PRCTICA No.

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DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES
EN AGUA RESIDUAL POR EL MTODO DEL NUMERO MAS PROBABLE
(NMP)

I.

OBJETIVO

Determinar la presencia de coliformes totales y fecales en el efluente de la PTAR

de la UPEMOR por el mtodo del Nmero Ms Probable, utilizando la tcnica de
tubos de fermentacin mltiple.
II.

INTRODUCCION

Debido a que las aguas residuales son de composicin variada provenientes de

descargas de usos municipales, industriales, comerciales, de servicios, agrcolas,
pecuarios, domsticos, incluyendo fraccionamientos y en general de cualquier uso,
as como la mezcla de ellas, contienen diferentes tipos de microorganismos
contaminantes y las diferentes concentraciones, dependiendo de su fuente. La
variada poblacin de microorganismos en esta agua, proviene del suelo y de
origen intestinal, incluyen aerobios y anaerobios estrictos y facultativos as como
tambin numerosos virus como: Poliovirus y virus de la hepatitis. Igualmente
pueden contener formas parasitarias variables como quistes de Protozoarios y
huevecillos de Helmintos (Metazoarios).

Asimismo, existe en nuestro pas el grave problema de contaminacin de ros,

lagos acuferos y costas debido a que estos son utilizados como depsito de todos
los desechos generados por las actividades humanas. Estos microorganismos
pueden sobrevivir al tratamiento, por lo que su reso p.ej., en riego agrcola,
actividades recreativas: Aguas de piscinas, baos de hidromasaje, aguas potables
naturales, actividades pisccolas y aguas marinas superficiales (playas),
representan un riesgo potencial a la salud pblica.

La presencia y extensin de contaminacin fecal es un factor importante en la

determinacin de la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una

variedad de
microorganismos y formas de resistencia de los mismos,
involucrando organismos patgenos, los cuales son un riesgo para la salud
pblica al estar en contacto con el ser humano. El examen de muestras de agua
para determinar la presencia de microorganismos del grupo coliforme que habitan
normalmente en el intestino humano y de otros animales de sangre caliente, da
una indicacin, pues dada la limitada capacidad de algunos miembros del grupo
de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus nmeros tambin pueden
emplearse para estimar el grado de contaminacin fecal.
Son Organismos coliformes aquellos capaces de crecimiento aerbico ya sea 35
37 1C en un medio de cultivo lquido lactosado con produccin de acido y gas
dentro de un periodo de 48 h.
El mtodo de la NPM es un mtodo robusto por lo que puede aplicarse en
cualquier tipo de agua, an aquellos que contienen gran cantidad de materia
orgnica.
Para la determinacin del NMP de Coliformes Totales y Fecales en este tipo de
aguas, es necesario proceder a preparar diluciones decimales de la muestra,
debido a que se espera que la concentracin de coliformes sea superior en stas
que en un agua potable.
El nmero de diluciones vara mucho, dependiendo del origen de la muestra a
tratar. Por lo dems, para su anlisis de procede en la misma forma que para una
muestra de agua potable.
III.

MATERIAL Y SUBSTANCIAS

Muestra de agua de del efluente de la PTAR de la UPEMOR.

Mechero Bunsen.
Cerillos encendedor.
9 tubos de 18 x 150 mm conteniendo 9 mL de agua de dilucin estril.
9 Pipetas de 1 mL estriles.
15 tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo caldo lactosado
estril de concentracin sencilla.
15 tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo Caldo Lactosa
Bilis Verde Brillante estril.
10 tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo caldo E.C. estril.
2 Cajas de Petri conteniendo Agar Endo estril.
5 Tubos de 18 x 150 mm conteniendo agar nutritivo inclinado estril.
Agitador de tubos Vortex.
Gradillas para tubos de 18 x 150 y de 13 x 100 mm.

Asa Bacteriolgica.
Incubadora a 35 C.
Bao Incubador para Coliformes fecales a una temperatura constante de 44 C
(0.5 C).

IV.

METODOLOGA PARA LA PREPARACIN DE MEDIOS Y

SOLUCIONES.

MEDIOS DE AISLAMIENTO:
-Caldo lauril triptosa (CLT).
Triptosa

40.0g

Lactosa

10.0g

Cloruro de sodio (NaCl)

10.0g

Fosfato monobsico de potasio (KH2PO4)

5.5g

Fosfato dibsico de potasio (K2HPO4)

5.5g

Lauril sulfato de sodio

0.2g

Agua para llevar a

1000 cm3

Aadir la triptosa y el cloruro de sodio al agua, calentar para disolver y aadir el

lauril sulfato de sodio. Disolver el resto de los componentes por separado y
agregarlos a los anteriores mezclando suavemente para evitar la formacin de
espuma.

-Caldo bilis lactosa verde brillante:

Peptona

10.0g

Lactosa

10.0g

Bilis de buey (deshidratada)

20.0g

Verde brillante (1% m/m en solucin acuosa)

13 cm3

Agua para llevar a

1000 cm3

-Medio EC:
Triptosa o tripticasa

20.0g

Lactosa

5.0g

Mezcla de sales biliares

1.5g

Fosfato dibsico de potasio (K2HPO4)

4.0g

Fosfato monobsico de potasio (KH2PO4)

1.5g

Cloruro de sodio (NaCl)

5.0g

Agua para llevar a

1000 cm3

Distribuir el medio de simple concentracin en volmenes indicados en cada tubo

que debe contener un tubo de fermentacin invertido (Durham). Colocar en
autoclave y esterilizar. Disolver los componentes por separado y agregarles
agitando suavemente y esterilice.
Nota:
Como medio confirmativo para coliformes totales, el ms generalizado es el caldo
de bilis lactosa verde brillante (BLVB). Para confirmar la presencia de coliformes
fecales se utilizan tanto el BLVB como el caldo EC.
V.

TECNICA

PRUEBA PRESUNTIVA
Todas las operaciones debern efectuarse en absolutas condiciones de
asepsia.
1. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces para lograr una
distribucin uniforme de los microorganismos.
2. Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano esperado
preparar diluciones.
3. Para preparar las diluciones, con una pipeta estril tomar una alcuota de 1
mL de la muestra original y llevarlo a uno de los tubos conteniendo 9 mL de

agua de dilucin estril, obteniendo de esta manera una dilucin de 10 -1.

(Fig. 7.1)
4. Agitar el tubo de la dilucin 10-1 y con otra pipeta estril tomar una alcuota
de 1 mL y llevarlo a otro tubo con 9 mL de agua de dilucin estril para
obtener una dilucin de 10-2.
5. Proceder de la misma manera hasta obtener una dilucin de 10 -3 o hasta
donde sea necesario.
6. Inocular aspticamente con 1 mL de muestra por triplicado, tubos de
fermentacin conteniendo caldo lactosado o caldo lauril triptosa, a partir de
las ltimas 3 diluciones y conservar todas las anteriores en refrigeracin por
si se requiere su utilizacin posterior.
7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 C durante 24horas.
8. Despus de 24 horas de incubacin efectuar una primera lectura para
observar si hay tubos positivos, es decir, con produccin de cido, si el
medio contiene un indicador de pH, turbidez y produccin de gas en el
interior de la campana Durham.
9. Al hacer esta verificacin es importante asegurarse que la produccin de
gas sea resultado de la fermentacin de la lactosa, en cuyo caso se
observar turbidez en el medio de cultivo, y no confundir con burbujas de
aire.
10. .Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las
campanas Durham antes de proceder a la inoculacin y desechar aquellos
tubos cuyas campanas contengan burbujas de aire de alguna manera
eliminar stas y as poder utilizarlos.
11. De los tubos que en la primera lectura den positivos, ya se pueden hacer
las pruebas confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales.
12. En caso de no apreciarse crecimiento en el resto de los tubos, continuarn
en incubacin 24 horas ms.
13. Despus de 48 horas ( 2h) a partir de la inoculacin, se hace la lectura
final. 14. Si pasadas 48 h tampoco se aprecia crecimiento ni produccin de
gas, los tubos se toman como negativos.
INTERPRETACIN:

Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado,

reportando la AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en
la muestra analizada.
Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se
anotarn convenientemente y se proceder a realizar la PRUEBA
CONFIRMATORIA para Coliformes Totales y Fecales.

PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES:

1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba
presuntiva, agitndolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos
conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB).
2. Incubar durante 48 3 h a 35 0.5 C.
3. Despus de la incubacin observar la presencia de turbidez y de gas.
INTERPRETACIN:

Si se observa turbidez y produccin de gas: La prueba se considera

POSITIVA, debiendo anotar el nmero de tubos positivos para
posteriormente hacer el clculo del NMP.

Si en ninguno de los tubos se observa produccin de gas, aun cuando

se observe turbidez: Se consideran NEGATIVOS, establecindose el
Cdigo 0,0,0 para efecto del clculo del NMP

Si todos los tubos dan negativos todos dan positivos, con base en
los grados de dilucin analizados, considerar la necesidad de repetir el
anlisis a partir de grados de dilucin menores (mayores volmenes de
muestra) mayores (menores volmenes de muestra), respectivamente.

PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES:

1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba
presuntiva, agitndolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos
conteniendo caldo E.C. (Escherichia coli).
2. Incubar durante 24 horas a 44.5 0.2 C. y despus de este perodo,
observar presencia de turbidez y gas.
INTERPRETACIN:

Si se observa turbidez y produccin de gas: La prueba se considera

POSITIVA, debiendo anotar el nmero de tubos positivos y establecer el
cdigo para posteriormente hacer el clculo del NMP, (Figs. 7.2 y 7.3)
Si no se observa produccin de gas, aun cuando se observe turbidez:
Se consideran negativos, establecindose el Cdigo 0,0,0 para efecto del
clculo del NMP.
Si todos los tubos dan negativos todos dan positivos, con base en
los grados de dilucin analizados, considerar la necesidad de repetir el
anlisis a partir de grados de dilucin menores (mayores volmenes de
muestra) mayores (menores volmenes de muestra), respectivamente.

VI.

CLCULOS

De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para Coliformes

Totales y Fecales, establecer los cdigos correspondientes para calcular por
referencia en las tablas estadsticas (Tablas 7.1) el NMP de Coliformes Totales y
Fecales en 100 mL de agua.
En caso de no encontrar en las tablas la combinacin de tubos adecuada, emplear
para los clculos la siguiente ecuacin:

VII.

ELABORACIN Y PRESENTACIN DE RESULTADOS.

Los resultados se elaboran de la siguiente manera:

Si se han realizado diluciones, se ha de obtener una serie final con valor

cero.
A continuacin se establece el triplete de valores correspondiente a las tres
series anteriores a la del valor cero que podr ser leda en la tabla del
NMP.
Para efectos de expresar el valor obtenido basndose en 100 mL de
muestra habr de dividirse el resultado de la tabla por el volumen real de
muestra inoculada en cada tubo de la serie central de cada triplete
escogido.

En general se tiene:

Los resultados obtenidos se expresarn de la siguiente manera:

NMP DE COLIFORMES TOTALES: __________ / 100 mL
NMP DE COLIFORMES FECALES: __________ / 100 mL

VIII.

CUESTIONARIO

1. Cules son los lmites mximos permisibles de Coliformes. Fecales para

las descargas de aguas residuales vertidas a aguas y bienes nacionales as
como a suelo?
2. Mencionar 5 enfermedades transmitidas por el agua, indicando el agente
etiolgico correspondiente.
3. Adems de representar un riesgo para la salud pblica el vertido de aguas
residuales tratadas inadecuadamente o sin tratar a los depsitos naturales,
Qu otros efectos indeseables puede representar?
4. Cules son los lmites mximos permisibles de Coliformes Fecales en
aguas residuales tratadas que se resan en servicios al pblico? Indicar
NOM

.
Figura 7.1 Preparacin de diluciones decimales

Figura 7.2 Cdigo de NMP, 5,2,1

Figura 3. Ejemplo de tabla de resultados de coliformes totales y fecales

Tabla 7.1 Tabla para el clculo del NMP

IX.

BIBLIOGRAFA

Secretaria de Comercio y Fomento industrial. 1987. NNX-AA-42-1987. Calidad del

agua determinacin del numero ms probable (NMP) de coliformes totales,
coliformes fecales (termotolerantes) y Escherichia Coli presuntiva. 21 p.