HEMOGRAMA

AUTOMATIZADO
BQCO. GONZALO OJEDA
HEMATOLOGA CLNICA
FaCENA UNNE
2013

AUTOMATIZACIN EN
HEMATOLOGA

Exactitud
Precisin
Rapidez
Standarizacin
Screening

TOMA DE MUESTRA Y
PROCESAMIENTO

Sangre entera(EDTA-K3)
Volumen requerido
Procesamiento dentro de
las 8 h
Conservar refrigerada
Temperatura ambiente

PRINCIPIOS DE MEDICION
Impedancia Elctrica
Espectrometra de Absorcin
Citometra de Flujo
Dispersin ptica
Fluorescencia
Citoqumica: Peroxidasa

EQUIPOS
IMPEDANCIA + ESPECTROMETRA
ABSORCIN : COULTER (RBC-INDICE
HEMATIMTRICOS PLT WBC HB)
IMPEDANCIA + RADIOFRECUENCIA +
ESPECTROMETRA DE ABSORCIN: 3
DIFF
IMPEDANCIA + RADIOFRECUENCIA +
ESPECTROMETRA + DISPERCIN DE
LUZ/FLUORESCENCIA/ OTRA : EQUIPOS
5 DIFF

PRINCIPIO COULTER
Wallace Coulter (1913-1998)

IMPEDANCIA ELECTRNICA Y
RADIOFRECUENCIA
Impedancia electrnica o la resistencia a la
corriente continua (cc) de bajo voltaje fue
desarrollada por Wallace Coulter en la
dcada de 1950 y es la metodologa
utilizada con mayor frecuencia
La radiofrecuencia (RF) o la resistencia a la
corriente electromagntica de alto voltaje a
veces se utiliza junto con la impedancia
electrnica de la CC.

IMPEDANCIA ELECTRNICA
El principio de impedancia en el recuento
de clulas se basa en la deteccin y
medicin de cambios en la resistencia
elctrica producida por las clulas cuando
atraviesan una apertura pequea
Las clulas suspendidas en un diluyente
conductor de la electricidad ,se arrastran a
travs de una apertura (orificio) en un tubo
de vidrio

RECUENTO DE
PLT Y RBCs

Impedancia Volumtrica
N Pulsos :proporcional al N de clulas
Amplitud del pulso :proporcional al tamao
de la clula

El numero de pulsos es proporcional

al numero de clulas contadas
El tamao del pulso de voltaje es
proporcional al tamao de la clula
(volumen)
Lo que permite la discriminacin y el
conteo de clulas de tamao
especifico

INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS
SANGUINEOS.

CLASIFICACION DE LOS IMPULSOS

ELECTRICOS GENERADOS POR RBC Y
PLT.

RBC`s

Plaquetas.

Los pulsos se renen y ordenan

(canalizan) segn su amplitud mediante
analizadores de la altura de pulsos
Los datos se trazan en un grafico de
distribucin de frecuencias o histograma
de distribucin de tamao con el numero
relativo en el eje de las y el tamao (
numero del canal equivalente al tamao
especifico) en el eje de las x
El histograma producido representa la
distribucin del volumen de las clulas
contadas

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

Histograma de Eritrocitos

INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS
SANGUINEOS.

INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS
SANGUINEOS.
Limite flotante
para divisin de
PLQ/RBC

Media

MCV

Ancho de Distribucin

Conteo por impedancia: RBC y PLT

MCV
PLQ's

Zona Microcitica.
Zona Macrocitica.
Linfocitos.

50

100 150 200 250 300 350

Conteo por impedancia: RBC y PLT.

PLQ's

Ancho de Distribucin
Eritroctica.

50

100 150 200 250 300 350

ADE RDW INDICE DE

ANISOCITOSIS
La amplitud de distribucin eritrocitaria (RDW)
se calcula a partir del histograma como el
coeficiente de variacin de la distribucin del
volumen eritrocitario. Con valores de
referencia de 11.5-14 %
El RDW es un ndice de anisocitocis, que en
realidad refleja la relacin entre la desviacin
estndar y el VCM
El VCM es un promedio tomado de los datos
de distribucin eritrocitaria de tamao.

Qu significa RDW?
RDW Ancho de la distribucin de la curva de los eritrocitos

Dos

frmulas matemticas usadas para describir la variacin

de tamao de los eritrocitos (Anisocitosis).

RDW-CV

Definicin: Es el coeficiente de
variacin alrededor de la media
(X) correspondiente a la curva
de distribucin del volumen de
los glbulos rojos
VR: 11.5 14 %

RDW-SD
Definicin: Medida directa (en fl) del ancho de la
curva de los glbulos rojos (RBC) Tomada 20%
arriba de la lnea base
El ancho es medido al 20% de la altura relativa. A
esta altura es donde se encuentra la mayor
variacin de tamaos de las clulas

RDW-SD
Histograma de Eritrocitos
Altura
relativa

La curva ms ancha
Representa a la poblacin
Con mayor anisocitosis

20%
Tamao de los Eritrocitos en fl

Conteo por impedancia: RBC y PLQ.

Macrocitosis.

50

100 150 200 250 300 350

Conteo por impedancia: RBC y PLQ.

Macrocitosis.
MCV aprox. de 102 fl

50

100 150 200 250 300 350

Conteo por impedancia: RBC y PLQ.

Microcitosis.

50

100 150 200 250 300 350

Conteo por impedancia: RBC y PLQ.

Microcitosis.

MCV Aprox de 70 fl

50

100 150 200 250 300 350

FACTORES QUE PRODUCEN

INTERFERENCIA
FACTORES

PARMETRO
AFECTADO

Crioaglutinina

GR ,VCM ,CHCM

Aglutinacin de GR

Lipemia ,ictericia
,quilomicrones

Hb

La turbidez afecta la
lectura
espectrofotomtrica

HbCM

Hemlisis

GR , Hto

Gr lisados y no
contados

GR resistentes a la
lisis con Hb
anormales

GB , Hb

Gr (Hb : S,C,F) no
pueden lisarse y se
cuentan como GB

Microcitosis o
esquistocitos

GR

El tamao
eritrocitario < que el
umbral

GR nucleados
,fragmento de
Megacariocitos

GB

Se cuentan como GB

Histograma de plaquetas.

Histograma de plaquetas.

Lmite para la Zona para

clculo del
zona de
. VPM
plaquetas.

2 fl

Plaquetas

Lmite flotante
para divisin de
PLQ/RBC

35 fl

Histograma normal de plaquetas.

10

15

20

25

30

35

INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS
SANGUINEOS.
Histograma normal de plaquetas.
El punto de partida debe ser 2 fl en la
base del histograma.

10

15

20

25

30

35

INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS
SANGUINEOS.
Histograma normal de plaquetas.
El VPM es la media
aritmtica de la poblacin de
plaquetas.
No ser calculado en
presencia de alertas de
plaquetas.
2

10

15

20

25

30

35

INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS
SANGUINEOS.
Histograma normal de plaquetas.

El histograma debe hacerse

asinttico con la horizontal hacia
los 25-30 fl

10

15

20

25

30

35

ALARMAS PARA RBC Y PLT

RBC/MORPH
LRI
URI
LURI

PSEUDOAGLUTINACIN CON
EDTA

IMPORTANCIA DEL FROTIS DE

PUNTA DE AGUJA
RECUENTO VS ESTIMACIN

RECUENTO POR
IMPEDANCIA DE
WBC

RECUENTO DE LEUCOCITOS
El conteo se realiza en un transductor de Von Behrens.
Los impulsos elctricos detectados son clasificados y
almacenados en un histograma con canales de 1 fl de ancho

SOBREESTIMACIN POR
PRESENCIA DE
ERITROBLASTOS
Ej: WBC 30.000 /mm3
200 eritroblastos por cada 100 GB
300 (WBC+EB)-----------100
30.000 ---------------------x=10.000
Gb corregidos= Gb contador (Gb contador x 100)
(EB+100)

Conteo por impedancia: WBC.

Histograma Normal de Leucocitos por

Impedancia.

50

100 150 200 250 300 350

Conteo por impedancia: WBC.

Histograma Normal de Leucocitos por

Impedancia.
LIM

50

MID

GRAN

100 150 200 250 300 350

Conteo por impedancia: WBC.

Histograma Normal de Leucocitos por

Impedancia.
Ubicacin Normal del pico
LIM es entre 50-75 fl

50

100 150 200 250 300 350

Conteo por impedancia: WBC.

Histograma Normal de Leucocitos por

Impedancia.
MID

50

La regin MID debe ser

un valle entre las
regiones LIM y GRAN.

100 150 200 250 300 350

ALARMAS

DOSAJE DE HEMOGLOBINA
Se utiliza el sobrante de la dilucin con que se
realiz el conteo de WBC.
Mtodo de la Cianmetahemoglobina
Se realiza la lectura en la celda de
hemoglobina a 540 nm con un blanco para
cada muestra.
El valor de absorbancia obtenido se interpola
en la curva de calibracin almacenada en el
instrumento.

DISPERSIN
PTICA

Una corriente de muestra centrada en forma

hidrodinmica se dirige a travs de un
cuarzo para flujo celular por el que pasa una
fuente de luz centrada (un lser de helio
nen polarizado en sentido vertical). La luz
dispersada se divide en varios ngulos
Se utilizan varias combinaciones de estas
mediciones para diferenciar y cuantificar las
cinco subpoblaciones leucocitaria principales
:neutrfilos ,linfocitos ,monocitos , eosinfilos
y basfilos

Enfoque hidrodinmico
Minimiza la
acumulacin de
protenas
Elimina la circulacin
retrograda
Reduce la
irregularidad de la
altura de pulso
Reduce la perdida
por pasaje
coincidente

Enfoque analtico
Iluminado por medio de
un laser helio nen
Enfocado
hidrodinmicamente a
traves de una celda de
flujo de diseo especial
Medicin de las
carcteristicas de
dispersin ptica de la
luz para las celdas
individuales

Separacin por dispersin polarizada

con mltiples ngulos (M.A.P.S.S).
-La dispersin frontal de luz 0 :se usa para
determinar el TAMAO CELULAR (FORWARD
SCATTER)
-La dispersin ortogonal de 90 : para determinar
la LOBULARIDAD CELULAR. (SIDE SCATTER)
-La dispersin de la luz en ngulo estrecho de
10:se correlaciona con COMPLEJIDAD
CELULAR (SIDE SCATTER)
-La dispersin de luz despolarizada de 90 (90D)
para evaluar la GRANULARIDAD CELULAR.

 El citograma MAPSS
final muestra los eventos
de celdas individuales
los cuales se definen por
medio del uso del color

TECNOLOGIA CVS

La muestra una vez tratada es dirigida a una

celda de flujo (Flow cell) en la cual por el diseo
hidrodinmico, los leucocitos se alinean y pasan
formados uno a uno y en donde se realizan las
siguientes mediciones

 Volumen
Mediante impedancia de baja frecuencia se determina el
volumen de la clula
Impedancia (resistencia a la cc de bajo voltaje)

 Conductividad
La densidad interna de la clula es proporcional al
tamao del pulso o al cambio de la seal de
Radiofrecuencia
RF(ola resistencia a la corriente magntica de alta
voltaje)

 Scatter
La dispersin (scatter) de luz lser indica la estructura y
forma de la clula

Los cambios de voltaje de CC y RF pueden

detectarse en forma simultnea

Pueden graficarse en forma comparativa la impedancia y la conductividad :se forma

Un citograma de distribucin bidimensional ,este trazado de dispersin muestra poblaciones
celulares como cmulos <por anlisis computarizado se determinan los recuentos celulares

 DF1: Volumen vs. Scatter

El trazado de dispersin de la funcin de discriminacin
DF1 del volumen vs dispersin de la luz muestra. una
separacin clara de Nt ,L y, Mo, Eo

Sysmex XS-1000i

Descripcin del Cell Dyn 3200

Tecnologa ptica :PLT,WBC;RBC
Tecnologa diferencial MAPSS
Reticulocitos

OTRAS TECNOLOGAS

Tecnologa para Hemoglobina

Reactivo libre de cianuro

Grupo hidrofbico del SLS que se une a la molcula de la globina

Ocurre un cambio de configuracin
Oxidacin de Fe 2+ --> Fe 3+
Grupos Hidroflicos de SLS se unen a Fe --> SLS-Hb

Fe 3+

Fe 2+

SLS

Fe 3+

Sysmex XS-1000i
Tecnologa
En los Xs el Hto se mide
electrnicamente, basado en
el principio de que el pulso
producido cuando un Gr
pasa a travs de la apertura
es proporcional al volumen
de la clula
El Hto se determina
comparando el volumen total
o acumulado de Gr con el
volumen de sangre completa
en la dilucin

Por Citometra de Flujo se obtiene informacin

acerca de la composicin y madurez celular
Fluorescencia

Informacin del contenido de RNA y

DNA
Dispersin lateral

Informacin de la estructura
interna
Lser
Dispersin frontal

Tamao de la clula

Sysmex XS-1000i
Tecnologa

Cuantificacin de Grnulos Inmaduros

Informacin til sobre el diferencial
extendido de leucocitos

IG:
promielocitos
mielocitos
metamielocitos

Maduracin de neutrfilos
Blastos

promielo

mielo

IG

metamielo

bandas

segmentos

Cuantificacin de Grnulos Inmaduros

IG Master
Canal del diferencial

Normal
IG % , #

Dispersin lateral

Deteccin de los RBC resistentes a la

hemlisis

Conteo ptico nucleado NOC

Anlisis ptico de las plaquetas

Por medio del uso de
un enfoque de
dispersin ptica de
la luz con ngulo
dual se logra una
buena separacin de
los GR y las plq
Ademas , la
presencia de los
cmulos de plq se
puede detectar en
forma confiable

Medida de los eritroblastos

Los EB son contados y separados de los WBC
basados en su tamao y cantidad de
fluorescencia

Recuentos de Reticulocitos
Mtodo de Referencia: Azul de Metileno
Variacin entre observadores
Altos coeficientes de variacin
Laboriosos
Mtodos automatizados
Azul de metileno
Fluorescentes

Canal reticulocitos - Fluorescente

RETSEARCH II (Diluyente + Colorante)

WBC

RET

Tincin:
Polimetino: ARN
Oxazina: ADN
Fl muy alta

Fl alta

RBC
Fl baja

Canal de los reticulocitos

..
.

Utilidad Clnica - FIR

Confirmacin de Anemia Aplstica
Permite la clasificacin de anemias por su
capacidad eritropoytica

..
.

Talasemia vs. deficiencia de Hierro

Anemia de los procesos crnicos
Hipoproduccin vs. respuesta eritroide
temprana

Deteccin de implante correcto luego de

transplante

Contenido de Hb de los reticulocitos

Ret-He
Reticulocitos con contenido de Hb
<28pg Hipocrmicos
Son identificados con colorantes
fluorescentes por la posicin en el
dispersograma de acuerdo con la
fluorescencia y la luz dispersada
frontalmente

Contenido de Hb de los reticulocitos

Ret-He