y 5 de la unidad 2: cidos nucleicos y bioenergtica del mdulo del curso.

Forma de trabajo:
Estimado estudiante a continuacin encontrar los pasos a seguir para el desarrollo de la prctica
#6 del curso.
La metodologa es la siguiente: Trabajo individual: el estudiante obtiene las guas de laboratorio,
prepara un pre informe que contenga: resumen conocimientos previos, diagrama de flujo de la
marcha de la prctica y tabla de resultados en blanco.
66

Procedimiento: Suspenda 30 g de levadura seca en 120 ml de agua a 37C. Deje reposar por 15
min a esta temperatura y agregue 160 ml de solucin concentrada de fenol (precaucin: muy
corrosivo). Agite mecnicamente la suspensin durante 30 min a T ambiente. Luego Centrifuge
en fro a 3000 g durante 15 min, para romper la emulsin.
Con una pipeta pasteur remueva cuidadosamente la capa superior acuosa y Centrifuge a 10000
g durante 5 min en una centrifuga refrigerada para separar la protena desnaturalizada. Agregue
acetato de potasio al sobrenadante hasta obtener una concentracin final de 20g/L y precipite el
ARN aadiendo 2 volmenes de etanol.
Enfre la solucin en hielo por 1 hora. Recoja el precipitado por centrifugacin en frio a 2000 g por
5 min. Lave el ARN con una mezcla de etanol-agua (3:1) , luego con etanol y finalmente con ter;
deje secar al aire y pese. El contenido de ARN en la levadura es de aproximadamente 4% de su
peso seco.
Evaluacin grupal: El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por
el tutor, que contenga: portada, introduccin, objetivos, tabla de resultados, anlisis y
67

PRACTICA No. 7- AISLAMIENTO Y DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS6

Tipo de practica
Presencial
Autodirigida
Remota
1H
Captulo 4 y 5 de la unidad 2: cidos nucleicos y bioenergtica.
Intencionalidades
formativas
Propsitos
Reconocer la presencia de ARN y ADN en los tejidos biolgicos.
Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas de ADN y
ARN en los tejidos biolgicos.
Establecer relaciones entre la estructura y la funcin de ARN y
ADN en los procesos metablicos.
Objetivos
Reconocer la presencia de ARN y ADN en los tejidos biolgicos.
Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas de ADN y
ARN en los tejidos biolgicos.
Establecer relaciones entre la estructura y la funcin de ARN y
ADN en los procesos metablicos.
COMPETENCIAS
los
resultados observados en cada prueba cualitativa y relaciona el
marco terico y los resultados para dar el respectivo anlisis.
cada prueba y la estructura de ARN y ADN.
El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a travs de
la elaboracin de informes escritos.
Universitas Malacitana (2008). Prcticas de biomolculas. Consultado en julio, 16, 2009 en

http://www.biorom.uma.es/contenido/av_biomo/Guiones_Biomol.pdf.
68

Metas
resultados.
servir investigar antes de la prctica y a manera de pre informe los siguientes temas,
enfatizando en la reacciones qumicas que tienen lugar y el principio del mtodo:
1. Unidad didctica 2: cidos nucleicos y bioenergtica: lecciones 16 a la 25.
2. EL estudiante puede complementar su gestin investigando en la bibliografa recomendada los
siguientes temas:
- cidos Nucleicos: ADN y ARN. Identificacin bioqumica.
Mediante esta prctica, se quiere separar el ARN ADN de los dems componentes celulares de
la levadura, del hgado de ternera y del tejido de una cebolla cabezona, para posteriores
identificaciones. Es una prctica cualitativa para identificar la extraccin de este tipo de
sustancias. Una vez obtenido el Acido Nucleico se puede aplicar tcnicas de identificacin de
pentosas y bases nitrogenadas.
Esta prctica corresponde a los temas que se tratan en los Captulo 4 y 5 de la unidad 2: cidos
nucleicos y bioenergtica.
que guardan los cidos nucleicos para en las reacciones bioqumica de los organismos vivos.
69

Material de vidrio
Material
biolgico
Reactivos
Balanza, esptula , vasos de

precipitado de 600 y 250 ml
Levadura
seca
Solucin de fenol
Probeta de 100 ml, pipetas de

2 5 y 10 ml, agitadores de
vidrio.
Hgado de
ternera
Acetato de
potasio
Tubos de ensayo, tubos falcon

de 15 ml, ,
Cebolla
cabezona
fresca
Etanol absoluto
Tampn + detergente: NaCl

0,14 M, acetato magnsico
1,5 mM, KCl 5 mM, dodecil
sulfato sdico (SDS) al 1%.
Detergente
lavavajillas,
sal, zumo
de pia o
papaya.
ter etlico,
Equipos
Balanza analtica
Tabla
32:
reactivos la
prctica 7.
Termmetros
centrifuga
espectrofotmetro
alcohol de 96 muy
fro
batidora
Fenol/cloroform
o/isoamilico
(25:24:1).
Acetato sdico
3 M pH 5,2.
Tampn TrisEDTA: Tris 10
mM, EDTA 1
mM, pH 7,5.
Ninguno.
Seguridad industrial
REACTIVO
PROTECCION
Solucin de fenol.
Gafas de seguridad,
tapabocas.
RIESGO
Metodologa
70


Unidad didctica 2: cidos nucleicos y bioenergtica: lecciones 16 a la 25.
Forma de trabajo:
Estimado estudiante a continuacin encontrar los pasos a seguir para el desarrollo de la prctica
# 7 del curso.
Procedimiento:
1. experimento 1: AISLAMIENTO DEL ARN EN LEVADURA7
Suspenda 30 g de levadura seca en 120 ml de agua a 37C. Deje reposar por 15 min a esta
temperatura y agregue 160 ml de solucin concentrada de fenol (precaucin: muy corrosivo).
Agite mecnicamente la suspensin durante 30 min a T ambiente. Luego centrifugue en fro a
3000 g durante 15 min, para romper la emulsin.
Con una pipeta pasteur remueva cuidadosamente la capa superior acuosa y Centrifuge a 10000
g durante 5 min en una centrifuga refrigerada para separar la protena desnaturalizada. Agregue
acetato de potasio al sobrenadante hasta obtener una concentracin final de 20g/L y precipite el
ARN aadiendo 2 volmenes de etanol.
Enfre la solucin en hielo por 1 hora. Recoja el precipitado por centrifugacin en frio a 2000 g
por 5 min. Lave el ARN con una mezcla de etanol-agua (3:1), luego con etanol y finalmente con
ter; deje secar al aire y pese. El contenido de ARN en la levadura es de aproximadamente 4%
de su peso seco.
2. experimento 2: AISLAMIENTO Y DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS8
71

1. En un tubo de vidrio de fondo redondo, tomar 0,1-0,2 g de un hgado de ternera, pesarlo y

anotar su peso hmedo.
2. Desmenuzarlo tanto como sea posible con una varilla de vidrio y aadirle 10 veces el peso
hmedo (en ml) de tampn salino ms detergente.
3. Transferirlo a un tubo Falcon de 15 mL (tubo de plstico con tapn rojo).
4. Aadir el mismo volumen de fenol/cloroformo/alcohol isoamlico que se haya aadido de
tampn salino con detergente.
5. Agitar vigorosamente.
6. Centrifugar a 3.500 rpm (en centrfuga de mesa) durante 5 minutos y separar con cuidado la
fase acuosa (fase superior).
7. Aadir 1/10 del volumen, de fase acuosa recuperada, de acetato sdico 3 M pH 5,2, y mezclar
bien.
8. Aadir, gota a gota, 2,5 volmenes, de fase acuosa recuperada, de etanol absoluto.
9. Al aadir el etanol el DNA precipita en forma de un ovillo. Si no aparece el ovillo de DNA de
forma clara, incubar 5 minutos en hielo (o en el congelador de la nevera). Centrifugar a 3.500 rpm
5 minutos y resuspender el precipitado de cidos nucleicos en 2 mL de tampn Tris/EDTA pH 7,5.
Si el ovillo se ve claramente, se puede "pescar" el DNA con la pipeta Pasteur, escurrir el exceso
de etanol y transferirlo a un tubo limpio que contenga 2 mL de Tris/EDTA 1 pH 7,5.
Determinacin del espectro de absorcin de la disolucin de los cidos nucleicos
Preparar 3 mL de una dilucin 1/10 de la solucin de DNA obtenida en el paso anterior y
determinar el espectro de absorcin de la muestra entre 300 y 200 nm. Anotar las Absorbancias a
260 y 280 nm.
3. experimento 3: EXTRACCION DEL ADN DE UNA CEBOLLA9
Corta la zona central de la cebolla en cuadrados
En un vaso de agua adiciona 3 cucharaditas de detergente lavavajillas y una de sal y

aade agua destilada hasta llenar el vaso.
Mezcla esta solucin con los trozos de cebolla
Lica el conjunto, con la batidora, a velocidad mxima durante 30 segundos
Filtra el lquido obtenido con un filtro de caf
Llena hasta la mitad aproximadamente un vaso de cristal alto con la disolucin filtrada
Aade 3 cucharaditas de caf de zumo de pia o papaya y mezcla bien
Aade un volumen de alcohol muy fro equivalente al del filtrado, cuidadosamente,
hacindolo resbalar por las paredes del vaso para que forme una capa sobre el filtrado.
Puedes utilizar la varilla de vidrio o una cucharilla para ayudarte.
Deja reposar durante 2 3 minutos hasta que se forme una zona turbia entre las dos
8
Universitas Malacitana (2008). Prcticas de biomolculas. Consultado en julio, 16, 2009 en

http://www.biorom.uma.es/contenido/av_biomo/Guiones_Biomol.pdf.
9
Tato M. (2000). Extraccin del ADN de una cebolla. Consultado

http://centros5.pntic.mec.es/ies.victoria.kent/Rincon-C/Practica/PR-5.htm.
en
julio,
16,2009
en
72

capas. A continuacin introduce la varilla y extrae una maraa de fibras blancas de ADN.
Cuestionarios
1. Valorar la pureza de la preparacin de cidos nucleicos obtenida y calcular su concentracin y
la cantidad de cidos nucleicos por gramo de tejido. Comentar el resultado.
2. Por qu las protenas tienen un mximo de absorcin a 280 nm?
3. Qu tipo de detergente es el SDS, y cmo acta frente a las membranas y protenas?
4. Por qu al extraer con fenol los cidos nucleicos van a la fase acuosa y no al fenol?
5. Accin del lavavajillas y sal sobre la pared celular y las membranas plasmtica y nuclear.
6. Accin de los zumos de pia y papaya
7. Accin del alcohol sobre el ADN
Evaluacin grupal:
El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que
contenga: portada, introduccin, objetivos, tabla de resultados, anlisis y confrontacin de
resultados, desarrollo de cuestionarios. Conclusiones y bibliografa.
73

PRACTICA No. 8- PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS 10
Tipo de practica
Presencial
Autodirigida
Remota
1H
La Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosntesis de
Biomolculas, especficamente el captulo 7, Metabolismo de
glcidos.
Propsitos
Reconocer a los monosacridos
como unidades
estructurales de los polisacridos como la celulosa, almidn y
glucgeno y su importancia en los diferentes procesos
metablicos.
Analizar, mediante reacciones cualitativas coloreadas la
presencia de monosacridos y la presencia del enlace
glucocsidico en las muestras.
Establecer relaciones entre la estructura y la funcin de los
monosacridos y polisacridos y prdida de esta al variar
sus propiedades fisicoqumicas.
Objetivos
Que los estudiantes reconozcan los monosacridos como
unidades estructurales de los polisacridos como la celulosa,
almidn y glucgeno y su importancia en los diferentes
procesos metablicos.
10

74

Que el estudiante analice mediante reacciones cualitativas

coloreadas la presencia de monosacridos y la presencia del
enlace glucocsidico en las muestras.
la funcin de los monosacridos y polisacridos y prdida
de esta al variar sus propiedades fisicoqumicas.
COMPETENCIAS
anlisis.
tiene cada prueba y la de monosacridos y polisacridos.
El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a a
travs de la elaboracin de informes escritos.
Metas
servir investigar antes de la prctica y a manera de pre informe los siguientes temas, :
1. estructura general de carbohidratos.
2. clasificacin de carbohidratos: monosacridos y disacridos (enfatizando en al formacin del
enlace glicosdico).
75

3. principio y reacciones de:

prueba de tollens
prueba de Fehling
reaccin del lugol y el almidn
prueba de Benedict
Prueba de Barfoed
En esta prctica mediante pruebas coloreadas, se identifica los monosacridos y la identificacin
del comportamiento qumico de los carbohidratos segn sus funciones qumicas (aldehdos y
cetonas).
Esta prctica es un apoyo
Metabolismo: catabolismo y
Metabolismo de glcidos.
para la comprensin de los temas se tratan en la Unidad 3:

Biosntesis de
Biomolculas, especficamente el captulo 7,
que guardan los carbohidratos en las reacciones catabolismo y anabolismo para el aporte de
energa metablica.
76

Material de vidrio
Material
biolgico
Reactivos
Equipos
Tubos de ensayo
Trozo de pan
Solucin de glucosa
Mecheros de gas
Vasos de precipitado
de 250 y 600 ml
Una papa
Solucin de fructosa
Estufas, termmetros.
Pipetas de 10 ml
Tabla 34: reactivos

prctica 7.
Solucin de almidn
Solucin de yodo o reactivo
de lugol
Solucin diluida de HCl
Alcohol etlico, reactivo de
tollens, reactivo de Fehlin A y
B).

No hay un software recomendado, en internet, el estudiante puede consultar videos ilustrativos de
las pruebas a realizar.
Como complemento a la fundamentacin terica, se recomienda revisar el presentacin de OA:
Presentacin: Generalidades de Carbohidratos, que se encuentra en la pgina principal del curso
en campus virtual de la Unad.
No hay situaciones o eventos de peligrosidad.
Metodologa
Conocimiento previo para el desarrollo de la prctica: Los temas dados en la fundamentacin
terica.
Forma de trabajo: Estimado estudiante a continuacin encontrar los pasos a seguir para el
desarrollo de la prctica #8 del curso.
77

Procedimiento:
Parte A: solubilidad
1. Se toma 0.5 g de un azcar en cada uno de los tubos de ensayo, debidamente rotulados.
Organice los tubos de ensayo en la gradilla.
2. Aada 2.0 ml. de agua a cada tubo de ensayo. Agite cada tubo de ensayo fuertemente
durante un minuto y deje en reposo durante 30 segundos. Anote sus observaciones.
3. Repita los dos pasos anteriores utilizando otros tubos de ensayo, pero en vez de agua
utilice 2.0 mL de alcohol etlico. Anote sus observaciones.
4. Construya un cuadro en donde cualifique cualitativamente el grado de solubilidad de las
diferentes muestras.
Parte B: prueba con los reactivos de Tollens y Fehling
1. Realice un montaje de bao de Mara y caliente a 60C.
2. Prepare soluciones de cada azcar al 10%. Tome 1.0 mL de cada solucin y llvela a
diferentes tubos de ensayo, previamente rotulados. Organice los tubos de ensayo en la
gradilla.
3. Adicione 1.0 mL del reactivo de Tollens a cada tubo de ensayo.
4. Verifique que la temperatura en el bao Mara se sostenga a 60 C. Coloque dentro un vaso
de precipitado los diferentes tubos de ensayo y lleve este conjunto al bao Mara por 5
minutos. Anote sus observaciones.
5. Repita los pasos dos, tres y cuatro, pero en lugar del reactivo de Tollens utilice 0.5 mL del
reactivo A de Fehling y 0.5 ml. del reactivo B de Fehling.
6. Ahora, tome 2.0 mL de solucin de sacarosa y agregue tres o cuatro gotas de solucin
diluida de HCL Agite y caliente suavemente por un minuto. Permita que se enfre y luego
agregue 0.5 mL de reactivo A de Fehling y 0.5 mL de reactivo B de Fehling. Caliente en el
bao de Mara por tres minutos. Anote sus observaciones.
C: polisacridos
1. Prepare una solucin concentrada de almidn en agua. Caliente suavemente hasta que se
forme engrudo. Djela en reposo hasta que enfre. Luego aada dos gotas de solucin de
yodo o de reactivo de lugol. Anote sus observaciones.
2. Repita esta prueba utilizando reactivo de lugol en una rebanada de papa o de pan. Anote
sus observaciones.
Cuestionario:
1. Qu resultados muestra la prueba con el reactivo de Tollens? y con el reactivo de
Fehling?
2. Qu resultados muestra la prueba de solubilidad?
78

Evaluacin grupal:
El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor, que
79

PRACTICA No. 9- HIDRLISIS DE POLSACARIDOS, MTODO DEL REACTIVO 3,5DINITROSALICILATO 11
Tipo de practica
Presencial
X Autodirigida
Remota
1H
Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y
Biosntesis de
glcidos.
Intencionalidades
formativas
Propsitos
Comparar
tres mtodos de hidrlisis de polisacridos,
determinando la cantidad de azcar reductor formado mediante la
reaccin de la glucosa con 3,5-dinitrosalicilato de sodio.
Reconocer los productos de hidrlisis de polisacridos.
Cuantificar la concentracin de glucosa residual como producto de
las hidrlisis cida, enzimtica por el mtodo 3,5-dinitrosalicilato
de sodio del almidn y celulosa.
Objetivos
Que los estudiantes comparen tres mtodos de hidrlisis de
polisacridos, determinando la cantidad de azcar reductor
formado mediante la reaccin de la glucosa con 3,5-dinitrosalicilato
de sodio.
Que los estudiantes rreconozcan los productos de hidrlisis de
polisacridos.
Que los estudiantes cuantifiquen
la concentracin de glucosa
residual como producto de las hidrlisis cida, enzimtica por el
mtodo 3,5-dinitrosalicilato de sodio del almidn y celulosa.
COMPETENCIAS
11
80


los
cada prueba y los procesos de hidrlisis de polisacridos.
Metas
resultados.
1. estructura y funcin biolgica del almidn, glucgeno y celulosa.
2. mtodo del reactivo 3,5-dinitrosalicilato para cuantificacin de azcares.
En esta prctica se compara tres mtodos de hidrlisis de polisacridos, determinando la
cantidad de azcar reductor formado mediante la reaccin de la glucosa con 3,5-dinitrosalicilato
de sodio.

Biosntesis de

81

regentes de farmacia, el desarrollo de estas prcticas, ya que profundizan y analizan la relacin

e importancia que guardan los carbohidratos en las reacciones catabolismo y anabolismo para
el aporte de energa metablica. Es importante adems que los estudiantes adquieran la
competencia bsica de cuantificar carbohidratos por los mtodos tradicionales como el DNS y
Somogy-Nelson.
Material de vidrio
Material
biolgico
Tubos de ensayo,
saliva
Vasos de
precipitado de
1000, 600, 50 ml.
200 gramos
de maizena.
Pipetas de 10 ml,
probetas de 100
ml, agitadores de
vidrio.
Reactivos
Equipos
Solucin de almidn soluble (6 espectrofotmetro

mg/ml) en buffer fosfato de sodio
0.02 M y pH 6.9
NaOH2, 4 N, HCI 4 N. NaOH 20%
Balanza
Reactivo 3,5-dinitro salicilato de

sodio: (disolver 5 g de cido 3,5dinitro saliclico en 100 ml de NaOH
2N,
calentar.
Por
separado,
adicionar 150 g de tartrato de sodio
y potasio a 250 ml de H2O, calentar.
Mezclar las dos soluciones y
completar a 500 ml)
Buffer fosfato de sodio 0.02 M pH
6.9 en NaCI 0.005 M.
centrifuga
Reactivo de Lucas. (134 g de ZnCI2

en 89 ml de HCI concentrado).
Tabla 36: reactivos de la prctica 9.

No hay un software recomendado, en internet, el estudiante puede consultar videos ilustrativos
de las pruebas a realizar.
Presentacin: Generalidades de Carbohidratos, que se encuentra en la pgina principal del
curso en campus virtual de la Unad.
82

No hay situaciones o eventos de peligrosidad.

Metodologa
Conocimiento previo para el desarrollo de la prctica: Los conceptos sugeridos en la
fundamentacin terica.
Procedimiento:
El tutor en el momento de la prctica distribuir el trabajo de tal manera que cada grupo realice
una hidrlisis diferente sobre el mismo polisacrido; por ejemplo el grupo 1 efectuar hidrlisis
cida sobre almidn proveniente de maizena y el grupo 2 efectuar la hidrlisis enzimtica
sobre la misma muestra a fin de que puedan comparar los resultados.
La solucin del polisacrido tendr una concentracin de 6 mg/ml y se preparar en Buffer
fosfato de sodio 0.02 M pH = 6,9.
Todos los grupos realizarn la hidrlisis cida de la celulosa en presencia de ZnCl 2 (o reactivo
de Lucas)
1.1 Hidrlisis cida
Rotular ocho tubos de ensayo y agregar en orden los siguientes reactivos:
Tubos
Condiciones
Solucin almidn, ml
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
83

Agua destilada, ml
NaOH, 2.4 N
HCl 4N, ml
0.4
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
Colocar los tubos 1 a 6 en un bao mara a ebullicin y dejarlos en los siguientes

tiempos:
Tiempo de incubacin, minutos
12
15
25
Finalizado el tiempo de incubacin, sacar cada tubo y detener la hidrlisis agregando:

NaOH, 2.4N, ml
Reactivo 3,5-dinitrosalicilato, ml
Introducir todos los tubos en el bao a ebullicin durante cinco minutos, enfriar y
agregar 7 ml de agua destilada. Agitar y medir transmitancia a 540 nm. Utilice el B
para ajustar el 100% de transmitancia.
Tabla 37: bateras de tubos cuantificacin de glucosa DNS hidrlisis qumica.
1.2 Hidrlisis enzimtica

Recoger 2 ml de saliva en un vaso de precipitados. Cuando est todo listo para la hidrlisis
enzimtica, diluya la saliva original tomando 0.3 ml de saliva y 19.7 ml de buffer de fosfato de
sodio pH 6.9 en NaCI 0.005 M. Use inmediatamente la saliva diluida.
Si la velocidad de hidrlisis es muy rpida para obtener una rata lineal en los primeros minutos o
demasiado lenta, para observar una rata apreciable, repita el ensayo usando otra dilucin de
saliva.
Rotular ocho tubos de ensayo y agregar los siguientes reactivos:
Tubos
Condiciones
B
Solucin almidn, ml
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
Agua destilada, ml
0.4
Saliva diluida, ml
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
Inmediatamente adicione la saliva a los tubos B y 0, agregue el siguiente reactivo:

Agite todos los tubos y deje incubar a temperatura ambiente:
84

Tiempo de incubacin, minutos
12
15
25
Luego de terminar la incubacin, agregue:

Coloque todos los tubos en un bao a ebullicin durante cinco minutos, enfre y
agregue 8 ml de agua destilada. Mida la transmitancia a 540 nm y use el tubo B para
ajustar el 100% de transmitancia.
Tabla 38: bateras de tubos cuantificacin de glucosa DNS hidrlisis enzimtica.
1.3 Hidrlisis cida de la celulosa en presencia de ZnCI2

Colocar en una cpsula un trozo de algodn bien desmenuzado o vanos pedacitos pequeos de
papel de filtro. Agregue 3 ml del reactivo de Lucas y caliente durante tres minutos, agitando
energticamente. Deje enfriar y neutralice rpidamente con NaOH al 20%. Si se forma un
precipitado centrifugue a 2.500 rpm durante 10 minutos y luego pase 0.5 ml del sobrenadante a
un tubo, adicione 1 ml de NaOH 2,4 N y 1 ml del reactivo, 3,5-dinitro salicilato y proceda en igual
forma a la utilizada en las hidrlisis anteriores. Repita el procedimiento calentando durante 6
minutos.
La glucosa libre que queda despus de la hidrlisis completa del almidn, (tubo No. 6 de la
hidrlisis cida), representa el 100% de conversin del polisacrido en glucosa.
Tomando el valor de absorbancia de este tubo como el 100% de hidrlisis, calcule el porcentaje
de hidrlisis en los dems tubos de las diferentes hidrlisis.
Grafique el porcentaje de hidrlisis o formacin de azcar reductor vs tiempo para la hidrlisis
cida y enzimtica del almidn.
Compare el porcentaje de hidrlisis a los 3 minutos de cada polisacrido para la hidrlisis cida,
la hidrlisis cida en presencia de ZnCI2 e hidrlisis enzimtica.
Cuestionario
1. Cules son los productos de la hidrlisis enzimtica parcial y total del almidn, del
glicgeno y de la celulosa?
2. Cul es el efecto de la adicin de NaCI al buffer fosfato usado para diluir la saliva?
3. Explique la diferencia estructural entre la celulosa y el almidn. Cmo puede degradarse
enzimticamente la celulosa?
4. Qu son los compuestos llamados dextrinas y cul es su importancia en la elaboracin de
alimentos?
85

Evaluacin grupal: el grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada
por el tutor , que contenga: portada, introduccin, objetivos, tabla de resultados, anlisis y
86

PRCTICA No. 10- RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE CARBOHIDRATOS:

RECONOCIMIENTO DEL GLUCOGENO A PARTIR DEL ALMIDN.
Tipo de practica
Temticas de la
prctica
Intencionalidades
formativas
Presencial
Autodirigida
Remota
2H
Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosntesis de Biomolculas,
especficamente el captulo 7, Metabolismo de glcidos.
Propsitos
Extraer el glucgeno presente en materiales biolgicos como el
hgado.
Reconocer cualitativamente la presencia de glucgeno en
mediante su hidrlisis enzimtica.
hidrlisis del glucgeno extrado.
hgado
cualitativas los productos de la
Establecer relaciones entre la estructura y la funcin del glucgeno y

las reacciones metablicas en las cuales participa.
Objetivos
Que el estudiante aprenda a extraer
materiales biolgicos como el hgado.
el glucgeno presente en
Que el estudiante reconozca cualitativamente la presencia de

glucgeno en hgado mediante su hidrlisis enzimtica.
Que el estudiante analice mediante reacciones
productos de la hidrlisis del glucgeno extrado.
cualitativas los
Que el estudiante relaciones la estructura y la funcin del glucgeno

y las reacciones metablicas en las cuales participa.
COMPETENCIAS
El estudiante describe y analiza de manera eficiente los resultados
observados en cada prueba cualitativa y relaciona el marco terico y
los resultados para dar el respectivo anlisis.
87

cada prueba y la estructura y funcin del glucgeno..

Metas
resultados.

1. Glucgeno:
a.
b.
c.
d.
e.
f.
que es el glucgeno
donde se encuentra el glucgeno y cul es su funcin biolgica
cul es la composicin qumica del glucgeno
cules son los productos de la hidrlisis del glucgeno va enzimtica.
De qu organismos es caractersticos el glucgeno?
En qu otros tejidos fuera del hgado se almacenan glcidos en forma de
glucgeno?
g. Escriba con frmulas la estructura qumica del glucgeno y el almidn. Mencione las
diferencias encontradas.
h. Porque se relaciona la alfa amilasa con el glucgeno.
i. Porque se usa la prueba de Tollens y Fehling en el experimento?
2. Digestin intestinal de glcidos:
a. Que tipos de enzimas se encuentran en el intestino delgado de
Humanos y rumiantes.
b. Cules son los sustratos de dichas enzimas y los productos de hidrlisis
c. En qu consiste la prueba de Benedict y de barfoed y porque se usan en el
experimento?
88

3. Resumen Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y

Biosntesis de
especficamente el captulo 7, Metabolismo de glcidos.
Biomolculas,
En esta prctica se va a extraer glucgeno a partir del hgado, realizar reconocimiento de

azucares a partir del glucgeno y extraer las enzimas intestinales que actan en la hidrlisis
digestiva de glcidos y comprobar su actividad enzimtica.

Biosntesis de

regentes de farmacia, el desarrollo de esta prctica, ya que profundizan y analizan la relacin e
importancia que guardan los carbohidratos en las reacciones catabolismo y anabolismo para el
aporte de energa metablica. En esta prctica, los estudiantes profundizan la relacin que tiene
el glucgeno como reserva energtica en las reacciones de generacin de ATP.
MATERIALES DE VIDRIO
MATERIALES
BIOLOGICO
REACTIVOS
EQUIPOS
Vasos de precipitado 200 ml 100 g de hgado fresco

de cerdo
Solucin de KOH 30% 50 ml
Balanza analtica (1)
Vasos de precipitado de
1000 ml (vidrio y plstico)
Solucin de tricloroacetico TCA

10%.
Incubadora
Erlenmeyers 250 ml
50 ml Solucin saturada de
Na2SO4
Centrifuga y tubos
Pipetas de 5 y 10 ml
Solucin amortiguadora:
tampn fosfato sdico 0,02 M;
NaCl 0,005 M pH
Estufas (1)
Agitadores de vidrio
Reactivo de Fehling A y B.
Mallas
micro pipetas
Reactivo de tollens.
Probetas 100 ml
10 ml de tolueno
Vidrio reloj
Reactivo de Benedict
esptulas
Acido actico glacial
89

Tubos de ensayo
hielo
gradillas
Sacarosa
Pinzas para tubos de ensayo
Lactosa
Tollens
Fehling A y B.
Tabla 40: reactivos de la prctica 10.
No hay un software recomendado, en internet, el estudiante puede consultar videos ilustrativos de

las pruebas a realizar.
Presentacin: Generalidades de Carbohidratos, que se encuentra en la pgina principal del curso
en campus virtual de la Unad.
REACTIVO
PROTECCION
Proceso de digestin con

KOH al 30%
RIESGO
Metodologa
Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y Biosntesis de Biomolculas, especficamente el captulo

7, Metabolismo de glcidos.

90

Evaluacin grupal:
El grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que
Procedimiento:
EXTRACCION DE GLUCOGENO
OBSERVACIONES
Pese un erlenmeyer de 50 ml.

Se ponen 3 ml de la solucin de hidrxido potsico al 30% en un erlenmeyer de 50
ml.
Se pesan 8 g de tejido (aproximadamente) y se introducen en el erlenmeyer. Se
pesa este conjunto.
Se calienta en un bao de agua hirviendo, agitando con cuidado para acelerar el
proceso, durante 20 minutos (o hasta su digestin). Se enfra el tubo una vez
acabada la digestin.
Una vez enfriado el tubo de se aaden 0,2 ml de la solucin saturada de Na2SO4
y se mezclan fuertemente. Reposar 5 minutos.
Se precipita el glucgeno que est en solucin por adicin de 7 m de etanol al 95%.
Se agita y deja en fro en un bao de hielo durante 5 minutos.
Se pesan los tubos de centrifuga.
Primera
centrifugacin:
Se pasa la solucin a tubos de centrfuga se centrifuga 3000

rpm durante 5 minutos. Se desecha el sobrenadante Se
aaden 5 ml de la solucin de TCA al 10% al tubo y se
91

disuelve totalmente el sedimento agitando fuertemente.
Segunda
Se centrifuga de nuevo.
centrifugacin:
Se aade el sobrenadante a un tubo de ensayo largo, al

que previamente se han aadido 10 mL de etanol al 95%,
desechando el sedimento de la centrifugacin. Se deja
reposar 5 minutos para que se produzca la precipitacin del
glucgeno.
Tercera
Se traslada la solucin al tubo de centrfuga previamente

pesado, y se centrifuga durante 5 minutos
centrifugacin:
Una vez acabada la centrifugacin se tira el sobrenadante.
El
sedimento
obtenido
representa
el
glucgeno
prcticamente exento de sustancias contaminantes. Secar
en la estufa a 35C hasta su utilizacin.
Cantidad de
glucgeno
Se pesa en la balanza el tubo con el glucgeno desecado,

obtenido en la parte anterior, y se anota el resultado.(
determinar la cantidad de glucgeno obtenido).
Solucin de
glucgeno
De acuerdo a la cantidad de glucgeno obtenido hacer la

siguiente relacin:
8 mg de glucgeno por 0.5 ml de solucin tampn fosfato
0,02 M pH 7,0 que contenga NaCl 0,005 M,
De esta manera queda preparado el glucgeno para las
siguientes determinaciones.
Hidrlisis enzimtica del glucgeno por la enzima alfamailasa.

Pruebas
Recoleccin
de
la
alfa
amilasa
Adicin de la
alfa
amilasa
sobre
el
glucgeno
PROCEDIMIENTO
VOLUMEN
RESULTADO
PRUEBA POSITIVA
PARA:
Recoja 20 ml de alfa amilasa salival

fresca.
Tome cuatro tubos de ensayo
cada uno agregue:
y en
de solucin de glucgeno
1 ml
solucin de saliva
3 ml
92

Incubar a 37 C por 45 minutos
AL cabo del tiempo adicionar a caca
tubo TCA (cido tricloroacetico `para
parar la reaccin)
1 ml.
Realice las pruebas respectivas para

determinar
los productos de la
hidrlisis del almidn.
1 ml
Prueba de
1 ml
FEHLING
Agua destilada
1 ml
Solucin de glucgeno + enzima
2 ml

Prueba de
TOLLENS
Reactivo de tollens
2ml
Solucin de glucgeno + enzima
2 ml
Agite los tubos y djelo un bao de

agua a 35 C, durante 5 minutos
Un espejo de plata o un precipitado
negro es prueba positiva indica la
presencia de glucosa proveniente de la
hidrlisis del glucgeno.
Tabla 41: Marcha de la prctica extraccin de glicgeno.
1.2 EXTRACCION DE LAS ENZIMAS INTESTINALES

Prueba
Extraccin de
las
enzimas
intestinales.
EXTRACCION DE LAS ENZIMAS INTESTINALES
Observaciones ( escriba aqu sus

observaciones)
Utilice intestino delgado (duodeno) de res u oveja

recin sacrificada (no sirve intestinos de ms de un
da, y estos deben refrigerasen (no congelar) en el
menor tiempo posible. En caso de que el
Laboratorio no se realice inmediatamente se
sacrifique el animal, extraer la primera porcin del
intestino delgado (duodeno) y mantngalo en el
refrigerador a un tiempo no mayor de 12 horas a la
93

prctica.
REALICE TODAS LAS OPERACIONES BAJO

BAO DE HIELO.
Utilice de 10 a 15 cm de duodeno. Crtelo a lo
largo con unas tijeras provistas de buen corte, lave
el intestino preferiblemente con agua destilada,
crtelo en pedazos pequeitos y en un mortero,
tritrelo, en bao de hielo
Recoja el molido en un vaso de precipitado en
bao de hielo y agregue 50 ml de agua destilada y
2 gotas de tolueno. Agite bien. Es aconsejable que
trabaje hasta aqu lo ms rpido posible. Agitar.
Durante unos 15 minutos y filtre a travs de una
tela limpia, sobre un bao de hielo. En el lquido,
que debe salir claro, estn las enzimas.
SOLUCIN DE
ENZIMA
Mantenga en hielo el tubo de enzima cruda.
Tabla 42: Marcha de la prctica extraccin de de disacridasas.
ACCION DE LAS DISACARIDASAS

Pruebas
PROCEDIMIENTO
VOLUMEN
Solucin de sacarosa recin preparada

al 5%
5 ml
A cada tubo adicionar enzima cruda
5 ml
RESULTADO
PRUEBA POSITIVA
PARA:
Incubar a 38C por una hora.

Accin
enzimtica
Repetir:
Solucin de lactosa
preparada al 5%
y maltosa recin
A cada tubo adicionar enzima cruda
5 ml
2 ml
94

Incubar a 38C por una hora. Realice las
pruebas
respectivas para determinar
los productos de la hidrlisis del la
sacarosa y la lactosa respectivamente.
PRUEBA
DE
BENEDICT
2m
Solucin enzimtica
2.0 ml
Bao mara por 5 minutos

Repita el procedimiento para la siguiente
solucin problema.
Repita la experiencia sobre soluciones
de sacarosa y lactosa.
PRUEBA
BARFOED
DE
Reactivo de BARFOED
2m
Solucin enzimtica
2.0 ml
Bao mara por 5 minutos

Repita el procedimiento para la siguiente
solucin problema.
Para
que
sea
positivo
para
monosacridos, la coloracin una vez
en el bao mara no debe durar mas de
5 minutos. Despus de los 5 min se
consideran disacridos.
PRUEBA
FEHLING
DE
Realice la prueba de Fehling a las

soluciones
enzimticas
con
los
siguientes sustratos: lactosa, sacarosa y
maltosa. De igual forma realice patrones
para glucosa, sacarosa, lactosa y
maltosa.
Prueba
tollens
de
Realice la prueba de tollens

a las
soluciones
enzimticas
con
los
siguientes sustratos: lactosa, sacarosa y
maltosa. De igual forma realice patrones
para glucosa, sacarosa, lactosa y
maltosa.
Tabla 43: Marcha de la prctica accin de disacridasas.
95

PRACTICA No. 11- RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE LIPIDOS

Tipo de practica
Presencial
Autodirigida
Remota
2H
Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y
Biosntesis de
lpidos.
Propsitos
Reconocer los diferentes tipos de lpidos que se encuentran
en los tejidos biolgicos.
Analizar, mediante reacciones cualitativas la presencia de
algunos de los tipos de lpidos como fosfolpidos, cidos
grasos, colesterol y glucolipidos
en cada una de las
muestras.
Establecer relaciones entre la estructura y la funcin de las
los lpidos y su participacin en los diferentes procesos
metablicos.
Objetivos
Que el estudiante reconozca los diferentes tipos de lpidos
que se encuentran en los tejidos biolgicos.
Que el estudiante analice los resultados obtenidos en las
reacciones cualitativas, la presencia de algunos de los tipos
de lpidos como fosfolpidos, cidos grasos, colesterol y
glucolipidos en cada una de las muestras.
la funcin de las los lpidos
y su participacin en los
COMPETENCIAS
96


anlisis.
tiene cada prueba y la estructura y funcin con el tipo de
lpido.
El estudiante comunica los conocimientos adquiridos a travs
de la elaboracin de informes escritos.
Metas
Marco terico
1. Qu son los lpidos compuestos,
2. quines integran a los lpidos compuestos,
3. Qu es el colesterol,
4. cul es la importancia biolgica del colesterol,
5. estructura del colesterol,
6. que pruebas coloreadas existen para identificar el colesterol
7. a qu tipo de lpidos pertenece el colesterol.
8. composicin qumica de la yema de huevo.
9. que son los fosfolpidos,
10.Cul es la estructura qumica de los fosfolpidos
11.cul es la importancia biolgica de los fosfolpidos.
12.Qu son los esfingolpidos
97

13.Cul es la estructura de los esfingolpidos

14.Qu son los glucolipidos
15.Cul es la estructura de los glucolipidos
16.Qu son los fosfolpidos
En esta prctica se extraer y separar entre s lpidos compuestos de la yema de huevo y

reconocerlos y se reconocen mediante su composicin qumica. Tambin se extraen lpidos del
cerebro y analizar las diferentes clases de lpidos que se encuentran en este tejido biolgico.
Esta prctica se relaciona con la Unidad 3: Metabolismo: catabolismo y
Biomolculas, especficamente el captulo 8, Metabolismo de lpidos.
Biosntesis de

regentes de farmacia, el desarrollo de esta prctica, ya que profundizan y analizan la relacin e
importancia que guardan los lpidos en las reacciones del catabolismo y anabolismo para el
aporte de energa metablica. En esta prctica, los estudiantes profundizan en los diferentes
tipos de lpidos que se encuentran en los tejidos biolgicos.
MATERIALES
VIDRIO
DE MATERALES
BIOLOGICO
Probeta de 100 ml
3 huevos
Agitador de vidrio
20 gramos de
fresco de res.
REACTIVOS
EQUIPOS
180 ml de etanol
Estufa y malla
cerebro 200 ml de ter
centrifuga
Vaso de precipitado
de 600 ml
50 ml de KOH 1.5N
Perlas de vidrio
Vaso de precipitado
de 1000 ml
50 ml de acetona
Varilla para reflujo
Vaso de precipitado
de 600 ml plstico
50 ml de HNO3
Corchos
orificios
Vaso de precipitado
de 1000 ml plstico
Solucin de molibdato Microcoscopio (1)

de amonio
Vaso de precipitado
de 50 ml
50 ml de acetona
con
Plancha
de
calentamiento
98

esptula
20 ml de etanol
Papel filtro
Erlenmeyer de 250 ml
20 ml de ter
mechero
Pipetas de 10 ml
y
10 ml de acetona
Pinzas para la varilla

refrigerante
10 ml de HNO3
Pinzas para crisol
Solucin de molibdato
de amonio
Crisol
o cpsula
mediana y pequea.
30 ml de acetona
Pinzas de madera
10 ml de HCl
Embudos
50 ml de NaOH al 30 %
Soporte
pinzas.
universal
Reactivo
Fehling
Ay
DE

Ubicacin: Pgina principal del curso, tpico Unidad 3 Video Beta- oxidacin de cidos grasos insaturados
REACTIVO
PROTECCION
Solventes orgnicos: acetona, ter
cidos inorgnicos concentrados
RIESGO
Metodologa
99

1. Captulo 1 y 2 de la Unidad 1: Biomolculas del mdulo del curso.


Procedimiento:
Procedimiento #1: reconocimiento de colesterol

huevo
y fosfolpidos a partir de la yema de
Preparar una solucin de alcohol ter as: 40 ml de alcohol y 20 ml de ter.

Tome un huevo, hacer un orifico en uno de los extremos y a travs de l deje salir la clara.
Luego transfiera la yema a un vaso de precipitado que contenga una mezcla de 40 ml de etanol
y 20 ml de ter, disuelva bien la yema, agitando durante 10 minutos, filtre a travs de papel filtro
y recoja el filtrado en un vaso de precipitado seco.
Prepare una solucin de mezcla de etanol- ter (2:1), tome 14 ml de etanol y mezcle con 7 ml de
ter.
Lave el residuo con 20 ml de de la mezcla de etanol- ter (2:1).
Evapore a sequedad el filtrado anterior sobre una plancha de calentamiento o a bao mara,
cuidando de no dejar quemar el residuo. Disuelva el residuo en 5 ml de ter y virtalo poco a
poco y agitando en un vaso de precipitado que contenga 20 ml de acetona. Se debe formar un
precipitado que generalmente es fosfolipidos. Centrifugue y recoja el sobrenadante en un vaso
de precipitado de 50 ml. El precipitado debe recogerlo guardarlo para la prueba de fosfolipidos.
1.1 Reconocimiento de colesterol
Evapore el liquido anterior a bao mara, hasta que se forme una pasta Agregue 15 ml de de
solucin de KOH al 1.5 N, agite bien y transfiera a un erlenmeyer de 250 ml y deposite en l
100

perlas de vidrio y caliente la mezcla a reflujo durante 20 minutos. Enfriar y aadir 20 ml de

ter, agitar durante 10 minutos y centrifugar. El precipitado es jabn, descartar. Guardar el
sobrenadante que contiene colesterol.
Tome el sobrenadante, evaprelo en una bao de vapor, lejos de la llama, cuando ya quede
slo el residuo, adicionar
5 ml de alcohol y pasar la solucin a un tubo de centrifuga y centrifugar durante 5 minutos.
Pasar el lquido sobrenadante a otro tubo de centrifuga y aadir agua gota a gota hasta que se
forma bastante precipitado. Dejar en reposo durante 15 minutos y centrifugar nuevamente y
decantar el lquido sobrenadante, guardar y marcar como sobrenadante de colesterol. Recoger
el precipitado.
1.2 Reconocimiento de fosfoglicridos o fosfolpidos
Utilice el resto del precipitado. Paselo a un crisol y caliente sobre un mechero hasta
convertirlo completamente en cenizas. Disolver el residuo en 5 ml de agua destilada y 5 gotas
de HNO3 concentrado, filtren y agregue al filtrado 1 ml de solucin de Molibdato de amonio.
Observe la coloracin y la formacin de precipitado.
Cuestionario:
Describa microscpicamente el colesterol

es el colesterol una sustancia saponificable? explique su respuesta.
que significa la prueba del glicerol sobre los lpidos de la yema de huevo?
que significa la prueba para fosfato sobre los lpidos de la yema de huevo?
Explique los resultados.
2. Procedimiento #2: extraccin de lpidos del cerebro

Pese 4 gramos de cerebro fresco de res. Reprtalos en dos tubos de centrifuga, macrelos con
ayuda de un agitador suavemente contra las paredes del tubo. Agregue 5 ml de acetona, mezcle
durante 10 minutos, centrifugue a 3000 rpm por dos minutos. Decante la acetona en un
erlenmeyer de 50 ml y colquele el nombre de extracto I.
Con el residuo, agregue 10 ml de acetona, vuelva a centrifugar y el sobrenadante colquelo en el
vaso de extracto I
Coloque el residuo de los tubos a bao mara por 10 minutos y agrguele 5 ml de ter, mezcle,
centrifugue a 3000 rpm por 1 minuto, decante el ter en otro vaso de 50 ml marcado como
extracto II.
Al residuo adicinele 5 ml de ter y vuelva a centrifugar y el lquido depostelo en el vaso del
extracto II. Repita nuevamente la operacin.
101

Extienda en los tubos el residuo y squelo a bao mara, una vez secos adicione 5 ml de etanol
al 97% caliente, mezcle bien, centrifugue a 3000 rpm a 2 minutos, decante el etanol en un tercer
vaso de 50 ml y marcado como extracto III. Repita una vez ms el procedimiento desde la
adicin de los 5 ml de etanol caliente.
2.1 separacin de los lpidos del extracto II
Evapore a bao mara el extracto II. Agregue al residuo 5 ml de acetona, mezcle bien y
centrifugue por 2 min. Decante el lquido en el vaso de extracto I.
Al residuo que queda, agregu 5 ml de ter, mezcle bien, y centrifugue, decante el liquido en el
vaso del precipitado extracto II.
Al residuo adicione, 3 ml de etanol caliente, mezcle y centrifugue y decante el etanol en el vaso
de extracto III.
Evapore los extractos II y III, hasta sequedad. (en bao mara),
Tome el extracto II, adicione 4 ml de etanol caliente y realice las pruebas para fosfolipidos.
2.2 prueba para fosfolpidos:
Coloque el extracto en una cpsula de porcelana, evapore el etanol, contine calentando hasta
que el residuo quede completamente en cenizas, adicione 5 gotas de HNO3, y 5 ml de agua
destilada, disuelva bien las cenizas y filtre, al filtrado adicione 5 ml de Molibdato de amonio ,
observe la coloracin y formacin de precipitados.
Cuestionario:
Para qu clase de lpidos es positiva esta prueba?
Que sustancia se forme en el precipitado?
Dentro de la composicin de los lpidos que tomo o grupo de tomos es la que se identifica con
esta prueba.
2.3 prueba para glucolipidos y esfingolipidos
Disuelva el extracto III, en 3 ml de etanol, calentando para disolverla, agregue 4 ml de agua y
realice:
Agregue 1 ml de HCL concentrado, agite bien, caliente a bao de agua hirviendo por 15
minutos. Deje enfriar y adicinele gota a gota NaOH al 30% hasta alcalinizar (con tiras de papel
indicador de pH), realice la prueba de Fehling.
Cuestionario:
102

1. Qu indica esta prueba. Para quin es positiva esta prueba, que se deduce de la prueba.
2. que esperaban encontrar en el extracto I
103

PRCTICA No. 12- FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS PRINCIPALES

CONSTITUYENTES: CARBOHIDRATOS, LPIDOS, PROTENAS Y CIDOS
NUCLEICOS12 (Opcional, puede hacerse en lugar de las prcticas practicas
#1, 6, 7, 8,10 y 11.
Tipo de practica
Presencial
Autodirigida
Remota
16 horas divididas en 3 y 4 sesiones.

Unidad 1, 2, y 3 del mdulo del curso.
Propsitos
Reconocer a los aminocidos como unidades estructurales de las
protenas y su importancia en los diferentes procesos metablicos.
Reconocer a los nucletidos como unidades estructurales de los
cidos nucleicos y su importancia en los diferentes procesos
genticos.
Reconocer a
los lpidos como unidades estructurales de
membranas biolgicas y su importancia en los diferentes procesos
metablicos.
Reconocer a los monosacridos como unidades estructurales de
las polisacridos y su importancia en los diferentes procesos
metablicos.
cualitativas coloreadas
la
presencia de aminocidos y enlaces peptdicos, diferentes tipos de
lpidos, carbohidratos y cidos nucleicos en las muestras.
Establecer relaciones entre la estructura y la funcin de las de las
biomolculas.
Objetivos
Que el estudiante reconozca a los aminocidos como unidades
estructurales de las protenas y su importancia en los diferentes
procesos metablicos.
12
104

Que el estudiante reconozca como unidades estructurales de los

cidos nucleicos y su importancia en los diferentes procesos
genticos.
Que el estudiante reconozca a los lpidos como unidades
estructurales de membranas biolgicas y su importancia en los
Que el estudiante reconozca a los monosacridos como unidades
estructurales de los polisacridos y su importancia en los
Que el estudiante analice, mediante reacciones cualitativas
coloreadas la presencia de aminocidos y enlaces peptdicos,
diferentes tipos de lpidos, carbohidratos y cidos nucleicos en las
muestras.
Que el estudiante establezca relaciones entre la estructura y la
funcin de las de las biomolculas.
COMPETENCIAS
los
cada prueba y la estructura de las biomolculas.
Metas
resultados.
105

fundamentacin Terica
Debido a las diferencias qumicas que existen entre las molculas de carbohidratos, lpidos,
protenas y cidos nucleicos, stas presentan diferente solubilidad en solventes orgnicos y
adems en cidos semejantes al tricloroacetico (ATA) de acuerdo con la temperatura. Es posible
entonces utilizar tales solubilidades diferenciales para separarlos, una vez que los tejidos han sido
triturados y se han roto sus membranas.
Accin del cido tricloroacetico a baja temperatura
Sobre carbohidratos
A baja temperatura los monosacridos son estables en medio cido, mientras que si se tratan en
caliente, sufren deshidratacin producindose los furfurales.
Los polisacridos en medio cido sufren hidrlisis del enlace glicosdico, reaccin que aumenta su
velocidad a medida que se eleva la temperatura. A temperaturas interiores a 4C, la velocidad de
hidrlisis es tan lenta que para fines prcticos se considera que no ocurre reaccin.
En general se puede decir que los carbohidratos son solubles en solucin de cido tricioroactico al
20% a temperaturas inferiores a 4C y que no sufren cambios qumicos en estas condiciones.
Sobre lpidos
Segn sus propiedades fisicoqumicas, estos compuestos son poco solubles en soluciones
acuosas y no son extrados si se trata el tejido con soluciones acuosas de cido tricioroactico.
Sobre protenas
Forman sales insolubles en cidos como tricloroacetico o perclrico, por tanto no son solubles en
soluciones de cido tricioroactico al 20% en fro.
Sobre cidos nucleicos
Lo mismo que las protenas, estos cidos son insolubles en soluciones fras de cido
tricloroacetico. Por otra parte el cido desoxirribonucleico (DNA) est unido a histonas, lo cual lo
hace ms insoluble en estas condiciones.
En conclusin, al tratar un tejido previamente triturado con cido tricioroactico al 20% y a 4C y
someter a centrifugacin la suspensin resultante, en el sobrenadante se obtienen los azcares,
mientras que los lpidos, protenas y cidos nucleicos quedan en el residuo.
Accin del etanol-ter-cloroformo (2: 2: 1 v/v)
Si el residuo de la extraccin con cido tricloroactico a 4C, se trata con solucin de etanol-ter106

cloroformo, al solvente solo pasan los lpidos, mientras que las protenas y los cidos nucleicos
quedan en la fase slida.
Accin del cloruro de sodio al 10% en caliente
Si el residuo anterior se suspende en una solucin de NaCI al 10% y se calienta en bao mara
(92C) durante 40 minutos, se desnaturalizan las protenas, en tanto que los cidos nucleicos,
principalmente el ribonucleico (RNA), quedan en solucin. Por este procedimiento es posible
separar las protenas de los cidos nucleicos. Si al sobre nadante se le agrega ahora etanol
absoluto en un volumen igual al doble de la solucin original y se enfra en bao de hielo durante
10 minutos, se obtiene un precipitado que puede ser separado por centrifugacin y que contiene los
cidos nucleicos.
1. CARACTERIZACIN DE LAS FRACCIONES OBTENIDAS A PARTIR DE DIFERENTES
TEJIDOS
Fundamento terico
Carbohidratos
Los organismos vivos contienen carbohidratos que pueden estar formando polisacridos de
reserva, pueden ser componentes estructurales o pueden estar participando en el metabolismo en
forma monomrica.
Las propiedades qumicas de tales compuestos permiten diferenciarlos, as:
Los polisacridos son solubles en soluciones acuosas cidas, pero insolubles en etanol.
Los polisacridos como el almidn, el glicgeno y los dextranos, forman compuestos
coloreados caractersticos cuando se combinan con yodo molecular.
A pesar de que la naturaleza de estos complejos no est bien definida, la evidencia disponible
indica a formacin de complejos de absorcin entre las cadenas helicoidales del polisacrido y el
yodo. Para que haya estructura helicoidal se necesita por lo menos una cadena con ocho unidades
de monosacrido.
Los polisacridos que a todo lo largo de su molcula muestran estructura helicoidal, dan coloracin
azul intensa, ej. la amilosa. Aquellos que son ramificados con hlices interrumpidas, producen
coloraciones menos intensas, ej. la amilopectina. Los altamente ramificados con segmentos cortos
de ramificacin, producen color pardo o rojizo, ej. el glicgeno.
Reaccin de Molisch
Un azcar tratado con a-naftol y cido sulfrico concentrado, produce una coloracin violeta. Se
presume que el cido sulfrico acta como deshidratante formando derivados del tipo de los
107

furfurales que reaccionan con el a-naftol para dar productos coloreados.

Reaccin de Benedict
Azcares reductores tratados con solucin alcalina suave (citrato-carbonato de sodio) de in
cprico, lo reducen a xido cuproso de color ladrillo.
Lpidos
En cuanto a solubilidad, los lpidos son insolubles en agua pero solubles en solventes orgnicos.
Los triglicridos forman un complejo coloreado (vino tinto) con el cido hidroxmico y el hierro en
medio cido y oxidante.
Los hidroxiesteroides con insaturacin en la posicin 5 reaccionan con el anhdrido actico para dar
steres, que en medio sulfrico se deshidratan produciendo una coloracin verde.
Los fosfolpidos por accin del NaOH se hidrolizan produciendo fosfatos inorgnicos, que con el
cido molbdico dan fosfomolibdato y estos, por accin de reductores como el cido 1,2,4aminonaftolsulfnico o el cido ascrbico, producen complejos de xidos de molibdeno de color
azul.
Si los jabones resultantes de la hidrlisis alcalina se someten a la accin del ter, los jabones se
sedimentan y en el sobrenadante queda el glicerol. Los compuestos que en su estructura tienen
grupos ( > CHOH)n forman complejos con iones metlicos como el Cu +2 por tanto si el
sobrenadante anterior se evapora al bao de mara el residuo se disuelve en agua caliente y se
acidifica con HCI; si los jabones no se haban separado totalmente, los cidos grasos de estos se
separan en una capa insoluble en agua. Despus de evaporar la capa acuosa, el residuo se
disuelve en etanol y por la adicin de solucin de sulfato de cobre se formar un quelato de cobre
de color verde, luego de agregar NaOH 0.1 N.
cidos nucleicos
Hidrlisis
Los lcalis diluidos (0.3 a 1.0 N) hidrolizan los enlaces ster del cido ribonucleico.
108

En cambio los enlaces ster del cido desoxirribonucleico son relativamente estables, lo mismo que
los enlaces N-glicosdicos de DNA y RNA. La facilidad de hidrlisis en el RNA parece estar
asociada a la presencia de hidroxilos en los carbonos 2 y3, lo cual permite la formacin de
intermedios
cclicos
2,
3-fosfonucletidos,
que
finalmente
dan
los
complejos
monofosfonucletidos- 2 o 3. Como la deoxirribosa del DNA no forma tales intermediarios, es
relativamente estable en presencia de lcali diluido. La acidificacin de la solucin despus del
tratamiento alcalino precipita las molculas de DNA intactas.
Los nucletidos obtenidos en la hidrlisis anterior fluorecen a la luz ultravioleta.
Con orcinol
Los nucletidos del RNA, debido a la presencia de ribosa, reaccionan con el reactivo cido de
orcinol (cloruro frrico en HCI concentrado + solucin alcohlica de orcinol), dando coloracin
verdosa.
Desnaturalizacin de protenas
Por accin de pHs extremos se destruyen los puentes de hidrgeno que mantienen la estructura
secundaria de las protenas. Las protenas a temperaturas mayores de 50C precipitan, por
formacin de agregados que resultan de la destruccin de la estructura secundaria y terciaria.
Millon
Las protenas que contienen tirosina reaccionan con mercurio disuelto en cido ntrico, produciendo
nitroderivados mercuriales de color rojo.
Ninhidrina
Los grupos amino terminales de las protenas reaccionan con la ninhidrina en caliente, dando
complejos de color violeta. En ellos, el amonaco desprendido reacciona con una molcula de
ninhidrina en estado oxidado y con otra en estado reducido.
Biuret
109

Los nitrgenos del enlace peptdico forman complejos coloreados con los iones cpricos en medio
alcalino.
Reaccin Xantoproteica
Esta reaccin se basa en la nitracin del anillo bencnico por el HNO 3 concentrado, dando
derivados amarillos de nitrobenceno. Las protenas que contienen tirosina y triptfano dan esta
reaccin, pero el color amarillo resultante se transforma en naranja si se le adiciona NH4OH. Para
nitrar la fenilalanina se requiere H2SO4 como catalizador.
2. EXTRACCIN DE LA YEMA DE LPIDOS DEL HUEVO
La separacin de los lpidos es extremadamente difcil por extraccin con vanos solventes
orgnicos puros. Se hace uso de la propiedad que tienen la mayora de los lpidos de ser solubles
en mezclas de etanol: ter o etanol: cloroformo. La yema de huevo contiene buenas cantidades de
grasas neutras, lecitinas y colesterol.
Las lecitinas tienen un pH aproximadamente neutro, ya que contienen grupos cidos (HPO 4-2) y
bsicos (Colina) formando Zwiteriones muy polares. Se dispersan coloidalmente en agua en
contraste con las grasas neutras que no se emulsionan. Las lecitinas se precipitan a partir de una
solucin etrea por adicin de acetona y su reconocimiento se basa en un test para saponificacin
y en un test para Colina. Las esfingomielinas tambin tienen Colina pero son solubles en ter y se
presentan en cantidades despreciables en el huevo crudo.
El colesterol no precipita por tratamiento con acetona de una solucin etrea y como no es
saponificable despus del tratamiento con KOH puede extraerse con ter, en tanto que los
triglicridos se han saponificado dando jabones solubles en agua. Para el reconocimiento del
colesterol se aplica el test de Liebermann-Burchard. El colesterol requiere de 15 a 20 minutos para
el desarrollo de un color verde profundo, precedido de un color lila.
Se requieren condiciones completamente anhidras para esta reaccin.
3. DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTENAS EN HARINAS DE LEGUMINOSAS Y

110

CEREALES POR EL MTODO DE MICRO KJELDAHL

Mtodo Kjeldahl
Este mtodo, diseado para la determinacin de nitrgeno total, puede aplicarse al anlisis de
protena bruta de una muestra o de protena verdadera, haciendo una extraccin previa de sta o
tambin determinando el nitrgeno no protenico.
El resultado de los anlisis por Kjeldahl se expresa como protena bruta, multiplicando el porcentaje
de nitrgeno en la muestra por 6.25. Esta conversin se basa en el contenido promedio de
nitrgeno del 16% de muchas protenas. Aunque este promedio puede no ser vlido para protenas
especficas purificadas, es suficientemente exacto para la mayora de propsitos.
Para la determinacin del nitrgeno presente en la muestra, es necesario hacer la digestin del
compuesto hasta CO2 e iones NH4+, por tratamiento en caliente con H2SO4 concentrado y en
presencia de mezcla catalizadora. Cuando se trata de determinar el nitrgeno de compuestos que
contengan enlaces N-N, NO y NO2, previamente debe practicarse tratamiento con agentes
reductores para convertirlos en grupos amina.
La cantidad de amonio producido se determina agregando un exceso de lcali a la solucin cida
que los contiene, con lo cual se desplazan tales iones del bisulfato amnico y en la forma de
hidrxido de amonio son arrastrados por una corriente de vapor de agua a un sistema cerrado y
absorbidos en una solucin de cido de concentracin conocida.
El exceso de cido que queda en la solucin, despus de haber recogido todo el amoniaco
desprendido, se valora con un lcali de ttulo conocido.
Tambin el amonio desprendido puede recogerse sobre una solucin de cido brico, y el borato
cido de amonio producido se titula por retroceso con solucin de un cido fuerte de concentracin
conocida.
El mtodo que se usa en la realidad se ha ajustado a la tcnica micro.
Las reacciones que ocurren durante todo el proceso son:
Digestin:
Destilacin:
Absorcin:
N orgnico H 2 SO 4
NH 4 SO 4 CO 2 SO 2 SO 3
Mezcla Caral
NH 4 HSO 4 NaOH
NH 4 OH NaHSO 4
Arrastre con Vapor
111

NH 4 OH H 3 BO 3
NH 4 H 2 BO 3 H 2 O
Titulacin:
NH 4 H 2 BO 3 HCl
NH 4 Cl H 3 BO 3
La suma miembro a miembro de las ecuaciones de absorcin y titulacin, da la ecuacin definitiva

de titulacin:
NH 4 OH HCl
NH 4 Cl H 2 O
Indicador
El mtodo es reproducible, requiere el tratamiento de muestras con un contenido de protena mayor

de 3 mg y puede calificarse como consumidor de tiempo y dispendioso en general. Sin embargo,
como es posible conocer el contenido de nitrgeno no protenico (haciendo una extraccin previa
de este y determinndolo en la solucin de extraccin), se obtienen entonces valores bastante
exactos del contenido real de protena.
Se recomienda usarlo para determinar protena en mezclas crudas y relativamente grandes, pero
no es rpido ni muy aconsejable para aplicarlo a gran nmero de muestras de protena soluble
relativamente pura.
El desarrollo de esta prctica puede reemplazar a las practicas #1, 6, 7, 8,10 y 11, puede ser una
prctica de complemento, ya que contiene el desarrollo de las principales temticas de la Unidad
1, 2, y 3 del mdulo del curso.
En esta prctica mediante pruebas coloreadas, se identifica los aminocidos que componen las
protenas de los extractos utilizados basados en las reacciones de los grupos R cadena lateral.
Se desarrolla pruebas para analizar el comportamiento y la solubilidad de protenas
tratamientos de precipitacin y desnaturalizacin.
en
Los objetivos de esta seccin de prcticas son:

Investigar la presencia de carbohidratos, lpidos, protenas y cidos nucleicos en las tracciones
obtenidas de diferentes tejidos del animal empleado, utilizando para ello reacciones caractersticas
para cada uno de los componentes anteriores.
Extraer y caracterizar los fosfolpidos, colesterol y triglicridos presentes en la yema de huevo.
Determinar el contenido total de nitrgeno en harinas de leguminosas y cereales utilizando el
mtodo de micro Kjeldahl.
112

farmacia, el desarrollo de estas prcticas, ya que profundizan y analizan los principales
componentes de los tejidos, haciendo referencia a aminocidos, protenas, lpidos y cidos
nucleicos, temticas de relevancia dentro de un curso general de bioqumica para los programas de
las ciencias bsicas biolgicas.
113

Material de vidrio
Material
biolgico
Reactivos
Equipos
Probeta de 100 ml
Huevos
ATA al 10%
Equipo de
digestin para
protenas.
Agitador de vidrio
Harina de
leguminosas.
Arena lavada
Centrifuga
Vaso de precipitado
de 600 ml
Etanol del 95% , ter

etlico.
Plancha de
calentamiento
Vaso de precipitado
de 1000 ml
NaCI al 10%, HCI 2N,

Ninhidrina al 0.2%
Equipo de
titulacin
Vaso de precipitado
de 600 ml plstico
etanol ter cloroformo (2:

2:1)
Vaso de precipitado
de 1000 ml plstico
Etanol, Solucin de lugol,

Reactivo de Molish,
Acido sulfrico
concentrado,
Vaso de precipitado
de 50 ml
esptula
Reactivo de Milln
Reactivo de Biuret
Erlenmeyer de 250 ml
NaOH al 15% y 50%,

Hidroxilamina al 10%,
KOH 2N. FeCl3 al 5%
Cloroformo, Anhdrido
actico, AcOH 10%.
Fenolftalena , Acido
molbdico, Acido 1,2,4aminonaftolsulfnico
Pipetas de 10 ml
cido ntrico
concentrado, Hidrxido
de amonio concentrado,
Almidn , Glucosa
Soporte universal y
pinzas.
o cido ascrbico (150

mg/100 mI), Bencidina al
114


Ninguno.
REACTIVO
PROTECCION
cidos inorgnicos
concentrados.
Catalizador y otros reactivos

del mtodo de Kjeldahl
Gafas de seguridad, tapabocas con

filtro de carbono, mascara para
vapores cidos.
Solventes orgnicos: acetona,

ter
RIESGO
Metodologa
1. Unidades 1,2 y 3 del curso de Bioqumica.

115

Procedimiento
Cada grupo har el fraccionamiento qumico sobre un tejido determinado. Para comparar los
diferentes tejidos desde el punto de vista del contenido de carbohidratos, lpidos, protenas y cidos
nucleicos, deber confrontar sus resultados con los obtenidos por los otros grupos.
NOTA: Las diferentes fracciones obtenidas en esta prctica, deben guardarse para la siguiente
sesin de laboratorio.
A cada grupo se le entregar una muestra de tejido en ATA al 10% con los siguientes datos:
peso del tejido.

origen del tejido.
ATA al 10% adicionado (1,5 mI/g de tejido).
Este tejido se tratar conforme al diagrama esquemtico del mtodo para fraccionar un tejido en
sus constituyentes que se encuentra en la siguiente pgina.
Cada grupo recibir cinco frascos donde guardar y marcar adecuadamente cada fraccin que
obtenga.
Cuando tenga que evaporar las fracciones, lo har en una plancha de calentamiento sobre una
malla de asbesto; para secar, debe utilizar la estufa.
Compare sus resultados con los obtenidos por los dems grupos y con los datos bibliogrficos. De
acuerdo con la funcin fisiolgica y con los resultados, diga cules son los tejidos que
cualitativamente contienen ms protenas, lpidos, cidos nucleicos y carbohidratos.
Cuestionario
1. Por qu se recomienda mantener los tejidos que se fraccionan a baja temperatura?

2. Qu sucede al contenido celular si la temperatura a que se mantiene es de 37C?
3. Cul es el fundamento de la centrifugacin? Haga una explicacin breve de los principios.
116

figura 2: Extraccin de biomolculas.
1. CARACTERIZACIN DE LAS FRACCIONES OBTENIDAS A PARTIR DE DIFERENTES

TEJIDOS
Con las muestras M1, M2, M3, M4 y M5 obtenidas en la prctica anterior, se harn las siguientes
pruebas de caracterizacin.
Carbohidratos: Muestras M1, M2 y patrones de mono y polisacridos.
Lugol : A una fraccin de cada una de las muestras agregarles 3 gotas de solucin de Lugol.
Observar las coloraciones. A otras porciones iguales de estos compuestos, adicioflanes 1 ml de
HCI 2N y colocarlos al baflo mara durante 25 minutos. Dejar enfriar y agregarles nuevamente
Lugol. Obsrvese los resultados y explquelos en el informe.
117

Molisch
A una nueva fraccin de los compuestos anteriores, agrgueles 1 ml de agua destilada, 2 gotas de
reactivo de Molisch. Mezcle cuidadosamente y con los tubos inclinados agregue 1 ml de cido
sulfrico concentrado de manera que se forme una capa de cido debajo de la fase acuosa. Anote
el color del anillo formado en la interfase.
Benedict : Coloque al bao mara durante 2 minutos, fracciones de las muestras y patrones, con 2
ml de solucin de Benedict. Observe los resultados y contine calentando por 15 minutos. De
nuevo observe los tubos.
Lpidos: Muestra M3 y patrones de lecitina, colesterol y triglicridos.
cidos hidroxmicos: A una fraccin de las muestras, agregue 1 mI de hidroxilamina al 10% a la
cual se le ha incorporado 0.01% del indicador timolftalena. Adicione lentamente solucin de NaOH
al 10% hasta color azul permanente. Caliente en bao mara por 10 minutos, enfre al chorro y
adicione HCI al 10% lentamente y con agitacin, hasta desaparicin del color azul. Agregue unas 2
gotas del mismo cido en exceso. Por ltimo adicione 0.5 ml de solucin de FeCl 3 al 5%. Observe
los cambios de coloracin que ocurren y anote los resultados.
3.2.2 Prueba de Lieberman-Burchard: Tome una fraccin de cada una de las muestras,
agrgueles 3 ml de cloroformo, mezcle bien. Agregue despus 1 ml de anhdrido actico, agite y
adicione con cuidado 3 gotas de cido sulfrico, por las paredes del tubo. Observe la coloracin en
la interfase al minuto y a los 15 minutos. Explique.
3.2.3 Saponificacin: A una cantidad anloga a la anterior de las fracciones, agregue 3 ml de
NaOH al 15% coloque en la boca del tubo una estera de vidrio y ponga al bao mara durante 20
minutos. Aada 15 ml de ter etlico y filtre los jabones resultantes. Despus de la hidrlisis
neutralizar con cido actico al 10% usando fenolftalena como indicador.
Colina: A 10 ml del filtrado anterior aadir 6 ml de Reineckato de amonio al 2% en etanol y
colocarlo en nevera por 30 minutos hasta que cristalice.
cidos nucleicos
Muestra M5: Tome una traccin de la correspondiente a los cidos nucleicos, adicione 3 mI de
KOH 2 N y coloque en la boca del tubo una esfera de vidrio. Ponga el tubo al bao mara durante
30 minutos. Acidifique la solucin con HCI y observe si se forma precipitado. Separe ste por
centrifugacin.
Pentosas: A 0,5 ml del sobrenadante anterior adicione 0,5 ml de solucin de bencidina al 0,4% en
cido actico caliente la solucin al bao mara durante 10 minutos, colocando una bola de vidrio
en la boca del tubo. Observe la coloracin. Repita la experiencia con 0,5 ml de solucin patrn de
118

pentosa.
Fosfatos: A 1 ml del mismo sobrenadante acidificado, agregar 1 ml de cido molibdico, mezcle

bien y despus de dejar en reposo 10 minutos adicione 0,5 ml de cido 1,2,4-aminonaftolsulfnico
o 1 ml de cido ascrbico. Observe la coloracin.
Protenas
Muestra M4 y patrones de protena y de aminocidos.
Millon: A una traccin de la muestra y de los patrones, suspendidas en 1 mI de agua, agregue 3
gotas del reactivo de Millon; caliente durante unos minutos al bao mara; observe el precipitado.
Ninhidrina: A una fraccin de la muestra y los patrones agregue 1 ml de la solucin de ninhidrina
al 0,2%. Caliente al bao mara durante 10 minutos y observe el color.
Biuret: Tome una fraccin de la muestra y de los patrones, agregue 1 ml del reactivo de Biuret.
Mezcle, espere 10 minutos y observe el color.
Xantoproteica : Caliente una traccin de la muestra y de los patrones con 1 ml de cido ntrico
concentrado, enfre y observe el color. Agregue cuidadosamente un exceso de hidrxido de amonio
concentrado. Observe la interfase.
De acuerdo con los resultados, deduzca qu tipo de polisacridos, aminocidos en las protenas,
lpidos y cidos nucleicos estn presentes en el tejido.
Cuestionario
1. Explique la reaccin con el reactivo de Lugol, de las fracciones de carbohidratos y patrones,
antes y despus del tratamiento con HCI 2N.
2. Por qu el colesterol no es saponificable?
3. Escriba las reacciones de las diferentes pruebas realizadas en esta prctica.
4. En qu tejidos se almacena el glicgeno? y cul es su funcin?
5. Si en su muestra de protenas estn presentes sales de amonio, Cul de las reacciones de
reconocimiento de aminocidos no se debe usar? D sus razones.
119

EXTRACCIN DE LA YEMA DE LPIDOS DEL HUEVO

Procedimiento
Trate la muestra como se indica en el esquema de extraccin:
figura 3: Extraccin de lpidos de la tema de huevo.
120

Preparacin de Lecitina : Amasar la yema de huevo cocido y mezclarla con 40 ml de la mezcla de

alcoholter (2:1). Dejar reposar 10 minutos con agitacin ocasional, filtrar con papel humedecido
con alcohol. Remover el residuo del papel filtro y mezclarlo con otros 10 ml de la mezcla de alcoholter y filtrar. Combinar los dos filtrados en una cpsula previamente pesada.
El filtrado se evapora hasta sequedad en un bao mara. Pesar y disolver el residuo en 5 ml de ter
y agregar esta solucin lentamente y con agitacin a 15 ml de acetona y con ayuda de un polica
agitar de manera que las partculas de lecitina se aglomeren y formen una bola. Guardar la solucin
de ter-acetona para la segunda parte.
Solubilidad : Mezclar un poco de lecitina con agua. Observar que se dispersa formando un
coloide.
Hidrlisis: Agregar 20 ml de Ba(OH)2 saturado al resto de lecitina y luego hidrolizar durante 30 mm
en un erlenmeyer con varilla para reflujo.
Despus de la hidrlisis neutralizar con CH3COOH al 10% usando fenolftalena como indicador.
Filtrar y descartar el residuo. Al filtrado aadir 6 mI de reineckato de amonio al 2% en etanol y
colocarlo en la nevera por 20 30 minutos hasta que cristalice.
Preparacin del Colesterol : La solucin de ter-acetona obtenida durante la preparacin de la
lecitina, evaporarla en un bao de vapor hasta obtener una pasta. (El residuo no debe oer a ter o
acetona). Enfriar y pesar. Aadir 10 ml de KOH alcohlico al 10%, perlas de vidrio y colocar en
reflujo por 30 mm. Enfriar y luego aadir 30 ml de ter. Filtrar el precipitado de jabn si se forma. La
solucin de ter contiene entonces el colesterol.
Evaporar hasta sequedad en un vidrio de reloj, descartar los restos de agua o secar con un papel
de filtro.
Extraer el colesterol calentando el residuo con 5 ml de alcohol en un bao de vapor y pasar la
solucin a un tubo de centrfuga de 15 ml. Al residuo sobre el papel agregar otros 3 ml. de alcohol
con el fin de lograr una extraccin completa, combinar los dos extractos alcohlicos, centrifugar
durante 5 minutos. Pasar el lquido sobrenadante que contiene el colesterol a otro tubo de
centrfuga y aadir agua gota a gota hasta que no se forme ms precipitado. Dejar en reposo
durante 15 minutos y centrifugar. Decantar el lquido sobrenadante.
Si se desea, el colesterol puede purificarse por recristalizacin con unos pocos mililitros de alcohol
caliente. Cuando est fro, la adicin de unas gotas de agua asegura la cristalizacin. Centrifugar.
Dejar secar el precipitado y sobre el producto seco realizar el test de Liebermann-Burchard as: en
un tubo de ensayo seco colocar unos pocos mg de colesterol, 1,5 ml de cloroformo anhidro, 0,5 mI
de anhdrido actico y 2 gotas de cido sulfrico concentrado. El desarrollo del color generalmente
demora de 15 a 30 minutos y durante este tiempo debe colocarse en la oscuridad.
121

Calcular el porcentaje de lpidos totales, lecitina, colesterol y triglicridos presentes en la yema de
huevo.
Comparar con los valores reportados en la bibliografa.
Escribir las reacciones de caracterizacin de cada uno de los lpidos extrados.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.
5.
Cules son los productos de hidrlisis completa de la lecitina?

Si la extraccin del colesterol no se realiza en condiciones anhidras qu resultado esperara?
Por qu la lecitina forma una emulsin en presencia de H 2O?
Es el colesterol saponificable? Explique su respuesta.
Escriba las estructuras del colesterol, cido desoxiclico, estradiol, progesterona, vitaminas A y
D Qu similitud estructural encuentra entre ellas?
6. Cules son las ventajas y desventajas del mtodo de extraccin utilizado?
DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTENAS EN HARINAS DE LEGUMINOSAS Y
CEREALES POR EL MTODO DE MICRO KJELDAHL
Digestin
En un baln de digestin marcado colocar en su orden lo siguiente:
Muestra de harina de leguminosa, 30 a 35 mg; o en su defecto muestra de harina de cereal, 45

a 50 mg
Mezcla catalizadora, aproximadamente 100 mg.
H2SO4 concentrado, 1 ml.
Para todo el grupo se corrern nicamente dos blancos. En tales balones se coloca lo mismo a
excepcin de la muestra.
Llevar los balones al digestor, calentar al principio suavemente-aproximadamente durante 15
minutos-con el fin de sacar por evaporacin la mayor parte de la humedad que acompaa a la
muestra. Aumentar luego gradualmente el calor hasta una temperatura tal, que los vapores de SO 3
(precaucin: estos son producidos por descomposicin del H 2SO4, causan irritacin y producen tos
de no hacerse la operacin en vitrina) no alcancen sino la mitad del cuello del baln de digestin.
Mantener estas condiciones aproximadamente por una hora, hasta obtener una solucin de color
verde esmeralda. Dejar enfriar los balones al aire.
122

Destilacin y absorcin
En la figura 66 se muestra el aparato correspondiente. Al baln del generador de vapor se agregan
perlas de vidrio o trozos de corcho o vidrio para ayudar a regular la ebullicin.
Operar el generador de vapor hasta alcanzar un flujo constante de vapor, lo que se consigue
aumentando o disminuyendo el calor. Entre tanto, la llave de doble paso debe conducir el vapor al
vertedero. Agregar con cuidado un poco de agua destilada al baln de digestin y agitar para
disolver la suspensin. Transferir totalmente la mezcla digerida al baln de destilacin que tiene
cuello esmerilado.
Lavar unas tres veces el baln de digestin con pequeas porciones de agua destilada y agregar
estas aguas de lavado al baln de destilacin.
Medir 10 ml de H3BO3 al 4% en un erlenmeyer de 125 ml, agregar 3 gotas de indicador y colocarlo
debajo del refrigerante, de modo que la punta del tubo interior del mismo quede sumergida en el
cido brico, ver figura 66.
Coloca el baln de destilacin que contiene la mezcla digerida en el extremo del tubo que conduce
el vapor y asegurarse que quede perfectamente ajustado para prevenir escapes. Levantar la tapa
del embudo (cuidando de dejar un pequeo nivel en el mismo para que acte como sello) para
permitir el paso de aproximadamente unos 5 ml de NaOH del 50%. Tapar rpidamente el embudo y
operar la llave de doble paso para que el vapor penetre al baln de destilacin al cual se le acaba
de agregar la soda concentrada.
Figura 4: Montaje para destilacin en el mtodo de Micro Kjeldahl
A partir del momento en que empiecen a condensarse vapores de NH 3 en la parte superior del
refrigerante, lo cual se conoce porque la solucin de cido brico vira a un violeta o azul,
cronometre cinco minutos. Transcurrido este tiempo, baje el erlenmeyer de modo que el extremo
del tubo interior del refrigerante quede por encima del nivel del lquido en el erlenmeyer. Hecha la
123

anterior operacin, esperar tres minutos ms para que el refrigerante escurra y se lave.
Con el frasco lavador, lave la punta del refrigerante y reciba estas aguas de lavado en el
erlenmeyer. Desmontar el baln de destilacin y dejar pasar el vapor para efectos de lavado.
Operar enseguida la llave de doble paso para dirigir el vapor hacia el vertedero.
Por ltimo, con el frasco lavador, lavar tambin el extremo del tubo que conduce el vapor al baln
de destilacin, con el fin de dejarlo limpio para la prxima destilacin.
Titulacin : Titular el destilado del blanco recogido sobre el cido brico, con el HCI estndar,
hasta alcanzar la misma coloracin que tena antes de recibir el destilado.
El destilado de cada muestra recogido sobre el cido brico, que por efecto del NH 3 absorbido ha
tomado color azul, se titula con el mismo cido, hasta obtener una coloracin final igual a la
alcanzada con el blanco.
A partir de los volmenes de cido gastados en las titulaciones de la muestra (Vm) y el blanco (Vb),
calcular el porcentaje de nitrgeno total con la ecuacin:
%N
Vm Vb x N HCl x 14 x 100
Peso Muestra en mg
Donde:
Nt = nitrgeno total
Vm = Volumen de HCI gastado en la muestra
Vb = Volumen de HCI gastado en el blanco
N = Normalidad del HCI
y el porcentaje de protena bruta, aplicando la ecuacin:
% Pr otena Bruta %Nt x
100
16
% Pr otena Bruta %Nt x 6.25
Comparar los valores obtenidos con los que se hallen en la literatura consultada para la leguminosa
o el cereal analizado.
Incluir en su informe el contenido de protenas en: soya, maz, trigo, cebada, frjol, arveja, lenteja,
garbanzo, papa y leche.
124

Cuestionario
1. Qu se conoce con el nombre de protena bruta?, de protena real? Cmo se determinara
cada una utilizando el mtodo de micro-Kjeldahl?
2. Al comparar los mtodos de Biuret y Kjeldahl qu ventajas y desventajas encontrara en cada
uno?
3. Explique porqu el contenido total de protena determinado sobre una muestra de harina
vegetal, no es el mismo que se determina sobre un extracto de la misma harina con NaCI 1%.
4. El factor de conversin usado (6,25) es vlido cuando se determina el contenido de protena
en leches? Explique su respuesta.
Evaluacin grupal:
el grupo de trabajo debe presentar un informe escrito en la fecha acordada por el tutor , que contenga:
portada, introduccin, objetivos, tabla de resultados, anlisis y confrontacin de resultados, desarrollo de
cuestionarios. Conclusiones y bibliografa.
125

7. FUENTES DOCUMENTALES
Miguez, J. (1997). Prcticas de Bioqumica. Tunja: Universidad Pedaggica y

Tecnolgica de Colombia.
Munera, R: (2008). GUA PARA PRCTICAS DE LABORATORIO
BIOQUMICA. Palmira: Universidad Nacional Abierta y a Distancia.
DE

Rawn, J (2005). Bioqumica. Madrid: Interamericana-McGraw_Hill.
Rodney, B. (1999). El ciclo del cido ctrico. En B. Rodney, Conceptos de
Bioqumica (pgs. 489-494). Mxico: International Thomson Editores S.A de C.V.
Universidad Nacional de Colombia (2003). Laboratorio de Bioqumica. Bogot:
Universidad Nacional.
126

ANEXO
ASPECTOS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO 13
El trabajo en el laboratorio requiere la observacin de una serie de normas de de seguridad que eviten
posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se est haciendo.
3.1 NORMAS PERSONALES
Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su material.

Es conveniente la utilizacin de bata, ya que evita que posibles proyecciones de sustancias qumicas
lleguen a la piel. Por supuesto adems, evitars posibles deterioros en sus prendas de vestir.
Use gafas de seguridad.
Si tienes el pelo largo, es conveniente que lo lleve recogido.
En el laboratorio est terminantemente prohibido fumar, ni tomar bebidas ni comidas.
Antes de utilizar un compuesto, asegurarse bien de que es el que se necesita, fijarse bien el rtulo.
No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con
el profesor.
Verifica el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo. Cuando los instrumentos no estn
siendo usados deben permanecer desenchufados.
Usa siempre guantes de asbesto, para el aislamiento trmico, al manipular material caliente.
Es muy importante que cuando los productos qumicos de desecho se viertan en la pila de desage,
aunque estn debidamente neutralizados, debe dejarse que circule por la misma, abundante agua.
No tocar con las manos y menos con la boca, los productos qumicos.
No pipetear con la boca, se debe utilizar una pera manual o dispositivo que se disponga para tal fin.
Los cidos requieren un cuidado especial. Nunca se debe adicionar agua sobre ellos, cuando se
quiera diluirlos; siempre al contrario, es decir, cido sobre agua. Tenga en cuenta que normalmente
hay desprendimiento de calor.
Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) no deben estar cerca de fuentes de calor. Si
hay que calentar tubos con estos productos, se har al bao Mara, nunca directamente a la llama.
Si se vierte sobre ti cualquier cido o producto corrosivo, lvate inmediatamente con mucha agua y
avisa al profesor.
Al preparar cualquier disolucin se colocar en un frasco limpio y rotulado convenientemente.
Cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio.
El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio fro. Para evitar quemaduras, dejarlo enfriar
antes de tocarlo.
Las manos se protegern con guantes o trapos cuando se introduzca un tapn en un tubo de vidrio.
Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, observa cuidadosamente estas
dos normas:
o Ten sumo cuidado y ten en cuenta que la boca del tubo de ensayo no apunte a ningn
compaero. Puede hervir el lquido y salir disparado, por lo que podras ocasionar un
accidente.
o Calienta por el lateral del tubo de ensayo, nunca por el fondo; agita suavemente.
Cuando se determinan masas de productos qumicos con balanza, se colocar papel de filtro sobre
los platos de la misma y si es necesario, porque el producto a pesar fuera corrosivo, se utilizar un
vidrio de reloj.
Se debe evitar cualquier perturbacin que conduzca a un error, como vibraciones debidas a golpes,
aparatos en funcionamiento, soplar sobre los platos de la balanza, etc.
3.2 NORMAS PARA EL MANEJO DE REACTIVOS Y SOLUCIONES
13 13

127

La alta calidad en un anlisis qumico requiere reactivos y soluciones de excelente pureza. Las siguientes
normas deben observarse para prevenir la contaminacin accidental de los reactivos y de las soluciones:
Seleccionar el reactivo qumico de mejor calidad que se encuentre disponible. Elegir la botella de
menor volumen para obtener la cantidad deseada.
Tapar la botella inmediatamente despus de haber tomado la cantidad deseada. Por ningn motivo
delegue a otro esta accin.
Mantener los tapones de las botellas de los reactivos entre los dedos, nunca debe colocarse un
tapn sobre la mesa.
A menos que se diga otra cosa, nunca se debe devolver el reactivo a una botella. El dinero ahorrado
por retornar el exceso de reactivo rara vez supera el riesgo de contaminar toda la botella.
A menos que se diga otra cosa, nunca se deben insertar esptulas, cucharas, o cuchillos en una
botella que contenga un reactivo slido.
3.3 MANEJO DE SUSTANCIAS QUMICAS
La seguridad en el laboratorio no se limita nicamente a la proteccin personal o de la infraestructura, sino

tambin a un manejo adecuado de los reactivos qumicos encaminado a preservarlos de la contaminacin y
del desperdicio.
Sustancias slidas
Como costumbre se debe leer la etiqueta de un reactivo antes de usarlo. Los reactivos slidos
normalmente se almacenan en recipientes de boca ancha y antes de abrirlos se gira e inclina la
vasija de tal manera que algo del contenido pase a la tapa plstica. A continuacin se remueve
cuidadosamente la tapa con slido dentro de ella y se golpea suavemente hasta obtener la cantidad
deseada. Cuando se requieren cantidades apreciables comparadas con el contenido del frasco, se
inclina la botella suavemente y se gira hacia atrs y hacia adelante hasta retirar lo necesario. Si el
reactivo se encuentra compactado, se tapa el recipiente y se agita fuertemente para lograr romper los
terrones. Evitar introducir elementos como destornilladores, esptulas de hierro u otro objeto que
pueda contaminar el slido. Si el reactivo es muy fino y libera polvo fcilmente, debe utilizarse una
mascarilla apropiada.
Sustancias lquidas
Los lquidos se almacenan por lo general en recipientes de boca angosta o en frascos con gotero.
Para medir una cantidad de lquido, sea una solucin o un lquido puro, se debe sacar una pequea
porcin a un vaso limpio y seco, y de all se toma la cantidad requerida mediante una pipeta. No
deben introducirse pipetas o cualquier otro dispositivo directamente dentro de la botella que contiene
el lquido, esto conduce generalmente a la contaminacin de todo el contenido.
Cuando se van a transferir lquidos desde un gotero tipo medicinal, la manera ms correcta es verter
el lquido sin introducir el gotero en el recipiente en el cual se va a almacenar el lquido, para evitar la
posibilidad de contaminacin del gotero y de la solucin original.
3.4 CAMPANA DE EXTRACCIN

Las reacciones que liberan gases txicos o corrosivos deben realizarse dentro de una vitrina o campana de
extraccin. Este dispositivo es una cabina provista de un ventilador que succiona el aire del laboratorio
llevando los gases fuera de l.
3.5 SMBOLOS DE RIESGO
Para manejar con seguridad las sustancias qumicas se han ideado diversos cdigos dependiendo de la casa
fabricante, pero en general los sistemas clasifican las sustancias en las siguientes categoras:
128

Sustancias explosivas
Peligro. Este smbolo sealiza sustancias que pueden explotar bajo determinadas condiciones.
Ejemplo: dicromato de amonio.
Precaucin. Evitar choques, percusin, friccin, formacin de chispas y contacto con el calor.
Sustancias oxidantes (comburentes)

Peligro: Los compuestos comburentes pueden inflamar sustancias combustibles o favorecer la
amplitud de incendios ya declarados, dificultando
Su extincin. Ejemplo: permanganato de potasio, perxido de sodio. Precaucin: Evitar cualquier
contacto con sustancias combustibles.
Sustancias fcilmente inflamables

Sustancias autoinflamables: Ejemplo: alquilos de aluminio, fsforo. Precaucin. Evitar contacto con el
aire. Gases fcilmente inflamables: Ejemplo: butano, propano. Precaucin. Evitar la formacin de
mezclas inflamables gas-aire y aislar de fuentes de ignicin. Sustancias sensibles a la humedad:
Productos qumicos que desarrollan emanaciones de gas inflamable al contacto con el agua.
Ejemplo: litio, borohidruro de sodio. Precauciones: evitar contacto con agua o con humedad.
Lquidos inflamables
En trminos muy sencillos, los lquidos inflamables son aquellos que fcilmente pueden arder. El que
un lquido arda con ms o menos facilidad depende de su punto de llama. Entre ms bajo sea este
punto ms fcilmente arde el reactivo y por lo tanto mayor cuidado se ha de tener en su manejo,
almacenamiento y transporte. Con estos lquidos se ha realizado una clasificacin teniendo en cuenta
lo anteriormente expuesto y su solubilidad en el agua:
o
Peligro Clase A
Esta clasificacin se le asigna a lquidos que tienen un punto de llama por debajo de 100 C
y que no se disuelven en el agua a 15 C.
AI
Lquidos con punto de llama por debajo de 21 C.
AII
Lquidos con punto de llama entre 21 y 55 C.
AIII
Lquidos con punto de llama entre 55 y 100 C.
Peligro Clase B
Esta clasificacin se le asigna a lquidos que tienen punto de llama por debajo de 21 C y
que se disuelven en agua a 15 C, o a aquellos cuyos componentes inflamables se
disuelven en agua tambin a 15 C. Este tipo de lquidos no se puede apagar con agua.
129

Sustancias txicas
Peligro: Tras una inhalacin, ingestin o absorcin a travs de la piel pueden presentarse, en
general, trastornos orgnicos de carcter grave o incluso la muerte. Ejemplo: trixido de arsnico,
cloruro
de
mercurio
(II).
Precaucin: Evitar cualquier contacto con el cuerpo y en caso de malestar acudir inmediatamente al
mdico.
Sustancias nocivas
Peligro: La incorporacin de estas sustancias por el organismo produce efectos nocivos de poca
trascendencia. Ejemplo: tricloroetileno. Precaucin: Evitar el contacto con el cuerpo humano as
como la inhalacin de vapores. En caso de malestar acudir al mdico.
Sustancias corrosivas
Peligro: Por contacto con estas sustancias se destruye el tejido vivo y tambin otros materiales.
Ejemplo: bromo, cido sulfrico. Precaucin. No inhalar los vapores y evitar el contacto con la piel,
los ojos y la ropa.
Sustancias irritantes
Peligro: Este smbolo destaca en aquellas sustancias que pueden producir accin irritante sobre la
piel, los ojos y sobre los rganos respiratorios. Ejemplo: amonaco, cloruro de bencilo. Precaucin.
No inhalar los vapores y evitar el contacto con la piel y los ojos.
PREPARACIN DE REACTIVOS14
4.1 DISOLUCIN DE YODO

Reactivos
1. Yodo, 1.0 g
2. Agua destilada, 300.0 mL
Procedimiento
Se mezclan ambos reactivos y se filtra la solucin.
4.2 REACTIVO DE LUGOL DETECCIN DE ALMIDN
En la deteccin de almidn se emplea el reactivo Lugol. El almidn y el yodo forman un complejo de color
violceo. Si se le agrega unas gotas de lugol a una muestra y esta permanece de color amarillento, la
reaccin es negativa. Si da un color azul violceo es positivo.
Reactivos
1. Yodo (I), 1.0 g
2. Yoduro potsico (KI), 2.0 g
3. Agua destilada, 300.0 mL
Procedimiento
Se mezclan los tres reactivos y se filtra la solucin. La solucin final que se obtiene presenta color mbar.
4.3 REACTIVO DE TOLLENS DETECCIN DE ALDEHDOS
14 14

130

En las pruebas que se utiliza este reactivo se forma un precipitado de plata que se deposita en la superficie de
los recipientes de vidrio, formando un espejo de plata, por lo que no se recomienda la agitacin. Se debe
utilizar recin preparado porque de lo contrario no se forma el espejo de plata.
La reaccin para la preparacin del reactivo de tollens es la siguiente:
AgNO3 + NH4OH = Ag(NH3)2OH
Se estabiliza por la adicin de NaOH.
Se utiliza para identificar aldehdos ya que ocurre la siguiente reaccin:
RCHO + 2 Ag(NH3)2OH = RCOONH4 + 2Ag + 3NH3 + H2O
En donde la plata se precipita formando un espejo de plata o un precipitado gris.
Reactivos
1.
2.
3.
NaOH al 5%, dos gotas

AgNO3 al 5%, 1.0 mL
NH4OH, 2N
Procedimiento
Cuando se requiera el reactivo, se debe mezclar en un tubo de ensayo dos gotas de una disolucin de NaOH
al 5% y 1.0 mL de disolucin acuosa de AgNO3 al 5%. Agitar el tubo y aadir gota a gota NH4OH 2N, hasta
que se consiga disolver el precipitado de AgOH, que previamente se haba formado. Si es necesario se debe
filtrar la solucin.
No se debe exceder en el uso del NH4OH 2N para que el reactivo as preparado sea bastante sensible. Debe
trasladarse a un frasco opaco ya que la solucin puede ser alterada por la accin de la luz.
Precaucin
El isocianato de plata, AgNCO, compuesto muy explosivo en seco, puede estar presente en los residuos de
las soluciones del reactivo de Tollens; por esta razn, es conveniente tirar el resto de la disolucin de Tollens
no utilizada y lavar los tubos con HNO3 diluido (disuelve el espejo de plata formado).
4.4 REACTIVO DE FEHLING DETECCIN DE AZCARES REDUCTORES
El reactivo de Fehling, tambien conocido como Licor de Fehling, es una disolucin descubierta por el qumico
alemn Hermann von Fehling y que se utiliza como reactivo para la determinacin de azcares reductores.
Sirve tambin para demostrar la presencia de glucosa en la orina.
El ensayo con el licor de Fehling se funda en el poder reductor del grupo carbonilo de un aldehdo. ste se
oxida a cido y reduce la sal de cobre (II) en medio alcalino a xido de cobre (I), que forma un precipitado de
color rojo. Un aspecto importante de esta reaccin es que la forma aldehdo puede detectarse fcilmente
aunque exista en muy pequea cantidad. Si un azcar reduce el licor de Fehling a xido de cobre (I) rojo, se
dice que es un azcar reductor.
Se utiliza como reactivo para la determinacin de azcares reductores, y es til para demostrar la presencia
de glucosa en la orina, y tambin para detectar derivados de la glucosa como la sacarosa o la fructosa.
131

Al mezclar las soluciones A y B de Fehling se forma complejo con el in cprico que es reducido por los
aldehdos. Si la reaccin es positiva se forma un precipitado rojo de CuO 2. Al reaccionar con monosacridos,
se torna verdoso; si lo hace con disacridos, toma el color del ladrillo.
La reaccin que se produce es la siguiente:
RCHO + 2Cu++ + OH- RCOOH + CuO2 + H2O
Reactivos
1. Sulfato de cobre (CuSO4), 34.64 g
2. Tartrato sdico potsico (KNa(C4H4O6) 4H2O), 17.6 g
3. Hidrxido sdico en escamas (NaOH), 7.7 g
Procedimiento
Se preparan las soluciones A y B de la siguiente manera:
Solucin A: Se disuelven 34.64 g de sulfato de cobre en 500 mL de agua.

Solucin B: Se disuelven 17.6 g de tartrato sdico potsico y 7.7 g de hidrxido sdico en 50 mL de
agua.
Cuando se requiera su utilizacin se mezclan volmenes iguales de cada una de las soluciones. Ambas
soluciones se guardan separadas hasta el momento de su uso para evitar la precipitacin del hidrxido de
cobre (II).
4.5 REACTIVO DE BIURET DETECCIN DE PROTENAS
Para la deteccin de protenas en los alimentos se usa el reactivo de Biuret. cual se fundamenta en la
formacin de un complejo coordinado entre los iones cpricos del reactivo y el enlace peptdico de la protena,
reaccin que transcurre en medio alcalino.
Si al agregar unas gotas del reactivo la muestra no cambia de color, la reaccin es negativa; en este caso se
puede decir que la muestra no contiene protenas o presenta una cantidad que no es posible detectar. Si la
muestra cambia de color, primero a un tono rosado, luego se pone azul y, finalmente, violeta, la reaccin es
positiva, lo que indica la presencia de protena.
Reactivos
1.
2.
3.
Sulfato cprico (CuSO4.5H2O), 2.5 g

Hidrxido de sodio en escamas, 440g
Agua destilada
Procedimiento
Disuelva 2.5 g de sulfato cprico en un litro de agua destilada. Disuelva 440 g de hidrxido de sodio en u n litro
de agua destilada. Luego mezcle estas dos soluciones. Esta preparacin debe almacenarse en botellas
oscuras (color mbar).
132

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1. ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

Este material ha tenido tres actualizaciones, la primera en el 2008 el Ingeniero

El proceso de revisin de estilo del material y aportes disciplinares, didcticos y

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PRCTICA No. 1: METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE

PRCTICA No. 2: FRACCIONAMIENTO DE PROTENAS EN SEMILLAS DE

PRCTICA No. 3: ENSAYOS ENZIMATICOS CUALITATIVOS

PRCTICA No. 4 :ESTUDIO CINTICO DE LA UREASA

PRCTICA No. 5: DETERMINACIN DE VITAMINA C

PRCTICA No. 6: AISLAMIENTO DEL ARN EN LEVADURA

PRCTICA No. 7: AISLAMIENTO Y DETERMINACION DE CIDOS NUCLEICOS

PRCTICA No. 8- PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS 84

PRCTICA No. 10: RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE CARBOHIDRATOS:

PRCTICA No. 11- RECONOCIMIENTO CUALITATIVO DE LPIDOS

PRCTICA No. 12- FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS PRINCIPALES

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Tabla 24: bateras de tubos variacin de la temperatura60

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4.1 LISTADO DE GRFICOS Y FIGURAS

Figura 1: fraccionamiento de protenas en semillas de leguminosas y cereales por

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Uno de los cursos fundamentales es la Bioqumica, el cual permite comprender los

Un curso de bioqumica sin experiencia prctica es un curso incompleto, slo con

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anlisis instrumental, volumtrico y gravimtrico.

25% que equivale a 125/ 500 puntos

El trabajo en el laboratorio requiere la observacin de una serie de normas de de seguridad que

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del respectivo pre informe personal como

El estudiante resolver los respectivos cuestionarios dados.

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Material biolgico y otros

Alimento de origen vegetal o Reactivo de milln

Agua destilada, Solucin de CuSO4

Solucin NaOH 30% y 40%, Solucin

HNO3 concentrado, Cristales de

Cinta para rotular

HCl concentrado, Acido triclorcetico

Solucin cido pcrico saturada,

Solucin de (NH4SO4) al 50%,

Marcador para vidrio

Solucin de acetato de plomo 0.5 %

Reactivo de sakaguchi, cido actico

HSO4 concentrado, Acido actico al

Aminocidos: glicina, tirosina,

Ninhidrina (2 g/l) preprese en fresco,

Pinzas para tubos

cido sulfanilico (10 g/l en solucin

Nitrito de sodio, Carbonato de sodio

Acetato de plomo, Nitrato de mercurio.

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Nitroprusiato de sodio (20 g/l,

Pinzas para tubos

Alfa- naftol, Agua de bromo

cido fosfrico, Molibdato de sodio