Publicado por Jorge Cabeza | Last updated Jul, 03 2013
Los transgnicos, conocidos tambin como OMG (Organismo Modificado Genticamente), son aquellos alimentos cuyos genes han sido manipulados artificialmente. Hasta ahora la mayora de las manipulaciones que se realizan tienen como objetivo conseguir vegetales resistentes a insectos y herbicidas. La modificacin gentica Bt dota a los vegetales de un gen bacteriano que les permite segregar una toxina que elimina cierto tipo de insectos. La tolerancia a los herbicidas permite a los productores emplear herbicidas muy potentes para eliminar las malas hierbas sin que los vegetales modificados genticamente sufran daos. Qu OMG se comercializan? En la Unin Europea slo se comercializan para su consumo humano ciertos tipos de maz y soja tratados genticamente, pero lo cierto es que estos componentes se encuentran presentes en ms del 60% de los alimentos transformados como por ejemplo la harina y el chocolate. Para evitar que los consumidores ingieran OMG sin saberlo las leyes exigen el etiquetado de modificado genticamente a todos aquellos alimentos en los que los transgnicos estn presentes en una concentracin mayor al 0,9%. El problema de este etiquetado radica en que una persona, sin saberlo, puede estar consumiendo por ejemplo un filete de ternera que ha sido alimentada con transgnicos pero que no est obligado a llevar ningn tipo de etiqueta por ello. Ventajas de los OMG Los productos modificados genticamente presentan una mejor calidad en sus semillas, y una gran tolerancia a sequas, inundaciones y cambios climticos. En la actualidad se encuentran en fase de desarrollo diversos productos para mejorar las propiedades de los alimentos y que resulten ms nutritivos o de mayor tamao y que tarden ms tiempo en degenerarse. Desventajas del uso de transgnicos Como consecuencia de la resistencia obtenida por los OMG, se utilizan herbicidas mucho ms potentes que conllevan a una mayor contaminacin del suelo con productos qumicos. Adems los herbicidas pueden filtrase del suelo a los acuferos y contaminar tambin las aguas subterrneas. Otro de los problemas que est surgiendo en relacin al uso de transgnicos es la aparicin de insectos y malas hierbas que van hacindose cada vez ms resistentes a los insecticidas y herbicidas. En la actualidad se est trabajando en la produccin de semillas modificadas genticamente para que sean estriles, es decir, que solo podran plantarse una vez y los agricultores se veran obligados a pagar cada ao una gran cantidad de dinero si quisiesen seguir sembrando estas semillas. Otro problema de los OMG es que estn comercializados por una pequea cantidad de empresas que tienen monopolizado el mercado mundial y en muchos casos la produccin de transgnicos es ms costosa que la de productos ecolgicos. De la misma forma el uso de estos productos conlleva tambin la prdida de biodiversidad y efectos en el medioambiente impredecibles. Riesgos para la salud Hasta la fecha no se ha realizado ningn estudio oficial acerca de los posibles daos que pueden ocasionar a los seres humanos el consumo de estos productos. Aunque existen diversos estudios de carcter independiente que pueden aportar algo de luz sobre este tema. Este tipo de estudios han relacionado los OMG con la aparicin de reacciones alrgicas, bacterias resistentes a antibiticos e incluso problemas de fertilidad y disminucin de la funcin renal y heptica. Alternativas al consumo de transgnicos Si se quiere estar seguro de que no se est consumiendo OMG lo mejor es apostar por los productos ecolgicos ya que tanto en la agricultura como en la ganadera est prohibido su uso. La asociacin ecologista Greenpeace posee tambin una lista actualizada peridicamente con aquellos alimentos que estn libres de OMG y aquellos que, aunque no lo refleje en su etiqueta, son sospechosos de llevarlos en su composicin. En la actualidad cada vez hay ms personas preocupadas por su alimentacin que exigen su derecho a estar informados de todos aquellos productos que ingieren. Hoy en da cada vez ms comestibles tienen su origen en un laboratorio y es muy necesario conocer de cerca los OMG y disponer de datos que puedan orientar a las personas hacia su consumo. Jorge Cabeza Tcnico en Energas Renovables, Qumico Ambiental, Tcnico en Medio Ambiente y apasionado de los videojuegos. Tambin me gusta leer sobre todo literatura fantstica e histrica. Espero poder aportar mi granito ... unirse a la discusin 22222222222222222 Riesgos de los cultivos transgnicos Share on facebook Share on twitter Share on email Share on print More Sharing Services 56 Octubre de 2005, por Transgnicos | Visitas: 47222 Sumario Efectos sobre la salud humana 1. Aumento de la toxicidad 2. Aumento de las alergias 3. Propagacin de resistencias a los (...) 4. Recombinacin de virus y bacterias 5. Aumento del nivel de residuos (...) El proceso de creacin de organismos manipulados genticamente (OMG) est rodeado de incertidumbres, que pueden dar lugar a multitud de efectos imprevistos [1]. La insercin de ADN extrao en una posicin no deseada dentro del genoma puede potenciar, silenciar o perturbar los procesos de produccin de protenas. El promotor insertado puede tambin activar a otros genes presentes en la planta, modificando su comportamiento. La presencia de la protena extraa puede alterar vas metablicas importantes para la planta. Puede ocurrir tambin, y ocurre con frecuencia, que se hayan insertado demasiadas copias de ADN extrao, o que se integren mltiples segmentos genticos con reordenaciones. O que el ADN extrao se haya contaminado durante la manipulacin en el laboratorio. Cualquiera de estos sucesos puede provocar perturbaciones importantes en la planta manipulada genticamente (MG) [2]. En 2000, se revel que la soja resistente al herbicida Roundup de Monsanto, cultivada en miles de hectreas en el mundo a partir de 1997 -el primer producto transgnico autorizado en Europa- contiene segmentos adicionales de ADN, insertados de forma accidental. El ADN de la soja ha sufrido reordenaciones que pueden dar lugar a cambios en las protenas producidas por las plantas, con efectos completamente imprevisibles [3]. Se ha demostrado, adems, que algunos de los fragmentos insertados se transcriben, sin que se conozca el producto ni como afecta ste a la planta [4]. En los estudios de caracterizacin independientes llevados a cabo se han detectado numerosas anomalas de este tipo en las variedades transgnicas analizadas [5]. Los trastornos originados por el proceso de manipulacin gentica en las plantas pueden manifestarse de inmediato, o al cabo de varias generaciones. Tambin pueden aparecer en determinadas condiciones ambientales o de estrs. Durante una ola de calor padecida en 1999 en EE UU, por ejemplo, la soja transgnica de Monsanto padeci una devastadora -y misteriosa- infeccin por un hongo, que provoc considerables daos en grandes superficies. Posteriormente se demostr que las plantas eran ms vulnerables al ataque del hongo debido a una produccin de lignina inusualmente alta, asociada a la manipulacin gentica del cultivo, que haca que con la ola de calor los tallos se agrietasen [6]. Este problema ocasion prdidas considerables a los agricultores del sur de EE UU. Tambin se ha observado que los tallos del maz Bt tienen un contenido de lignina ms elevado que el convencional, siendo rechazado en algunos casos por la ganadera [7]. Es relativamente frecuente tambin que las plantas MG inactiven (apaguen) los genes extraos, un mecanismo que parece activarse en situaciones de estrs ambiental o fisiolgico de las plantas [8]. En uno de los numerosos casos documentados, la infeccin de cultivos transgnicos resistentes a un herbicida por el virus del mosaico de la coliflor provoc el apagado de los genes extraos, haciendo que las plantas resultasen vulnerables al herbicida [9]. Se cree que la prdida de un 20% de la cosecha de algodn MG en EE UU en 1997 fue debida asimismo a la inactivacin del transgen de resistencia al herbicida, que provoc la cada de las cpsulas (las semillas de algodn) al ser fumigado el cultivo [10].
Efectos sobre la salud humana 1. Aumento de la toxicidad Las plantas tienen mecanismos naturales de defensa. Uno de estos mecanismos es la produccin de toxinas que las protegen de determinadas enfermedades y de los herbvoros. La manipulacin gentica puede inducir la produccin de dosis mayores de estas sustancias txicas, su presencia en el fruto o en partes de la planta donde antes no se producan, o la aparicin de compuestos totalmente nuevos dainos para la salud [11]. Tambin puede provocar otras alteraciones en la composicin de los alimentos, con efectos desconocidos para la salud humana. La transformacin de cultivos mediante ingeniera gentica puede, por ejemplo, potenciar la produccin de sustancias que son saludables cuando se consumen en pequeas cantidades, como algunas vitaminas y minerales, pero que pueden tener efectos txicos en dosis mayores a las habituales. En la soja resistente al Roundup, por ejemplo, se han detectado alteraciones del nivel de fitoestrgenos producidos por la planta, cuyo efecto se desconoce y que no se tuvieron en cuenta en la evaluacin de seguridad requerida en el proceso de autorizacin [12]. Tambin puede darse una prdida de las cualidades nutritivas de un alimento, al disminuir determinados compuestos o aparecer sustancias antinutrientes, que impiden su correcta asimilacin. En varios estudios de toxicidad se han detectado trastornos en los animales alimentados con OMGs. En ensayos realizados con ratas a las que se aliment con tomates transgnicos Flavr Savr -el primer tomate transgnico autorizado en EE UU-, varios animales presentaban principio de lcera en el revestimiento del estmago. El proceso de autorizacin de este tomate, sin embargo, sigui su curso sin que se verificara la causa de esta anomala, que la empresa Calgene -promotora del tomate- nunca lleg a explicar adecuadamente, segn un memorando interno del departamento de salud estadounidense en el que se cuestiona la validez de las conclusiones del estudio de riesgos presentado por dicha empresa [13]. En uno de los primeros ensayos independientes realizados con ratas alimentadas con patatas insecticidas Bt se observaron alteraciones significativas del revestimiento del intestino delgado al cabo de 14 das de dieta transgnica [14]. Otro estudio llevado a cabo en Escocia con patatas MG insecticidas (en este caso transformadas para la produccin de otra protena insecticida del grupo de las lectinas, presentes en muchos seres vivos) revel trastornos similares en el intestino de las ratas a los 10 das de dieta, observndose tambin problemas en el crecimiento de los animales y en el desarrollo de sus rganos vitales, as como trastornos inmunolgicos [15]. Otra investigacin realizada en Italia revelaba alteraciones morfolgicas significativas -sin causa aparente- en las clulas del hgado de ratones alimentados con soja transgnica [16]. Ms recientemente, el comit cientfico del gobierno francs se pronunciaba en contra de la aprobacin de un maz autorizado por la Comisin Europea en Octubre 2004, por considerar que las anomalas aparecidas en los estudios toxicolgicos eran muy preocupantes y que no se encontraba en situacin de concluir la inexistencia de riesgos para la salud animal. La documentacin sometida a consideracin de dicho comit cientfico -que Monsanto se neg a hacer pblica alegando secreto comercial- revelaba daos en los riones y en las clulas sanguneas de ratones que haban consumido el maz transgnico [17]. Estas alteraciones nunca han llegado a investigarse a fondo, sin embargo, se han intentando silenciar.
2. Aumento de las alergias Los cultivos transgnicos pueden introducir en los alimentos nuevos compuestos que produzcan alergias. Cuando se transfiere a una planta ADN de una especie con propiedades alergnicas, existe un riesgo de que el consumo de la variedad transgnica provoque reacciones alrgicas. Un ejemplo muy citado es el caso de la transferencia a la soja de un gen de la nuez de Brasil, cuyas propiedades alergnicas son conocidas; con el gen extrao se trasladaron a la soja transgnica las propiedades alergnicas de la nuez de Brasil [18]. En este caso el problema era previsible, puesto que se saba que algunas personas eran alrgicas a dicho fruto. Lo grave, sin embargo, es que tambin pueden producirse reacciones alrgicas a nuevas protenas procedentes de una especie que no tenga un historial de efectos alergnicos. Hay que tener en cuenta que se estn introduciendo en los alimentos protenas derivadas de bacterias, de virus, de insectos, de ratones y de multitud de otras especies que nunca han formado parte de la alimentacin humana. La inmensa mayora de los alrgenos alimentarios conocidos son protenas con caractersticas peculiares, como estructura molecular muy grande, relativa estabilidad al calor y solubilidad en el agua. En un estudio realizado en Holanda, los investigadores descubrieron que 22 de las 33 protenas procedentes de cultivos MG analizadas contenan secuencias de ADN idnticas a las presentes en alrgenos conocidos [19]. Pero hay compuestos alergnicos que no encajan en esta descripcin, y no se dispone de ninguna tcnica que permita descubrir a priori sus propiedades alergnicas [20]. La aparicin de alergias por exposicin a nuevos compuestos alimentarios puede tardar aos en desarrollarse, y ms an en detectarse, siendo difcil la identificacin de la sustancia alergnica [21]. Por otra parte, en la Unin Europea hasta 2004 unas normas de etiquetado inadecuadas han impedido realizar un seguimiento de los efectos de los OMG sobre la salud, mientras que en EEUU la absoluta falta de informacin al consumidor difcilmente permitira verificar posibles propiedades alergnicas en los alimentos transgnicos [22]. Es significativo, sin embargo, que en los ltimos aos las alergias en Estados Unidos se hayan disparado, mientras que en el Reino Unido aumentaron un 50% coincidiendo con la importacin de soja transgnica, aunque no se ha podido comprobar una relacin directa de este incremento -al que seguramente contribuye el deterioro generalizado de la alimentacin y de la calidad de vida- con el consumo de alimentos manipulados genticamente [23]. La existencia de cultivos transgnicos en el entorno tambin puede originar problemas de alergias (al polen, etc.). En Filipinas la poblacin de una zona en la que se cultivaban variedades transgnicas insecticidas ha desarrollado una misteriosa enfermedad alrgica que se piensa puede estar asociada a estos cultivos [24]. De hecho, est demostrado que los compuestos insecticidas producidos de forma natural por la bacteria Bacillus thuringienses (Bt), fabricados ahora en versin transgnica por las plantas en millones de hectreas de cultivos, pueden ser alergnicos para los seres humanos [25]. Una de las toxinas Bt de los cultivos insecticidas transgnicos es un inmungeno sistmico y de las mucosas tan potente como la toxina del clera [26].
3. Propagacin de resistencias a los antibiticos La mayor parte de los cultivos MG que se comercializan actualmente llevan genes marcadores de resistencia a los antibiticos, empleados en el proceso de manipulacin gentica. Se ha demostrado que el ADN y las protenas pueden resistir el proceso de digestin, permaneciendo intactos en el estmago de los mamferos, donde conviven con multitud de bacterias, pasando incluso al torrente sanguneo y a otros rganos del cuerpo [27]. La ingestin de alimentos transgnicos que contienen la enzima que degrada el antibitico pudiera, en consecuencia, anular la eficacia de un medicamento consumido con la comida. Ms preocupante an es la posibilidad de que los genes marcadores pasen de los alimentos a bacterias presentes en el estmago y en el intestino de las personas (y del ganado), que desarrollaran resistencia a antibiticos valiosos en medicina. Se ha comprobado experimentalmente que la posibilidad de transferencia de genes de alimentos transgnicos a bacterias gastrointestinales, que se deca era altamente improbable, no solo ocurre, sino que se da con una frecuencia mayor de la esperada [28]. Como consecuencia de esta transferencia, podran perder su eficacia tratamientos mdicos actuales de considerable importancia en la lucha contra enfermedades infecciosas [29]. La resistencia a los antibiticos es tambin preocupante en el caso de cultivos destinados a pienso para animales domsticos, actualmente la mayor parte de los OMG. Parte del ADN contenido en los alimentos se degrada durante el proceso de elaboracin o cocinado, pero el resto es ingerido intacto. Durante la digestin la mayor parte del ADN consumido se hidroliza. Sin embargo, Netherwood et al. han demostrado la presencia de ADN transgnico intacto en el intestino delgado, que puede ser incorporado a bacterias en este medio. Se ha demostrado tambin que el ADN puede pasar de los residuos vegetales de los cultivos a bacterias del suelo [30], aumentando de forma alarmante la posibilidad de propagacin de resistencia a los antibiticos en los miles de hectreas de OMG cultivados. Las variedades de maz insecticida cultivadas en Espaa desde 1998 hasta 2005 llevaban un gen de resistencia a la ampicilina en todas las clulas de la planta, y constituyen un importante riesgo para la salud pblica. Diversas asociaciones mdicas e instituciones internacionales han recomendado reiteradamente la retirada de este tipo de cultivos transgnicos [31]. En abril 2004 la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria dictamin asimismo la retirada del mercado de estas variedades, que en Espaa deban haberse eliminado a partir de enero 2005 (y no en julio 2005, permitiendo otro ao de cultivo), tras ms de seis aos de cultivo de este maz transgnico en ms de 20.000 hectreas [32].
4. Recombinacin de virus y bacterias La profusa utilizacin en ingeniera gentica de virus, de bacterias y de plsmidos bacterianos, todos ellos con una gran capacidad de recombinacin y de intercambio de material gentico con otros microorganismos, y diseados para atravesar las barreras de las especies, constituye una autntica bomba de relojera, pudiendo contribuir a la creacin de nuevas enfermedades con enormes riesgos para la salud humana [33]. La seguridad del promotor ms utilizado en ingeniera gentica (procedente del virus de mosaico de la coliflor) ha sido tambin cuestionada en diversas publicaciones, que sealan que su inestabilidad y caractersticas estructurales aumentan el riesgo de que se incorpore a otro material gentico (recombinndose y reactivando virus dormidos, por ejemplo), dando lugar a nuevos patgenos ms virulentos y con gran capacidad de infeccin [34].
5. Aumento del nivel de residuos txicos en los alimentos Es evidente que el aumento en el uso de herbicidas asociado a los cultivos transgnicos contribuir a incrementar en los alimentos los residuos de este tipo de productos, que se sabe tienen efectos dainos para la salud. Segn un estudio realizado en Australia, la soja resistente al herbicida Roundup contiene un nivel de residuos de glifosato, el componente activo de este herbicida, hasta 200 veces mayor que la soja convencional [35].
Los principales compuestos herbicidas asociados a los cultivos transgnicos son el glufosinato de amonio y el glifosato [36]. El glufosinato de amonio est asociado a casos de toxicidad neurolgica, respiratoria, gastrointestinal y hematolgica, as como a defectos congnitos en seres humanos y mamferos. Es txico para las mariposas y numerosos insectos beneficiosos, as como para las larvas de almejas, las ostras, la Daphnia (mosca de agua) y algunos peces de agua dulce, especialmente la trucha arco iris. Afecta negativamente a bacterias y hongos beneficiosos para el suelo por su capacidad de fijacin del nitrgeno. Se ha descubierto adems que algunas especies consideradas plaga para los cultivos son muy resistentes al glufosinato, mientras que sus enemigos naturales son muy vulnerables a este compuesto, lo cual puede tener efectos catastrficos para la agricultura. La accin del glufosinato en las plantas provoca la acumulacin de un nuevo metabolito, cuyos efectos en la cadena alimentaria no se han tenido en cuenta, aunque se sabe que los mamferos pueden regenerar a partir de este compuesto el herbicida txico, que puede tener efectos neurolgicos y graves repercusiones en la salud. El glifosato mata a las plantas inhibiendo la actividad de una enzima fundamental para la sntesis de aminocidos importantes para la planta, y es la causa ms frecuente de reclamaciones y casos de envenenamiento en el Reino Unido. Se han registrado trastornos de numerosas funciones fisiolgicas despus de una exposicin a este producto a niveles de uso normales. En los estudios realizados se detect que la exposicin al glifosato casi duplicaba el riesgo de aborto espontneo, y que los hijos de quienes trabajan con glifosato presentaban un elevado ndice de trastornos neurolgicos y de comportamiento. El glifosato es un agente genotxico en mamferos, peces y sapos, por lo que su utilizacin cerca de los cauces fluviales est prohibida en algunos pases. En las lombrices la exposicin a las dosis de glifosato aplicadas habitualmente en el campo provoc una mortandad de ms del 50% y lesiones intestinales importantes en los individuos que sobrevivieron al tratamiento. El Roundup, herbicida de Monsanto cuyas ventas se han disparado con la introduccin de los cultivos resistentes y cuyo principal compuesto activo es el glifosato, provoca disfunciones en la divisin celular, que podran estar asociadas con algunos tipos de cncer en seres humanos.
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Cultivos que producen su propio insecticida, jitomates que conservan su frescura y sabor durante varias semanas, capullos donde crece algodn de colores, son algunos ejemplos de lo que la biotecnologa ha logrado a travs de las llamadas plantas transgnicas, un campo de investigacin y desarrollo tan fascinante como polmico. Las plantas transgnicas forman parte del grupo de los llamados organismos modificados genticamente y son el resultado del avance de las tcnicas de la biologa experimental, as como de la bsqueda de soluciones a diversos problemas de la produccin agroindustrial. Muchos de los conceptos y procedimientos necesarios para obtenerlas se desarrollaron durante los ltimos veinte aos; sin embargo, sus aplicaciones comerciales slo pudieron ser financiadas por las grandes compaas que hoy dominan el mercado de la agrobiotecnologa. Lo que distingue a las plantas transgnicas es que poseen una o ms caractersticas que no fueron heredadas de sus antecesores. En cada una de sus clulas llevan genes "aadidos" artificialmente, es decir, fragmentos adicionales de cido desoxirribonucleico (ADN) provenientes de otra especie de planta, un virus, una bacteria o un hongo; estos genes contribuyen a producir nuevas sustancias, a modificar el ritmo del desarrollo de la planta o, bien, a aumentar su capacidad de defensa contra factores adversos. El inters en el desarrollo de plantas transgnicas es el de mejorar la calidad y productividad de los cultivos; adems, estas plantas constituyen una poderosa herramienta de investigacin. La ensalada transgnica El aspecto de una planta transgnica no es, en general, sorprendente; no se trata de calabazas gigantes, ni de limones con formas extraas, ni papas que saben a jitomate. A primera vista, una planta transgnica es semejante a las que no han sido transformadas. El cambio lo llevan en su interior y ste s es asombroso: ya es posible adquirir semillas para cultivar plantas de varias especies que producen un bioinsecticida (cultivos Bt), lo que ha reducido significativamente la aplicacin de pesticidas qumicos; otras plantas son resistentes a un tipo de herbicida, lo cual permite que el combate de malezas o "malas yerbas" sea ms efectivo pues los cultivos no resultan daados. En particular, destaca una variedad de jitomate diseada para tener una maduracin retrasada en sus frutos que hace posible que stos permanezcan ms tiempo frescos en color, textura y sabor. En algunos pases existen ya en el mercado productos derivados de plantas transgnicas de soya, algodn, papa, maz y jitomate, principalmente. Y quiz pronto se sumen otros a la lista; actualmente se realizan pruebas de campo y de tipo sanitario de variedades de calabacita que pueden evitar el ataque de ciertos virus, de oleaginosas como la colza (canola), que contienen una proporcin ms saludable para el consumidor de aceites en sus semillas, y tambin de papayas y otros frutales que pueden tolerar el aluminio txico de suelos cidos y absorben mejor el fsforo disponible. Se investiga, adems, la posibilidad de desarrollar plantas que puedan ser vehculos de vacunacin: se trata de que la propia planta produzca la vacuna y sta sea administrada con el alimento mismo, digamos un pltano; otras posibilidades son plantas que produzcan anticuerpos, diversos frmacos e incluso plsticos biodegradables. Una muestra del potencial comercial de las plantas transgnicas es el hecho de que en los Estados Unidos se estn probando actualmente cultivos de este tipo usando casi 100 genes distintos, introducidos en por lo menos 35 especies vegetales diferentes. La modificacin gentica De dnde surge una planta transgnica? Para conocer la respuesta es preciso recordar que los genes son partes o regiones definidas del ADN, esa larga molcula informativa que poseemos todos los seres vivos nuestro genoma y que est formada por combinaciones enormes de cuatro "letras" moleculares denominadas bases nitrogenadas. Cada gene contiene una instruccin especfica para la fabricacin de una protena, la cual se"dobla" en una forma caracterstica para funcionar ya sea como enzima, fibra muscular, hormona o toxina. As, cada protena participa en alguna parte de las numerosas estructuras y actividades de la clula. Normalmente conocemos la funcin de los genes a travs de la protena que codifican (y viceversa). En aos recientes, ha crecido el inters por conocer mejor cules son los genes importantes para el crecimiento, la nutricin y aqullos relacionados con la susceptibilidad a las enfermedades o la resistencia a los parsitos, para poder incidir en los factores que hacen que las plantas que cultivamos sean productivas, saludables y ms resistentes, o que aumenten su valor nutricional. La idea central de la modificacin gentica, en este caso de la creacin de plantas transgnicas, es que si un gene tiene influencia directa en alguna propiedad de un organismo determinado, es muy posible que el mismo gene afecte esa propiedad en otros organismos. Y esto se ha comprobado: la adicin de genes especficos en varios organismos produce gracias a la protena que estos genes originan algunos cambios significativos, heredables y frecuentemente tiles. En el caso particular de las plantas, como se pueden regenerar plantas completas a partir de clulas individuales o grupos de ellas, una clula a la que se le ha insertado un gene de otro organismo puede dar origen a plantas completas con copias del gene adicional en el tallo, las hojas, la raz, las flores o el fruto. La ingeniera gentica de plantas para usos agrcolas se nutre tambin de estrategias basadas en el conocimiento del modo en que varios organismos aprovechan su medio ambiente. Se sabe que diversos patgenos tienen formas de evitar la accin de sus propias toxinas o que muchos insectos tiene enemigos que los atacan de modo muy especfico. Como existen genes involucrados en este tipo de capacidades, su insercin en el ADN de las plantas puede darle a stas formas especiales de tolerancia o defensa ante plagas y enfermedades. Por ejemplo, existe un grupo de bacterias del suelo (Bacillus thuringensis), que produce una protena insecticida que no es txica a muchas especies tiles. Durante casi dos dcadas, extractos de este organismo se han rociado en los cultivos para protegerlos, pero hace cuatro o cinco aos se logr introducir en diversas especies de plantas el gene bacteriano responsable de la toxina, de modo que ahora ellas mismas producen el insecticida. Los riesgos y la polmica En la aplicacin comercial de las plantas transgnicas se han considerado varios riesgos potenciales que pudieran reducir su efectividad o, lo que es peor, que generen problemas de salud, agronmicos o ecolgicos en el futuro. En primer lugar, la posibilidad de que los procesos de transformacin y regeneracin de las plantas produzcan en ellas alteraciones no deseadas (por ejemplo en su tamao, coloracin o rendimiento) se descarta por medio de pruebas que se realizan en invernaderos y en el campo. Sin embargo, es posible que se presenten efectos en el ambiente en una extensin o en un plazo ms largos. Al reproducirse las plantas transgnicas, su polen puede contribuir a que los transgenes sean diseminados en otras plantas compatibles (de la misma especie pero de distinta variedad), en las especies silvestres (que a veces son malezas) o en especies ancestrales de las formas cultivadas, generando problemas ecolgicos, comerciales y legales. ste es todava un aspecto que debe evaluarse, considerando el tipo de reproduccin de las especies en cuestin. En Mxico existe preocupacin por el maz y otros cultivos (jitomate, chile, calabaza), ya que nuestro pas es fuente primordial de riqueza en biodiversidad de tales especies. Se considera tambin que las variedades transgnicas diseadas para producir nuevas toxinas contra plagas (por ejemplo, el algodn Bt) podran tener efectos nocivos en organismos benficos como abejas y catarinas, o bien, que esas toxinas se acumulen en las cadenas alimenticias e incluso promuevan la resistencia de las plagas. Se han planteado ya diversas estrategias para el manejo agrcola y una reglamentacin que disminuyan algunos de estos riesgos. Una de esas estrategias, por ejemplo, es destinar una parte del terreno de cultivo a la siembra de plantas no transgnicas, a fin de conservar el equilibrio en la poblacin de plagas y evitar que aquellas que desarrollen resistencia a la toxina se multipliquen. Otra preocupacin importante se refiere a la posibilidad de un impacto negativo en la nutricin y la salud humanas; este riesgo es muy bajo dadas las pruebas y controles sanitarios a los que se somete cualquier producto nuevo destinado al consumo humano. Un punto ms de la discusin es el derecho, tanto de los consumidores como de cada nacin, a comprar o no productos transgnicos; para ejercer este derecho es preciso que los productos se comercialicen por separado, no mezclados junto con los convencionales, y que sean fcilmente identificables. En este sentido, hay posturas encontradas entre los Estados Unidos, que se oponen a etiquetar sus productos, y sus socios de la Unin Europea, que exigen el etiquetado. La situacin se ha complicado, adems, por la necesidad de que la regulacin de diversos aspectos sobre el uso de los productos derivados de plantas transgnicas a nivel mundial sea compatible con los acuerdos internacionales de comercio. Hasta el momento prevalece una falta de consenso entre los pases sobre cmo regular la produccin, distribucin y venta no slo de plantas transgnicas y sus derivados, tambin de otros organismos modificados genticamente. Un esfuerzo importante pero que no resolvi la cuestin fue la reunin mundial celebrada el pasado mes de febrero en Cartagena de Indias, Colombia, convocada para aprobar el llamado Protocolo de Bioseguridad. Desde el punto de vista sanitario, se ha constatado que las variedades transgnicas ya comercializadas no son distintas de las convencionales; otras estn todava pendientes de aprobacin. Con respecto a los efectos en el ambiente, hay cierto acuerdo en que es necesaria ms investigacin, tanto de las empresas de agrobiotecnologa como de instituciones acadmicas y organismos pblicos. De cualquier manera, la perspectiva de una agricultura complementada con el cultivo de plantas transgnicas es an muy promisoria y una de nuestras mejores opciones para satisfacer la demanda de alimentos de una poblacin humana en continuo crecimiento. Herramientas de investigacin En el Instituto de Biotecnologa de la UNAM se realizan investigaciones sobre la localizacin, estructura y funcin de varios genes vegetales. Para ello se utilizan frecuentemente plantas transgnicas como una herramienta experimental que permite estudiar ms directamente la accin de algunos genes. Entre otros, aquellos que inciden en la capacidad de asociacin con otros organismos, la tolerancia a la sequa, el desarrollo de races, la sntesis de pigmentos y las respuestas a los daos que sufre la planta. Normalmente se utilizan especies de fcil transformacin y regeneracin como el tabaco, la leguminosa Lotus o bien, una plantita de la familia de las crucferas llamada Arabidopsis thaliana. Estas plantas deben cultivarse en condiciones controladas, es decir, cmaras de crecimiento donde se determina de antemano la temperatura, la cantidad de luz y la duracin del ciclo iluminacin-oscuridad. Otras plantas como el frijol o el maz, por su tamao, se cultivan en invernaderos, donde estn sujetas a cambios ms parecidos a los que tendran en el campo. En cualquier caso, esto permite desarrollar muchas de ellas de manera aislada, hasta que producen flores y semillas. Tambin se busca localizar y "etiquetar" otros genes con efectos en el metabolismo, el desarrollo y la interaccin con el ambiente utilizando tcnicas de "barrido genmico" (genome scanning); esta labor puede contribuir a conocer y preservar mejor nuestra diversidad biolgica y a generar variedades de diversos cultivos adaptados a nuestros recursos y necesidades. Jaime Padilla es bilogo e investigador-docente. Trabaja en el Instituto de Biotecnologa de la UNAM y coordina el rea de Bioqumica y Biologa Molecular en la Facultad de Ciencias de la Universidad Autnoma de Morelos. 4444444444444 Revista de Proteccin Vegetal versin On-line ISSN 2224-4697 Rev. Proteccin Veg. v.22 n.2 La Habana Mayo-ago. 2007
ARTCULO RESEA
ESTRATEGIAS DE INGENIERA GENTICA PARA LA OBTENCIN DE PLANTAS RANSGNICAS RESISTENTES A GEMINIVIRUS. EXPERIENCIA DEL CENSA
STRATEGIES OF GENETIC ENGINEERING FOR THE OBTAINMENT OF TRANSGENIC PLANTS RESISTANT TO GEMINIVIRUSES. EXPERIENCE AT CENSA Madelaine L. Quiones*, A. Vega**, Yamila Martnez* y E. Rodrguez*** * Grupo de Fitopatologa, Direccin de Proteccin de Plantas y ** Grupo de Virologa Animal, Direccin de Microbiologa. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA). Apartado 10, San Jos de las Lajas, La Habana. Cuba. Correo electrnico: madeqp@censa.edu.cu; ***Facultad de Ciencias. Universidad de Mlaga, Espaa.
RESUMEN Los begomovirus constituyen el principal problema para la produccin del cultivo del tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) en la mayora de las regiones tropicales y subtropicales, causando prdidas de un 100% del rendimiento. Para el control de los mismos se han aplicado varias estrategias convencionales de lucha, las que prometen obtener resultados alentadores a largo plazo. La aplicacin de la transgenesis en plantas para conferir resistencia a virus hace de esta alternativa una herramienta de gran importancia para el desarrollo de una agricultura ms sostenible. Entre las estrategias ms utilizadas se encuentran: la resistencia conferida por la sobreexpresin del gen de la protena de la cpsida viral (CP), uso de cidos nucleicos defectivos interferentes, expresin de los ARNs de genes de inters utilizando la expresin de ARNs antisentido, as como de pequeos fragmentos de ARN viral como inductores del silenciamiento gnico post-transcripcional. En Cuba, se han identificado tres begomovirus afectando este cultivo, el Virus del Encrespamiento Amarillo de la Hoja del Tomate (TYLCV), Tano Moteado del Tomate (ToMoTV) y Mosaico Habana del Tomate (ToMHV), pero el TYLCV ha sido el de mayor diseminacin e incidencia. Dado el impacto que conllevan las prdidas ocasionadas por los geminivirus y el aporte de la ingeniera genticapara su control, el presente artculo refiere aspectos sobre las principales estrategias desarrolladas para la obtencin de plantas transgnicas resistentes a estos, el impacto de esta tecnologa en la agricultura actual y los resultados especficos obtenidos en el CENSA. Palabras clave: ingeniera gentica; plantas transgnicas; resistencia derivada del patgeno; geminivirus.
ABSTRACT Begomoviruses constitute the principal problem for the production of tomato crop (Lycopersicon esculentum Mill.) in tropical and subtropical regions, causing yield damages of 100%. Conventional strategies for the control of these viruses which promise to obtain long term results have been developed. The application of trangenesis in plants for conferring resistance to virus is a tool of great importance for the development of a more sustainable agriculture. Among the main strategies developed are: resistance by the over expression of the coat protein (CP), use of interfering defective nucleic acids, expression of RNAs from genes of interest, as well as the use of antisense RNAs and short RNAs as inductors of post-transcriptional gene silencing. In Cuba, three begomoviruses have been identified in tomato crops: Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV), Tomato Mosaic Havana Virus (ToMHV) and Tano Tomato Mottle Virus (TToMoV), but TYLCV has had the greatest incidence and dissemination. Due to the impact on damages caused by geminiviruses and the role played by the genetic engineering in their control, the present article reviews the aspect related to the main strategies developed for obtainment of transgenic plants resistant to geminiviruses, the impact of this technology in the current agriculture and the specific results obtained at CENSA. Key words: genetic engineering; transgenic plants; pathogen-derived resistance; geminiviruses.
INTRODUCCIN Las enfermedades virales causan prdidas significativas en todos los cultivos de importancia econmica, que estas afectan. Las mismas provocan un impacto negativo en la agricultura mundial, por lo que durante muchos siglos los agrnomos y fitopatlogos han realizado un considerable esfuerzo para controlar las mismas. Su control se basa fundamentalmente, en la deteccin a tiempo de la enfermedad para evitar el establecimiento y diseminacin de sus agentes causales. En este sentido, la prevencin mediante la evaluacin frecuente de los semilleros y el uso de variedades con altos niveles de tolerancia o resistencia a virus constituyen los elementos de mayor importancia para su control. Para la prevencin de estos patgenos se hace necesario el uso de un grupo de medidas de manejo integrado, que comprenden, desde la aplicacin de prcticas culturales tradicionales, hasta la lucha contra el vector y otras posibles fuentes de virus, as como, la aplicacin de nuevas tecnologas de avanzada que permitan de conjunto con las tcnicas tradicionales realizar un control ms eficiente de estas entidades patgenas (36). Los geminivirus causan prdidas devastadoras en varios cultivos de importancia econmica, particularmente en los pases tropicales y subtropicales (25,34). Estos se caracterizan por presentar partculas isomtricas geminadas (del latn, gemini: dobles), variando su tamao entre 30-36nm de largo y 18-20nm de ancho, teniendo como principales vectores, la mosca blanca y diferentes especies de saltahojas (Homoptera: Cicadellidae), adems de algunas chinches de los rboles (Membraceae). Estos virus integran la segunda familia ms extensa de virus de plantas y est compuesta por cuatro gneros: Mastrevirus, Curtovirus, Topocuvirus y Begomovirus que se distinguen por su vector, gama de hospedantes y caractersticas de su genoma. El genoma viral est compuesto por una cadena sencilla de ADN circular, de aproximadamente 2.7-2.8 Kb, que se presenta en algunos miembros como un solo componente (genoma monopartito) y en otros, como dos componentes (genoma bipartito). La mayora de los begomovirus tienen dos componentes genmicos el ADN-A y ADN-B, ambos esenciales para la infectividad. El ADN-A presenta seis genes: Ac1 codifica para una protena esencial para la replicacin viral (Rep) en asociacin con la ADN polimerasa del hospedante, Ac2 codifica una protena activadora de la transcripcin (TrAP), Ac3 codifica una protena potenciadora de la replicacin (REn), Av1 y Av2 codifican la protenas de la cpsida y la protena de pre-cpsida, respectivamente. La funcin del gene Ac4 aun no est completamente esclarecida. En el componente B se localizan los genes Bv1 y Bc1 que codifican protenas relacionadas con el transporte nuclear y el movimiento, respectivamente. A diferencia los begomovirus monopartitas presentan un nico componente genmico donde se localizan todos los genes esenciales para la replicacin, transcripcin, encapsidacin y movimiento viral (43). Tres begomovirus se han identificado en el cultivo del tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) en el pas: Virus del Encrespamiento Amarillo de la Hoja (de las siglas en ingls TYLCV) (22), Mosaico Habana (ToMHV) (23) y Moteado Tano del Tomate (ToMoTV) (37). La alta incidencia del TYLCV constituye el principal problema para la produccin de tomate en muchos pases (46). Cuba no es una excepcin, donde se ha podido cuantificar prdidas desde el 40-100% en campos comerciales de tomate, adems de haberse informado en los ltimos aos su presencia en nuevos hospedantes de importancia econmica, tales como pimiento (34) frijol (26) y calabaza (24). Antes del advenimiento de la ingeniera gentica, las metodologas de mejoramiento tradicional fueron aplicadas al desarrollo de plantas resistentes a virus de cultivos importantes agronmicamente. En adicin, tcnicas estndares de fitopatologa, que incluyen cuarentena, erradicacin, rotacin de cultivos y uso de semilla certificada libre de virus se han utilizado como herramientas de valor para el control de enfermedades virales. Para el caso especfico de los geminivirus, se han aplicado mtodos de control tradicionales y de nueva generacin, obtenindose resultados alentadores en muchos casos (6,16,20,27,29). Estrategias no convencionales son desarrolladas en la actualidad en muchos laboratorios del mundo. Los avances en el campo de la biologa molecular y la ingeniera gentica, han permitido desde hace ms de una dcada, la obtencin de plantas transformadas que portan informacin gentica fornea y les confiere resistencia a virus (6,10, 27,30). Varios mtodos que emplean el uso de la ingeniera gentica han sido evaluados y demostrados satisfactoriamente para la obtencin de plantas trangnicas resistentes a geminivirus (42). Entre los ms relevantes se pueden mencionar, la sobreexpresin en plantas de genes virales (gen que codifica para la protena de la cpsida cp) (4), uso de cidos nucleicos defectivos interferentes (41) y la expresin de los ARN de genes de inters (rep, AV2) utilizando construcciones antisentido (6,30,31,32,33), as como un pequeo fragmento del ARN viral que desencadena el denominado mecanismo de silenciamiento gnico post-transcripcional (de las siglas en ingls PTGS) (29,31). En este sentido, la aplicacin de estas estrategias han posibilitado en gran medida apoyar el control de estos patgenos de inters y obtener en menor tiempo; y de forma ms especfica variedades resistentes a geminivirus, cuyo proceso reduce a la mitad el tiempo necesario destinado a obtener una variedad mejorada por la va clsica. No obstante, a pesar del desarrollo alcanzado, la aplicacin e introduccin de esta tecnologa para obtener plantas con los caracteres deseados, an contina siendo un tema de gran debate a nivel internacional. Los riesgos asociados con la liberacin de las plantas al medio ambiente natural que pudiera traer consigo el escape de los transgenes y la introgresin de estos en el pool de genes silvestres, el impacto del producto de los transgenes sobre otros organismos y el ecosistema parecen ser los principales obstculos, por los cuales an esta tecnologa no ha logrado una aceptacin pblica adecuada y una aprobacin regulatoria a nivel mundial (12). En Cuba, desde hace algunos aos el Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa (CIGB) trabaja en la obtencin de plantas transgnicas con resistencia a diferentes plagas y enfermedades que afectan a las plantas, as como el uso de plantas como biofbricas de enzimas de uso industrial, productos biofarmacuticos u otros obteniendo resultados novedosos en este campo. En el caso especfico del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), se trabaj en la obtencin especfica de vectores que contienen construcciones genticas para expresar el gene c1 que codifica para la protena de la replicacin del TYLCV y su expresin transitoria en protoplastos obtenidos a partir de plantas de Nicotiana bentahmiana (35). Este artculo resea tiene como objetivo dar una breve panormica sobre las diferentes estrategias desarrolladas para la obtencin de plantas transgnicas resistentes a geminivirus a nivel mundial, el impacto de esta tecnologa en la agricultura actual y los resultados especficos obtenidos en el CENSA. Estrategias desarrolladas para el control de enfermedades causadas por geminivirus mediante tcnicas de ingeniera gentica. Sanford y Johnston (39), propusieron el concepto de resistencia derivada del patgeno como va alternativa a la creacin de genes de resistencia. Ellos sugirieron que los genes de los patgenos, cuando eran expresados por un organismo "hospedante potencial" podran conllevar a que el mismo se hiciera resistente al patgeno. Teniendo en cuenta esta teora, en la actualidad las tcnicas de ingeniera gentica que involucran el uso de genes derivados del patgeno para el control de virus estn siendo de amplia aplicacin (27,32). Diversas estrategias se han diseado y obtenido con resultados altamente satisfactorios. Entre las principales a destacar se encuentran: la resistencia conferida por la sobreexpresin en plantas de genes virales (CP) (4), la cual muestra que la sobreexpresin de un gen desencadena en estas plantas un mecanismo de competencia por la maquinaria celular y las hace mucho ms resistentes a la infeccin contra el virus del cual se obtuvo la secuencia de esta protena. Otra estrategia se basa en la resistencia mediada por el uso de molculas defectivas (41) y establece que los cidos nucleicos defectivos interferentes (DI) son mutantes de delecin de las secuencias genmicas virales, las cuales dependen de sus parentales para la replicacin y que al igual que los ARN satlites, son capaces de aminorar los sntomas producidos e interferir en la replicacin del virus. Una de las estrategias ms trabajadas en la actualidad lo constituye el uso de fragmentos del ARN viral, en el caso especfico de los geminivirus se trabaja con la resistencia mediada por la replicasa viral, o sea, uso del gen c1 que codifica para la protena Rep con el propsito de interferir con la replicacin viral y as conferir resistencia. La interferencia con la accin de la protena Rep representa una de las opciones ms promisorias para la resistencia derivada del patgeno contra las enfermedades causadas por geminivirus. Dos vas son empleadas para su uso: la primera est relacionada con la resistencia mediada por la expresin del gen c1 ubicado en antisentido en una construccin gentica (6) y la segunda involucra el silenciamiento gnico post-transcripcional (de las siglas en ingls PTGS) utilizando pequeos fragmentos de ARN interferentes (ARNsi) que se basan en el silenciamiento gnico dependiente de homologa (29,31,32). - Resistencia conferida por la sobreexpresin de genes virales (protena de la cpsida). La resistencia mediada por la protena de la cpsida es uno de los primeros mtodos que se aplic al control de muchos virus de plantas (45) y es la fuente de resistencia ms frecuente derivada del patgeno. Las plantas transgnicas que expresan el gen de la cubierta proteica viral, son mucho ms resistentes a la infeccin contra el virus del cual se obtuvo la secuencia de la protena de la cpsida (PC). El primer reporte de este tipo de resistencia se obtuvo en 1986, mediante la introduccin del gen de la PC del Virus del Mosaico del Tabaco (TMV) en el genoma de las plantas de tabaco (1). Siguiendo este primer ejemplo, la resistencia mediada por la protena de la cpsida ha sido efectiva al conferir resistencia contra al menos 30 virus de plantas. Sin embargo, el mecanismo responsable de esta resistencia en el hospedante aun no est bien entendido en todos los casos. Se han postulado dos teoras que explican la resistencia mediada por la protena de la cpsida: la primera plantea que la PC impide el desnudamiento del ARN viral tan pronto como los capsmeros del virus son removidos, de forma que el desensamblaje del virus no ocurrir o estar retardado, si los niveles de la PC estn por encima de los mximos normales (38). La otra teora seala que la PC se une a un receptor celular, que permite la entrada y/o el desensamblaje del virus. Al unirse al receptor queda bloqueado el sitio de entrada del virus a la clula y eliminada tambin la posibilidad de que se formen complejos para el desensamblaje. En el caso especfico de los geminivirus un ejemplo de esta estrategia lo muestra la sobreexpresin en plantas de tomate del gen v1 que codifica para la PC de TYLCV. El mismo se situ bajo el control transcripcional del promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV) y se clon en vectores Ti de Agrobacterium, luego se transformaron plantas de tomates sensibles a la infeccin por el TYLCV. Las plantas transgnicas expresando el gen v1 se inocularon con TYLCV utilizando moscas blancas alimentadas sobre plantas infectadas con el virus, estas respondieron con retardo en la aparicin de los sntomas y se recuperaron de la enfermedad con un incremento de la resistencia en inoculaciones repetidas. Todas las plantas transformadas que se recuperaron expresaron la PC del TYLCV (19). Trabajos realizados que involucran el uso de este mtodo aplicado al control de otros virus de plantas sugieren la posibilidad de ocurrencia de dos posibles riesgos que parecen estar asociados a esta alternativa: la encapsidacin de genes heterlogos y la recombinacin. Esto fue demostrado al infectar con el Virus de las Venas Necrticas Amarillas de la Remolacha (BNYVV), plantas transgnicas que expresaban el gen de la CP del Virus de la Sharka o Plum Pox Virus (PPV) (21). Sin embargo, en el evento de encapsidacin heterloga el cambio en la progenie del virus es limitado a una generacin porque la informacin gentica del virus permanece intacta. En contraste, la recombinacin entre los genomas virales y los transgenes conteniendo protenas de cpsida resultaron en cambios permanentes en la constitucin gentica de la progenie viral (14). - Resistencia mediada por cidos nucleicos defectivos interferentes (DI). Los cidos nucleicos interferentes defectivos (DI), son mutantes de delecin de secuencias genmicas virales, que dependen de sus virus parentales para su replicacin. Al igual que los ARN satlites, son capaces de aminorar los sntomas producidos por el virus al cual se encuentra asociado y de interferir en su replicacin. Frishchmuth y Stanley (15) descubrieron un brillante acercamiento a la resistencia de geminivirus, al introducir un clon dimrico que contiene el genoma B (ADN-B) del Virus del Mosaico Africano de la Yuca (ACMV) en el genoma de plantas de N. benthamiana utilizando tcnicas de agroinoculacin. En este experimento las plantas transgnicas desarrollaron sntomas atenuados al compararlos con las plantas no transformadas utilizadas como controles. La transmisin sucesiva de savia entre plantas transgnicas evidenci una disminucin en los niveles de ADN viral y acrecent la atenuacin de los sntomas y el nmero de plantas asintomticas con muy bajo contenido de ADN viral, lo cual demostr que el efecto del ADN DI en la proliferacin del virus es acumulativo. La infeccin por el Virus del Encrespamiento de la Remolacha (de las siglas en ingles BCTV) est asociada con la sntesis de novo de una poblacin heterognea de ADNs viral subgenmico. Otro ejemplo del uso de estas partculas interferentes se demostr al agroinocular con BCTV plantas de N. benthamiana transformadas con una construccin que contena una repeticin parcial de un ADN subgenmico y se observ una disminucin de los sntomas tpicos a la infeccin (13). Esta disminucin en los sntomas est asociada con la movilizacin del ADN subgenmico de la copia integrada. En un intento por mejorar la resistencia, plantas de N. benthamiana se transformaron con una construccin que contena un dmero parcial de un ADN subgenmico mucho ms pequeo. Estas plantas no mostraron resistencia a pesar de que el ADN subgenmico se moviliz del genoma del hospedante. Para un mejor entendimiento de las bases del fenmeno de interferencia, ellos compararon la habilidad del BCTV de replicarse y acumularse en discos de hoja de plantas transgnicas resistentes y no resistentes. En estas, ambos ADNs subgenmicos interfirieron con la replicacin del virus pero solo en las resistentes el ADN de interferencia suprimi eficientemente la acumulacin viral (13). - Resistencia mediada por el ARN viral. Inicialmente se pens que las plantas transgnicas que expresaban las protenas virales podran conferir proteccin contra el virus. En algunos estudios se ha demostrado que la expresin de las protenas ha sido la responsable de la resistencia al virus, pero en diversos casos tambin se ha demostrado que esta resistencia ocurre a nivel del ARN (43). Un mtodo de regulacin de genes en el organismo se realiza a travs del uso de molculas de ARN complementarias las cuales son capaces de unirse al ARN transcripto de genes especficos y de este modo previenen su traduccin. Los investigadores del tema han desarrollado dos teoras que argumentan y demuestran la resistencia obtenida en experimentos in vitro con vistas a obtener plantas altamente resistentes. La primera relaciona la resistencia mediada por la expresin del gen c1 de los geminivirus en direccin antisentido en una construccin gentica (6) y la segunda est asociada con el PTGS mediado por un pequeo fragmento de ARN y se basa en el silenciamiento gnico dependiente de homologa (29,31,32). ARN antisentido Secuencias antisentido apropiadas incorporadas en el genoma de la planta han mostrado que estas bloquean la actividad de genes especficos, por lo que constituyen otra variante para la obtencin de resistencia; a este ARN se le ha denominado ARN antisentido o ARN mic (ARN complementario interfiriendo con el ARN mensajero). En este caso se piensa que la resistencia conferida por el ARN antisentido est dada por una interaccin entre el ARN viral y el ARN antisentido, el complejo que se forma puede ser rpidamente degradado y el ARN viral estar incapacitado para la traduccin (5). Utilizando este basamento se han obtenido plantas transgnicas de tabaco que contienen una construccin gentica que incluye una secuencia de ADN antisentido del gen c1 del geminivirus del Mosaico Dorado del Tomate (TGMV); donde c1 codifica para una protena absolutamente requerida para la replicacin del ADN de TGMV. Cuando estas plantas se infectaron con el virus mediante agroinoculacin, la frecuencia de desarrollo de sntomas se redujo significativamente en un nmero de lneas antisentido, lo cual estuvo correlacionado con la abundancia de ARN antisentido transcripto y con una reduccin en el ADN viral en los tejidos de hojas infectadas (9). Bendahmane y Gronenborn (6), informaron la obtencin de plantas transgnicas resistentes a un aislado de TYLCV empleando casetes de expresin que contenan ARNs antisentido. El blanco del ARN antisentido es una porcin del ARN mensajero de la protena Rep. Las plantas transgnicas de N. benthamiana obtenidas expresando el ARN antisentido de c1 mostraron resistencia a la infeccin por el TYLCV. Algunas de las lneas resistentes fueron asintomticas y la replicacin de TYLCV casi completamente suprimida. La resistencia mediada por transgenes demostr ser efectiva en al menos dos generaciones de la progenie. As mismo se ha informado recientemente por otros autores el uso de una construccin antisentido conteniendo el gen rep del Virus del Encrespamiento de las Hojas del Tomate (ToLC) (30,33). A pesar de los altos niveles de resistencia obtenidos utilizando esta variante, dos problemas principales o desventajas son atribuidos al mismo, el primero relacionado con un sustancial exceso de ARN antisentido que requiere frecuentemente una efectiva reduccin de los niveles de ARNm blanco y el otro problema es que este mtodo solo es factible de aplicarlo a virus que se replican en el ncleo de las clulas y no para virus que se encuentran en el citoplasma ya que las molculas antisentidos transcriptas son producidos en el ncleo. En el caso de los geminivirus donde el ADN viral se encuentra abundante en el ncleo esta estrategia es de mucho valor (17). Silenciamiento gnico postranscripcional (PTGS) El PTGS es un proceso altamente especfico en el cual el ARN con homologa al ARN transgnico inductor es especficamente degradado en el citoplasma. Diversos mecanismos se han propuesto para explicar como este sistema de degradacin del ARN secuencia-especfica podra ser activado, esto incluye el aumento de los niveles del ARNm del transgen por encima del "umbral" requerido, lo que trae como consecuencia la induccin del sistema de degradacin, la metilacin de los transgenes, lo que resulta en una produccin de ARNs aberrantes prematuros para iniciar el mecanismo de degradacin y la formacin de los ARNs de doble cadena que son capaces de inducir una degradacin directa de lo ARNs. Un modelo de cuatro etapas se ha propuesto para esclarecer la va por la cual ocurre el silenciamiento del ARN (43). Evidencias genticas recientes muestran la posibilidad de que la ruta del silenciamiento del ARN est ramificada y que las ramas que se forman convergen en la produccin de los ARNs de doble cadena (ARNdc). Estos ARNdc pueden ser producidos por las ARN polimerasas dependientes de ARN codificadas por el hospedante o bien codificadas por el virus, por la transcripcin de promotores convergentes, o a partir de loci reorganizados. Las largas molculas de ARNdc son procesadas en pequeas molculas de 21-25 nucletidos, denominadas ARN interferentes (de las siglas en ingls siRNAs), por una enzima endonucleasa ARNdc- especfica similar a la ARNasa III y denominada DICER (43). Los ARNs interferentes del ARN molde, con ambas cadenas sentido y antisentido son incorporados en una endonucleasa multi-subunidad, denominado complejo del silenciamiento inducido del ARN (de las siglas en ingles RISC) o complejo de interferencia especfica del ARN, que es guiado a este ARN molde por apareamiento de bases y por consiguiente ocurre el corte del ARN de secuencias similares, lo que trae consigo la produccin del ARNdc (3,18,44). Los ARNs pequeos de interferencia no solo se han encontrado y asociado con el PTGS en plantas. Un proceso similar denominado ARN de interferencia (de las siglas en ingles RNAi) se ha determinado en Caenorhabditis elegans y utilizado como marcador para el silenciamiento gnico. Tambin se han encontrado evidencias de que los virus pueden a la vez ser blancos e inductores del PTGS y pueden conllevar al PTGS, lo que sugiere que el PTGS acta como un mecanismo de defensa natural de las plantas ante la invasin de ARN virales o secuencias de ADN tales como elementos transponibles o el ADN-T de Agrobacterium (43). Los resultados obtenidos a partir de la recuperacin natural de plantas infectadas con la cepa de Camern del Virus del Mosaico Africano de la Yuca (ACMV-CM) y la correlacin encontrada entre esta respuesta natural y los altos niveles de ARN citoplsmasticos pequeos e interferentes (ARNsi) apoyan el mecanismo del silenciamiento gnico post-transcripcional como una estrategia de control efectiva para los geminivirus (8). En los geminivirus, se ha demostrado el silenciamiento de un transgen conteniendo el gen GUS puesto bajo la regulacin del promotor del TYLCV por la infeccin de virus homlogos pero no de heterlogos. Este fenmeno ocurre debido a la hipermetilacin de secuencias derivadas del promotor TYLCV. Una estrategia de control basada en el PTGS fue demostrada cuando clulas de plantas que fueron transfectadas simultneamente con ACMV (CM) y con un ARNsi sinttico diseado como molde del gen Ac1 del virus mostr una reduccin en los niveles de acumulacin viral del ARNm de Ac1 en ms del 90% y en el 70% del ADN viral, comparado con los controles utilizados. Consecuentemente la expresin transgnica del ARN de doble cadena del gen Ac1 revela una resistencia durable al Virus del Encrespamiento de la Hoja del Algodn en tabaco (2) y al TYLCV en tomate (46). Otro ejemplo concreto de este tipo de estrategia fue demostrado recientemente donde se analiz el efecto de los ARNsi sobre la inhibicin de la expresin del gen de la protena de la cpsida del TYLCV, donde se evidenci en las plantas transgnicas de tomate la ausencia de sntomas tpicos de la enfermedad, an luego de siete semanas de la inoculacin con el virus, mientras que las no transgnicas se infectaron a las dos semanas postinoculacin, demostrndose la factibilidad de esta alternativa para conferir resistencia a este virus (47). Impacto de la transgnesis en plantas en la agricultura mundial No es menos cierto que el crecimiento de la poblacin mundial tiende a la duplicacin en los prximos 10 aos y que adems de satisfacer el aumento de la demanda de alimentos como resultado de ese crecimiento, el incremento de la produccin de alimentos tendr que satisfacer el aumento del consumo per cpita debido al mejoramiento de la calidad de vida, calculndose que para el ao 2025 habr que aumentar la produccin de alimentos en al menos 50% de la que actualmente se produce. La conclusin inevitable derivada de esto es que para poder satisfacer la demanda, la humanidad tendr que aumentar el rendimiento de las reas sembradas. Adems este incremento tendr que ser el resultado del uso de menos tierra, agua y menos plaguicidas, por lo que varios factores biticos y abiticos de estrs, as como varias condiciones desfavorables de post-cosecha, tambin darn lugar a prdidas significativas en las producciones agrcolas. Por lo tanto, se necesitar de variedades de cultivos ms estables y con mejores rendimientos, as como mejores formas de manejo con el propsito de aumentar la productividad y la sostenibilidad de los cultivos (40). A fin de enfrentar estos retos ser necesario disponer de nuevos conocimientos derivados del avance cientfico ininterrumpido, el desarrollo de nuevas tecnologas adecuadas y una amplia difusin de dichos conocimientos y tecnologas, as como la capacidad de introducirlos y utilizarlos racionalmente en todo el mundo. En este contexto es que el uso de nuevas tecnologas que al ser aplicadas junto a mtodos tradicionales de mejoramiento y manejo de los cultivos cobra una importancia primordial en la produccin sostenible de alimentos para la poblacin existente. La biotecnologa de plantas podra contribuir sustancialmente al rescate de las cosechas perdidas por el ataque de plagas y enfermedades, as como en el mejoramiento de la produccin y calidad de los productos obtenidos. La necesidad urgente de mtodos sustentables para la produccin agrcola del mundo con el objetivo de satisfacer las demandas de una poblacin mundial en constante crecimiento hace de la tecnologa del uso de plantas transgnicas o de los tambin denominados, organismos genticamente modificados (OGMs) en la agricultura; una opcin de valor a tener en cuenta. Las plantas transgnicas con caracteres tan primordiales como la resistencia a las plagas, enfermedades y herbicidas, son sumamente importantes y necesarias cuando no se ha detectado resistencia inherente en las especies locales. Por otra parte, estas poseen entre sus beneficios la mayor flexibilidad para administrar el cultivo, menor dependencia de insecticidas qumicos, mayores rendimientos, facilidad de cosecha y mayor proporcin de esta para su comercializacin. Para el consumidor esto significa menor costo del alimento y ms valor nutritivo en estos. A pesar de los resultados demostrados en el uso de la transgnesis en plantas para conferir resistencia a diversas plagas y enfermedades, as como para la expresin de protenas de inters teraputico e industrial; y las ventajas que esta tecnologa podra traer para el desarrollo biotecnolgico y socieconmico, no ha conseguido tener una aceptacin favorable por el pblico. Los principales problemas estn relacionados con preocupaciones intrnsecas sobre las plantas y los genes en s, as como preocupaciones extrnsecas relacionadas con la salud de los consumidores, el medio ambiente y la socioeconoma (28). Como toda tecnologa nueva, la transgnesis enfrenta importantes desafos como resultado de la percepcin del pblico en general, de tendencias ambientalistas y econmicas, as como la predominancia de las compaas multinacionales en el desarrollo y beneficios de esta tecnologa. Estudios realizados han identificado riesgos potenciales inherentes a esta novedosa tecnologa, que incluye riesgos para la salud y el medio ambiente. Este ltimo, se refiere especialmente a los riesgos potenciales que pudieran atentar contra la biodiversidad. Aqu se han propuesto como riesgos, la adquisicin por parte del cultivo de rasgos de "maleza", el desarrollo de resistencias en las plagas y la dispersin o flujo del transgn. En cuanto a los riesgos potenciales para el ambiente se encuentran el flujo e introgresin de genes. De todos los riesgos potenciales atribuidos a los cultivos transgnicos, el flujo de genes y su impacto en la biodiversidad, contina siendo estudiado y evaluado, especialmente en regiones o pases que son centros de origen o centros de diversidad gentica. El flujo vertical de cultivo a cultivo o a parientes silvestres es relevante. Este flujo involucra la produccin de hbridos viables que expresan el transgn y con capacidad de adaptacin en hbitats naturales o de cultivo. Hay que tener en cuenta que el flujo de genes es una de las fuerzas del proceso de evolucin y domesticacin de los cultivos y que no es extrao que algunos cultivos, ej. trigo, canola, han resultado de la recombinacin de ms de un genoma. Para determinar el potencial del flujo de genes en la agrobiodiversidad, cada cultivo debe ser analizado con respecto a los siguientes factores: biologa reproductiva, modificacin gentica (naturaleza del transgn, nmero de copias insertadas, expresin), dispersin del polen, flujo de genes de cultivo a cultivo (hibridizacin-posibles consecuencias), definicin y estatus de la planta silvestre o maleza, flujo de genes del cultivo a parientes silvestres (compatibilidad y distribucin), hibridacin, posibles consecuencias del flujo. Entre los factores que afectan la dispersin del polen y la polinizacin cruzada se encuentra: tamao (rea) del cultivo fuente y receptor de polen, vectores de polen, factores ambientales (clima, barreras biolgicas y fsicas), viabilidad del polen, grados de alogamia en el cultivo, grado de sincronizacin en la floracin. En caso de que el flujo de genes haya sido exitoso, tiene lugar entonces la hibridacin y la introgresin. Han sido reportadas tasas de flujo de genes de un 1% entre cultivos y parientes silvestres, pero puede llegar hasta 100% cuando el cultivo y los silvestres se encuentran muy cercanos. En algunos casos, las poblaciones de especies silvestres introgresadas han mostrado mayor diversidad gentica que aquellos que se encuentran separados del cultivo. La introgresin por flujo de genes ha resultado ser importante en la evolucin y domesticacin de una docena de especies estudiadas (11). A pesar de los riesgos asociados al uso de esta tecnologa de avanzada es importante sealar que la biotecnologa puede ofrecer un gran potencial para desarrollar una agricultura ms compatible con el uso sostenible de los recursos naturales. Esto se puede lograr conectando la conservacin y uso de la biodiversidad con el desarrollo sostenible de la agricultura. La biotecnologa est contribuyendo a revelar en detalles y precisin la estructura gentica de las plantas y de la biodiversidad, y este conocimiento est contribuyendo a aumentar la productividad de reas intervenidas, a reducir la contaminacin ambiental y agregar valor a la agrobiodiversidad. Construccin de un vector quimrico conteniendo el gen c1 del TYLCV aislado en Cuba y expresin transitoria en protoplastos de N. benthamiana. Experiencia del CENSA. En los laboratorios de Virologa Vegetal del CENSA y el de gentica de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Mlaga se construyeron los plsmidos que contienen los genes virales de inters del TYLCV aislado y caracterizado en Cuba (35), los que fueron utilizados para la construccin del vector que se emple en la transfeccin de clulas de protoplastos de N. benthamiana y podr ser de utilidad en la generacin de plantas transgnicas resistentes a este aislado viral posteriormente. El vector (pTYCU11) obtenido (Fig. 1) est compuesto por una construccin gentica que contiene un dmero del origen de replicacin del virus y un transgen integrado por el gen c1 (en la orientacin antisentido) del virus TYLCV, bajo el control de las secuencias: promotora del CaMV 35 S, secuencia ocs poly A y secuencia amplificadora de la transcripcin del transgen (EN), as como un marcador para la seleccin, en este caso un gen de resistencia a antibiticos (Kanamicina).
Los protoplastos se aislaron a partir de cinco hojas jvenes donde se obtuvo un rendimiento de 10 X 10 6 protoplastos (7,35). Estos fueron tranfectados con la construccin obtenida (pTYCU11) y la deteccin de la construccin insertada se realiz mediante la hibridacin no radiactiva de cidos nucleicos tipo "dot-blot". Se emple como sonda un fragmento del plsmido pJC2ENa que contiene el promotor 35S, amplificador y la secuencia seal de terminacin de la transcripcin del gen ocs. El fragmento se marc utilizando el juego de reactivos para marcaje no radiactivo empleando la digoxigenina (DIG Nucleic Acid Detection Kit, Boehringer Mannheim), de acuerdo a las instrucciones recomendadas por la casa comercial (35). La hibridacin se realiz utilizando una fraccin de los ADN genmicos (125 ng) obtenidos a las 24 y 96 horas post-inoculacin a partir de protoplastos transfectados y no transfectados. Se utiliz como control positivo de esta deteccin el fragmento utilizado como sonda (30 ng) (35). La deteccin mostr seales positivas en los ADN extrados a las 24 y 96 horas a partir de los protoplastos transfectados (Fig. 2: Lneas 3 y 4); sin embargo, no se observ seal positiva en los ADN extrados a partir de protoplastos no transfectados (Fig. 2, Lneas 1 y 2), lo cual evidencia que los protoplastos fueron eficientemente transfectados mediante la metodologa utilizada y que la misma puede ser de gran utilidad en los ensayos de expresin transitoria con las construcciones que se obtengan por esta tecnologa. El uso de dos orgenes de replicacin viral permite que al producirse la infeccin y siempre que el virus sea capaz de expresar la protena del gen c1, sobrepasando la inhibicin producida por el ARN antisentido se producir la formacin de partculas extragnicas, a partir de la construccin genmica insertada. Estas partculas contendrn una copia de la construccin gentica del ARN antisentido y se pondran en marcha dos mecanismos adicionales para aumentar la resistencia, uno vinculado a la competencia de las partculas al tener el mismo origen de replicacin que el virus por la maquinaria de replicacin y el segundo la posibilidad de obtener mayor nivel de expresin de los cassettes en clulas de la planta hospedante (Bejarano, 2000, comunicacin personal). Teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto la construccin gentica pTYCU11 incrementar en clulas transformadas la expresin del gen c1 en la orientacin antisentido, a travs del aumento del nmero de copias de la construccin gentica por la presencia de las dos secuencias IR, por el control transcripcional bajo el promotor 35 S del CaMV y el amplificador contenido en este promotor el cual aumenta los niveles de expresin, elementos que se han utilizado ampliamente en la ingeniera gentica de plantas. El montaje de la transfeccin de protoplastos de N. benthamiana con la construccin pTYCU11, permiti la introduccin de esta metodologa en nuestro laboratorio para la evaluacin de las construcciones genticas, con vistas a la posterior transformacin de plantas y la obtencin de plantas transgnicas resistentes al aislado cubano de TYLCV. Estos resultados permitirn continuar los trabajos de transformacin de plantas siguiendo la estrategia de produccin de ARN antisentido, resultados prometedores se han obtenido con la aplicacin de esta estrategia como alternativa al control de enfermedades producidas por geminivirus en cultivos de inters econmico (6). Conclusiones y perspectivas futuras En la actualidad el desarrollo alcanzado por la biologa molecular y la ingeniera gentica unido a la prctica de mtodos convencionales para el control de estas enfermedades han permitido la obtencin de plantas transgnicas con alto potencial de resistencia a enfermedades virales. Diversas estrategias se han diseado, entre las que se encuentran, la resistencia conferida por la protena de la cpsida viral, resistencia mediada por molculas defectivas y la mediada por el uso del ARN viral ya sea por del ARN antisentido y por el denominado PTGS que interfieran con la replicacin viral, para conferir resistencia. Esta ltima destacndose en la actualidad como una de las opciones ms promisorias para la resistencia derivada del patgeno contra las enfermedades causadas por geminivirus. De forma destacada, la tecnologa de transformacin tiene un gran potencial de aplicacin en muchas reas de las ciencias de las plantas, tanto bsicas como aplicadas. La introduccin de transgenes podra facilitar nuevas alternativas en los campos de la gentica, la bioqumica y la fisiologa, y estimular progresos en estos. Los resultados alcanzados al transfectar protoplastos con la construccin pTYCU11 obtenida y la alta expresin de esta quimera en estos indican que la misma se replica de forma eficiente en ellos, lo cual garantiza su posterior uso para la transformacin de plantas y la consiguiente obtencin de plantas transgnicas de tomate y otros hospedantes alternativos del virus, con alta resistencia a este virus. Es una realidad que el advenimiento de los OGMs ofrece nuevas opciones en la alimentacin y agricultura de los pases en desarrollo, pero en la actualidad tambin se habla de la afectacin a la diversidad y ecosistemas naturales que podra conllevar un uso desorganizado, desmedido y de lucro de esta tecnologa. Es importante destacar que es necesario tener en cuenta los riesgos medioambientales potenciales y los beneficios de esta alternativa en el momento de tomar decisiones sobre el uso de OGMs. Las interacciones complejas que pueden ocurrir entre los OGMs y factores medio ambientales necesitan de una fuerte capacidad cientfico-tcnica para evaluar y manejar los riesgos que estos organismos pudieran conllevar. Por otra parte, es necesario el establecimiento de un marco regulatorio internacional de bioseguridad legislativa basado en el protocolo de Cartagena sobre la bioseguridad de la convencin de Diversidad biolgica. AGRADECIMIENTOS Los autores de este artculo desean agradecer a la Comisin Interministerial de Ciencia y Tecnologa de Espaa, por el financiamiento concedido para la ejecucin del proyecto bilateral que permiti la obtencin de los resultados presentados. REFERENCIAS 1. Abel PP, Nelson RS, De B, Hoffmann N, Rogers SG, Fraley RT, et al. 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