Diversidad de hongos endfitos comunidad del cacao

(Theobroma cacao L.) y el control biolgico de Crinipellis perniciosa, agente causal

de la enfermedad de la Escoba de Bruja.
Resumen El hongo basidiomiceto Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer es el agente
causal de laLa enfermedad de la escoba de bruja del cacao (Theobroma cacao L.), que
es el principal factor limitar la produccin de cacao en las Amricas. Pod prdidas de
hasta el 90% son experimentados en las zonas afectadas como lo demuestra la cada del
50% en la produccin en la provincia de Baha, Brasil tras la llegada de la C. perniciosa
en la zona en 1989. La enfermedad tiene demostrado particularmente difcil de controlar
y muchos agricultores de las zonas afectadas han dado hasta el cultivo de cacao. Con el
fin de evaluar el potencial de endofitos como un biolgica agente de control de este
fitopatgeno, la comunidad de hongos endfitos de resistencia
y plantas de cacao susceptibles, as como ramas afectadas se estudi entre 2001 y 2002.
La comunidad fngica fue identificado por los rasgos morfolgicos y ADNr
secuenciacin como pertenecientes a los gneros Acremonium, Blastomyces,
Botryosphaeria,Cladosporium, Colletotrichum, Cordyceps, Diaporthe, Fusarium,
Geotrichum, Gibberella, Gliocladium, Lasiodiplodia, Monilochoetes, Nectria,
Pestalotiopsis, Phomopsis, Pleurotus, Pseudofusarium, Rhizopycnis, Syncephalastrum,
Trichoderma, Verticillium y Xylaria. Estos hongos se evaluaron tanto in vitro como en
vivo por su capacidad para inhibir C. perniciosa. Entre estos, algunos fueron
identificados como antagonistas potenciales, pero slo un hongo (Gliocladium
catenulatum) redujeron el
incidencia de la enfermedad de la Escoba de Bruja en plntulas de cacao al 70%.
Palabras clave endfitos, antibiosis, resistencia de las plantas, la biodiversidad, el
anlisis de ADN recombinante
Investigacin
intereses incluyen investigacin de la ecologa y la bioqumica de los hongos
antagnicos, epfita y especies endofticas, y la gestin de los orgnicos manzana
huertos, Los viedos, hortalizas y plantas ornamentales.
Alan WV Pomella (PhD Universidad de Viosa, 1999) es un director de investigacin
en Almirante Cacau, una empresa de Masterfoods Inc. EE.UU.. Sus intereses de
investigacin incluyen investigacin de las enfermedades de las plantas de cacao se
centra en el control biolgico de Witches'Broom y
Pod Negro.
... Contina al final del papel. Correspondiente direccin
Dr. L. Welington Arajo, Departamento de Gentica, Escuela Superior de Agricultura
"Luiz de Queiroz ", Universidad de So Paulo, PO Box 83, 13400-970 Piracicaba, So
Paulo, Brasil. Wlaraujo@esalq.usp.br E-mail; Tel. (55-19) 34294251; Fax (55-19)
34336706 Int. J. Biol. Sci. 2005 1: 24-33 25
1.Introduccin
El basidiomycete Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, es el agente causal de la Escoba
de Bruja Enfermedades del cacao (Theobroma cacao L.). Escoba de Bruja es uno de los
principales factores limitantes para el la produccin de cacao en Amrica del Sur y las

islas del Caribe, y ha sido considerado como uno de los ms patgeno importante para
el cultivo [10]. El proceso de infeccin se produce despus de la germinacin y
basidiospora penetracin del tubo germinal en los tejidos meristemticos y vainas [14],
a partir de la etapa de biotrfico colonizacin [13]. Esta fase se caracteriza por el
crecimiento intercelular, grueso y hifas monokaryoticas sin conexiones abrazadera [7,
19]. En la siguiente fase, la fase de saprofitas, necrosis e intracelular la colonizacin por
hifas dicaritico ocurre [13]. Este hongo coloniza los tejidos meristemticos reduciendo
la productividad, as como la vida de la planta husped. Como este hongo coloniza
creciente tejidos de las plantas, las la aplicacin de fungicidas es una organizacin sin
un tratamiento efectivo, siendo el control biolgico una alternativa potencial estrategia.
Los hongos endfitos colonizan sus anfitriones sin causar sntomas externos de la
enfermedad , salvo Cuando el husped es bajo condiciones de estrs. Los estudios sobre
los microorganismos de las especies de plantas tropicales son
recientemente cada vez ms frecuentes, ya que estos hongos y bacterias han sido
estudiados para biolgica el control y la produccin de compuestos con propiedades
farmacolgicas . Los estudios sobre el cacao comunidad endfitos son recientes, pero
los aspectos prcticos ya se han evaluado . Sin embargo, ms estudios sobre la
enfermedad de la Escoba de Bruja y la interaccin de la comunidad endoftico deben
llevarse a cabo desde la comprensin de la fisiologa y ecologa de la enfermedad es
crucial para la elaboracin de mejores estrategias de control para el patgeno.
En el presente estudio se aislaron hongos endfitos de los tallos de las diferentes plantas
de cacao a ms identificar posibles agentes de control biolgico para la enfermedad
escoba de bruja. La composicin y la poblacin
Tambin se estudi la frecuencia de la poblacin hongos endfitos.
Material y mtodos
El material biolgico La diversidad de hongos endfitos se estim en ramas de cacao
(Theobroma cacao) de al tres categoras de rboles de cacao (plantas susceptibles y
resistentes, sanos sintomticos). Por estadstica propsitos, estas tres categoras de
plantas (resistentes, sanos y sintomticos) fueron considerados como tratamientos en el
presente estudio. Las plantas de huertos ubicados en ms cercana a Itabuna, Estado de
Baha, Brasil fueron muestreados. Para cada tratamiento / ubicacin, se recogieron
ramas de 5 plantas (repeticiones) durante 2001 y 2002. Las cepas VV1 y VV2 de C.
perniciosa que pertenece al Almirante Cacau Granja coleccin tambin se utilizaron.
Desinfeccin de superficies y Endfitos Aislamiento
Todas las ramas se lavaron en agua corriente del grifo y clasificados por tamao y
apariencia de la superficie y de cualquier
visiblemente material daado excluido. Los tejidos de la planta se enjuagaron con etanol
al 70%, superficie desinfectada con una solucin de hipoclorito de sodio (3% disponible
Cl-) durante 3 minutos, se enjuagaron una vez en 70% de etanol y dos veces en agua
destilada estril. El proceso de desinfeccin se comprob pulsando la planta
desinfectado material sobre la Papa Dextrosa Agar (PDA). Las alcuotas de agua de
soluciones finales de enjuague tambin fueron chapada en el mismo medio. Las ramas
de superficie desinfectada se utilizaron en los aislamientos fngicos como descrito
abajo.

Los hongos endfitos fueron aislados de rboles de cacao por categoras (resistentes,
sanos y susceptibles plantas enfermas). Una muestra aleatoria de cada rbol, que consta
de 30 sucursales fue tomada. Despus de superficie
desinfeccin, cada rama fue entonces pelada y cortada en 10 fragmentos (3-4 mm), que
se colocaron en PDA tetraciclina que contiene (50 g / ml). Despus de 3 a 15 das de
incubacin a 28 C el nmero de piezas
que muestra el crecimiento de hongos fue contado. La punta de las hifas de cada micelio
morfolgicamente diferente que surgido a partir de un fragmento de rama fue sub culta
y trasladado a PDA inclina para su posterior identificacin. La incidencia endfito (EI)
se calcul como el porcentaje de piezas que muestran el crecimiento de hongos.
Despus de la incubacin, se seleccionaron aislados fngicos recuperados de cada
fragmento planta al azar,
purificada y se agrupan en funcin de las caractersticas fenotpicas, por ejemplo,
morfologa de la colonia, colonia color y tasa de crecimiento. Los aislamientos que
representa cada grupo de hongos de inters fueron seleccionados para su posterior
identificacin de rasgos morfolgicos (taxonoma clsica) y / o secuenciacin del
rDNA.
2.3. Caracterizacin de microorganismos endfitos
ADN fue extrado por hongos [16] y el ADNr y su regin fueron amplificados en una
final de 50 l volumen que contiene 1 l (0,5 a 10,0 ng) de ADN total, 0,2 M de cebadores
ITS1 (5'- TCCGATGGTGAACCTGCGG-3 ') y ITS2 (5'-TCCTCGTTATTGATATGC3'), 200 mM de cada dNTP, 3,75 mM de MgCl2 y 0,05 U de Taq ADN polimerasa
(Invitrogen) en 20 mM de Tris pH 8,4 HCl que contiene 50 mM KCl. Un control
negativo (mezcla de PCR sin ADN) fue incluido en todos PCR Int. J. Biol. Sci. 2005 1:
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26 experimentos. Las condiciones de reaccin fueron las siguientes: 94 C durante 4
minutos seguido por 25 ciclos de desnaturalizacin a 94 C durante 30 s, hibridacin a
57oC durante 1 min y extensin del cebador a 72oC durante 1 min; seguido de una
extensin final a 72oC durante 7 min. Los productos de reaccin se separaron mediante
la ejecucin de 5 l de la mezcla de reaccin PCR en 1,2% (w / v) en gel de agarosa y
tincin de las bandas con bromuro de etidio [18]. Para la identificacin, los productos de
PCR de al menos 20% de los aislados se purificaron usando una PCR GFX
ADN y el kit de purificacin de gel de banda (Amersham Biosciences) y se
secuenciaron usando el cebador ITS1. Los anlisis de secuencias se realizaron con el
programa bsico de alineacin de secuencias BLAST plazo contra
la base de datos (National Center for Biotechnology Information pgina web
[http://www.ncbi.nlm.nih.gov]) y la secuencia determinada fueron alineados utilizando
Clustal X y las matrices de distancia y filogentico Se calcularon los rboles [11] y
vecino a participar en [17] algoritmos, respectivamente, utilizando el software PAUP
[21]. Las secuencias de nucletidos obtenidos en este estudio se han presentado al
GenBank y asignado nmeros de acceso AY745985 a AY746007, AY753281 a
AY753285 y AY753987 a AY754010 G2.4. Las plantas de cultivo e inoculacin
endfito
Para obtener plntulas-endfitos libre de T. cacao, semillas de sano, fruta madura

sufragados en
Se recogieron Broom plantas susceptibles brujas, superficie desinfectada durante 15
minutos en una solucin acuosa
solucin de hipoclorito de sodio y germinadas en medio MS [12]. Las plantas de
semillero se mantuvieron en
condiciones controladas (25 C y fotoperiodo de 12 horas). Cuarenta das despus de la
germinacin, las plntulas fueron
evaluados para confirmar que las hojas y tallos fueron-endfito libre. El inculo que
contiene propgulos
de endfitos se introdujeron en plantas de semillero tallos con una aguja estril.
Para la germinacin de efecto invernadero, semillas de semillas de cacao susceptibles
fueron plantados en macetas que contenan
suelo oscuro y se mantuvieron en invernadero. Sesenta das despus de la germinacin
de las semillas, las plntulas fueron
inoculado con las suspensiones que contienen los propgulos de hongos endfitos.
2.5. Seleccin de los endfitos antagonista de hongos a C. perniciosa
La seleccin in vitro de antagonistas contra C. perniciosa se llev a cabo en medio
PDA. Para
esto, discos miceliales (5 mm) de C. perniciosa se inocularon en placas de Petri (100
mm) que contiene PDA
medio y se incubaron a 28 C (fotoperodo de 12 horas). Despus de 8 das, los
microorganismos endfitos
se inocularon 50 mm de C. colonia perniciosa. El antagonismo se detect mediante la
formacin de una
halo de inhibicin.
Para el cribado planta para los antagonistas perniciosa C., 3 das despus de la
inoculacin de hongos endfitos,
basidiosporas de C. perniciosa se introdujeron en tallo de las plantas de semillero con
una aguja estril. Control
plantas fueron inoculadas solo con tampn PBS ((g / l) NaCl, 8; KCl, 0,2; Na2HPO4,
1,4; KH2PO4, 0,24). La
sntomas se evaluaron de 10 a 60 das, y los datos se analizaron estadsticamente por el
Ida
Mtodo de la varianza y el mltiple de Tukey-Kramer Comparacin prueba compar los
medios.
3. Resultados
3.1. Aislamiento de hongos endfitos La diversidad de hongos endfitos se evalu en
las ramas de las 3 categoras (resistente y saludable
susceptible y sintomtico) de plantas de cacao. Para evitar la contaminacin y para
aislar hongos endfitos
Slo a partir de tejidos de plantas interiores, las ramas se desprendieron despus de la
desinfeccin de superficies. El endoftico
comunidad fngica que se aisl de las ramas de cacao incluido Acremonium sp.,
Blastomyces sp.,

Botryosphaeria sp., Cladosporium sp., Gloeosporiodes Colletotrichum, Cordyceps

sobolifera,
Diaporthe phaseolorum, D. helianthi, Fusarium sp., F. chlamydosporum, F. oxysporum,
F.
polyphialidicum, Geotrichum sp., Gibberella zeae, G. fujikuroi, G. moniliformis,
Gliocladium sp., G.
catenulatum, Lasiodiplodia theobromae, Monilochoetes sp., haematococca Nectria,
Pestalotiopsis
microspora, Phomopsis sp., Pleurotus ostreatus, purpureum Pseudofusarium,
Rhizopycnis vagum,
Syncephalastrum sp., Trichoderma sp., Verticillium sp., V. luteo-lbum, Xylaria sp. El
nmero de
hongos endfitos cultivables que se recuperaron utilizando medio PDA no fue
significativamente diferente
dentro de las tres categoras de la planta (sana, resistente y sintomtico) evaluaron. La
frecuencia de
aislamiento hongos fue 0,42, 0,34 y 0,50 para las plantas sanas, resistentes y
sintomticas, respectivamente.
3.2. Caracterizacin de hongos endfitos de las ramas de cacao
Un total de 150 hongos endfitos aislados de tallos de cacao fueron recogidos al azar, y
esto
poblacin fue parcialmente caracteriza por ADNr (18S parciales, SUS-1, 5.8S, ITS-2 y
parciales 23S)
secuenciacin. Los resultados (Tabla 1) mostraron que la hongos endfitos cultivable
asociada con cacao
cultivares pertenecen principalmente al grupo de Ascomycetes (Figuras 1, 2, 3 y 4)
siendo el Botryosphaeriaceae,
Valsaceae y Nectriaceae familias las ms frecuentes. El hongo Fusarium spp. fue la
dominante
gnero y mostr la diversidad ms alta (Figura 1). No existe correlacin entre los grupos
de hongos y plantas
se observ categoras.
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Secuencias parciales de rDNA fueron alineadas y las relaciones entre los aislados
endofticos fueron
evaluado por el algoritmo vecino a participar (Figuras 1, 2, 3 y 4). Con esta estrategia,
algunos aislados,
como CM27, CM34, CM36, CM42, CM44, CM46, CM50, CM53, CM58 y CM64
(figura 3) y
CM26, CM40, CM65 (figura 4) no pudo ser identificado.
3.3. Proyeccin de hongos endfitos in vitro frente a C. perniciosa.
Un total de 265 hongos endfitos se evaluaron in vitro frente a C. perniciosa. Cuarenta y
tres aislamientos

(16,22%) fueron capaces de inhibir el crecimiento del agente causal de la enfermedad de

la escoba de brujas de cacao. En
general, la frecuencia de hongos endfitos capaz de inhibir C. perniciosa disminuy de
saludable
(18,96%)> (16,06%)> sintomticos (14,28%) plantas resistentes.
3.4. Proyeccin de hongos endfitos capaz de reducir los sntomas de la escoba de bruja
Plntulas de cacao axnicos fueron inoculadas con hongos endfitos y adems con C.
perniciosa
basidiosporas. Catorce aislamientos fueron capaces de inhibir completamente el
desarrollo de la escoba de bruja
sntomas en las plantas evaluadas. Sin embargo, en condiciones de invernadero, slo
aislado identificado como
Gliocladium catenulatum fue capaz de reducir en 70,84% los sntomas de la enfermedad
de la Escoba de Bruja.
4. Discusin
El hbitat asociada a planta es un entorno dinmico en el que muchos factores afectan a
la estructura y composicin de especies de las comunidades microbianas que colonizan
las races, tallos, ramas y hojas.
Previamente se ha demostrado que las comunidades endfitos varan espacialmente en
la planta de [9] o puede ser
depende de la interaccin con otros microorganismos endfitos o patgenos
[1, 2].
Estos microorganismos endfitos son ubicuos y pueden aumentar la aptitud planta al
mejorar la tolerancia a la metales pesados y la sequa, lo que reduce la herbivora o
fitopatgeno sedimentacin [5] y la promocin de la planta
crecimiento [22].
A pesar de que sigue siendo difcil comparar estudios anteriores y ms recientes que los
aislados hongos endfitos, algunas tendencias son evidentes con los tipos de hongos
predominantes aislados como endfitos. El
gnero Fusarium parece ser muy ubicuo y ha sido aislado de muchas plantas anfitrionas.
En el presente estudio, este gnero se aisl en alta frecuencia, mientras que algunos
gnero, tales como Acremonium, Cordiceps,
Pseudofusarium, Syncephalastrum y Trichoderma se produjeron en frecuencias muy
bajas en todo el
estudio. Sin embargo, no se observ correlacin entre las categoras de plantas y
especies de hongos endfitos
recuperado de ramas de cacao. Algunas cepas endofticas no se identificaron
consistentemente por ADNr
de secuenciacin (Figuras 3 y 4) y los rasgos morfolgicos, lo que sugiere que estos
podran pertenecer a las especies no
pero descritas. De hecho, ha sido sugieren que las plantas de la selva tropical podra ser
habitada por una
gran diversidad de microorganismos endfitos, que presentan una notable actividad
biolgica [20] y un

fuente de nuevas especies. Ms estudios en enfoque taxonmico se debe hacer para

aclarar la identificacin
de estos aislados. Adems, estos microorganismos podran ser una fuente de nuevas
estructuras moleculares y
compuestos biolgicamente activos.
Como puede observarse, el Fusarium gnero que se describe como endfito y / o
fitopatgeno en
Muchas especies de plantas fue el grupo dominante, lo que sugiere que estos hongos
podran desempear un papel en la planta
desarrollo. En el pepino, no patgeno F. oxysporum puede inducir resistencia del
husped contra Pythium
ultimum a travs de una combinacin de antibiosis y micoparasitismo, as como la
induccin de defensa de la planta
reacciones [6]. Sin embargo, en el presente anlisis, los aislados de Fusarium no fueron
capaces de inhibir de manera eficiente
sntomas de las Brujas 'Broom, tanto en condiciones in vitro y en invernadero.
Basado en el informe anterior de que los hongos endfitos son capaces de proteger
contra el cacao fitopatgenos
[3], se evalu in vitro y en la interaccin planta entre hongos endfitos aislados de cacao
y C.
perniciosa. Este hongo es el agente causal de la enfermedad de la escoba de bruja del
cacao (Theobroma cacao L.)
que es uno de los principales factores limitantes para la produccin de cacao en Amrica
del Sur y el Caribe
islas, y ha sido considerado como uno de los patgenos ms importantes para el cultivo
[10]. La infeccin
proceso se produce despus de la germinacin basidiospora y penetracin del tubo
germinal en los tejidos meristemticos
y vainas [14], siendo esta etapa un punto importante para inhibir la infeccin, ya que la
viabilidad de la
esporas en los tejidos de la planta se reduce. Aunque una gran proporcin de los
endfitos (16,22%) inhiben la
C. perniciosa en los ensayos por parejas en medio PDA, en condiciones de planta, la
proporcin se redujo,
mostrando que la evaluacin por pares slo tienes que seleccionar los microorganismos
capaces de producir biolgicamente activa
compuestos, pero no para seleccionar los microorganismos que se utilizan en
condiciones Planta. Adems, varios endoftico
aislamientos fueron capaces de inhibir completamente los sntomas escoba de bruja en
condiciones axnicas, pero slo G.
catenulatum reduce los sntomas en invernadero. Estos resultados muestran que este
aislamiento es la promesa de ser
utilizado como agente de control biolgico contra C. perniciosa en condiciones de
campo. Endfito mediada

la proteccin es mayor en las hojas maduras, que llevan la defensa menos intrnseca
contra hongos patgenos que
hacer hojas jvenes [3]. Adems, los autores sugieren que la afinidad de acogida est
mediado por qumica de la hoja, y
la proteccin puede estar mediada por interacciones directas de endfitos con patgenos
foliares. Por lo tanto,
teniendo en cuenta que en el presente trabajo la frecuencia de aislamientos endofticos,
capaz de controlar C.
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perniciosa, disminuido como seguimiento in vitro> planta axnico> plantas de
invernadero, podemos sugerir que esta baja
frecuencia en las plantas de invernadero se debe a la competencia entre los endfitos
objetivo e indgenas
comunidad asociado a las plntulas de acogida. Adems, si el endfito inoculado no es
capaz de establecer
dentro de la planta de cacao el control no ser posible.
Interacciones mutualistas entre simbiontes de acogida y verticalmente heredados como
endfitos son
fcilmente reconciliada con la teora existente de las interacciones entre especies [3].
Sin embargo, estas interacciones dependen
una relacin web complejo dentro de los tejidos vegetales, incluyendo diferentes
especies de hongos y bacterias, as como
genotipo de la planta. Entender qu especies microbianas estn involucrados, cmo y
cundo se producen y
cules son las ventajas de estas interacciones de la planta, es posible utilizar este
mtodo para contrpolar varios
enfermedades de las plantas en el cacao. Hoy en da, un programa de proteccin
mejorada implica la disponibilidad de altamente
biofungicidas eficientes, por lo tanto, debido a sus propiedades biolgicas notables, el
aislado de G. catenulatum
ofrece muy buenas perspectivas para el manejo integrado de la enfermedad de la Escoba
de Bruja. As que, ms estudios
debe ser el foco en el anlisis y desarrollo de una estrategia eficaz para el control de C.
perniciosa in planta
en base a este hongos endfitos.