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Tec - rec.DNA DR - Cortez
Tec - rec.DNA DR - Cortez
FACULTAD DE MEDICINA
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
TECNOLOGIA
DEL DNA
RECOMBINANTE
AO 2007
Autores
Dr.
Gustavo
Agolti.
INDICE
Bibliografa: ------------------------------------------------------------------- 33
CONSTRUCCIN Y CLONACIN DE MOLCULAS DE DNA
RECOMBINANTE ----------------------------------------------------------4
GLOSARIO: ------------------------------------------------------------------ 30
INTRODUCCION: ------------------------------------------------------------2
ORGANISMOS GENTICAMENTE MODIFICADOS ------------- 29
OTRAS TECNICAS IMPORTANTES DE RECOMBINACION DEL
DNA. ------------------------------------------------------------------------- 18
OTRAS
TECNICAS
RELEVANTES
DE
LA
BIOLOGIA
MOLECULAR ------------------------------------------------------------- 27
REVISIN DE LA ESTRUCTURA ADN / GEN: -----------------------3
SCREENING Y EXPRESION DE DNA EXTRAO EN CLONES
BACTERIANOS: ---------------------------------------------------------- 12
1.INTRODUCCION:
GATC
GAATTC
CTAG
CTTAAG
Por convencin, la cadena superior en una secuencia de DNA de doble cadena se lee
5' fosfato a 3' hidroxilo y la cadena inferior se lee 3' hidroxilo a 5' fosfato. Las dos secuencias
de doble cadena ilustradas se denominan Palndromes ya que se leen exactamente igual en
ambas cadenas en la direccin 5' a 3'.
Las enzimas de restriccin son endonucleasas que clivan (hidrolizan) en una forma
especfica puentes fosfodister 3' - 5' entre pares de bases adyacentes en la doble cadena de
DNA.
Las enzimas de restriccin reciben su nombre de la bacteria de la que fueron
aisladas por ejemplo: EcoRI de Escherichia coli, BamHI de Bacillus amyloliquefaciens. Las
tres primeras letras en el nombre de la enzima, corresponden la primera al genero (E) y las
otras dos a la especie (co). stas pueden ir seguidas por la designacin de una cepa ( R) y un
nmero romano (I) para indicar el orden del descubrimiento.
El tipo ms comn de enzimas de restriccin (tipo II) usado en la tecnologa del
DNA recombinante proviene de bacterias y no requiere fuente de energa para el clivaje del
puente. Requiere en cambio iones Mg++ para la unin especfica al DNA y posterior clivaje.
Otras enzimas de restriccin clivan palndromos de DNA de 4 o 6 pb.
Algunas otras enzimas de restriccin clivan una secuencia nica. Estas enzimas que
reconocen la misma secuencia se llaman ISOCHIZOMERS.
Las enzimas de restriccin de tipo OO son parte de un sistema de restriccin /
modificacin en la bacteria. La misma tiene un sistema de proteccin contra sus propias
enzimas de restriccin a travs de una enzima acompaante que metila nucletidos de su
ADN y los convierte en un sustrato inadecuado para ser digerido en las secuencias de
reconocimiento. Por esto es que las ADN metilasas de sitio especfico y las enzimas de
restriccin siempre estn por pares en una bacteria.
En el palndrome de 6 pb ilustrado antes, la enzima de restriccin EcoRI (una
enzima aislada de E. coli) cliva el puente fosfodister entre G y A en ambas cadenas para
producir dos fragmentos asimtricos con el extremo 5' fosfato que sobresale del extremo 3'
hidroxilo.
cuando la enzima corta las dos hebras por el mismo lugar, generando dos extremos doble
cadena.
Figura 3: Enzimas de restriccin. Este tipo de endonucleasas puede dejar dos tipos de extremos
cohesivos o romos.
3.2.DNA LIGASA.
requiere Mg++ y una unin covalente, derivada del ATP en el caso de la DNA ligasa del
bacterifago T4.
La enzima T4 puede unir covalentemente molculas de DNA con extremos
cohesivos compatibles (por ejemplo, unin de hidrgeno del extremo ms largo 5' de EcoRI
digiriendo fragmentos de DNA) y tambin fragmentos de DNA con extremos sin punta.
El uso en la digestin / restriccin del DNA seguido por unin covalente de
extremos cohesivos de diferentes fragmentos de DNA forma la base de la enzimologa del
DNA recombinante.
1.
Se corta el ADN circular del plsmido con enzimas de restriccin, para generar
extremos cohesivos.
2.
Se corta el ADN que se quiere multiplicar. Asegurndose que los extremos del
Se une el gen que se desea introducir (inserto) por medio de la enzima ADN-
antibiticos. Dado que los plsmidos contienen un gen de resistencia a antibitico, al exponer
las bacterias a ese antibitico, slo las que hayan incorporado el plsmido (y con l la
resistencia) sobrevivirn, mientras que las que no lo tengan morirn. Esta es una manera
relativamente eficaz de obtener millones de copias del ADN incorporado. Dado que todas las
copias del gen provienen de una sola molcula multiplicada a partir de una nica bacteria que
dio origen a la colonia, esta tcnica lleva el nombre de clonacin.
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La unin por la DNA ligasa forma una molcula de DNA recombinante con una
estructura covalentemente cerrada. Una molcula recombinante circular puede ingresar a la
clula bacteriana, replicarse y por virtud el gen del plsmido con resistencia a antibiticos,
transformar la clula normal sensitiva a una que crecer en presencia de antibiticos.
Si la unin es realizada en un tubo de prueba con millones de molculas plsmidas
digeridas por EcoRI y millones de fragmentos de DNA extrao nico con extremos cohesivos
(por ejemplo genoma humano digerido con EcoRI) son formadas millones de molculas de
DNA recombinante, cada una conteniendo el mismo DNA vector plsmido pero con un
fragmento nico (gen en algunos casos) de DNA humano.
Cuando clulas bacterianas receptoras son transformadas con esta mezcla y
colocadas en placas de agar conteniendo el antibitico apropiado, solo una clula conteniendo
un plsmido crecer y formar una colonia visible conteniendo millones de bacterias, todas
con el idntico plsmido vector y el DNA extrao inserto (clones). De un pequeo nmero de
placas de agar es posible tener suficientes clones bacterianos individuales, as cada gen en el
genoma humano es clonado en una colonia bacteriana nica.
Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser plsmidos, virus como el fago
lambda, cromosomas creados de forma artificial y quimeras (DNA quimrico).
Para clonar genes especficos se puede preparar una biblioteca genmica que
consiste en una coleccin de fragmentos de DNA genmicos, clonados en vectores
(plsmidos, bacterifagos o csmidos), que representan el genoma entero del organismo.
Otra alternativa son las bibliotecas de cDNA (DNA complementario) que
representan la coleccin completa de los mRNA que se sintetizan en un momento en una
clula dada.
El DNA extrao clonado que est en esta biblioteca son molculas de DNA de
doble cadena sintetizadas por la enzima transcriptasa inversa a partir de la poblacin de RNA
mensajeros, moldes encontrados en un tejido especfico.
As una biblioteca cDNA contiene regiones clonadas codificantes para todas las
protenas expresadas en un tejido particular y variar de tejido en tejido.
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P-O-desoxiribosa-
DNA
Esta tcnica es extremadamente til y rpida ya que permite el marcaje de
molculas de DNA ya preformadas.
Las bibliotecas de genes de screening tambin pueden ser determinadas usando un
anticuerpo especfico que reconocer y unir a la protena del gen a ser aislado. El anticuerpo
puede ser contra la protena entera o dirigida contra un pptido sinttico derivado de la
secuencia primaria de la protena. El anticuerpo puede ser marcado radiactiva o
enzimticamente y usado para filtrar bancos de clones bacterianos en los que los genes
extraos han sido clonados en un plsmido de expresin especial. En este plsmido el gen
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En los ltimos aos, se ha desarrollado una tcnica que promete generar un salto
cualitativo en los estudios de la expresin gentica. Se trata de los micro-arreglos o chips de
DNA que permiten monitorear la expresin de un genoma en forma integrada y en un tiempo
rcord.
La base de la tcnica es simplemente la hibridacin de secuencias complementarias
de cidos nucleicos a una escala microscpica. Este altsimo nivel de miniaturizacin permite
que la cantidad de sonda requerida sea mnima. Con el empleo de diferentes "etiquetas"
fluorescentes se pueden comparar los patrones de hibridacin de dos tipos celulares
cualesquiera encontrando rpidamente aquellos genes que poseen un patrn de expresin
diferencial. De este modo es posible detectar genes especficamente activados en clulas que
han sufrido algn tipo de diferenciacin, como clulas de diferentes tejidos, tumorales,
sometidas a ciertos tratamientos, etc.
Los microchips proveen una revolucionaria herramienta para explorar la expresin
gnica y el anlisis de secuencias tanto en la investigacin bsica como aplicada.
estimulantes
de
colonias,
eritropoyetina,
factores
de
la
coagulacin
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plsmidos de expresin que funcionan en clulas eucariotas. Tales plsmidos deben contener
transcripcin eucaritica, procesamiento del RNA y regiones reguladoras de la transcripcin.
La transferencia de DNA exgeno a clulas eucariotas se denomina transfeccin de DNA.
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existe como una molcula de DNA de doble cadena durante la replicacin, sino es una cadena
nica.
El fago de DNA de cadena nica contiene una de las cadenas del DNA extrao a ser
secuenciado, y es sometido a una sntesis de DNA in Vitro usando la DNA polimerasa y un
oligonucletido sinttico especfico como molde de hibridacin que une el molde del
bacterifago corriente arriba del DNA extrao insertado. La sntesis in Vitro del DNA es
realizada en cuatro recipientes separados de reaccin, cada uno conteniendo 4 dNTPS (uno
marcado radiactivamente) ms una pequea cantidad de solo un dideoxinucletido (ddGTP ddATP - ddCTP o ddTTP).
El deoxinucletido contiene un azcar 2'H y 3'OH y el dideoxinucletido contiene
hidrgenos en posiciones 2' y 3'. Una vez que son incorporados a la cadena de DNA en
crecimiento durante la sntesis 5' fosfato se agrega a 3' OH, termina la sntesis de la cadena
porque bloquean el 3'OH requerido para la adicin del prximo 5' fosfato dNTP.
Debido a que los dideoxinucletidos estn presentes en pequeas concentraciones
en relacin a los dNTPs en reacciones individuales, la terminacin de la cadena es al azar y
resulta en un amplio rango de tamaos de cadenas nuevas sintetizadas (20 a 1.000b).
Como la electroforesis en gel de acrilamida es capaz de determinar las cadenas
individuales que difieren en una base, las cuatro mezclas de reaccin son sometidas a
electroforesis a travs de acrilamida polimerizada en caminos adyacentes. Luego el gel es
expuesto a una pelcula de rayos X donde los productos de terminacin de la cadena
radiactiva se revelan como bandas de diferente movilidad electrofortica.
La secuencia nueva sintetizada es leda en incrementos de una base a travs de
cuatro caminos de reaccin (ddG, ddA, ddT, ddC) de arriba a abajo la direccin 5' a 3'.
El complemento de esta secuencia ser la secuencia del molde de DNA extrao en
direccin 3' a 5'.
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Figura 10: Determinacin de la secuencia exacta de un cido nucleico. Hebra de DNA marcada
en su extremo 5` con 32P.
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Figura 13: a). La mezcla de reaccin contiene la secuencia de DNA que se quiere amplificar,
dos oligonucletidos sintticos (P1 y P2) que servirn como cebadores, una DNA polimerasa termoestable
(Taq) y los cuatro desoxirribonucletidos trifosfato -dATP, dGTP, dCTP y dTTP-. b). b. La mezcla de
reaccin se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de desnaturalizacin, una de
hibridacin y una de elongacin-. c). La hibridacin-. d). La elongacin.
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El mtodo de hibridacin in situ tambin puede ser usado para detectar la presencia
de molculas de RNA especficas en clulas de distintos tejidos e indicar, de esta manera la
expresin diferencial de genes en esos tejidos.
En la hibridacin in situ, las sondas estn marcadas con colorantes fluorescentes.
Cada color indica la localizacin de una secuencia de DNA diferente: rojo, localizacin en el
cromosoma X del gen de la distrofia muscular infantil mas comn; verde, regin del
cromosoma 21 donde se encuentra el gen responsable del Sndrome de Down; blanco, un
oncogen en el cromosoma 8; violeta, un gen que codifica una protena de membrana de los
glbulos blancos; amarillo, una secuencia sin determinar en el cromosoma 5.
Este mtodo puede usarse con propsitos diagnsticos usando cidos nucleicos
virales, genes alterados u oncogenes.
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8.GLOSARIO:
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EXON: porcin de un gen intercalada entre intrones que codifica secuencias del RNAm
maduro.
EXTREMOS COHESIVOS: extremos de las molculas de DNA de doble cadena
constituidos por cadenas nicas complementarias y que por ello pueden aparearse y producir
molculas circulares.
GEN: secuencia en el DNA que codifica un producto determinado, RNA o protenas.
GEN ESTRUCTURAL: gen que codifica la estructura primaria de un polipptido o la
secuencia de bases de un RNA.
GEN REGULADOR: gen cuyo producto regula la expresin de otros genes.
GENOMA: conjunto de genes de un organismo.
HIBRIDACION: procedimiento por el cual dos muestras de DNA desnaturalizadas de
distinto origen y una de ellas radioactiva, son re naturalizadas para formar molculas hbridas
con cadenas de ambos orgenes.
INTRON: segmento de un gen intercalado entre exones que no participa en la codificacin de
secuencias de RNA maduro.
LINKER: segmento corto de DNA de doble cadena portador de la secuencia de
reconocimiento de una nucleasa de restriccin.
NTP: nuclesido trifosfato.
OPERON: unidad gentica que especifica uno o varios polipptidos. Consta de un operador
que regula la transcripcin del opern, de un promotor donde se inicia la transcripcin del
gen o los genes estructurales que codifican al polipptido o los polipptidos, y de un
terminador donde concluye la transcripcin.
PALINDROME: parte de la cadena de DNA que presenta auto homologa por la presencia de
dos secuencias repetidas e invertidas.
POLI A: secuencia de poliadenilato en el extremo 3' de los RNAm eucariontes.
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9.Bibliografa:
Http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/biotec/contenidos5.htm
Http://es.wikipedia.org/wiki/ADN_recombinante
Http://aportes.educ.ar/biologa/nucleo-teorico/influencia-de-las-tic/tecnologa-deladn-recombinante/como_amplificar_el_adn_reaccio.php
http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tem11MI.html
www.educa.aragob.es/iescarin/depart/biogeo/varios/BiologiaCurtis/Seccion%203/3
%20-%20Capitulo%2016.htm
www.personales.ulpgc.es/ecastro.dbbf/Descargas/Transparencias/DNA%20recombi
nante.pdf
http://www.arrakis.es/~ibrabida/vigcorte.html
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