ELISA

Dra Morella Bouchard

Instituto de Inmunologa Clnica
Universidad de Los Andes

ELISA
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

Dra Morella Bouchard

Instituto de Inmunologa Clnica
Universidad de Los Andes

Interaccin Antgeno Anticuerpo

ANTGENO

ANTICUERPO

Puentes de
Hidrgeno

Fuerzas que
participan
en la
Interaccin
Antgeno
Anticuerpo

Enlaces
Inicos

Interacciones
hidrofbicas

Fuerzas de van
der Waals

Enlaces Inicos

Caractersticas del Ac relacionadas con

el reconocimiento del Ag
zEspecificidad
zDiversidad
zAfinidad y Avidez

RESPUESTA HUMORAL

ELISA
Descrita por Engvall y Perlman en 1971
Uno de los inmunorreactivos se absorbe a una
fase slida y el otro se marca
con una enzima.
La enzima reacciona con
un sustrato formando un
producto coloreado

Ventajas del ELISA

zMuy sensible
zGran nmero de muestras procesadas
simultneamente.
zResultados rpidos
zUtilizacin de reactivos menos txicos
zMenor costo
zCuantificacin de sustancias diversas:
hormonas
frmacos
citoquinas

metabolitos
mediadores de inflamacin
agentes infecciosos, etc.

toxinas
protenas

Fundamento del ELISA

Ag o Ac
Conjugado:
Ag o Ac
fijado a +
en la
+ Ac unido a + SUSTRATO
una fase
ENZIMA
muestra
slida
CAMBIO
DE
COLOR

Componentes del ELISA

zFASE SLIDA
zAntgeno o Anticuerpo
zConjugado: ENZIMA
zSUSTRATO

SOPORTE SLIDO
Material del Soporte

Formas disponibles

Unin

Nitrocelulosa

Membranas,
Lminas

No covalente

Polivinilo

Placas, Lminas

Covalente

Poliestireno

Placas, Lminas,
Perlas

Covalente

Ltex, nylon, celulosa

y sefarosa

Membranas,
Lminas, Perlas

Covalente

ANTGENO
zCompleto
zExtracto total
zFraccin Purificada
zPptido sinttico
zProtena recombinante

zAnticuerpos Policlonales
Heterogneos
Reconocen eptopes diferentes del Ag
Producidos por numerosos clones de Linfocitos B

zAnticuerpos
Monoclonales
Homogneos
Especificidad nica
Producidos por un nico clon de Linfocitos B

BLOQUEO
Buffer de
bloqueo
Casena

Composicin

5% p/v leche sin grasa

Casena/Tween20 5% p/v leche sin grasa, O,2 %de

Tween20

Tween 20
Gelatina
BSA

O,2 %de Tween

Desventajas
Deteriora rpidamente.
Enmascara algunos
antgenos
Deteriora rpidamente.
Enmascara algunos
antgenos
Podra generar algunos
residuos

Gelatina 0.2% (2mg/ml)

3% de BSA,

Relativamente costoso

MUESTRA
zSuero
zOrina

zSaliva
zLCR
zHeces
zOtros

ENZIMAS
zPeroxidasa
zFosfatasa alcalina
z-galactosidasa
zPenicilinasa
zUreasa
zGlucosa oxidasa

SUSTRATOS
Requerimientos del sustrato
z
z
z
z

Solubles en agua
Fcil de manipular
No txicos, no mutagnicos
Bajo costo

Formacin de colores por la accin enzimtica

sobre diferentes cromgenos
-Nitrofenil Fosfato (NPP)

Fosfatasa
Alcalina

5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato /
nitro azul de tetrazolium (BCIP / NBT)

Naftol AS-TR posfato /fast red RC

Peroxidasa

Amarillo
Prpura
Rojo

2,2-azino-bis (3-etilbenziazoline-6cido sulfnico)

Verde

-fenilendiamino (OPD)

Naranja

3,35,5-tetrametilbencidina base o
Dihidrocloruro (TMB)

Azul

3,3-Diaminobencidina (DAB)

Marrn

3-amino-9-Etilcarbazole (AEC)

Rojo

4-cloro-1-Naftol (4C1N)

Azul

Lavados
Utilizados para separar los componentes
unidos de los libres
Generalmente:
z De 3 a 6 lavados por cada etapa
z Duracin de 30 seg a 1 min c/u
z Se utiliza Buffer fosfato 0.01 a pH 7,2

Revelacin de la actividad
enzimtica
z Incorporacin de cidos o bases
fuertes para detener la reaccin
zLa cantidad de producto enzimtico
formado se determina leyendo la
densidad ptica (DO) con un
espectrofotmetro

FASES DEL ELISA

1. Titulacin de la cantidad de Ag o Ac a utilizar para
sensibilizar la placa.
2. Sensibilizacin
3. Lavado
4. Bloqueo
5. Lavado
6. Incubacin de las placas con las muestras y controles
positivos y negativos
7. Lavado
8. Incubacin del conjugado
9. Lavado
10.Incubacin del sustrato
11.Detenimiento de la reaccin enzimtica
12.Lectura de las placas

TIPOS DE ELISA
z DIRECTO
z INDIRECTO
z COMPETITIVO
z TIPO SANDWICH
z MTODO AVIDINA-BIOTINA

Antgeno
Buffer de bloqueo
Anticuerpo

ELISA INDIRECTO

Conjugado Anticuerpo-Enzima
Sustrato

ELISA SANDWICH
S

Anticuerpo
fijado al
pozo

ELISA SANDWICH
S
lavado

Anticuerpo
fijado al
pozo

Adicin de
la muestra
con
Antgeno a
ser medido

ELISA SANDWICH
S
lavado

Anticuerpo
fijado al
pozo

lavado

Adicin de
la muestra
con
Antgeno a
ser medido

E
E E

Adicin del
conjugado
enzimaAnticuerpo
secundario

ELISA SANDWICH

lavado

Anticuerpo
fijado al
pozo

lavado

Adicin de
la muestra
con
Antgeno a
ser medido

E
E E

Adicin del
conjugado
enzimaAnticuerpo
secundario

S S
lavado

E
E E

Adicin del
sustrato y
medicin
del color

ELISA SANDWICH

lavado

Anticuerpo
fijado al
pozo

lavado

Adicin de
la muestra
con
Antgeno a
ser medido

E
E E

Adicin del
conjugado
enzimaAnticuerpo
secundario

S S
lavado

E
E E

Adicin del
sustrato y
medicin
del color

INTERPRETACIN
DE RESULTADOS

INTERPRETACIN DE RESULTADOS
Incluir controles:
zControl del PBS (blanco)
zControl Negativo
zControl Positivo Bajo
zControl Positivo Alto

Paciente

C
D
E
F
G
H

Control
negativo

B L A N C O S

Control
positivo

Paciente

10

9 10 11 12

1/64

1/256

1/1024

1/4096

1/64

1/256

1/1024

1/4096

3
11

4
12

5
13

6
14

9 10 11 12

15

16

17

18

19

20

REPORTE DE RESULTADOS
REPORTE CUALITATIVO
zPositivo
zNegativo
REPORTE CUANTITATIVO
zng o g/ ml
zUnidades internacionales de ELISA
(EIU)

REPORTE DE RESULTADOS

Pruebas cuantitativas:
z Empleo de controles
negativos, positivos
bajos y positivos
altos para construir
curva de calibracin.

REPORTE DE RESULTADOS
Semicuantitativa
Valor
mnimo =
positivo

Promedio
de los
Controles
Negativos

23
Desviaciones
estndar

PRUEBAS QUE SE REALIZAN CON LA

TCNICA DE ELISA EN EL IDIC
z ANTICUERPOS CONTRA AGENTES INFECCIOSOS
Toxoplasma
Cisticerco
Amibas
CMV
Hepatitis A-B-C
Helycobacter pylori
Epstein Barr
Rubeola
HIV
z ANTGENOS TUMORALES
ACE
CA125
APS
AFP
z AUTOANTICUERPOS
ANA
Anticuerpos antitiroideos
z PROTENAS PLASMTICAS
PCR

FR
Anticardiolipinas

GRACIAS