PROTOCOLOS DE CULTIVOS DE CELULAS DE CRESTA NEURAL (CCN) 1. Materiales: + Huevos fértiles sin incubar. * Medio de Cultivo DMEM + Suero fetal bovino + HEPES IM * PBSo CINa 0.9% + Bicarbonato de Na (7,5%) Alcohol etilico Pipetas automiticas Pipetas Pasteur ‘Capsulas de Petri (35 mm diam.) Capsulas de Petri (100 mm diam.) * Recipiente de vidrio de boca ancha (bow!) + Capsulas fondo negro de parafina o silicona + Alfileres entomolégicos + Jeringas de vidrio (2-3ml) + Agujas (25G 5/8) para jeringa + Agujas de tungsteno + Cubreobjetos son diferentes sustratos + Recipientes “multiwell” + Frascos para preparar medios + Filtros para esterilizar medios Pinzas finas ‘Tijeras finas y/o microbisturi Espitula perforada (espumadera) Espatula pequefia (microespatula) Lupa estereoseépica Microscopio Estufa CO, Estufa p/incubar huevos Flujo laminar (optativo) cscara con alcoho! 70% u otro desinfectante de superficie). Sacar un huevo de la estufa de incubacién y llevarlo al gabinete de cultivo. Colocar en un recipiente de boca ancha (bowl) 10-20 ml de PBS 0 NaC! 0,9%. Limpiar la cascara del huevo con alcohol 70% y romperlo golpeandolo en su parte inferior con el borde del bowl, dejando caer el contenido en ef mismo. [Altemativamente, sobre la parte ancha del huevo (camara de aire) se rompe un fragmento de la cascara con ¢l mango de la tijera, se abre con ésta una ventana il 2 cm? en la edscara, se vierte un poco Ia albimina fluida y se realiza el siguiente paso in ovo]. Tomar con una pinza fina todo cl espesor de las membranas extracmbrionarias y recortar, con tijera fina, el disco embrionario por fuera del rea vascular. Levantar el disco con la espatula-espumadera y pasarlo a una céipsula con PBS, lavarlo suavemente climinando la membrana vitelina y los restos de albimina y vitelo adheridos. Si fuese necesario, repetir el lavado en otra céipsula con medio limpio. Llevar el disco embrionario con la espitula-espumadera a una cipsula con “fondo negro”, fijarlo con alfileres en su periferia, Bajo la lupa, recortar con bisturi de hoja pequefia (N°11), un explanto de todo el espesor del embrién, por fuera de la regién somitica y abarcando los iltimos 5-7 pares de somitas (Fig. 18-3, B). Levantar el explanto con la microespatula y pasarlo a una gota de solucién de Dispasa © Colagenasa en medio DMEM sin suero, en una cépsula de Petri chica (35 mm), ¢ incubar por 10-15 minutos a temperatura ambiente. Con experiencia, se pueden acu- mmular lotes i 4-5 explantos antes del peso siguiente. [Altemativamente, los explantos10. se pueden levantar con un “tip” pequeflo y una pipeta automatica regulada a $ jl, teniendo la precaucién de mojar el tip en medio: para evitar que el explanto se adhiera a las pareces del tip]. ‘Trabajando bajo la lupa, cuando se observa que el explanto comienza a “arrugarse” {indicio que la enzima ha digerido gran parte de la matriz extracelular), pasarlo a un gota de DMEM+10% suero fetal bovino (SFB), para inactivar la enzima, en otra céip- sula de Petri, '. Utilizando agujas de tungsteno, se procede a una microdiseccién a fin de aislar el seg- mento de tubo neural, eliminando ectodermo, endodermo, notocorda y somitas (Fig. jernativamente, esta operacién puede hacerse en el paso 5, dentro de la gota de Dispasa, y luego pasar el explanto a DMEM +suero}. . Aspirarel segmento de tubo neural con un tip previamente mojado con DMEM+suero montado en una pipeta automatica, y pasarlo a un recipiente para cultive conteniendo DMEM+suero. [Alternativamente, el segue de tubo neural puede tomarse con una microespatula, o con una pipeta Pasteur de punta fina, o con un tubo de vidrio capilar ‘montado en una tubuladura de goma con boquilla, etc.) ). Solo como orientacién y dependiendo del uso que se dari al cultivo, pueden cultivarse 5-10 explantos en una capsula de 35 mm, o 1-2 explantos sobre un cubreobjetos, 0 explantos distribuidos en un recipiente “multiwell”, etc. A su vez, los soportes pueden estar recubiertos (0 no) con diferentes sustratos (fibronectina. laminina, matriz extrace- lular compleja, polilisina, etc.). En nuestro laboratorio se cultiva rutinariamente sobre un suao il Gbeonecio,colocano una aoksciga Hl 10-30 ng/ml, incubando 30 minutos (0 toda la noche), a temperatura ambiente (0 a 37 °C), con posterior lavando (5 minutos * 5) con PBS o medio de Lievar a estufa de. 37°C y 5% de CO, en aire. Usualmente, a los 30 minutos los explantos estin adheridos, las CCN comienzan a segregarse desde el explanto tubo neural, se aplanan sobre el sustrato y migran formando un halo concéntrico