MTODOS DE OBTENCIN DE ANTICUERPOS

MONOCLONALES
El mtodo ms habitual de obtencin de anticuerpos monoclonales se
basa en la activacin de linfocitos B
frente al antgeno contra el que se
desea
obtener
los
anticuerpos
especficos. Las clulas B se suelen
obtener del bazo de un ratn que ha
sido inmunizado repetidamente con el
antgeno para aumentar el nmero de
linfocitos B que lo reconocen, as como
su afinidad. Estas clulas B se fusionan
con clulas de mieloma de ratn que no produce anticuerpos, aun
cuando conserva la capacidad de fabricarlos.
Una vez conseguida la fusin existen, en teora, tres tipos de clulas:
los hbridos de los diversos clones de linfocitos B y una clula de
mieloma, clulas B y clulas de mieloma, ambas sin fusionar. De
estas se seleccionan los hbridos, que adquieren el carcter inmortal
de la clula tumoral. Posteriormente se seleccionan aquellas que
tienen la especificidad deseada y se cultivan con el fin de que
generen los anticuerpos deseados.
Los clones que producen el anticuerpo monoclonal se pueden
expandir y crecer en cantidades grandes e ilimitadas, bien como
tumores ascticos en animales, en biorreactores de fibras huecas o
incluso mediante ingeniera gentica
Tcnica de produccin de anticuerpos monoclonales
El procedimiento para producir anticuerpos monoclonales demora,
habitualmente, cuatro meses. Para ello, se inyecta en ratones el
antgeno, aun cuando no est puro. Luego de un perodo de espera
que permite un aumento de los linfocitos B especficos, se sacrifica el
ratn y se extrae el bazo, rico en linfocitos. Como primera etapa, los
linfocitos que se obtengan del bazo, se mezclan con clulas
mielomatosas (clulas de un tumor de linfocitos), agregando adems
polietilenglicol, un agente que facilita la fusin. Con esto se consigue
que algunas clulas mielomatosas se fusionen con linfocitos del bazo,
produciendo lo que se llama un hibridoma. Se logra as una clula que
combina la capacidad de producir anticuerpos de los linfocitos, con la
capacidad de multiplicarse indefinidamente de la clula mielomatosa.
No todas las clulas logran fusionarse (hibridizarse), sino que por el
contrario, un escaso nmero de ellas (slo una cada 2 x 105 de las

clulas del bazo). De all que sea necesario eliminar todas aquellas
clulas que no se fusionen (linfocitos y clulas mielomatosas).
Los linfocitos que no se han fusionado se eliminan solos, porque luego
de unas pocas divisiones, mueren. El problema ms complicado es
eliminar las clulas del mieloma, que si continan multiplicndose.
Las clulas mielomatosas que se utilizan para la fusin han sido
genticamente alteradas, de modo que les falta una enzima vital para
la sntesis de DNA: la hipoxantina guanina fosforibosiltrarferasa.
Cuando estas clulas mielomatosas mutadas se hacen crecer en un
medie do cultivo especial, ellas tambin mueren. Sin embargo, si se
logran fusionar con linfocitos normales, sobreviven, porque los
linfocitos le proveen la enzima que a ellas les falta. De este modo, al
poco tiempo, en el cultivo slo quedan las clulas fusionadas
(hibridomas).
Luego debe seleccionarse y purificarse, entre todos las hibridomas,
aquel que produce el anticuerpo especfico que se desea. Muchas
tcnicas se han utilizado para seleccionar los hibridomas especficos,
siendo la ms usada aquella que utiliza un radioinmunoanlisis. Para
ello, se fija el antgeno especfico en el fondo de pocillos de plstico.
Luego, a cada uno de los pocillos se agrega el lquido del cultivo
donde estn creciendo las colonias de hibridomas. En aquellos casos
en que las colonias secretan el anticuerpo especfico ste va a
reaccionar con el antgeno que se ha fijado al plstico, los dems se
eliminan por un simple lavado. En este momento se agrega un
reactivo (marcado con un radioistopo) que reacciona solamente con
la molcula de anticuerpo monoclonal (generalmente un segundo
anticuerpo especfico contra los anticuerpos monoclonales). Despus
de un tiempo de incubacin apropiada, nuevamente se lavan los
pocillos. Para ubicar el hibridoma que interesa se busca en qu pocillo
est la radioactividad (figura 2).

La etapa final, es separar los distintos hibridomas resultantes, con el

fin de obtener una poblacin proveniente de una sola clula (clon).
Para ello, las clulas se diluyen hasta lograr que una clula quede en
un micropocillo de cultivo. El anticuerpo producido por esta clula y
sus progenitoras (clon), es un anticuerpo monoclanal. De all en
adelante estas clulas se pueden guardar congeladas o cultivar y
multiplicar por siempre (figura 2).
Estos hibridomas pueden inyectarse en la cavidad peritoneal de un
ratn donde se multiplican y desarrollan como un cncer secretando
al mismo tiempo el anticuerpo deseado. Este mtodo es til para el
trabajo de laboratorio, pero no es prctico ni econmico para la
produccin comercial del anticuerpo monoclonal. Por esto, se ha
buscado otra forma para poder reproducir y multiplicar el hibridoma;
el mtodo llamado Encapel, que consiste en capsular los hibridomas,
en pequeas esferas (figura 3).

Primero se colocan los hibridomas en una solucin biocompatible de

alginatos (sustancia derivada del alga Gracilaria), y luego se
encapsulan con una membrana de polmeros de almidn. La
porosidad de la membrana de la cpsula permite que los gases y
nutrientes fluyan al interior y que los productos de desechos, salgan
de ella. Cuando se alcanza la densidad apropiada de anticuerpos en
su interior, las cpsulas se rompen y se recolecta la protena (figura
4).

Anticuerpos Monoclonales Humanos

Produccin de anticuerpos monoclonales humanos
La produccin de anticuerpos monoclonales humanos ha sido
abordada desde dos frentes principales. Uno es a travs de la
inmortalizacin de las clulas productoras de anticuerpos, aspecto
que detallaremos a continuacin, y el otro mediante el uso de
tcnicas de biologa molecular y ADN recombinante, el cual se
describe ms adelante, en la seccin que hemos titulado "Anticuerpo
de segunda generacin"

Inmortalizacin de las clulas productoras de anticuerpos

La preparacin de anticuerpos monoclonales humanos mediante la
inmortalizacin de las clulas productoras de stos ha tenido que
enfrentar dos escollos importantes que vale la pena mencionar antes
de detallar las tcnicas por las cuales se ha abordado este objetivo.
Uno es la fuente de donde obtener los linfocitos B humanos. En la
mayora de los casos, la sangre perifrica ha sido la fuente
prcticamente obligada (James y Bell, 1987). Desgraciadamente, en
la sangre perifrica la proporcin relativa de linfocitos B es baja si se
compara con rganos linfoides como el bazo y los ganglios. Adems,
se cree que en la sangre perifrica son pocos los linfocitos B que se
encuentran en el estadio adecuado de diferenciacin para rendir
hbridos productores de inmunoglobulinas (Schwaber et al., 1984).
El otro aspecto es la inmunizacin. A menos que uno cuente con la
suerte de tener individuos inmunizados de forma "natural", son pocos
los casos en los que deliberadamente se puede inmunizar a un ser
humano para luego obtener una muestra de sus linfocitos B inmunes
y utilizarlos para la produccin de anticuerpos monoclonales.
Resultados obtenidos por Melamed en 1987 realizando estudios para
la produccin de anticuerpos monoclonales humanos con
especificidad por el grupo sanguneo Rh ilustran la importancia que la
inmunizacin tiene para la generacin de un anticuerpo monoclonal.
En estos estudios se encontr que el tiempo para la obtencin de los
linfocitos desde el momento M ltimo "contacto con el antgeno"
resulta crtico para el xito o fracaso (Melamed et al, 1987).
La utilizacin de esquemas de inmunizacin in vitro se mantiene
como una alternativa promisoria para la resolucin de este problema.
Haciendo uso de los avances en el conocimiento de los mecanismos y
seales solubles que se ponen en juego durante la aparicin de la
respuesta inmune humoral, como por ejemplo la interaccin de
linfocitos B con linfocitos T cooperadores activados que expresan el
ligando para CD40 (Banchereau et al., 1991) y con clulas dendrticas
foliculares, el efecto de ciertas interleucinas como las IL-2, IL-4, IL-5
(Phillips y Klaus, 1992; Morikawa et al., 1993), la IL-6 (Hirano y col.,
1987; Tosato et al., 1988), la IL-10 (De Waal et al., 1992; Briere et al.,
1993; Burdin et al., 1993) y la forma soluble de CD23 (ThorleyLawson, 1988), en conjunto con los avances en el desarrollo de
nuevos agentes adyuvantes tipo P3C-X (Hoffman et al., 1990) y
muramil-dipptido (Carrol et al., 1990) y la caracterizacin de las
influencias que ejercen in vitro las poblaciones celulares presentes en
la sangre perifrica que, como se mencion, es la fuente principal

para la obtencin de los linfocitos B en la mayora de los casos

(eliminacin de la poblacin de linfocitos T CD8+) (Borrebaeck, 1988),
es probable que pronto se disponga de una manera confiable de
inmunizar linfocitos B humanos in vitro.
La inmortalizacin de las clulas humanas productoras de anticuerpos
se ha hecho bsicamente por tres vas. Una es la transformacin de
los linfocitos B humanos con el virus de Epstein-Barr (VEB); otra la
fusin de clulas somticas para generar horno o heterohibridomas y
una ltima que combina las dos primeras; es decir, transformacin
con el VEB seguido de fusin celular.
Inmortalizacin por transformacin con el VEB
Desde 1968 se conoce que la infeccin de linfocitos B humanos con el
VEB induce en ellos un proceso de transformacin que les faculta
para crecer por perodos prolongados en cultivo, generndose las, as
llamadas lneas linfoblastoides (Pope et al., 1968). El primer reporte
de tina lnea linfoblastoide productora de anticuerpos de especificidad
conocida fue hecho por Steinitz en 1977, quien obtuvo anticuerpos
monoclonales humanos especficos para el hapteno NNP (Steinitz et
al., 1977). La tcnica es relativamente sencilla: consiste en aislar la
fraccin de clulas mononucleares (CMN) a partir del "buffycoat" de
una muestra de sangre, obtenida de un donante en cuyo suero se
hayan detectado los anticuerpos deseados. Estas CMN son luego
incubadas con una fuente de VEB, lo cual permite que ocurra la
infeccin viral con la subsecuente multiplicacin celular y produccin
de anticuerpos. Dado que las clulas B infectadas expresan antgenos
virales en su superficie (Thorley-Lawson, 1988) y ms del 95% de los
seres humanos posee inmunidad contra el VEB (es el agente causal
de la mononucleosis infecciosa o enfermedad del beso) (Henle et al,
1968), es necesario eliminar o inactivar los linfocitos T citotxicos
especficos presentes en las CMN. Esto se logra comnmente
aadiendo a los cultivos fitohemaglutinina o ciclosporina A. Al cabo de
unos 7-10 das se examina el sobrenadante de los cultivos en busca
de aquellos que contengan los anticuerpos deseados y se procede a
aislar o clonar las clulas linfoblastoides productoras de stos. Dicho
aislamiento se ha realizado mediante tcnicas de roseteo, "panning"
o "FAC-sorting" (Kozbor y Roder, 1983) y es necesario debido a que
las clulas linfoblastoides obtenidas constituyen una poblacin
heterognea en la cual, por lo general, terminan predominando las
clulas B no productoras de las inmunoglobulinas de inters.

A pesar de su simplicidad, muchos investigadores han encontrado

numerosos inconvenientes al tratar de producir anticuerpos
monoclonales mediante la transformacin con VEB. Quizs el ms
importante de estos inconvenientes es la manifiesta incapacidad que
exhiben las clulas linfoblastoides para clonarse a baja densidad
celular (James y Bell, 1987). Como mencionamos, este clonamiento es
fundamental para minimizar el riesgo de sobrecrecimiento de las
clulas en las que no estamos interesados por encima de las que s,
pero adems es importante para garantizar la clonalidad de una
preparacin dada de anticuerpos. De manera que, aun teniendo xito
en la fase de aislamiento o seleccin, en muchos casos el producto
obtenido es oligoclonal, no monoclonal. Adems, la experiencia
acumulada indica que las clulas linfoblastoides tienden con el tiempo
a disminuir e incluso a detener la produccin de anticuerpos y a dejar
de crecer (Thompson, 1988).
Preparacin de hibridomas
Otra manera de inmortalizar las clulas productoras de anticuerpos
ha sido mediante la fusin de clulas somticas para generar
hibridomas humanos (Abrams et al., 1986). Por diversas razones,
algunas de ellas no del todo entendidas, la produccin de hibridomas
humanos ha resultado bastante ms dificultosa que la obtencin de
los homlogos hibridomas de ratn. Entre estas razones se encuentra
la no disponibilidad de una pareja (o parejas) de fusin adecuada. La
obtencin de lneas mielomatosas humanas equiparables a las
existentes en el modelo murino ha resultado difcil. Las clulas de
mieloma humano se adaptan pobremente a crecer en cultivo y
adems exhiben baja fusogenicidad y eficiencia de clonamiento. As
mismo, las pocas lneas que se han generado son productoras, ya sea
de cadenas livianas o pesadas (Kozbor y Roder, 1983: James y Bell,
1987; Thompson, 1988; Larrick y Gavilondo, 1989).
Estos inconvenientes han provocado la utilizacin de las lneas
mielomatosas mridas en la construccin de "heterohibridomas"
humano-ratn. Sin embargo, con este sistema se ha presentado el
problema de la inestabilidad de los hbridos. Esta inestabilidad radica,
fundamentalmente, en la ocurrencia de un fenmeno denominado
segregacin (prdida preferencial de los cromosomas de una especie
que ocurre cuando se hibridizan clulas somticas de diferentes
especies). Desafortunadamente, en el caso de los heterohibridomas
humano-ratn los cromosomas que se segregan son los humanos
(James y Bell, 1987). Tratando de disminuir este problema se ha
optado por preparar hbridos humano-ratn (los llamados

"heteromielomas") para usarlos como pareja de fusin, con la

esperanza de que al tener un componente humano previo, el nuevo
hbrido no segregue tan vigorosamente los cromosomas humanos
(Foung et al., 1986; Grunow et al., 1988; Jahn et al., 1990).
Transformacin con el VEB + fusin celular.
La otra forma cmo se ha abordado el problema de producir
anticuerpos de manera continua en el laboratorio es mediante la
combinacin de las dos tcnicas antes mencionadas, es decir
transformacin con VEB y posterior fusin con mieloma o
heteromieloma. Este enfoque ha resultado ms exitoso que
cualquiera de las dos tcnicas por separado. En esencia, el esquema
bsico de ambas tcnicas es respetado: luego de la transformacin y
enriquecimiento de las clulas transformadas productoras del
anticuerpo, stas se fusionan con una poblacin de clulas de
mieloma o heteromieloma. El producto de fusin es ahora sometido a
un proceso de doble seleccin negativa en un medio que contiene
una droga para eliminar las clulas mielomatosas (por lo general
aminopterina, ya que ordinariamente las clulas de mieloma
utilizadas son deficientes en la enzima HGPRT) y una droga para
eliminar las clulas linfoblastoides humanas no fusionadas (se emplea
Ouabaina, un inhibidor de la ATP-asa Na-K de la membrana celular,
para el cual las clulas humanas exhiben una mayor susceptibilidad
que las de ratn). Esta variante fue introducida en 1982 (Kozboret al.,
1982) y ha sido ampliamente utilizada para la produccin de
anticuerpos monoclonales humanos contra distintos antgenos.
Mediante el uso de estas tcnicas varios laboratorios en el mundo,
incluyendo el nuestro ubicado en el Instituto Venezolano de
Investigaciones Cientficas, han producido anticuerpos monoclonales
humanos anti-Rh. El inters fundamental en esta rea reside en su
posible utilidad como reactivos de clasificacin eritrocitaria y en su
potencial uso como sustitutos de la preparacin policlonal anti-Rh que
actualmente se utiliza para prevenir la inmunizacin materno-fetal en
los casos de incompatibilidad Rh. No obstante, estos anticuerpos
tambin han ayudado enormemente a definir los detalles finos de la
antigenicidad del antgeno D y a la identificacin y caracterizacin de
la(s) molcula(s) en la(s) que reside el factor Rh.
Resumen del
Monoclonal H

Proceso

de

Produccin

de

un

Anticuerpo

Resumen del Proceso

Monoclonal Humano

de

Produccin

de

un

Anticuerpo

En la figura 2 se esquematizan los pasos necesarios para el desarrollo

de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos.

FIGURA 2. ESQUEMA PARA LA PRODUCCIN DE ANTICUERPOS

MONOCLONALES HUMANOS TOMADO Y MODIFICADO DE
KOZBOR Y RODER, 1983.

Anticuerpos monoclonales de segunda generacin

En esta seccin se tratar lo relativo a dos modalidades de
produccin de anticuerpos monoclonales que tienen una perspectiva
tremenda en el campo de la teraputica y el diagnstico in vivo. Son
stas la produccin de anticuerpos biespecficos y de anticuerpos
recombinantes.
Anticuerpos biespecficos
Es bien sabido que una molcula de inmunoglobulina reconoce dos
determinantes antignicos iguales, gracias a la existencia en su
estructura de dos puntos de combinacin idnticos. Pero sera muy
til disponer de inmunoglobulinas en las cuales cada sitio de unin (o

punto de combinacin) reaccione con un determinante antignico

diferente, permitindoles as interactuar simultneamente con dos
antgenos distintos. Son estas molculas las que han sido llamadas
anticuerpos biespecficos. Su preparacin se ha logrado mediante la
fusin de, ya sea un hibridoma especfico para uno de los antgenos
con linfocitos de un animal inmunizado contra el otro antgeno
(generndose clulas hbridas llamadas triomas), o de dos hibridomas
cada uno con especificidad por un antgeno distinto (dando lugar a los
llamados cuadromas). Tanto los triomas como los cuadromas
expresan los genes de las inmunoglobulinas provenientes de ambas
clulas progenitoras y en ambos ocurre la combinacin aleatoria de
los productos proticos de estos genes. Por lo tanto, estas clulas
producen anticuerpos monoespecficos para cada antgeno pero
adems producen molculas de anticuerpos especficas para ambos
antgenos (Gavilondo, 1990), A ttulo de ejemplo, en 1993 Kaneko y
col. publicaron en la revista "Blood" la generacin de un anticuerpo
biespecfico de uso potencial en el tratamiento en humanos de la
leucemia mieloide aguda. Este anticuerpo es especfico para la
molcula CD3 presente en los linfocitos T humanos y para la molcula
CD13, la cual se expresa abundantemente en las clulas
leucmicas. In vitro, este monoclonal hbrido fue capaz de estimular
la lsis de clulas leucmicas provenientes de pacientes con leucemia
mieloide aguda, por parte de clulas mononucleares de sangre
perifrica autlogas, estimuladas con interleucina 2 o interleucina 7.
Los autores proponen a este monoclonal como una herramienta para
la eliminacin de clulas CD13+ en trasplantes de mdula sea
autloga en pacientes con este tipo de leucemia (Kaneko et al.,
1993).
Anticuerpos recombinantes
Las tecnologas de ADN recombinante se han revelado como una
herramienta tremendamente poderosa y promisoria para la
preparacin, modificacin y mejoramiento de los anticuerpos
monoclonales, tanto de origen mrido como humano. Esto ha sido
posible gracias al conocimiento detallado que se tiene en la
actualidad sobre la estructura y organizacin de los genes que
codifican a las molculas de inmunoglobulina (Max, 1993). La
combinacin de este conocimiento y estas tecnologas ha permitido
hacer verdadera ingeniera molecular para preparar molculas de
inmunoglobulina en las que las regiones que determinan la
especificidad por el antgeno provienen de genes de ratn y el resto
de la molcula es codificado por genes humanos. Virtualmente todo el
trabajo de ingeniera molecular, cuyos detalles escapan de los
alcances de esta revisin, se realiza a nivel del ADN. El producto de
este trabajo son genes hbridos o, ms apropiadamente,
recombinantes que ahora pueden ser insertados en vectores
adecuados los cuales permiten su expresin (transcripcin a ARN
mensajero y traduccin a protena) en bacterias o en clulas
eucariotas como ciertos hongos unicelulares o lneas celulares de

mamferos. Han surgido as los llamados anticuerpos "quimricos" y

"humanizados" como una alternativa tecnolgica en los intentos de
evitar o disminuir la respuesta inmune humana anti-inmunoglobulina
de ratn, que se genera cuando inyectamos un anticuerpo murino,
pero sin perder la especificidad que ste nos brinda (Winter y Milstein,
1991 ). A ttulo de ejemplo se puede mencionar el trabajo de Hale y
col., publicado en 1988 por a revista "Lancet" donde se seala la
utilizacin de ese tipo de reactivos humanizados en el tratamiento de
pacientes con linfomas, obtenindose mejores resultados que con el
uso de los monoclonales murinos (Hale et al., 1988).
Estas tecnologas tambin han permitido la preparacin de genes que
codifican molculas hbridas en las que el fragmento Fc del
anticuerpo ha sido sustituido por una enzima, una toxina o una droga.
Estos genes recombinantes pueden tambin ser expresados
apropiadamente, obtenindose molculas con la capacidad de
reconocer especficamente a un antgeno (mediante el fragmento de
inmunoglobulina) y con una propiedad funcional nueva, distinta de la
del anticuerpo "natural", conferida por la actividad enzimtica, de
toxina o de droga que le ha sido artificialmente incorporada. Un
ejemplo interesante y con una enorme potencialidad prctica lo
constituye un gen recombinante preparado por Schnee en 1987, en el
cual se combinaron los segmentos gnicos que codifican la cadena
beta del activador tisular del plasmingeno y la regin de
combinacin de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal con
especificidad por la fibrina. Al ser expresado este gen, se obtuvo una
protena recombinante capaz de reconocer especficamente cogulos
de fibrina y participar en su disolucin (Schnee et al., 1987). As
mismo, una serie de inmunotoxinas (as se llaman las protenas
recombinantes anticuerpo-toxina) han sido preparadas y estn siendo
evaluadas para su uso como agentes profilcticos en la enfermedad
injerto contra husped que aparece con frecuencia luego de un
transplante de mdula sea (Antin et al, 1990), en la eliminacin de
clulas leucmicas u en el tratamiento de linfomas (Amlot et al.,
1993; Grossbard y Nadler, 1994).