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hormonas (gonadotrofina de suero de yegua preada-PMSG y gonadotrofina corinica humana-hCG) que imitan las hormonas naturales de la hembra pero producen un nmero muy
grande de folculos y por lo tanto de ovulaciones. La edad ideal para la estimulacin hormonal
vara con las lneas, pero, en general, es entre 3 y 4 semanas. La hormona PMSG se inyecta
usualmente a las 2 p.m. del da 1 y la hormona hCG al medioda del da 3 (aproximadamente
48 horas ms tarde que PMSG). La superovulacin, al igual que la ovulacin natural, estimula
el inters del macho por copular y la aceptacin por parte de la hembra, lo que facilita la estandarizacin de los protocolos.
Es importante destacar que la respuesta a la superovulacin vara enormemente entre las lneas consanguneas de ratones, fenmeno nada inesperado por cierto. Entre las lneas de alta
produccin de embriones (40-60 embriones por hembra) se encuentran C57BL/6,
BALB/cByJ, 129/SvJ (ahora 129X1/SvJ), CBA/CaJ y SJL/J. Las lneas de bajo rendimiento (menos de 15 embriones por hembra) son A/J, C3H/HeJ, BALB/cJ, 129/J (ahora 129P3/J) y
DBA/2J. La lnea FVB/J se encuentra en el medio de estos dos grupos con una produccin de
alrededor de 25 embriones por hembra. Es interesante observar el caso de dos sublneas que
evidencian fenotipos opuestos ante la superovulacin, como son BALB/cJ versus BALB/cByJ.
Este hallazgo sugiere que an cambios muy sutiles en el genotipo pueden tener efectos muy
grandes sobre este rasgo reproductivo.
Las hembras que han ovulado, ya sea naturalmente o en forma inducida, deben recibir el servicio de un macho frtil (entre 2 y 8 meses de edad) para producir los embriones que sern
utilizados para la microinyeccin. Aquellos machos que han sido previamente probados con
otras hembras y han demostrado un buen ndice de formacin de tapn vaginal (indicativo
de cpula), sern los ideales para este propsito. Para obtener resultados ptimos se debe
mantener un macho y una hembra por jaula y una vez comprobado el servicio (por la presencia del tapn vaginal) dejar descansar al macho por 2 3 das antes de colocarlo con otra
hembra. Normalmente, la maana siguiente al servicio se sacrifica la hembra y se extraen los
oviductos, se realiza un lavado (en ingls, flushing) de los mismos y se recogen los embriones
en una placa de Petri con medio de cultivo adecuado. Luego se separan los embriones (recordar que son unicelulares) entre s y se los libera de las pegajosas clulas del cmulo para
dejarlos aislados en microgotas. Finalmente se los vuelve a colocar en medio de cultivo limpio,
se los evala al microscopio ptico y se los deja en incubacin hasta el momento de la microinyeccin del ADN (ver ms adelante).
8.1.2.2 Transferencia de embriones
Una vez que hemos mantenido los embriones en cultivo (e inyectado el ADN en el proncleo), estamos en condiciones de colocarlos en el tracto reproductivo de una hembra receptora o madre adoptiva (en ingls, foster mother) que ha sido cruzada con un macho estril, con el
fin de que los embriones se desarrollen a trmino. Las hembras receptoras se anestesian y se
exteriorizan los oviductos para proceder con la transferencia. Para tal propsito se usa una pipeta especial de trasferencia (de vidrio y con un dimetro interno menor a 150 m) la cual se
carga alternando burbujas de aire y medio de cultivo con embriones (Figura 8.1).
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Las consideraciones para elegir este vientre sustituto deben involucrar solamente los aspectos reproductivos y no los genticos, ya que estas hembras no aportarn material gentico a
Figura 8.1. Diagrama de la pipeta de transferencia de embriones. Primero se llena la pipeta con medio de cultivo (por
ejemplo M2), luego se toma una burbuja de aire, otra vez medio y una segunda burbuja de aire. Se toman los embriones alineados
uno tras otro con la menor cantidad de medio posible entre ellos. Se toma una tercera burbuja de aire y un poco de medio. Este orden: medio-aire-embriones es esencial para controlar la manipulacin durante la transferencia.
los recin nacidos. Las hembras receptoras deben tener un buen funcionamiento reproductivo y un comportamiento maternal adecuado. Para este propsito se suele utilizar hembras
provenientes de grupos (stocks) exocriados, como CD-1, CF-1 y todos los derivados de la familia Swiss Webster, o hbridos F1 entre lneas consanguneas estndar [por ejemplo
(C57BL/6 x CBA)F1]. Otra consideracin a la hora de elegir la hembra receptora de los embriones es la posibilidad de que el investigador pueda distinguir (sin genotipar) las cras provenientes del transplante embrionario de posibles cras naturales de esa hembra. Como veremos ms adelante, esta preocupacin est basada en que la ciruga para producir el macho
estril (vasectoma) puede haber fallado y el macho retiene entonces cierto nivel de fertilizacin. Esto se soluciona muy fcilmente con la eleccin de un color de pelaje adecuado. Por
ejemplo, si los embriones transplantados son pigmentados, la hembra receptora y el macho
vasectomizado deben ser albinos; si los embriones transplantados son albinos, el macho vasectomizado debe ser pigmentado (el 100% de las cras potenciales de este macho sern
pigmentados).
8.1.2.3 Induccin de pseudopreez
La induccin del estado de pseudopreez es fundamental debido a que los roedores (y muchos mamferos), a diferencia de los primates, necesitan el estmulo del acto sexual para preparar el tracto reproductivo para la implantacin de los embriones. Este estmulo tambin genera cambios hormonales que alterarn el ciclo estral de la hembra y llevarn la preez a trmino. Cuando tiene lugar una estimulacin sexual exitosa pero sin posterior implantacin de
embriones se habla de estado de pseudopreez. Esto es crucial para el xito del transplante
embrionario, de otra forma los embriones transplantados no se implantarn y no habr desarrollo embrionario. La pseudopreez se puede lograr por medio del servicio de un macho
estril o a travs del uso de aparatos de masturbacin, aunque el servicio natural es mucho
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ms eficiente. Si bien existe la posibilidad de usar machos genticamente infrtiles (por mutaciones o rearreglos cromosmicos), el mtodo ms comn para producir machos estriles es
la vasectoma, ciruga muy simple que consiste en remover un trozo de ambos vasos deferentes. Los hbridos F1 y los ratones exocriados son los ms utilizados para este propsito. Es
conveniente probar el xito de la vasectoma colocando al macho junto a hembras frtiles antes de su uso de rutina. Para una descripcin ms detallada de estos procedimientos visitar los
sitios de Internet del Anexo III o consultar los manuales especficos mencionados en la Bibliografa General de este captulo.
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Figura 8.2. Modelos transgnicos. El esquema muestra algunas de las posibilidades que brinda un ratn transgnico que sobre
expresa un oncogn como modelo en oncologa experimental. En el ejemplo se observa el oncogn Hras1 (ras) bajo la influencia de
un promotor especfico de epitelios, lo que genera tumores de piel.
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dores (promotores, secuencias activadoras, etc.) son las secuencias de ADN responsables de
que nuestro transgn se exprese en un determinado tipo celular y/o momento del desarrollo.
Este concepto es importante ya que podemos dirigir la sobreexpresin del transgn hacia los
tejidos de nuestro inters. Por ejemplo, si utilizamos el promotor de la queratina 5 (K5 o keratin 5) tendremos expresin del transgn en la epidermis y en el epitelio del timo, con posibles fenotipos en esos tejidos. Tambin se pueden incorporar promotores que se expresen
en forma ubicua, lo que llevar a la expresin del transgn en todos los tejidos, como sucede
con el promotor del gen metalotionina (inducible ante la exposicin de metales pesados) y el
promotor de la actina del pollo.
Es recomendable incorporar a la construccin transgnica, bajo las rdenes de las mismas
secuencias reguladoras, un gene reportero (del ingls reporter gene) que nos permita analizar fcilmente la expresin. Uno de los ms empleados es el gen lacZ, que codifica para la
enzima bacteriana -galactosidasa, ya que permite la deteccin rpida y sensible de la expresin del transgn por medio de la coloracin de embriones enteros o tejidos. La coloracin azul-verdosa obtenida luego del protocolo especfico nos indicar cuales son los animales transgnicos (normalmente se corta la punta de la cola y se identifica a los positivos), e
inclusive cuales son los tejidos y el momento preciso del desarrollo donde se expresa el
transgn.
8.2.1.1 La microinyeccin
La inyeccin se realiza con costosos equipos de precisin (cotizados entre 50.000 y 100.000
dlares), incluyendo microscopio estereoscpico, microscopio invertido, micromanipulador,
pipetas de sujecin de embriones, pipetas de vidrio, aparatos para estirar las pipetas, incubadoras de CO2, entre muchas otras cosas (Figura 8.3). Como hemos visto, la inyeccin se realiza aproximadamente 24 horas despus del servicio del macho, lo que coincide con el momento biolgico ideal, que es entre tres y cinco horas antes de que se produzca la fusin de
los proncelos. El proncleo elegido es el masculino debido a que, por su mayor tamao, es
de mejor manipulacin. Para la inyeccin se usan pipetas de sujecin (en ingls, holding
pipettes) de vidrio, preparadas en el propio laboratorio a partir de capilares de vidrio (de paredes muy delgadas y un dimetro interno entre 15 y 25 m) estirados con aparatos ad hoc
(pipette puller). La pipeta de sujecin debe tener el extremo perfectamente romo para no daar el embrin cuando es sostenido por la pipeta por presin de vaco. La segunda pipeta, de
inyeccin propiamente dicha, debe presentar un dimetro interno menor a 1 mm y tener el
extremo afilado. La cantidad de copias del transgn inyectada suele variar entre 20 y 200, en
un volumen de solucin acuosa no mayor a 2 l (el volumen del proncleo no debe expandirse ms del doble) (Figura 8.4).
Este procedimiento lleva a la integracin estable del ADN forneo en un 5-50 % de los embriones que sobreviven, siendo el promedio de copias integradas de entre 1 y 50, sin guardar
mucha relacin con la cantidad de ADN inyectada (se han reportado casos de hasta 1000 copias del transgn). En la mayora de los casos, dicha integracin ocurre en el estado embrionario de una clula, por lo que el animal transgnico resultante portar el ADN introducido
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Figura 8.3. Equipamiento para la microinyeccin de ADN en proncleo. La foto A muestra la mesa de trabajo (antivibratoria) con el microscopio invertido y el micro-manipulador con su joystick y el monitor. A la derecha (B) un primer plano del
microscopio. La foto C corresponde a un microscopio de diseccin usado para la ciruga de trasferencia de embriones. La foto D
muestra un aparato para estirar las pipetas de vidrio a medida (pipette puller). Fotos: F. Benavides. The University of Texas - M.D.
Anderson Cancer Center, Department of Carcinogenesis - Science Park, Texas, Estados Unidos.
en todas sus clulas, incluida la lnea germinal. Sin embargo, entre 10-20% de los animales
transgnicos pueden presentar una integracin en estados posteriores del embrin (embriones de ms de una clula), produciendo animales mosaico para el transgn. En este caso, la
transmisin del transgn a travs de las clulas germinales no est asegurada, perdindose una
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Figura 8.4. Microinyeccin de ADN en proncleo. La aguja de inyeccin se inserta en el proncleo masculino ya que es ms
grande que el femenino; adems puede identificarse porque suele tener slo un nucleolo. La inyeccin exitosa resulta en el ensanchamiento del proncleo (lnea de puntos). La foto muestra una imagen del momento de la microinyeccin (a la izquierda se observa la
pipeta de sostn). Foto cortesa del Dr. Charles Babinet, Biologie du Dveloppement, Institut Pasteur, Pars, Francia.
caracterstica fundamental para la creacin de lneas transgnicas. Frecuentemente, la integracin del ADN ocurre al azar y en un nico sitio del genoma, siendo esta regin propensa a
extensos rearreglos (de hecho, las mutaciones no son raras en la descendencia de aquellos
animales donde el genoma ha sido manipulado). La eficiencia final de la tcnica nos permite la
obtencin de entre 20 y 30% de ratones transgnicos del total de ratones nacidos vivos. El
diagrama de la Figura 8.5 resume los pasos que involucra la creacin de un ratn transgnico.
8.2.1.2 Desarrollo de lneas transgnicas
El animal que obtenemos a partir de un embrin inyectado con ADN se llama fundador. Es
importante entender que aun utilizando el mismo ADN (cassette de ADN) para inyectar varios embriones, cada uno de ellos tendr un sitio de insercin y una cantidad de copias dife-
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Figura 8.5. Transgnesis por microinyeccin de ADN en proncleo. El diagrama esquematiza los pasos que implica la realizacin de ratones transgnicos. A la hora de planear el desarrollo de una lnea de ratones transgnicos hay que tener presente que el
tiempo total del proyecto es de por lo menos seis meses. Para ms detalles ver el texto.
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rentes, ya que son fenmenos que ocurren al azar. Esto puede motivar diferentes niveles de
expresin e, incluso, diferentes fenotipos transgnicos. En cambio, todos los animales transgnicos que desciendan de un mismo fundador compartirn el mismo transgn (o locus transgnico), lo que se denomina una lnea transgnica.
Tengamos en cuenta que el ratn fundador es heterocigota para el locus transgnico (ms
correctamente hemicigota Tg/+), ya que el ADN fue insertado slo en el proncleo masculino (es como si lo hubiera heredado del padre) y el cromosoma homlogo materno (este
proncleo no fue inyectado) es wild type. Por lo tanto, este animal fundador transmitir el locus transgnico solamente a la mitad de su descendencia. Con la excepcin de aquellos transgnicos cuyo fenotipo sea de fcil deteccin (en particular los fenotipos dominantes), la presencia del transgn en las lneas que estamos criando no es algo muy evidente y debe hacerse
por medio del anlisis del ADN, lo que denominamos genotipado (del ingls genotyping) de
los animales.
Como estamos hablando, en la mayora de los casos, de cientos de cras a ser analizadas, la
tcnica por excelencia es el PCR a partir de ADN (ver Captulo I) obtenido de la punta de
la cola o del tejido que nos queda despus de marcar las orejas de los ratones (en ingls,
ear punch-outs). Existen otras variantes como el raspaje de mucosa bucal pero las mencionada anteriormente son, por lejos, las ms usadas. Los iniciadores (primers) de ADN deben
estar diseados para detectar secuencias que se encuentren en forma exclusiva en la construccin transgnica. Por medio de esta tcnica slo podemos evaluar la presencia o ausencia del locus transgnico en el ADN genmico de los animales. La discriminacin entre hemicigotas (el locus transgnico slo en un cromosoma homlogo, Tg/+) y homocigotas
(ambos cromosomas homlogos portan el locus transgnico, Tg/Tg) debe hacerse utilizando tcnicas cuantitativas como el Southern blot y el PCR cuantitativo, o por cruzas de
prueba con animales +/+. Por ejemplo, si el ratn era homocigota tendr 100% de cras
positivas al genotipado por PCR, y si era heterocigota, slo el 50% ser positivo. Esto no
ser necesario en aquellos raros casos en que existan diferencias fenotpicas entre animales
Tg/+ y Tg/Tg (tener en cuenta que en el 5-10% de los casos, el transgn es letal al estado
homocigota). Un dato imprescindible para tener en cuenta a la hora de planear el desarrollo de una lnea de ratones transgnicos es que el tiempo total del proyecto es de por lo
menos seis meses.
8.2.1.3 Nomenclatura de los loci y las lneas transgnicas
La creacin de un nuevo locus en forma artificial (el locus transgnico) hizo necesaria la estandarizacin de la nomenclatura para este tipo de loci y las lneas de roedores que los portan. El
smbolo oficial de un locus transgnico consta de cinco partes:
(i) Las letras Tg como designacin de transgn.
(ii) Una letra que indica el tipo de tcnica utilizada para la insercin: N, para insercin no homloga (microinyeccin), R, para inserciones con vectores retrovirales.
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(iii) La tercera parte de la nomenclatura es para indicar algunas caractersticas del transgn, incluyendo el nombre del gen o secuencia, usando hasta seis letras entre parntesis. Existen algunas abreviaturas estndar para utilizar en caso de ser necesario, como ser: An, por
anonymous sequence; Nc, por non-coding sequence; Rp, por reporter sequence; Sn, por
synthetic sequence; etc.
(iv) La cuarta parte del smbolo es un nmero (de hasta 5 dgitos) asignado por el investigador a una lnea transgnica particular.
(v) Finalmente, se coloca el cdigo del laboratorio (ver Captulo IV).
Veamos un ejemplo: un investigador que trabaja en el Institut Pasteur de Pars (cdigo de laboratorio Pas) inyecta embriones con una construccin que contiene el gen de la catepsina L
(smbolo Ctsl) con el promotor de la queratina 5 (K5), porque desea evaluar la sobreexpresin de Ctsl en los epitelios. La quinta lnea de ratones transgnicos que logr este investigador es la que tiene el fenotipo ms evidente y desea establecer una colonia. La nomenclatura
del transgn ser: TgN (K5Ctsl)5Pas.
En el caso de la insercin de un transgn dentro de la secuencia de un gen presente normalmente en el genoma, se formar un nuevo alelo mutante (seguramente nulo) de ese
gen, por lo tanto debe aclararse en la nomenclatura. Supongamos que una de las lneas (la
nmero 2) generadas por el mismo investigador gener una mutacin por insercin del
transgn en el gigantesco gen de la distrofina (Dmd). En este caso la nomenclatura debe ser
Dmd TgN (K5Ctsl)2Pas.
El fondo gentico de la lnea debe indicarse de la siguiente manera:
(i) Si el transgn ha sido incorporado a otro fondo gentico por medio de la creacin de
una lnea congnica, la nomenclatura es como se vio en el Captulo IV. Por ejemplo,
B6.FVB-TgN (Trp53), es una lnea congnica de fondo C57BL/6 a la cual se le incorpor
el transgn Trp53 ms un segmento de ADN perteneciente a la lnea donde se realiz la
microinyeccin, en este caso FVB.
(ii) Si el origen de la lnea que porta el transgn es desconocido puede indicarse: B6.Cg-TgN
(Trp53), en donde Cg indica lnea congnica.
(iii) Si los animales tienen un fondo gentico mezclado y no se ha desarrollado una verdadera
lnea congnica (full congenic strain), se debe colocar ambos fondos genticos separados
por punto y coma: B6;FVB-TgN (Trp53).
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campo de pulsos (PFGE) o bien columnas de sefarosa. Al igual que los plsmidos, el ADN de
los BACs es circular y es preferible hacerlo lineal antes de la microinyeccin, para evitar posibles roturas del transgn. El ADN de los YACs tambin se separa por medio de la tcnica
PFGE pero, debido al gran tamao de estos vectores, debe tenerse mucho cuidado en el aislamiento del ADN porque es muy susceptible a romperse.
Los protocolos detallados sobre todas estas tcnicas pueden encontrarse en Internet (ver
Anexo III), en el manual de Hogan y colaboradores (1994), el libro de Jackson y Abbott
(2000) y el manual de Nagy y colaboradores (2003).
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Esta tecnologa relativamente nueva permite a los investigadores crear mutaciones especficas (ya
sean nulas o no) en cualquier gen que est clonado. De la misma manera que en los animales transgnicos, estas mutaciones generadas in vitro sern incorporadas a la lnea germinal para obtener lneas de ratones mutantes [generalmente animales knock outs (KO) que no expresan el gen en cuestin] que sern estudiados para encontrar pistas de la funcin del gen. Por todo lo dicho, es fcil entender por qu, en los comienzos del nuevo milenio, los investigadores y encargados de animalarios
se enfrentan al problema (fundamentalmente de espacio y manejo) de la gran expansin en la produccin de ratones KO. Existen varias bases de datos donde se puede consultar las lneas desarrolladas en todo el mundo y sus usos potenciales (ver Anexo III). Algunos de los principales modelos
murinos generados por transgnesis dirigida sern vistos en ms detalle en el Captulo IX.
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de la secuencia genmica por la secuencia artificial (acarreada por un vector) sin duplicacin o (ii) insercin del vector dentro del gen diana con la consiguiente duplicacin de la regin de homologa (Figura 8.6). Como veremos ms adelante, el primer camino es el ms
empleado para la generacin de ratones KO. Para ello se utiliza una construccin que tiene
un gen marcador (normalmente el denominado cassette neo) flanqueado por dos zonas de
Figura 8.6. La recombinacin homloga. El diagrama muestra un ejemplo de los dos tipos de fenmenos que se dan en la recombinacin homloga (reemplazo e insercin). En este caso, el gen diana es el Hprt (Capecchi, 1989). Los dos vectores contienen
secuencias Hprt interrumpidas por el gen neo en el exn 8. Para ms detalles ver el texto.
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homologa. En cambio, el segundo tipo de evento es utilizado en el mtodo hit and run, diseado para incorporar cambios sutiles en el gen diana. Finalmente, es esencial subrayar que
la longitud de la regin de homologa en la secuencia experimental (dentro del vector) es un
factor muy importante a la hora de evaluar la frecuencia de inserciones o reemplazos exitosos (entre 5 y 10 kb de homologa es una buena medida).
Figura 8.7. Mutagnesis dirigida. El diagrama esquematiza los pasos involucrados en la realizacin de una lnea de ratones KO.
Se debe calcular que el tiempo requerido para un proyecto de esta naturaleza es de entre nueve meses y un ao. Para ms detalles
ver el texto.
Primero, se debe disear un vector que contenga al gen de inters cuya secuencia haya sido
interrumpida por un marcador de seleccin positiva. Normalmente se utiliza al gen de origen
bacteriano neo, el cual ofrece resistencia contra el antibitico Neomicina (G418r) a las clulas
que lo expresan. Adems, es muy comn el uso de un segundo marcador de seleccin, en
este caso negativo, flanqueando la secuencia del gen con el fin de enriquecer la reaccin con
eventos de mutagnesis dirigida. Uno de los marcadores de seleccin negativa ms utilizados
es el gen timidina quinasa del virus herpes (HSV-tk). La razn del uso de estos marcadores ne-
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gativos es que aquellos eventos de integracin al azar (no por secuencias homlogas) incorporarn toda la construccin de ADN (incluido el marcador de seleccin negativo) y la expresin de la timidina quinasa eliminar esa colonia de clulas.
Todo este proceso de seleccin positiva/seleccin negativa puede aumentar hasta 20 veces la
eficiencia del sistema y de hecho es empleado de rutina por los laboratorios. Como hemos
visto en la seccin de transgnicos, aqu tambin se pueden usar genes reporteros (como
lacZ o la protena fluorescente verde GFP) para rastrear el destino de las clulas ES en las
quimeras o para localizar los lugares de expresin del gen mutado. Con respecto al origen del
gen clonado se recomienda especialmente usar ADN proveniente de la misma lnea que gener las clulas ES. En otras palabras, los porcentajes ms altos de reemplazo por recombinacin homloga se obtienen cuando el ADN a incorporar es isognico al ADN blanco de la
integracin (en este caso el de las clulas ES). Como muestra de este fenmeno podemos
sealar que los ensayos de mutagnesis dirigida con el gen Rb (en clulas ES 129) fueron 20
veces ms eficientes al usar construcciones de ADN de origen 129 que de BALB/c. Esta observacin dio lugar a la idea de utilizar clulas ES derivadas de C57BL/6 que son luego inyectadas en blastocitos de ratones C57BL/6-Tyrc (una lnea congnica de C57BL/6 que porta el
alelo albino y por lo tanto es de color blanco). De esta manera, los ratones quimera son fcilmente reconocibles y la eficiencia de reemplazo por recombinacin homloga se ve mejorada por tratarse de ADN isognico.
El segundo paso es la introduccin del vector en un cultivo de clulas ES por medio de tcnicas de transfeccin. Seguido, se debe realizar la seleccin de aquellas clulas en las cuales el
marcador de seleccin positivo haya quedado integrado en el genoma, pero sin incluir al marcador negativo que flanqueaba la secuencia del gen.
El tercer paso es la identificacin de aquellas clulas ES que hayan integrado el vector por
medio de recombinacin homloga. Esto es para asegurarse que el vector se insert (o reemplaz) en el gen de inters y no en cualquier sitio del genoma (al azar) por eventos muy
comunes que no involucran recombinacin homloga.
Una vez identificados los clones que portan la mutagnesis dirigida, el cuarto paso es la produccin de embriones quimricos por medio de la inyeccin de las clulas ES seleccionadas
(entre 10 y 20 clulas) en la cavidad de un blastocito (Figura 8.8). La eleccin de la lnea donante del blastocito (normalmente C57BL/6) es importante, ya que debe favorecer el crecimiento de las clulas ES inyectadas (las lneas consanguneas son la mejor opcin) y debe
permitir la visualizacin de dos colores en el pelaje de las quimeras [por ejemplo: 129S (agut); C57BL/6 (negro)]. Como en el caso de los transgnicos, aqu tambin se necesita un laboratorio equipado con pipetas de sujecin de embriones, micromanipuladores y microscopio
invertido. Existen otras alternativas como ser la inyeccin de mrulas (embriones en estado
de 8 clulas), e inclusive la agregacin directa de las clulas ES con clulas de una mrula (en
este ltimo caso, luego de haber removido la zona pelcida). Estos embriones luego de un
corto perodo de incubacin de 2 3 horas sern transplantados en una hembra receptora
pseudopreada para obtener ratones quimricos (Figura 8.9).
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Figura 8.8. Mutagnesis dirigida. La secuencia fotogrfica de la izquierda muestra la inoculacin de clulas ES (manipuladas in vitro) dentro de la cavidad de un blastocito receptor (observar a la izquierda la pipeta de sujecin por vaco) con el fin de generar ratones quimricos portando una mutacin dirigida. A la derecha se muestra un ratn quimera. El marmolado en el color del pelaje se
debe a que este animal est formado por un agregado de clulas originadas de lneas con diferente color de pelaje. Fotos cortesa del
Dr. Charles Babinet, Biologie du Dveloppement, Institut Pasteur, Pars, Francia.
Finalmente, el xito del proceso estar dado por la incorporacin del gen mutado a la lnea
germinal de un ratn, lo que permitir desarrollar lneas de ratones KO, tanto heterocigotas
como homocigotas. Recordar que las lneas de clulas ES son, en su mayora, XY, por lo tanto
se cruzarn slo los machos quimricos. Este proceso, o parte del mismo, es ofrecido por
muchas compaas de perfil comercial (ver Anexo III) y adems existen varios manuales con
los protocolos detallados (ver Bibliografa General). Es fundamental entender que este sistema no es infalible y que existe la posibilidad de que durante el proceso se generen alelos que
tengan una expresin residual (en vez de nula) o que el gen mutado haya ganado una funcin
nueva. Adems de la posibilidad de generar ratones KO o nulos (lo que en la jerga se dice:
noquear al gen), existen variantes de la tcnica de recombinacin homloga (hit and run) que
sirven para incorporar cambios sutiles en un gen de inters (en ingls, knocking in). Por ejem-
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Figura 8.9. Generacin de ratones quimera. Mtodos usados para generar quimeras utilizando clulas ES y embriones receptores. Las clulas ES pueden ser inyectadas en blastocitos (o mrulas) o simplemente agregadas a las clulas de una mrula una vez
removida la zona pelcida. Los embriones tetraploides pueden ser usados tambin para la inyeccin o agregacin- de clulas ES, con
una mayor proporcin de embriones derivados totalmente de las clulas ES. Para ms detalles ver el texto.
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plo, podemos crear mutaciones puntuales en la secuencia del gen blanco seleccionando eventos de recombinacin entre cromosomas homlogos que hayan eliminado el marcador de
seleccin pero hayan dejado atrs la forma mutada del gen. En este caso, se reemplaza el gen
original por la copia modificada del gen, pudindose disecar la funcin que desempean distintas partes (o dominios) de la protena codificada por ese gen.
Nomenclatura de los KO
Bsicamente, la nomenclatura del alelo nulo (KO) consiste en el nombre del gen (recordar
que en el ratn y la rata va siempre en cursiva) ms el agregado (en superndice) de las letras
tm (targeted mutation), seguido del nmero de la lnea de ratones y del cdigo del laboratorio
o investigador (ver Captulo IV). Por ejemplo, Tcrbtm1Mom es la primera lnea de ratones KO
para el gen del receptor de linfocitos T (TCR) cadena desarrollada por el laboratorio del
Dr. Peter Mombaerts (cdigo: Mom) en Rockefeller University, New York. El fondo gentico de
la lnea debe indicarse como lo hemos visto para los transgnicos:
(i) Si el KO ha sido incorporado a otro fondo gentico por medio de la creacin de una lnea congnica , la nomenclatura ser por ejemplo B6.129P-Tcrbtm1Mom, o sea una lnea
congnica de fondo C57BL/6 a la cual se le incorpor la mutacin nula del gen Tcrb ms
un segmento de ADN perteneciente a la lnea (cultivo ES) donde se realiz la recombinacin homloga, en este caso 129P .
(i) Si los animales tienen un fondo gentico mezclado y no se ha desarrollado una verdadera
lnea congnica se deben colocar ambos fondos genticos separados por punto y coma:
B6;129P-Tcrbtm1Mom.
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Figura 8.10. Sistemas Cre-loxP. Generacin de un alelo floxeado in vitro utilizando marcadores de seleccin. Por medio del
uso de la recombinacin homloga (RH) se introducen marcadores positivos (neor) y negativos (HSV-tk) flanqueados por sitios loxP
dentro de un intrn del gen diana. Se coloca adems otro sitio loxP upstream o downstream de los exones. Luego de seleccionar
para los marcadores positivos (hubo RH) las clulas ES son transfectadas para que expresen (en forma temporaria) la enzima Cre. La
eliminacin de los marcadores de seleccin por recombinacin entre los sitios loxP da como resultado los dos tipos de delecin mostrados, siendo el tipo II el que nos interesa para crear un KO condicional. Adaptado de I. Jackson and C. Abbott, 2000.
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Figura 8.11. Ratones knock-out condicionales (espaciales o temporales). Un ratn que porta un gen floxeado (ratn
del medio) es cruzado con un ratn transgnico para la recombinasa Cre con una expresin limitada a un tejido especfico (izquierda). Las cras de esta cruza presentarn la delecin del gen en el tejido predeterminado. Alternativamente, el ratn con el gen floxeado (medio) puede cruzarse con un transgnico de Cre (promotor ubicuo) que se expresar slo ante la inoculacin de un inductor
qumico. Adaptado de I. Jackson and C. Abbott, 2000.
253
nar la expresin de alelos mutados (knock-in). Tambin es factible realizar ratones KO clsicos, es decir no condicionales, que lleven mutaciones limpias, de las cuales fueron eliminados los marcadores de seleccin. Otra virtud del sistema es poder producir deleciones, inversiones y translocaciones de grandes segmentos cromosmicos. Como veremos en el Captulo
IX, un ejemplo atrayente es la translocacin entre el oncogn Myc y los genes de cadena pesada de las inmunoglobinas, realizada en 1995. Esta translocacin generada por el sistema
Cre/loxP reproduce aquellas que son producidas en los plasmocitomas humanos.
254
8.5 La clonacin
El trmino clonar proviene del griego klon que significa brote o retoo. Por extensin, hoy se
entiende por clon al grupo de individuos que derivan de un mismo ancestro, a travs de una
reproduccin asexuada.
255
mfero clonado a partir de una clula somtica adulta: la hoy internacionalmente famosa oveja
Dolly. Esta vez, el grupo obtuvo corderos vivos a partir de clulas obtenidas de la glndula mamaria de una hembra adulta, adems de clulas diferenciadas obtenidas de embriones (da 9) y
fetos (da 26). Para lograr esto, las clulas donantes de los ncleos fueron previamente inducidas
a abandonar el ciclo celular y entrar en el estado G0 en un cultivo privado de suero. Luego, los
ncleos de estas clulas fueron inoculados en ovocito de oveja (previamente enucleados), los
cuales son activados por un impulso elctrico e implantados en una tercera oveja (madre sustituta) para llevar la preez a trmino. As pues, Dolly carece de padre y es el producto de tres
madres: la donante del vulo (citoplasma conteniendo el ADN mitocondrial), la donante del
ncleo (ADN cromosmico), y la madre sustituta (no aporta material gentico alguno). Sin embargo, la eficiencia del sistema es extremadamente baja, ya que Dolly fue el nico nacimiento de
los 277 embriones obtenidos por transplante nuclear.
De estos resultados qued claro que el ovocito posee un ambiente privilegiado que permite
re-programar un ncleo transplantado que se encuentra en vas de diferenciacin. Hasta el
nacimiento de la oveja Dolly, slo se conoca el desarrollo parcial (hasta el estado de renacuajo) por transplante de ncleos de queratinocitos en cultivo obtenidos de la piel de sapos adultos. Actualmente, el clonado de cras viables a partir de clulas somticas diferenciadas (por
mtodos de transplante nuclear) ha sido logrado en ovinos (1996), bovinos (1998), ratn
(1998), cabra (1999), cerdo (2000), gato (2002), conejo (2002) caballo (2003) y mula (2003),
incluyendo clones de ovejas transgnicas obtenidas a travs de mutagnesis dirigida realizada
sobre fibroblastos fetales. Muchos de estos animales clonados han manifestado anormalidades
en la placenta, crecimiento excesivo de los fetos y fallas respiratorias al nacer.
256
por un cultivo deficiente en suero (lo que se crea era la llave del xito). Estos experimentos
incluyeron el transplante de ncleos, provenientes de clulas de Srtoli, neuronas y clulas del
cmulo (cumulus oophorus del ovocito) de ratones hbridos B6D2F1 y B6C3F1, en ovocitos
de ratn previamente enucleados. En este caso, las clulas no provenan de cultivos celulares,
sino que fueron usadas inmediatamente despus de haber obtenido el tejido de un ratn recin sacrificado y los ncleos fueron insertados en los ovocitos por microinyeccin, en lugar
de electrofusin. Las clulas elegidas como donantes se encuentran normalmente en estado
G0, en el caso de las clulas de Srtoli y las neuronas, o en G0/G1, en el caso de las clulas
del cmulo. Los ovocitos transplantados fueron dejados entre 1 y 6 horas en cultivo (para
permitir la condensacin de los cromosomas) antes de ser activados en un medio con estroncio (Sr2+) y citocalasina B. Este procedimiento se lo conoce, en conjunto, como tcnica
Honolulu y se cree que su xito estara asociado al paso de condensacin de los cromosomas antes de la activacin, un factor crtico en la re-programacin del genoma dador luego
del transplante nuclear (Figura 8.12). Los ovocitos transplantados con ncleos de clulas de
Srtoli y neuronas no llegaron a trmino (slo lograron avanzar hasta el da embrionario 8,5),
lo que demuestra que el estado G0 en la clula donante del ncleo no es suficiente per se
para asegurar el desarrollo embrionario. Slo los embriones generados a partir de ncleos
provenientes de las clulas del cmulo llegaron a trmino.
El primer ratn clonado nacido de estos experimentos fue una hembra (obviamente, como la
dadora de los ovarios de donde se sacaron las clulas del cmulo) que fue bautizada con el
nombre de Cumulina. Una vez ms, la eficiencia del mtodo es muy baja (alrededor del
2%), con una produccin de 10 ratones viables a parir de 800 embriones transplantados.
Cuando estas 10 hembras llegaron a la madurez sexual fueron acopladas con xito con machos CD-1, demostrando ser frtiles. El mismo laboratorio ha intentado una serie de clonaciones sucesivas (clonar a partir de un ratn clon) con la misma tcnica, obteniendo resultados interesantes con respecto a la eficiencia de la clonacin y a la longitud de los telmeros.
La clonacin sucesiva fue posible pero la eficiencia (de por s baja) cay an ms en las sucesivas generaciones, llegando a ser casi imposible a partir de la generacin 6 (G6), en la cual ningn ratn vivo fue obtenido de 724 ovocitos reconstituidos. Los ratones clonados no mostraron signos de envejecimiento prematuro ni acortamiento de los telmeros, evento normalmente asociado con el envejecimiento celular.
En un experimento posterior, los mismos investigadores de University of Hawaii clonaron ratones machos a partir de ncleos obtenidos de clulas de una punta de cola (fibroblastos) obtenida de un ratn B6C3F1. En este caso, slo tres animales de 274 ovocitos reconstituidos
(1%) llegaron a trmino, aunque uno slo sobrevivi hasta ser un adulto frtil. De esta manera demostraron que la clonacin no estaba limitada a clulas obtenidas de hembras. En el ao
2002, estos investigadores publicaron hallazgos muy interesantes relacionados a la longevidad
y la salud de los ratones clonados. Los mismos presentaron una longitud de vida acortada, en
comparacin con los animales control del mismo sexo y genotipo (las muertes empezaron
desde los 10 meses de edad), particularmente debido a fallas hepticas y neumona; adems
de mostrar caractersticas de obesidad (porcentajes altos de grasa corporal y altos niveles de
insulina y leptina).
257
Figura 8.12. La clonacin de clulas somticas. Mtodo de clonacin por transplante de ncleos usado por R. Yanagimachi y
colaboradores (tcnica Honolulu). La primera clonacin de ratones, lograda en 1998 por este grupo, fue realizada a partir de ncleos
de clulas somticas del cumulus oophorus de un ovocito. Para ms detalles ver el texto.
258
En el ratn, una de las variantes ms prometedoras es la clonacin a partir de ncleos obtenidos de clulas ES en cultivo. En el ao 1999, el equipo del Ryuzo Yanagimachi pudo clonar
ratones viables a partir de clulas ES, a pesar de ser clulas que no pueden ser inducidas a entrar en la fase G0/G1. Tambin observaron diferencias en la eficiencia de la tcnica segn la lnea utilizada como dadora de ncleos. Rudolf Jaenisch (Cambridge, Massachusetts, Estados
Unidos) y colaboradores compararon la eficiencia (como dadoras de ncleos para la clonacin) de lneas ES derivadas de hbridos (129B6F1) y de la lnea consangunea 129. Las lneas
de origen hbrido demostraron una mejor eficiencia que aquellas de origen 129, y a su vez,
ambas mostraron una eficiencia muy superior a la clonacin con clulas somticas (debido
quizs a la conocida pluripotencia de las clulas ES). El mismo laboratorio logr clonar clulas
ES manipuladas genticamente, observacin que abri las puertas a la posibilidad de clonar
ratones genticamente modificados.
El mismo laboratorio dirigido por R. Jaenisch est actualmente trabajando en la posibilidad de
usar una tcnica para derivar ratones a partir de clulas ES que no usa transplante nuclear. Se
trata de la obtencin de ratones por medio de la complementacin de embriones tetraploides. Estos embriones tetraploides se obtienen por electrofusin de dos embriones (en el estado de dos clulas), lo que genera un nuevo embrin unicelular con doble grupo cromosmico (4n, o tetraploide). Los blastocitos de estos embriones tetraploides son incapaces de
completar un desarrollo completo en forma independiente, pero cuando son inoculados con
clulas ES normales (2n, diploides), apoyan el desarrollo de un ratn derivado enteramente
de las clulas ES (Figura 8.9). Como se puede ver, esto permitira generar ratones manipulados genticamente (por ejemplo, mutagnesis dirigida), sin la necesidad de pasar por el uso
de ratones quimera. Hasta el momento la eficiencia es muy superior cuando se utilizan embriones tetraploides y clulas ES derivadas de ratones hbridos F1.
259
(ii) Permite aumentar en forma rpida la produccin de animales de una constitucin gentica interesante. Al da de hoy, siendo el rendimiento de la clonacin muy pobre y sus costos prohibitivos, no se justifica su utilizacin para la produccin de animales de experimentacin ni de produccin. En la mayora de los casos, los mtodos de reproduccin
asistida (ver Captulo II) son una mejor opcin. Adems, para que una caracterstica gentica sea explotada, es necesario que se encuentre fijada en una lnea de laboratorio (o
raza, en el caso de animales de produccin). En el caso de los animales de inters zootcnico, la nica implementacin valiosa de la clonacin est en la produccin de grandes
cantidades de animales transgnicos.
(iii) Permite reconstituir un embrin a partir del ncleo de clulas ES manipuladas in vitro.
Uno de los mejores argumentos para continuar las experiencias de clonado en el ratn
es sin dudas la clonacin de clulas ES.
Bibliografa General
ANDERSEN JK. Genetically engineered mice and their use
in aging research. Molecular Biotechnology 19: 4557, 2001.
BABINET C. Transgenic mice: an irreplaceable tool for
the study of mammalian development and biology.
Journal of the American Society of Nephrology
11(supplement 16): 88-94, 2000.
BABINET C, COHEN-TANNOUDJI M. Genome engineering
via homologous recombination in mouse embryonic
stem (ES) cells: an amazingly versatile tool for the
study of mammalian biology. Anais da Academia
Brasileira de Cincias 73: 365-383, 2001.
BERTON TR, WANG XJ, ZHOU Z, KELLENDONK C, SCHUTZ
G, TSAI S, ROOP DR. Characterization of an inducible,
epidermal-specific knockout system: differential expression of lacZ in different Cre reporter mouse
strains. Genesis 26: 160-161, 2000.
BISHOP JO, P SMITH. Mechanism of chromosomal integration of microinjected DNA. Molecular Biology
and Medicine 6: 283-298, 1989.
BRADLEY A, EVANS M, KAUFMAN MH, ROBERTSON E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature 309: 255-256, 1984.
260
bin gene into the mouse germ line. Nature 294: 9294, 1981.
DOETSCHMAN T, GREGG RG, MAEDA N, HOOPER ML,
MELTON DW, THOMPSON S, SMITHIES O. Targetted
correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells. Nature 330: 576-578, 1987.
EGGAN K, AKUTSU H, HOCHEDLINGER K, RIDEOUT W 3RD,
YANAGIMACHI R, JAENISCH R. X-Chromosome inactivation in cloned mouse embryos. Science 290: 15781581, 2000.
EGGAN K, AKUTSU H, LORING J, JACKSON-GRUSBY L,
KLEMM M, RIDEOUT WM 3RD, YANAGIMACHI R,
JAENISCH R. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid
embryo complementation. Proceedings of the National Academy of Science USA 98: 6209-6214,
2001.
EGGAN K, RODE A, JENTSCH I, SAMUEL C, HENNEK T, TINTRUP H, ZEVNIK B, ERWIN J, LORING J, JACKSON-GRUSBY
L, SPEICHER MR, KUEHN R, JAENISCH R. Male and female mice derived from the same embryonic stem
cell clone by tetraploid embryo complementation.
Nature Biotechnology 20: 455-459, 2002.
GORDON JW, SCANGOS GA, PLOTKIN DJ, BARBOSA JA,
RUDDLE FH. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings
of the National Academy of Science USA 77:
7380-7384, 1980.
GOSSLER A, DOETSCHMAN T, KORN R, SERFLING E, KEMLER
R. Transgenesis by means of blastocyst-derived embryonic stem cell lines. Proceedings of the National
Academy of Science USA 83: 9065-9069, 1986.
HAMMER RE, MAIKA SD, RICHARDSON JA, TANG JP, TAUROG JD. Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human b2m: an
animal model of HLA-B27-associated human disorders. Cell 63: 1099-1112, 1990.
HANAHAN D. Transgenic mice as probes into complex
systems. Science 246: 1265-1275, 1989.
HOGAN B, BEDDINGTON R, COSTANTINI F, LACEY E (Eds).
Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (2nd Edition). Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York, 1994.
HUGUET E, ESPONDA P. Generation of genetically modified mice by spermatozoa transfection in vivo: Preliminary results. Molecular Reproduction and Development 56: 243-247, 2000.
261
262
263