Extraccin De ADN Minipreparacin

Modificado de Dellaporta
1. Colectar, 1 hoja o cogollo la mitad de una hoja madura; aproximadamente 0.150.2 gr de tejido.
2. Macerar en un mortero con nitrgeno lquido.
3. Transferir a un tubo eppendorf, de 1.5 ml fro, use una esptula fra.
4. Adicionar 800 lde buffer de extraccin, precalentado a 65C, y 50 I de SDS 20%.
(no manipular ms de 36 tubos eppendorf).
5. Agitar vigorosamente el tejido hasta que se mezcle bien con el buffer,continuar
mezclando durante 1 min.
6. Incubar en bao mara a 65C, y mezclar por inversin 5-6 veces, durante15 min.
7. Retirar los tubos del bao y dejar enfriar a temperatura ambiente,aproximadamente
2min.
8. Adicionar 250l de Acetato de Potasio 5M fro, mezclar por inversin suave5-6
veces.
9. Incubar en hielo durante 20 min.
10. Centrifugar a 12000 rpm en una centrifuga eppendorf durante 10 min.
11. Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo de 1.5 mI.
12. Adicionar un volumen de isopropanol fro (aprox. 700l), Y mezclar porInversin
suave 8-10 veces.
13. Incubar a -80C durante 1 h, Y centrifugar a 12000 rpm durante 10 min.
14. Eliminar el sobrenadante y remover el exceso de isopropanol invirtiendo lostubos
sobre una toalla de papel.
15. Resuspender el precipitado en 500 lde T50El0 (50mM Tris-HCI/lOMmEDTA),
incubar a 65C preferiblemente durante 10 a 15 min con agitacinsuave y constante.
16. Adicionar un volumen de isopropanol fro (500 l) Y mezclar por inversinsuave 810 veces.
17. Incubar a -80C durante 1 h, Y centrifugar a 12000 rpm durante 1Omin.
18. Eliminar el sobrenadante, y remover el exceso de isopropanol invirtiendo lostubos
sobre una toalla de papel. Dejar los tubos sobre la toalla de papeldurante 1 h, para
que el precipitado quede bien seco.
19. Adicionar 100-200 I de TlOEl (10mM Tris-HCI/1Mm EDTA, que contiene10
mg/ml RNAsa, dependiendo del tamao del precipitado). Guardar los tubosa 4C
toda la noche, o incubar a 65C para disolver el precipitado.
20. Transferir a tubos eppendorfy correr 2 lde muestra en un gel de agarosapara ver la
calidad.
21. Guardar el ADN a -20C paraalmacenar a largo plazo a 4C si se va a almacenar
durante 1 o 2 das.

Buffer de Extracccin (Para 1 litro de solucin).

Reactivo
Volumen
lOOmMTrs-HCl
100 ml de IM Tris-HCI

50mM EDTA
500mMNaCI

100 ml de O.5M EDTA

100 ml de 5M NaCI

Completar el volumen con agua deionizada.

Autoclavar durante 15 min.
Adicionar 1%. (w/v) de PVP; disolver.
Adicionar 700 l de 2p-Mercaptoetanol.
Precaucin: El 2p-Mercaptoetanol es altamente txico, debe usarse guantes y mascarilla
para manipularlo.

Anexo 2

Extraccin De ADN Minipreparacin

Tomado de Dellaporta, (modificado-laboratorio de gentica y biologa molecular)
1.
2.
3.
4.

Colectar hojas tiernas, aproximadamente 0.15-0.2 gr de tejido.

Macerar en un mortero con nitrgeno lquido.
Transferir a un tubo eppendorf, de 1.5 ml fro, use una esptula o asa fra.
Adicionar 800 lde buffer de extraccin, a temperatura ambiente, y 50 I de SDS
20%.
5. Agitar vigorosamente el tejido hasta que se mezcle bien con el buffer,continuar
mezclando durante 1 min manualmente.
6. Incubar en bao mara a 65C, y mezclar por inversin 5-6 veces, durante15 min.
7. Retirar los tubos del bao y dejar enfriar a temperatura ambiente,aproximadamente
2min.
8. Adicionar 250l de Acetato de Potasio 5M fro, mezclar por inversin suave5-6
veces.
9. Incubar en hielo durante 20 min.
10. Centrifugar a 12000 rpm en una centrifuga eppendorf durante 10 min.
11. Transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo de 1.5 mI.
12. Adicionar un volumen de isopropanol fro (aprox. 700l), Y mezclar porInversin
suave 8-10 veces.
13. Incubar a -20C durante 30 min y centrifugar a 12000 rpm durante 10 min.
14. Eliminar el sobrenadante y remover el exceso de isopropanol invirtiendo lostubos
sobre una toalla de papel.
15. Resuspender el precipitado en 500 lde T50El0 (50mM Tris-HCI/lOMmEDTA),
incubar a 65C preferiblemente durante 10 a 15 min con agitacinsuave y constante.
16. Adicionar un volumen de isopropanol fro (500 l) Y mezclar por inversinsuave 810 veces.
17. Incubar a -20C durante 30 min y centrifugar a 12000 rpm durante 1Omin.
18. Eliminar el sobrenadante, y remover el exceso de isopropanol invirtiendo lostubos
sobre una toalla de papel. Dejar los tubos sobre la toalla durante 10 min aprox. para
que el precipitado quede bien seco.

19. Adicionar 100-200 I de TlOEl (10mM Tris-HCI/1Mm EDTA, que contiene10

mg/ml RNAsa, dependiendo del tamao del precipitado). Guardar los tubosa 4C
toda la noche, o incubar a 65C para disolver el precipitado.
20. Transferir a tubos eppendorfy correr 2 lde muestra en un gel de agarosapara ver la
calidad.
21. Guardar el ADN a -20C paraalmacenar a largo plazo a 4C si se va a almacenar
durante 1 o 2 das.
CIAT -Protocolo de Laboratorio 4
Buffer de Extracccin (Para 10 ml de solucin).
Reactivo
Volumen
lOOmMTrs-HCl pH 7,5
1 ml de IM Tris-HCI
50mM EDTA
1 ml de O.5M EDTA
500mMNaCI
1 ml de 5M NaCI
Agua deionnizada
7 ml
Autoclavar durante 15 min.
Adicionar 1%. (w/v) de PVP); disolver.
Adicionar 7l de 2p-Mercaptoetanol.
Precaucin: El 2p-Mercaptoetanol es altamente txico, debe usarse guantes y mascarilla
para manipularlo.
Nota:adicionar el PVP y el 2p-Mercaptoetanol justo antes de utilizar el buffer.
Los 10 ml de buffer de extraccin preparado, alcanza para tratar xx muestras.