LABORATORIO N1

ESPECTROFOTOMETRA: CUANTIFICACIN

1. Aspectos tericos de espectrofotometra cuantitativa

La absorcin de luz por parte de una sustancia es una propiedad caracterstica de ella,
que puede ser utilizada para su identificacin y cuantificacin.
Todas las sustancias absorben luz en alguna regin del espectro electromagntico
(VIS, UV, IR, etc.).
La absorcin de luz depende de la estructura qumica del compuesto absorbente, y en
especial de ciertos grupos funcionales, de modo que es posible identificar un
compuesto por medio de las caractersticas de su espectro de absorcin.

NAD+

NADH

260
Figura 1.

300

340

nm

Espectros de absorcin del NAD+ y del NADH.

Ley de Lambert-Beer
Lambert y Beer demostraron que la absorbancia (A), tambin llamada densidad ptica
(D.O.) de una sustancia es directamente proporcional a la concentracin (c) de la
sustancia absorbente, la longitud del paso de luz (l) (espesor de la solucin) y una
constante denominada coeficiente de extincin o coeficiente de absorcin (a), que es
caracterstico para cada sustancia a una longitud de onda () determinada.

A = al c
Ecuacin 1.1
Para medir la absorbancia de una sustancia se utiliza el espectrofotmetro, instrumento
destinado a medir la absorcin por especies inorgnicas y orgnicas de luz
monocromtica en la regin ultravioleta / visible del espectro.
1

Los espectrofotmetros dan la lectura directa de la absorbancia (A) o bien, el porcentaje

de transmitancia (%T). La relacin entre ambos es:
A = 2 - log % T

Ecuacin 1.2

Anlisis espectrofotomtrico:
Todo mtodo espectrofotomtrico se basa en la comparacin de la absorbancia de una
sustancia de concentracin desconocida con la de una solucin de la misma sustancia
cuya concentracin se conoce y a la cual se denomina solucin patrn o estndar.
La absorbancia de una solucin es la resultante de la absorbancia del soluto cuya
concentracin se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes,
reactivos) que absorben tambin a esa longitud de onda. Estos compuestos se
denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para
ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todas los componentes del
sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la
absorbancia de ste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien,
con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de
transmisin.
Curva de Calibrado :
Se obtiene la curva de calibrado midiendo la absorbancia de una serie de soluciones de
concentraciones conocidas de una misma sustancia tratadas con un mismo mtodo y
medidas a igual longitud de onda en el mismo instrumento. Para medir la concentracin
de una sustancia se elige por lo general, la regin de mxima absorcin del espectro,
denominada longitud de onda analtica.
El resultado se expresa en una grfica de la absorbancia (A) en funcin de la
concentracin (c). Si el sistema sigue la ley de Lambert-Beer se obtiene una lnea recta
que pasa cerca del origen; de cuya pendiente se puede obtener el coeficiente de
extincin (a) (Ecuacin 1.3).
Es posible determinar grficamente la concentracin de una muestra desconocida (cx)
midiendo la absorbancia de la muestra (Ax) e interpolando en la curva de calibrado.
Normalmente la concentracin se estima, a partir de la ecuacin de la curva de
calibrado.

A = al c + Ao

Ecuacin 1.3

Donde, A es la variable dependiente (y), la pendiente es igual a (a l), c es la variable

controlada (x) y Ao es el intercepto.
Las unidades del coeficiente de extincin dependen de las unidades de concentracin y
de longitud del paso de luz. Generalmente la unidad de longitud es el centmetro y la
longitud del paso de luz es 1,0 cm. Si las unidades de concentracin son moles L -1 o
2

milimoles L-1, se hace referencia al coeficiente de extincin molar ( o milimolar,

respectivamente (Ecuacin 1.4). Si la concentracin est expresada en g/100 mL (%
peso / volumen) se obtiene el coeficiente de extincin especfico (E1%).

A =

+ Ao

Ecuacin 1.4

Cuando la concentracin de la sustancia y la longitud del paso de la luz se hacen

iguales a la unidad, la absorbancia corresponde al coeficiente de extincin. Si se
midiera la absorbancia de una solucin 1,0 M de una sustancia colocada en una celda
de 1,0 cm se obtendra el coeficiente de extincin molar (). Si la concentracin fuera
1,0 g/100 mL se obtendra el coeficiente de extincin especfico (E1%). Estos
coeficientes son una propiedad especfica de las partculas absorbentes y su valor es
referido a un determinado solvente y a una determinada longitud de onda.
Cuando se conoce por bibliografa el coeficiente de extincin de un compuesto (E1%),
o ste es estimado experimentalmente, midiendo la absorbancia (AX) de una muestra
del compuesto de concentracin desconocida (c X) se puede calcular su concentracin
(ecuacin 1.5).
A Ao
Ecuacin 1.5
cx X

En esta forma se obtiene la concentracin (cf) de la muestra problema en la cubeta,

para obtener la concentracin original (ci) se debe considerar las diluciones
correspondientes al ensayo usado para cuantificar (Ecuacin 1,6).

vi * ci

Ecuacin 1.6

vf * cf

Frmula del Estndar.

La concentracin desconocida puede determinarse sobre la base de un slo estndar,
de acuerdo a la siguiente ecuacin:

vi
vi

A
C
MP
S
mp


vf mp
vf

A c
S

Ecuacin 1.7
s

As y Amp son las absorbancias del estndar y muestra problema, respectivamente.

vi corresponde al volumen de la solucin estndar o de la muestra problema ocupado
en el ensayo para cuantificar.
vf corresponde al volumen final del ensayo ocupado para cuantificar.
cs y cmp corresponden a las concentraciones de las soluciones estndar y muestra
problema respectivamente. Ambas concentraciones se refieren a las originales sin la
dilucin propia del ensayo ocupado para cuantificar.

Unidades.
Absorbancia (A): Adimensional (sin unidades)
Longitud (l):
cm
Concentracin (c):

molar,

milimolar,

g/100 mL
Coeficiente de extincin (a)

molar ()

M-1 cm-1
L moles-1 cm-1
mL milimoles-1 cm-1

milimolar ()

mM -1 cm-1

L mmoles-1 cm-1

mL moles-1 cm-1

Especfico (E1%)
dL g-1 cm -1
(g/100mL) 1 cm-1
Cuantificacin de protenas de solucin:
En general, no hay un mtodo completamente satisfactorio para medir la concentracin
de protenas en una muestra. La eleccin del mtodo depende de la naturaleza de la
protena, de los otros componentes de la muestra problema, de la rapidez y sensibilidad
deseada. En este trabajo prctico se vern dos de los mtodos que se usan
corrientemente para medir concentraciones de protenas, Biuret y Lowry.
Mtodo Biuret
Los compuestos que tienen dos o ms uniones peptdicas (pptidos y protenas) dan
color prpura caracterstico cuando se tratan con una solucin alcalina de sulfato de
cobre diluida. El color se debe aparentemente al complejo de coordinacin del Cu con
cuatro tomos de nitrgeno, que participan en el enlace peptdico. Este mtodo es
reproducible, pero requiere una alta concentracin de protenas para la formacin de
color. La sensibilidad del mtodo es de 0,25 200 mg de protenas por mL de solucin.
Mtodo de Lowry
Los aminocidos pueden dar reacciones caractersticas con ciertos reactivos de
acuerdo a la naturaleza de sus cadenas laterales. Muchas reacciones de este tipo se
caracterizan por la formacin de productos coloreados. La tirosina por ejemplo, debido
a su grupo hidroxifenilo, reacciona con una solucin de cido fosfomolbdico tungstico
en un medio cprico alcalino, produciendo una coloracin azul, la cual absorbe a
650 nm.
4

Este mtodo llamado originalmente Foln Ciocalteau debido a sus estudios iniciales
ha sido desarrollado y transformado, por Lowry y colaboradores, en un procedimiento
muy sensible que ha sido ampliamente usado para la determinacin cuantitativa de
protenas en una muestra.
En el mtodo de Lowry la muestra se trata con el reactivo de Folin Ciocalteau
modificado. Si hay protenas presentes se produce una coloracin azul debido
principalmente a la presencia de residuos de tirosina y triptofano en las protenas.
Se mide la absorbancia a 650 nm y se compara con las medidas obtenidas de
soluciones de protenas de concentracin conocida (patrn), tratadas de forma idntica.
Sin embargo, debido a las diferencias en el contenido aminoacdico de una protena a
otra, cantidades iguales de protenas distintas, producen coloracin diferente con el
reactivo de Lowry, motivo por el cual no es posible obtener la concentracin real de
una muestra de protena por este mtodo, an as, cuando se requiere una estimacin
relativa de la concentracin de protenas, este mtodo es ampliamente satisfactorio,
debido a su alta sensibilidad. Sensibilidad 1 200 g de protenas por ensayo.
2. Objetivos.
Cuantificar protenas ocupando tcnicas espectroscpicas como el mtodo de Lowry y
el mtodo de Biuret.
3. Parte experimental
3.1
Equipos y materiales

espectrofotmetro (visible)
celdas para espectrofotmetro
1 bao termostatizado
1 termmetro.
16 tubos de ensayo
2 gradillas
2 pipetas graduadas de 5 ml
2 pipetas graduadas de 1 ml
1 pizeta.
1 vaso precipitado de 250 ml
1 vaso precipitado de 100 ml

3.2 Reactivos.

Reactivo de Biuret:
Solucin estndar de ovoalbmina al 5% en NaCl 9%.
Reactivo de cobre alcalino (RCA).
Reactivo Folin (RF)
Ovoalbmina
Albmina de suero de bovino (BSA).
5

4. Procedimiento.
4.1. Mtodo de Biuret.
De acuerdo a la tabla 1.1:
Prepare una batera de tubos enumerados.
Agregue el volumen indicado de la solucin de ovoalbmina estndar o muestra
problema con una pipeta graduada de 1 mL.
Agregue el volumen indicado de agua con una pipeta graduada de 1 mL.
Agregue 4,0 mL del reactivo de Biuret con una pipeta graduada de 5 mL.
TABLA 1.1

TUBO

1B
2S
3S
4S
5S
6S
7 MP
8 MP
9 MP

Ovoalbmina
(mL)
5%
MP

0,0
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
---

-----

------------1,0 MP1
1,0 MP2
1,0 MP3

H2O
(mL)

1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
0,0
0,0
0,0

R.
BIURET

(mL)
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0

Absorbancia Concentracin
%

Agite y espere 20 minutos a temperatura ambiente para la formacin del complejo

coloreado.
Mida la absorbancia de los tubos en un espectrofotmetro a 540 nm, previa
calibracin del equipo con el blanco.
De acuerdo a los datos:
Calcule la concentracin de la ovoalbmina en los tubos (2S 6S)
Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentracin.
Obtenga la ecuacin de la recta y el coeficiente de regresin por regresin lineal.
Construya una grfica absorbancia versus concentracin, trace la recta obtenida por
regresin.
Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las cubetas mediante la
ecuacin 1.5.
Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones originales
considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuacin1.6). Recuerde que cx
(Ecuacin 1.5) corresponde a cf (Ecuacin 1.6).

4.2. Mtodo de Lowry.

De acuerdo a la tabla 1.2:
Prepare una batera de tubos enumerados.
Agregue los volmenes indicados de la solucin de seroalbmina de bovino (BSA)
estndar o muestra problema con una pipeta graduada de 1 mL.
Agregue los volmenes indicados de agua con una pipeta graduada de 1 mL.
Agregue 1,0 mL del reactivo alcalino (RCA) con una pipeta de 1 mL. Espere 10
minutos exactos
Despus de los 10 minutos, agregue 4,0 mL del reactivo de Folin con una pipeta de
5 mL y mezcle.
Caliente los tubos por 5 minutos exactos a 55C en el bao termostatizado.
Enfre y lea en el espectrofotmetro a 650 nm, previa calibracin con el blanco.
TABLA 1.2

TUBO
1B
2S
3S
4S
5S
6S
7MP
8MP
9MP

BSA
(mL)
0,4 mg/mL
MP
-----0,1
--0.2
--0,3
--0,4
--0,5
--0,5 MP1
--0,5 MP2
--0,5 MP3
---

R.F.
H2O
(mL)
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,5
0,5
0,5

R.C.A.
(mL)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

(mL)
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0

Conc.
%

De acuerdo a los datos:

Calcule la concentracin de BSA en los tubos (2S 6S).
Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentracin.
Obtenga la ecuacin de la recta por regresin lineal y el coeficiente de regresin.
Construya una grfica absorbancia versus concentracin, trace la recta obtenida por
regresin.
Calcule las concentraciones de las muestras problemas en la cubeta mediante la
ecuacin 1.5.
Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones originales
considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuacin 1.6).
5. Bibliografa
Bohinski Robert, 1991, Bioqumica , 5 Edicin, Addison-Wesley, Iberoamericana.
D Skoog, D. West y F. Holler, 1995, Qumica Analtica, 6 Edicin.
D.Bozimowsk, J.D. Artiss and B. Zak, 1983, Spectrophotometric comparison of
several reactions used for cerebrospinal fluid protein determinations. Microchemical
Journal 23, 285-293.
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