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manual de prcticas
laboratorio
MICROBIOLOGA
GENERAL
Rector General
Dr. Luis Mier y Tetn Casanueva
Secretario General
Dr. Ricardo Sols Rosales
UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA - Iztapalapa
Rector
Dr. Jos Lema Labadie
Secretario
Mtro. Luis Javier Melgoza Valdivia
Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud
Director
Dr. J. Gerardo Saucedo Castaeda
Secretario Acadmico
M. en C. Arturo L. Preciado Lpez
Departamento de Biotecnologa
jefe del Departamento
Dr. J. Mariano Garca Garibay
ISBN 970-31-0141-0
Primera Edicin: 2004
Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa
Av. San Rafael Atlixco No. 186 Col. Vicentina.
Del. Iztapalapa, C.P. 09340 Mxico, D.F.
DERECHOS RESERVADOS 2004, Universidad Autnoma Metropolitana (Mxico). Prohibida la reproduccin de esta obra as como la distribucin y venta fuera del mbito de la UAM. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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MICROBIOLOGA
GENERAL
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ndice
7
PRESENTACIN
o
o
PRCTICA # 1
Preparacin y esterilizacin de materiales y medios de cultivo
12
14
15
15
16
20
22
22
23
24
28
30
31
31
32
t
A
ao
PRCTICA # 2
Preparacin, fijacin y coloracin simple de frotis
Preparacin de frotis
Fijacin del frotis
Tincin simple
Observacin al microscopio
PRCTICA # 3
Tincin diferencial de Gram y tinciones selectivas
36
38
38
39
40
PRCTICA # 4
Mtodos de cultivo y aislamiento de bacterias
Tcnica de estra cruzada
Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo
Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos
Condiciones de incubacin
46
48
49
49
49
PRCTICA # 5
Mtodos de cultivo y descripcin morfolgica de hongos
Siembra de hongos
Descripcin macroscpica de levaduras y mohos
Descripcin microscpica de levaduras
Descripcin microscpica de mohos en montaje con cinta adhesiva
54
56
57
57
PRCTICA # 6
Pruebas de diferenciacin bioqumica
Tcnica de Inoculacin en cajas de Petri
Tcnicas de Inoculacin en tubos
Evaluacin de actividades metablicas
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(O
64
66
67
68
PRCTICA # 7
Mtodos de cuantificacin de microorganismos
Tcnica turbidimtrica
Tcnica de cuenta directa en cmara de Neubauer
Tcnica de dilucin y siembra en placa
74
76
77
PRCTICA # 8
Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano
Efecto de la Temperatura
Efecto del pH
82
84
84
PRCTICA # 9
Efecto de la actividad de agua en el crecimiento microbiano
Efecto de la presin osmtica y actividad de agua (aw) en hongos y bacterias
Efecto de la desecacin
90
92
92
PRCTICA # 10
Curva de crecimiento bacteriano
Inoculacin e incubacin del cultivo
Tratamiento de las muestras
97
BIBLIOGRAFA GENERAL
101
Anexo 1
PREPARACIN DE SOLUCIONES Y COLORANTES
105
Anexo 2
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
115
Anexo 3
ATLAS DE PRUEBAS BIOQUMICAS
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Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de enfermedades en plantas, animales y humanos tambin es cierto que desde la
antigedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de
produccin de alimentos fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre
o
otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas reas de inves- o
tigacin bsica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacutica.
II
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Consideramos que este material puede ser de gran ayuda para los profesores y alumnos de la
UAM en el curso de Microbiologa General, est elaborado de acuerdo a la infraestructura de los laboratorios y a la programacin trimestral del curso, con sesiones de 4 horas/
semana.
Dra. Ma. de Los Angeles Aqulahuatl
Dra. Ma. de Lourdes Prez Chabela
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o
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Durante las sesiones, siempre deber usar una bata de laboratorio bien abotonada, que deber quitarse
antes de abandonar el laboratorio.
2.
3.
Evitar la acumulacin sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la prctica de laboratorio.
Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor.
4.
Se prohibe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio.
5.
Se prohibe fumar, aplicarse cosmticos o tocarse la cara con las manos o algn otro objeto. Se deber lavar
meticulosamente las manos con jabn y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salga por breves
periodos.
6.
Por seguridad no debei pipetear oralmente ningn tipo de cultivos microbianos, esta actividad deber
realizarse con pipetas accionadas de forma mecnica o automtica, tratando de evitar la formacin de
aerosoles.
7.
No se admitirn visitas personales que distraigan la atencin y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo
que se realiza.
a
o
Procedimientos de laboratorio
1.
Antes y despus de cada sesin pictica los alumnos debern limpiar las mesas de trabajo con el desinfectante que se le proporcionar para este fin.
2.
Cuando se utilice el mechero, este deber colocarse alejado del microscopio y otros equipos as como de
sus cuadernos o prendas de vestir.
3.
Al concluir cada sesin el estudiante deber asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contaminados sean colocados en recipientes especficos para ello, colocados en lugares apropiados, que les indicar
el profesor.
4.
Siempre deber dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analticas,
autoclave, potencimetros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento.
5.
En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deber notificarlo de inmediato al
profesor. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes con cultivos activos, deber conservar la
calma y adems de informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento:
a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersin
b. Poner abundante solucin desinfectante sobre las toallas
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c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptculo destinado a la
eliminacin de materiales contaminados.
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o
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Objetivos
introduccin
Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido
adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de
hbitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo fsico y qumico.
Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfeccin y esterilizacin para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilizacin es
un mtodo de eliminacin total de todo tipo de organismo y que
asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras
que la desinfeccin es un proceso que solamente elimina formas
vegetativas de los microorganismos.
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Materiales
7 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con tapn de baquelita
3 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin tapn de baquelita
9 cajas de Petri de vidrio
3 pipetas de 1 o 2 mL
3 pipetas de 10 mL
1 pipeta Pasteur
3 matraces Erlenmeyer de 250 mL
1 parrilla de calentamiento con agitacin
1 autoclave
(O
1 potencimetro
1 horno de calor seco
1 mechero Fisher
1 incubadora a 35C
1 hisopo estril, algodn y gasa
papel manila o estraza para envolver
Caldo nutritivo (Anexo 2.1)
Medio de agar nutritivo (Anexo 2.2)
Medio de agar papa dextrosa PDA (Anexo 2. 6)
Medio mnimo de sales (Anexo 2.3 )
Soluciones amortiguadoras pH 4 y 7
Procedimiento
El profesor explicar los principios generales de trabajo en el laboratorio de Microbiologa, enfatizando en la
desinfeccin de reas as como en la preparacin y esterilizacin de los medios de cultivo y materiales necesarios
para el trabajo cotidiano con microorganismos. Tambin har las demostraciones necesarias para que el estudiante aprenda a envolver los materiales, as como su manejo en condiciones aspticas.
Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobilln y detergente. Enjuagar con abundante agua
corriente.
2.
Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una piceta, por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningn
otro medio.
3.
Una vez seco el material, se proceder a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para los
tubos y matraces se elaborarn tapones de algodn y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los
que finalmente se les colocar un capuchn de papel.
4.
14
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5.
Preparar 120 mL de Agar Nutritivo (AN), calentar la mezcla en una parrilla con agitacin constante hasta
ebullicin, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) y vaciar enseguida 5 mL de medio en tres tubos
con tapn de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique el agar. El resto se
esteriliza en el autoclave.
6.
Preparar 120 mL de medio de cultivo Papa dextrosa agar (PDA) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, ajustar
el pH del medio a 5.0-5.6. Colocar un magneto de agitacin y calentar hasta ebullicin durante 1 minuto;
cuidando de que no se proyecte o derrame. Posteriormente vaciar 7 mL de medio en tres tubos que se
taparn con tapn de algodn y gasa. El resto se esteriliza en el autoclave.
7.
Preparar 120 mL de medio de cultivo Mnimo de sales (MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL
a
Esterilizacin de materiales y medios de cultivo oo
1.
Las cajas de Petri y pipetas envueltas se colocaran en horno a 150 C durante 2 horas. Despus de sacarlas,
dejarlas enfriar y abrir los paquetes nicamente en rea asptica.
2.
Los tubos con medios de cultivo con agar, se debern colocar en una superficie inclinada de tal forma que el
medio se solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.
2.
Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave se enfren a una temperatura
aproximada de 40-50 C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin
sentir un calor excesivo.
3.
Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con PDA y 3 con MM. Los medios de cultivo se vacan en las
cajas de Petri (aproximadamente 25-30 mL) en zona asptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar.
4.
Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos) y posteriormente envolver las cajas cuidadosamente con papel estraza o acomodarlas en forma invertida en bolsa de plstico limpias.
5.
115
manual de prcticas del LABORATORIO PE ICIlCIBiOLCIGJI S E I A L
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Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una estufa de incubacin
ajustada a 30 C durante 24-48 horas.
2.
Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparicin de turbidez,
nata superficial y/o depsito de material en el fondo de los tubos con medio lquido; as como la formacin
de colonias microbianas en la superficie de medios slidos.
3.
Si no hay contaminacin de los medios, se abrir una de las cajas de Petri de cada medio durante 1 minuto
en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetar como"al aire".
4.
La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetar "en
rea asptica".
5.
(0
CQ
0
Resultados
A.
Hacer la descripcin morfolgica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes medios de cultivo
(AN, PDA y MM) y con los distintos tratamientos en relacin a la caja control.
B.
Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento
regular y (+++) crecimiento abundante.
C.
Discuta los resultados y determine si la esterilizacin en el autoclave y horno fue adecuada, as como el
manejo de los materiales.
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Cuadro 1
Descripcin morfolgica de microorganismos en cajas de Petri con diferentes medios de cultivo.
MEDIO
DE CULTIVO
Abierta al aire
Abierta en rea
asptica
Control
a
t
AGAR
NUTRITIVO
MNIMO
DE SALES
PAPA DEXTROSA
AGAR
Cuestionario
1)
Cules son los mtodos de esterilizacin ms utilizados en Microbiologa? En que tipo de materiales se
aplica cada uno?
2)
Explique cules son las diferencias entre los procesos de esterilizacin, desinfeccin y asepsia. Cmo se
relacionan estos procedimientos con la pasteurizacin?
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Preparacin, fijacin y
coloracin simple de frotis
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Objetivos
Introduccin
o
o
Azul de metileno* +
(Cromoforo)
ci-
21
Materiales
1 Probeta de 100 mL
1 Vaso de precipitados de 100 mL
1 mechero
1 asa de siembra
5 Portaobjetos
Piceta con agua destilada
Microscopio compuesto de campo claro
Azul de metileno alcalino (Anexo 1.2)
Alcohol etlico al 70% (Anexo 1.7)
Fenol al 2% (Anexo 1.9)
Aceite de inmersin
(0
CQ
o
Procedimiento
El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de: Escherichla col, Streptococcus sp.,
Staphylococcus sp., Badllus subtilis, Klebsi'ella sp. y Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparar frotis de
cada cepa obtenida de cultivo slido y otros de cultivo lquido, los cuales fijar y teir con azul de metileno.
El profesor explicar los principios de manejo del microscopio y la forma de ajustar la iluminacin.
Preparacin de frotis
1.
Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos (Figura 1).
2.
Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.
3.
Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Despus
acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapn y flamear rpidamente la boca del mismo. Introducir
el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra.
4.
Para el caso de cultivos lquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en
un rea circular de 2 cm. de dimetro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis
al aire y repetir los procedimientos 3 y 4 por 2-3 veces ms.
5.
Si el cultivo es de medio slido, previamente se colocar en el centro del portaobjetos una gota de agua
destilada en la que se mezcla una pequea muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del
paso 3. Extenderla suavemente y dejar secar al aire.
Fijar los frotis de cultivos lquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto
en zonas alejadas al mechero).
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2.
Los frotis de cultivos slidos, completamente secos se fijarn con calor. Para esto se pasai el frotis rpidamente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero.
3.
Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no
hubo sobrecalentamiento.
Tincin simple
|
1.
2.
Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la piceta con agua
destilada.
i
a
o
3.
CULTIVO LIQUIDO
Observacin al microscopio
1.
Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2.
Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observacin, siguiendo las indicaciones del profesor.
3.
Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para la observacin con el objetivo de 100X, colocar previamente una pequea gota
de aceite de inmersin sobre la preparacin.
4.
Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de
aceite y evitar incrustaciones que daan estos sistemas.
Resultados
A.
Reportar las observaciones de forma, agrupacin y tamao relativo de cada uno de los microorganismos en
el cuadro de resultados.
B.
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Cuadro 2
Observaciones microscpicas de frotis de cultivos bacterianos
Escherichla coll
Streptococcus sp.
Cultivo: Lquido
0)
(0
t(0
Aumento total:
Aumento total:
Cuestionario
1.
Investigue cules son las estruauras celulares o molculas responsables de la tincin simple realizada. De
ejemplos de otros colorantes que podran utilizarse.
2.
Por qu se recomienda fijar los frotis de cultivos lquidos con alcohol y no con calor? Por qu se deben
poner varias veces muestras del cultivo lquido y slo una muestra de cultivos slidos al preparar los frotis?
25
manual de prcticas del
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3.
Cules son las principales precauciones de manejo del microscopio y por qu se debe utilizar el aceite de
inmersin al hacer el estudio microscpico de bacterias?
4.
5.
6.
Bibliografa consultada
a
o
Referencias bibliogrficas
Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Practicas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.
johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. USA.
Practical Handbookof Microbiology. William MO'Leary, Cornell Medical College, New York, New York, USA.
CRC Press, 1989.
Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
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introduccin
Objetivos
Que el estudiante clasifique algunas
especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la
tincin de Gram. Que observe estructuras bacterianas especiales, como las
endosporas y cpsulas con tinciones
selectivas. Que comprenda la importancia que tienen estas tinciones para
la caracterizacin e identificacin de
las bacterias.
arabio m:
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Materiales
1 Probeta de 100 mL
1 Vaso de precipitados de 100 mL
1 Parrilla de calentamiento
1 Mechero
5 Portaobjetos
1 Piceta con agua destilada
Cristal violeta (Anexo 1.3)
Safranina (Anexo 1.8)
Lugol (Anexo 1.5)
Solucin de alcohol-acetona (Anexo 1.6)
Verde de malaquita (Anexo 1.4)
Tinta china
Fenol 2% (Anexo 1.9)
Aceite de inmersin
Microscopio compuesto de campo claro
en
Procedimiento
El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de: Escherichia coll, Streptococcus sp.,
Staphylococcus sp., Badllus subtills y Klebsiella sp.
El estudiante preparar frotis de cultivo slido y de cultivo lquido de cada microorganismo y aplicar la tincin
de Gram.
Tambin realizar la tincin seieaiva de endosporas en un frotis fijado al calor de Badllus subtilis y la tincin
negativa en cultivos de K/ebsfef/a sp.
b)
Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el exceso de colorante
c)
Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos.
d)
e)
Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no fluya ms
tintura.
f)
g)
h)
Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar
secar al aire.
i
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Colocar un pequeo trozo de papel filtro sobre el frotis de Bacillus subtilk (Figura 2).
b)
Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparacin.
c)
d)
Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco ms s es necesario) y eliminar
el colorante con agua destilada.
e)
t
a
"O
f)
(a)
(b)
(e)
b)
Colocar una pequea gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos; colocar junto una gota del I
cultivo lquido de Klebsiella sp. (Figura 3). Si se trata de un cultivo slido, hacer una suspensin del microorganismo en una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china.
Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular en ngulo de
45 sobre la muestra.
31
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c)
Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla.
d)
(a)
10
a
o
(d)
Observaciones al microscopio
1.
Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2.
Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequea gota de
aceite de inmersin sobre la preparacin.
3.
Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso
de aceite y evitar incrustaciones que daan a estos sistemas.
Resultados
A.
Reportar las observaciones de forma, agrupacin, color y tamao relativo tal como se indica en el Cuadro 3
de resultados. Hacer los dibujos de la morfologa de cada uno de los microorganismos y colorearlos.
B.
32
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Cuadro 3
Descripcin microscpica de cultivos baaerianos
I
o
cu
Aumento total:
t
ti
a
o
Tamao:
Reaccin de Gram
TINCIN DE ENDOSPORAS
Badllus subtills
Streptococcus sp
Klebsiellasp.
Streptococcus sp
Aumento total:
Forma: cocos, bacilos
Agrupamiento de las clulas
Tamao:
TINCIN DE CPSULA
Descripcin del cultivo: (lquido
o slido, edad del cultivo, etc.)
Aumento total:
Cuestionario
1.
Explique en forma completa la teora que explica la tincin de Gram. Investigue otros dos ejemplos de
tincin diferencial.
33
2.
3.
Explique que reaccin de Gram darn los cultivos de levaduras? Estos resultados tendrn la misma importancia que para las bacterias? Por qu?
4.
Explique el fundamento de la tincin de endosporas. Por qu se debe calentar la preparacin? Que dificultades se tendran si no se adiciona la safranina al final de la tincin?
5.
6.
Bibliografa consultada
Referencias bibliogrficas
Johnson T.R. and C L. Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. EEUUA.
Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiologa. Cuarta Edicin. McGraw Hill Interamericana.
Mxico.
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francs
Pouch Downes and Keith Ito, 2001.
Practical Hahdt^ic of Microbiology. William M O'Leary, Cornell Medical College, New York, New York,
USA. CRC Press, 1989.
Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
j
DERECHOS RESERVADOS 2004, Universidad Autnoma Metropolitana (Mxico). Prohibida la reproduccin de esta obra as como la distribucin y venta fuera del mbito de la UAM. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
^ - w'V
Mtodos de cultivo y
aislamiento de bacterias
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Objetivos
Que el alumno conozca las diferentes tcnicas de aislamiento en medios de cultivo slido para la obtencin de cultivos puros de bacterias,
Que el estudiante prepare medios de
cultivo de uso general, diferenciales
y selectivos para el cultivo de diferentes especies bacterianas.
Introduccin
Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio
para caracterizar su crecimiento, hacer su identificacin y determinar sus
actividades metablicas. Un medio de cultivo es una solucin acuosa de
diferentes compuestos que contiene todos los elementos indispensables
que requieren los microorganismos para crecer,
o
i
i
8.
_t
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Materiales
3 cajas de Petri con Agar nutritivo (Anexo 2.2)
2 cajas de Petri con Agar de eosina azul de metileno EMB
(Anexo 2.3)
2 cajas de Petri con Agar para Estafilococos 110 (Anexo
2.5)
2 cajas de Petri con Medio Mnimo de sales (Anexo 2.3)
1 tubo con agua destilada estril
2 tubos con Caldo Nutritivo (Ver Anexo 2.1)
4 tubos con Agar Nutritivo (Ver Anexo 2.2)
1 Mechero
1 Asa d e inoculacin
1 Parrilla d e agitacin
1 Autoclave
Procedimiento
El profesor proporcionar cultivos puros de Bacillussubtilis, Escherichia col, Staphylococcusaureus, Pseudomonas
fluorescens, Klebslella sp. y Streptococcus sp.
Tambin les proporcionar una muestra problema por equipo (con dos microorganismos diferentes) en la que
practicarn la tcnica de aislamiento por estra cruzada.
En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una muestra con el asa
previamente flameada y fra, inocular la muestra haciendo 4-5 estras simples muy juntas de lado a lado
sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja (Figura 4).
b)
Flamear el asa de inoculacin y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja y
enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona de estras recin hechas.
c)
Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estras y hacer un segundo grupo de estras
en el segundo cuadrante como en el caso anterior.
d)
Sembrar un cultivo puro diferente en cada uno de los dos tubos con caldo Nutritivo y en tubos con agar
nutritivo inclinado.
2.
Sembrar con el asa extendida los mismos cultivos puros en otros dos tubos con agar nutritivo solidificado en
forma recta (Figura 5).
.
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I
cu
a
0)
(a)
(b)
Figura 5. Siembra de medios con agar por estra simple (a) en tubos inclinados y por picadura
(b) en tubos solidificados en forma recta.
Dividir en tres partes, una caja de Petri con EMB Agar, otra con Agar 110 y una de MM. Sembrar en cada parte
un cultivo puro diferente por estra simple.
2.
En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrar por estra cruzada la muestra
problema.
39
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Condiciones de incubacin
1.
Incubar las cajas en forma invertida a 35C durante 24 horas. De las cajas inoculadas por estra cruzada,
seleccionar la colonia ms aislada (generalmente del cuarto cuadrante). Transferir una pequea muestra de
esta colonia a tubos inclinados con agar nutritivo.
2.
Incubar los tubos a 35C durante 24-48 horas. Observar la aparicin de colonias y reportar la forma en que
se distribuyen a lo largo del tubo.
Resultados
A.
B.
ce
0
40
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Cuadro 4
Morfologa colonial de cultivos bacterianos
Escherichla col i
Streptococcus sp
MUESTRA PROBLEMA
o
(0
a
o
MEDKDEMB
Siembra en medios
selectivos y diferenciales:
MED 0 1 1 0
MEDIO fMNIMO
(j
Microorganismo 1:
Forma:
Color:
Tamao (mm):
Elevacin:
Luz transmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:
Nota: La descripcin colonial puede hacerse considerando los siguientes criterios
Forma: circular, irregular, filamentosa o rizoide
Borde: entero, lobulado, aserrado
Superficie: lisa o rugosa
Aspecto de la colonia: hmeda, seca, butirosa
Elevacin: convexa, plana, hundida
Luz transmitida: translcida, opaca
Luz reflejada: brillante, mate
Consistencia: dura, blanda, mucoide
41
manual de prcticas del
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Cuadro 5
Descripcin morfolgica de cultivos puros en tubos de cultivo
Tubos inclinados de
Agar Nutritivo
\y
Crecimiento: arborescente,
filiforme, rizoide, disperso,
puntiforme
Color:
ultivo en tubo de
Caldo Nutritivo
Crecimiento: superficie
como pelcula, como sedimento, turbidez en todo
el tubo
Color:
r~\
Tubos rectos de
Agar Nutritivo
Crecimiento: en forma de
pelcula superficial, a lo
largo de la picadura,
solo en el fondo
Color:
i-
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Cuestionario
O
1.
Que es el agar y de donde se obtiene? Cules son los nutrimentos que proporciona a los microorganismos?
|
o
II
2.
Cul es la composicin qumica de los medios EMB, 110 y MM? Cules son los componentes o propiedades
responsables de su funcin como medios selectivos o diferencales?
3.
Porque el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias? Proponga algunas sustancias que se le agregaran para hacerlo selectivo para bacterias Gram negativas?
4.
Cul es la informacin que se obtiene de las siembras de cultivos barterianos en tubos con agar inclinado
y en tubos con agar solidificado en forma recta?
5.
Bibliografa consultada
_k
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Referencias bibliogrficas
Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Prcticas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition). Edited by Francs
Pouch Downes and Keith Ito, 200.
Practical Handbook of Microbilogo CRC Press, 1989. William M O'Leary, Cornell Medical College, New
York, New York, USA.
Bergey's Manual of Determinative Barteriology. 9th edition, The Williams and Wiikins Co., Baltimore, USA.
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA),
American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
Ed. (1991).
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Mtodos de cultivo y
descripcin morfolgica de hongos
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Objetivos
introduccin
Los hongos son organismos eucariticos y de mayor tamao que las bacterias, se distinguen de otros eucariotes como los animales por ser inmviles y de las algas y plantas por carecer de pigmentos fotosintticos.
Son de nutricin hetertrofa, es decir dependen de nutrientes orgnicos
que son solubilizados por sistemas enzimticos especficos y son 5
absorbidos a travs de su pared celular y membrana plasmtica.
Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multicelulares (filamentosos), sin embargo, tambin existen hongos (0
dimrficos principalmente patgenos que se presentan en las dos
a
formas alternativamente, dependiendo de condiciones ambienta- o
"O
les como la temperatura.
Las levaduras son clulas de forma esfrica u oval, ampliamente distribuidas en la naturaleza; frecuentemente se encuentran formando una
cubierta polvosa fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reproducen asexualmente por gemacin, un proceso por el cul brota una
protuberancia o yema de la clula madre que posteriormente se
separa como clula individual.
El cuerpo o estructura vegetativa caracterstica de los hongos filamentosos
(mohos) se denomina talo, generalmente constituido de hifas
ramificadas que forman el micelio. Las hifas de algunos hongos
presentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de los
Zygomycetes las hifas no presentan estos septos y se les conoce
como hifas cenocticas.
El principal mecanismo de reproduccin de los hongos es asexual, por
fragmentacin de hifas vegetativas o por la produccin de abundantes esporas en conidiforos y esporangiforos formados en hifas
areas llamadas hifas reproductivas. Sin embargo, la descripcin
de las estructuras de reproduccin sexual es el principal criterio de
clasificacin, por el que pueden ser ubicados en tres subdivisiones
o phylum: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota.
Se estima que puede haber 1.5 millones de especies de hongos, de las
cules se han descrito ms de 250 000 y de stas solo se conocen
150 especies patgenas para el hombre y otras tantas para plantas y
animales. Es de gran importancia conocerlos, por los beneficios
que proporcionan al hombre, ya que como se mencion la mayora
son saprobios (utilizan materia orgnica muerta), por lo que tienen
una gran capacidad de reciclar materiales orgnicos de diferentes
tipos, de tal forma que se pueden utilizar como agentes de
biodegradacin de compuestos recalcitrantes en procesos de
biorremediacin.
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manual de prcticas del
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Desde la antigedad, estos microorganismos se han utilizado en procesos de produccin de diferentes alimentos
como: vino, cerveza, pan y queso entre otros. Tambin se ha reportado que en la naturaleza hay diversas
especies que funcionan como importantes agentes de control biolgico de insectos (bioinsecticidas) y que
pueden mejorar la nutricin y permanencia de la mayora de las plantas (micorrizas).
Materiales
4 Cajas de Petri con 25 mL de PDA (Anexo 2.6 )
4 Cajas de Petri con 25 mL de medio Czapek-Dox (Anexo
2.8)
3 Tubos de cultivo inclinados con 7 mL de PDA
2 matraces Erlenmeyer de 250 mL
1 Probeta de 100 mL
1 Vaso de precipitados de 100 mL
1 Mechero Fisher
5 Portaobjetos y cubreobjetos
1 Aguja de diseccin
1 Asa de siembra
Cinta adhesiva transparente
Microscopio ptico de campo claro
Aceite de inmersin
Autoclave
Incubadora a 30 C
Azul de lactofenol (Anexo 1.1 )
m
0
Procedimiento
El profesor proporcionar a los alumnos tubos de cultivo con Aspergillus niger, PenicHHum chrysogenum, Rhizopus
oliQosporus, Trlchoderma viridey de la levadura Saccharomycescerevislae.
El estudiante inocular cada una de las cepas en cajas de Petri con dos medios de cultivo: a) Czapek-Dox Agar, a
base de sales minerales y sacarosa y b) Papa Dextrosa Agar, que es un medio complejo.
Har la descripcin macroscpica de cada especie en los dos medios de cultivo y la observacin microscpica la
realizar aplicando la tcnica de cinta Scotch con azul de lactofenol.
Siembra de hongos
1.
Para sembrar los hongos filamentosos, se deber separar una parte de micelio de los tubos de cultivo con
aguja de diseccin, previamente calentada en la flama del mechero y enfriada.
2.
Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con PDA y de la misma manera inocular la caja con medio
de Czapek-Dox.
3.
Las levaduras se inocularn por estra cruzada sobre la superficie de las cajas, en forma similar a la inoculacin de bacterias.
4.
Colocar las cajas envueltas en papel o en bolsa de plstico en forma invertida dentro de una incubadora a
28-30 C durante 3-5 das.
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Hacer la descripcin de la forma, tamao, aspecto, textura y color de las colonias de Saccharomyces cerevisiae.
2.
En los cultivos de mohos describir la forma, tamao y el tipo de colonia, as como las caractersticas del
micelio (algodonoso, aterciopelado, velloso, areo o pegado al medio) el color del micelio, el color de
esporas, cambios en el medio de cultivo, etc.
De las colonias de levaduras preparar un frotis fijado al calor y teirlo con azul de metileno.
2.
Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomndola nicamente por los extremos.
2.
Cerca del mechero se abre la caja y se presiona ligeramente la cinta transparente sobre la periferia de la
colonia.
3.
Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol, previamente colocada en el
centro de un portaobjetos. La cinta funcionar como cubreobjetos por lo que se deber aplanar lo mejor
posible, evitando la formacin de burbujas y sin alterar demasiado las estructuras.
4.
Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer las observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y
40X.
5.
Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidiforos, conidias, esporangiforos,
esporangios y rizoides. Determine si las hifas presentan septos o no.
Resultados
A.
Reportar sus observaciones en el Cuadro 6. Hacer los dibujos de las observaciones morfolgicas de cada
uno de los microorganismos y colorearlos.
B.
C.
49
m a n u a l
d e p r c t i c a s
del
--,v.::'-"<t f *
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conidias
conidias
conidiforo
10 ^m
10 \im
10 \im
Aspergillus flavus
(O
m
o
porangiosporas
Aspergillus niger
esporangiforo
conidiforos
100
25 Jim
conidias O
10
Rhizopus oligosporus
Penicillium roqueforti
Saccharomyces cerevisiae
conidiforos
conidias
conidiforos
conidias
OOOOooo
oooooo
10 un
Trichoderma viride
OOOOOO
10
Penicillium chrysogenum
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Cuadro 6
Descripcin morfolgica de hongos
liliillilltllillliilllliiilliilliii
Descripcin macroscpica
en PDA
;olor y tamao:
Aspecto:
Textura:
Descripcin microscpica:
Aumento total:
Micelio con o sin septos
Tamao:
Estructuras de reproduccin
Tamao:
Clasificacin (phylum):
Descripcin macroscpica
en medio Czapek-Dox:
Color y tamao:
Aspecto:
Textura:
Descripcin microscpica:
Aumento total:
Micelio con o sin septos
Tcmao:
Estructura de reproduccin
Tamao:
Tipo de esporas
Tamao:
51
Cuestionario
1.
2.
3.
4.
Describir brevemente tres problemticas concretas para el hombre causadas por hongos y tres ejemplos de
utilizacin benfica.
5.
Bibliografa consultada
Referencias bibliogrficas
Hudson B.T. and L Sherwood. 1997. Explorations in Microbiology. Prentice-Hall, New Jersey. USA.
Herrera, T., Ulloa, M. 1990. El Reino de los Hongos. Micologa Bsica y Aplicada. Fondo de Cultura Econmica, UNAM. Mxico.
Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiologa. Cuarta Edicin. McGraw Hill Interamericana.
Mxico.
52
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fe*
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Objetivos
Que el alumno realice algunas pruebas bioqumicas en medios de cultivo
con sustratos especficos que permitirn demostrar actividades metablicas
de bacterias y levaduras. Que el estudiante comprenda la importancia de las
pruebas bioqumicas para la caracterizacin e identificacin de estos
microorganismos.
introduccin
El metabolismo, es toda la serie de reacciones que ocurren en los
seres vivos. stas reacciones incluyen procesos de obtencin de energa como son: la descomposicin de molculas orgnicas en los
quimitrofos (catabolismo) o la captacin de luz para el caso de los
fottrofos, as como de sntesis de material celular a partir de nutrientes
escenciales (anabolismo). Todas las reacciones metablicas, son
catalizados por enzimas que en su mayora funcionan dentro de la
clula por lo que se conocen como endoenzimas, hay tambin
exoenzimas principalmente hidrolticas que son liberadas por la clut
la para catalizar reacciones fuera de sta.
(0
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manual de prcticas del
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Materiales
1 Gradilla
1 Parrilla de agitacin
1 Probeta de 100 mL.
3 Matraces Erlenmeyer de 250 mL
3 Vasos de precipitados de 250 mL.
1 Mechero
1 Asa de siembra
2 cajas con agar almidn (AA) (Anexo 2.13 )
2 tubos con campana de Durham y 5 mL de cada uno de
los siguientes medios: glucosa-rojo de fenol lactosa-rojo
de fenol, sacarosa-rojo de fenol y manitol-rojo de fenol
(Anexo 2.9 ).
2 tubos con 7 mL de medio SIM (Sulfuro, Indol, Motilidad)
(Anexo 2.11)
2 tubos con 7 mL de medio TSI (triple azcar hierro)
solidificados en forma inclinada (Anexo 2.15)
2 tubos con 7 mL medio de citrato de Simmons solidificados
en forma inclinada (Anexo 2.10 )
2 tubos con 7 mL de caldo urea (Anexo 2.11)
2 tubos con 7 mL de leche tornasolada (Anexo 2.14)
2 tubos con 7 mL de agar gelatina solidificados en forma
recta (Anexo 2.15 )
2 tubos con 7 mL de agar nutritivo blando solidificados en
forma recta (Anexo 2.17 ).
Perxido de hidrgeno 30 %
cido tricloroactico al 5% (Anexo 1).
fl
0
Procedimiento
El profesor proporcionar cultivos puros de Bacillussubtllis, Escherichia col!, Pseudomonas fluorescens, Klebslella
sp. y Saccharomyces cerevislae. A cada uno de los equipos, les corresponder tambin un cultivo problema.
Todos los tubos y cajas debern etiquetarse e inocularse de acuerdo a las siguientes instrucciones.
Dividir en tres secciones por la parte de atrs las cajas con agar-almidn.
2.
En una de las cajas inocular por estra simple tres cepas diferentes.
3.
En la segunda caja inocular en dos secciones la muestra problema y dejar una seccin sin inocular.
4.
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Los tubos de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, caldo urea y leche tornasolada se inocularn
mezclando una asada de cada uno de los microorganismos.
2.
Los tubos con agar TSI se inocularn por estra simple en la superficie y por picadura hasta el fondo del tubo
(Figura 5).
3.
Los tubos con gelatina nutritiva y agar nutritivo blando se inocularn por picadura (con el asa recta)
4.
Determinar la actividad de amiiasas en las cajas de agar almidn por el crecimiento y aparicin de zonas
claras alrededor de las colonias. Si no es posible observarlas a simple vista, agregar unas gotas de lugol a las
cajas y observar la aparicin de zonas claras sobre el medio que se colorear de azul como indicativo de
prueba (+). Comparar los resultados con la zona de la caja que se dej sin inocular.
2.
En un portaobjetos hacer una suspensin en una gota de agua de las colonias obtenidas en cajas de agaralmidn y agregar unas gotas de perxido de hidrgeno al 30%. Observar la formacin de burbujas que
significan una prueba de catalasa (+).
3.
Todas las pruebas en tubo debern interpretarse en comparacin con tubos control, que contienen los
mismos medios de cultivo pero sin inocular
4.
En los tubos de agar gelatina, observar la licuefaccin del medio y agregar unas gotas de solucin de TCA
(cido tricloroactico) al 5%, observar la aparicin de zonas claras o nubosidad en el medio.
5.
En los tubos con medios de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, hacer observaciones a las 24
y 48 horas de incubacin. Determinar si hay crecimiento, cambios en el color del indicador y produccin de
gas en la campana de Durham
Resultados
A.
Reportar los resultados en el Cuadro 7. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-), crece un
poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++). Actividad sobre sustratos (+) o negativa (-)
B.
Investigar los resultados bibliogrficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la
prctica
C.
Investigar las reacciones enzimticas y de color realizadas para la evaluacin de actividades metablicas
D.
57
manual de prcticas del
M
MI
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Cuadro 7
Resultados de pruebas de diferenciacin bioqumica
MEDIO DE CULTIVO
Escherichla cot
Saccharomyces
cerevislae
CULTIVO PROBLEMA
Agar Almidn
Crecimiento:
Color del medio con el
ugol:
Hidrlisis de almidn:
Prueba de catalasa:
Aparicin de burbujas al
agregar perxido de
hidrgeno:
Reaccin de catalasa:
Gelatina Nutritiva:
Crecimiento:
Licuefaccin del medio:
Formacin de nubosidad
al agregar TCA al 5%:
Hidrlisis de gelatina:
Agar Nutritivo Blando:
r\
Crecimiento: superficial,
en la parte media,
en el fondo:
Crecimiento en la picadura
Movilidad:
58
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r\ r\ r\ r\ r\ r\
Gluc
1011011
Lac
Sac Man
r\ r\ r\
9
TI
|
a
Gluc
Lac
Sac Man
Gluc
Lac
Sac Man
Crecimiento:
Color del medio:
cido:
Gas:
Leche tornasolada
(Litmus Milk)
ddO:
lcali:
Sin cambio:
Reduccin:
Peptonizacin:
Coagulacin:
Gas:
Caldo Urea
Crecimiento:
Color:
Hidrlisis de urea:
59
Medio TSI
Crecimiento:
Cambio de color:
Produccin de H2s:
m
o
Produccin de gas:
Fermentacin del azcar:
Medio de citrato de
Simmons
r\
Crecimiento:
Cambio de color:
Utilizacin de citrato:
Cuestionario
1.
Cules son las rutas bioqumicas de obtencin de energa de las bacterias respiradoras aerobias, las de
respiracin anaerobia, las fermentadoras, y las anaerobias estrictas?.Cul de stas es ms eficiente?
Porque?
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2.
Describa brevemente las actividades enzimticas que se identificaron en cada uno de los medios de cultivo
utilizados en la prctica. Cul es la reaccin bioqumica que cataliza cada una? Cules son exoenzimas y
cules son endoenzimas?
!
0)
t
ti
a
o>
o
3.
Explique por qu los tubos de fermentacin de azcares deben evaluarse a las 24 y 48 horas? Qu resultados se observaran en los tubos en el caso de que un microorganismo metabolizara oxidativamente la
glucosa?
4.
Explique por qu se busca la presencia de precipitados de sulfuros en el fondo del tubo de TSI y no en la
superficie?
5.
Bibliografa consultada
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Referencias bibliogrficas
McFaddin, J.F., J Mac Faddin. 2000. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 3rd ed.,
Lippicont, Williams & Wilkins.
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francs
Pouch Downes and Keith Ito, 2001
Practical Handbook of Microbiology. William O'Leary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press,
1989.
Bergey's Manual of Determinative Bacterilogo 9th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA),
American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
Ed. (1991).
DERECHOS RESERVADOS 2004, Universidad Autnoma Metropolitana (Mxico). Prohibida la reproduccin de esta obra as como la distribucin y venta fuera del mbito de la UAM. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Mtodos de cuantificacin
de microorganismos
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introduccin
objetivos
Que el alumno conozca algunas de
las tcnicas de cuantificacin directa e indirecta de microorganismos
ms utilizadas. Que compare las ventajas y desventajas de cada una en
funcin de la informacin que se obtiene, del tiempo invertido y de los
recursos necesarios.
Materiales
6 cajas de Petri con agar nutritivo (Anexo 2.2 )
10 Pipetas de 1-2 ml_ estriles
10 Tubos con 9 mL de ssi (solucin salina isotnica= 0.89%
NaCI)
1 matraz Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de ssi
Vasos de precipitados
1 Parrilla de agitacin
1 espectrofotmetro
1 cmara de Neubauer
I pipeta Pasteur
Fenol al 2% (Anexo 1.9)
1 Varilla de vidrio doblada en L
1 Microscopio compuesto
Safranina (Anexo 1.8)
Procedimiento
El profesor proporcionar un cultivo de Saccharomyces cerevisiae y Escherichla colL
El alumno medir la turbidez de los cultivos en un espectrofotmetro (Spectronic 20); cuantificarn el nmero de
clulas totales, por cuenta direaa en cmara de Neubauer y determinar el nmero de unidades formadoras
de colonias (UFO por dilucin y siembra en placa.
Tcnica turbidimtrica
1.
2.
3.
Calibrar el instrumento a 0% de transmitancia con el botn izquierdo. Para leer en la escala, observar la
aguja a nivel de los ojos y tomar el dato donde la aguja coincida sobre su reflejo en el espejo.
4.
Colocar una celda con medio de cultivo estril como testigo (sin inocular) y calibrar el instrumento a 100% de
transmitancia.
5.
Para medir la turbidez de una muestra, vaciarla en otra celda, limpiar perfectamente con papel suave y
medir el valor de %T.
6.
7.
66
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Se coloca 1 mL de la muestra en un tubo de ensaye. Cuando se trata de cuantificar muestras muy concentradas (D.O > 1.5) ser necesario preparar diluciones de la misma con solucin salina isotnica. Agregar 0.5 mL
de solucin de fenol al 2% y dos gotas de safranina. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 minutos.
o
2.
3.
Lavar cuidadosamente la cmara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el portaobjetos. Secar
con papel suave. Colocar el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales,
donde se aprecian una zona cuadriculada a simple vista.
Homogeneizar perfectamente la muestra en un vrtex, tomar inmediatamente una muestra con una pipeta
Pasteur de punta fina y depositar una gota entre la cmara y el cubreobjetos por el borde de la cmara. Dejar
que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultar la evaluacin precisa de la
poblacin microbiana.
4.
Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cmara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo
seco dbil (10X) la zona cuadriculada que se muestra en la Figura 7.
5.
Localizar el cuadro central grande (C1) que miden 1.0 mm por lado, que se encuentra dividido en 5X5
cuadros pequeos (C2) limitados por triple lnea que miden 0.2mm por lado. Estos cuadros pequeos a su
vez se encuentran divididos en 16 cuadros mas pequeos (C3) de 0.05 mm de lado.
6.
Hacer la cuantificacin de clulas con el objetivo seco fuerte (40X), contando el nmero de clulas que se
localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamao C2 sirven de gua para el cmputo. Se empieza a
contar desde la parte superior de los cuadros C2 y se contina hasta la base. Si las clulas tocan los lmites de
los cuadros C2; debern contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado derecho del
cuadro. Si las clulas tocan la parte inferior o el lado derecho no se cuentan. Este mtodo reduce las
posibilidades de contar la misma clula dos veces.
7.
Cuente hasta cerca de 200 a 250 clulas antes de determinar el nmero de clulas por mL En el proceso de
contar se pueden presentar tres situaciones diferentes que a continuacin se explican:
I
8.
4)
a. Si hay de 200 a 250 clulas por cuadro grande (C1), multiplicar directamente X 104 para reportar el
nmero de clulas por mL.
b- Con menos de 200 clulas por cuadro grande (C1), ser necesario contar algunos de los cuadros de las
esquinas (miden 1x1 mm de lado y divididos en 4X4). De esta manera se cuantificarn ms de 200 clulas.
Despus dividir el nmero total de clulas entre el nmero de cuadros empleados y sacar el valor promedio
por cuadro grande. Despus multiplicar este valor por X 104 para reportar el nmero de clulas por mL.
c. En el caso de que se observen ms de 200 clulas por cuadro grande (C1), se debern contar las clulas de
los cuadros de menor tamao (C2) hasta contar cerca de 200 clulas. Dividir este valor entre el nmero de
cuadros usados para la cuenta para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio
por 25 para obtener el nmero de clulas aproximado en un cuadro grande (C1) y despus multiplicar X104
para reportar el nmero de clulas por mL.
67
manual d eprcticas del
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8.
El factor de 104 por el cul se debe multiplicar el nmero de clulas por cuadro grande (C1) es porque este
cuadrado contiene un volumen de 0.1 mm 3 (mide 1mm por lado y la cmara tiene una profundidad de 0.1
mm).
# clulas/cuadro C1 (25cuadros C2) = # clulas/ 0.1 mm 3 X 104 = # clulas/mL
9.
En el caso de que el # de clulas sea muy grande, la suspensin deber diluirse y se har la correccin como
sigue:
1 mm
m
1 m
1 mm
1 mnri
0.2 mrri
::::::::i:E2
Cuadro 2 (40X)
Cuadro 1 (10X)
Figura 7. Cuenta en cmara de Neubauer
Hacer diluciones decimales del cultivo de 105 hasta 10"9 en condiciones estriles (Figura 8). Se colocarn en
cajas de Petri con agar nutritivo por duplicado 0.1 mL de las ltimas tres diluciones.
2.
Distribuir cuidadosamente el inoculo en toda la caja con ayuda de una varilla de vidrio doblada en "L"
previamente esterilizada a la flama del mechero y enfriada.
3.
4.
Incubar las cajas en forma invertida a 35C durante 24-48 horas para bacterias y levaduras y de 5-7 das para
hongos filamentosos.
5.
Hacer la cuenta de las colonias de las placas, seleccionando la dilucin donde el nmero de colonias sea
entre 30 y 300.
68
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6.
Si la inoculacin fue por duplicado o triplicado, se calcula el nmero promedio de colonias por dilucin y
este nmero se multiplicar por el inverso de la dilucin XI0 (por ajuste de volumen inoculado) para obtener la nmero total de unidades formadoras de colonias (UFC)/mL en la muestra original.
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
0)
1 mL
(6
a
o
Cultivo bacteriano
10-3
io- 4
io- 5
io- 6
io- 7
O.lmL
XO.lmL
Resultados
A.
Reportar los resultados de cuantificacin de los cultivos, aplicando las tcnicas descritas. Indicar los clculos hechos para cada metodologa.
B.
Recopilar sus resultados en el Cuadro 8 incluyendo los de los otros equipos, indicando la muestra analizada
por cada equipo. Discutir en cada caso cules fueron las ventajas y desventajas de las metodologas de
cuantificacin.
69
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Cuadro 8
Cuantificacin de microorganismos por tcnicas directas e indirectas
MICROORGANISMO
Turbidez (D.O.)
Escherichia col
(0
a
o
Saccharomyces
cerevisiae
Cuestionario
1.
Compare el mtodo de dilucin en placa con el mtodo de cuenta direaa en cmara de Neubauer para la
cuantificacin de microorganismos. En que casos conviene usar cada uno?
2.
Explique cules son las ventajas y desventajas del mtodo turbidimtrico de cuantificacin de clulas.
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3.
Mencione dos aplicaciones concretas en las que se utilicen cada una de las tcnicas de cuantificacin
realizadas.
1
(0
ti
a
o
4.
5.
Bibliografa consultada
71
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Referencias bibliogrficas
Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prcticas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.
Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. USA.
Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biologa de los Microorganismos. Octava Edicin.
Prentice Hall. Espaa.
c
Prescott L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiologa. Cuarta Edicin. McGraw Hill Interamericana.
Mxico.
72
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I " O
ai*
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introduccin
Objetivos
Que el estudiante conozca el efecto
del pH y la temperatura como parmetros de control del crecimiento microbiano. Que el alumno comprenda la
importancia de estos factores fsicoqumicos en la seleccin de poblaciones microbianas en los diferentes
ambientes en que se encuentran y
los mecanismos de adaptacin a nivel celular y metablicos que han
desarrollado.
0)
(6
ti
c).-
Otros microorganismos se desarrollan en los habitat naturalmente alcalinos como lagos salados y desiertos donde los valores de pH 10 son comunes, estos alcalfilos incluyen especies de Rhizoblum, Bacillusy algunas
bacterias entricas y cianobacterias. En general los hongos son ms tolerantes a la acidez que las bacterias.
Cada microorganismo tiene un rango de temperatura y pH en el cual pueden crecer, de tal manera que al
modificarse estos factores se pueden alterar la velocidad de crecimiento y causar la muerte de lo mismos,
por lo que se pueden utilizar como factores de control del crecimiento microbiano.
Materiales
2 Cajas d e Petri con m e d i o d e Papa Dextrosa Agar (Anexo
2.6) ajustado a p H 7.0
2 Cajas d e Petri con m e d i o d e Papa Dextrosa Agar ajustado a pH 5.0
2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajustado a pH 9.0
22 Tubos con 7 mL de caldo microinoculacin (Bioxon) ajustado a pH 7.0 sin amortiguar (Anexo 2.19)
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculacin ajustado a pH
5.0 sin amortiguar
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculacin ajustado a pH
9.0 sin amortiguador
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculacin ajustado a pH
7.0 con amortiguador (Anexos 1.1, 2.19)
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculacin ajustado a pH
5.0 con amortiguador
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculacin ajustado a pH
9.0 con amortiguador
1 Asa de inoculacin
3 pipetas de 1.0 mL. estriles
1 mechero Fisher
Espectrofotmetro
Microscopio estereoscpico
Soluciones amortiguadoras de pH 4, 7 y 10
fi
0
Procedimiento
El profesor proporcionar cultivos lquidos de: Eschechia coli, Pseudomonas fluorescensy Lactobacii/ussp., una
suspensin de esporas de Aspergillus nigery Penicillium roqueforti. Cada uno de los tubos y cajas debern
etiquetarse con el nombre del microorganismo que se inocular.
Efecto de la Temperatura
1.
En tres cajas de Petri con PDA divididas en dos secciones, inocular 0.1 mL. de la suspensin de esporas de
hongos en cada seccin.
2.
Incubar una caja de Petri a 15C, otra a 30C y la ltima a 45C en forma invertida durante 72 horas y hacer
las observaciones macroscpicas.
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3.
Incubar nuevamente las cajas y realizar observaciones en microscopio estereoscpico despus de una semana.
4.
En seis tubos de caldo microinoculacin ajustado a pH 7.0, inocular dos con cada una de las cepas bacterianas.
5.
Incubar dos tubos en estufa a 15C, otros dos a 30C y los dos ltimos a 45C durante 24-48 horas. Medir la D.O.
Efecto del pH
1.
2.
Preparar tres series de cuatro tubos de caldo de microinoculacin ajustados a 3 diferentes valores de pH
(5.0, 7.0 y 9.0) con solucin de HC11.0 M o NaOH 1.0 M.
Preparar otra serie de cuatro tubos ajustados a los mismos valores de pH del punto anterior pero utilizando
soluciones amortiguadoras tal como se indica en la Tabla del Anexo 1.10.
3.
Inocular 0.1 ml_. de cada una de las cepas bacterianas en la serie de seis tubos de caldo microinoculacin
ajustados a diferentes pH con amortiguador y sin amortiguador, dejando uno sin inocular como testigo.
4.
5.
Inocular tres cajas de Petri con medio PDA ajustado a tres pH diferentes con cada una de las cepas de
hongos.
6.
Incubar las cajas de Petri a 30 C durante 72-96 horas y hacer observaciones macroscpicas.
7.
i
a
o
Resultados
A.
Reportar los resultados en los cuadros 8, 9 y 10 de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-),
crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++).
B.
Comparar sus resultados con los reportados en la bibliografa de cada una de las cepas.
77
m a n u a l d e p r c t i c a s d e l . v>
'::;.^':,''iv>.
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Cuadro 9
Efecto de la temperatura de cultivo en el crecimiento microbiano
TEMPERATURA
PAPA DEXTROSA AGAR
15C
30C
45C
CALDO
.
MICROINOCULACIN
Escherlchla col i
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia (D.O.)
Pseudomonas
fluorescens
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia (D.O.)
Lactobadllus sp.
r\
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia (D.O.)
78
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Cuadro 10
Efecto del pH de cultivo en el crecimiento microbiano
PAPA DEXTROSA AGAR
111
lili
Asperg/fus n/ger
Morfologa de la colonia
a las 72 horas
Morfologa microscpica
a la semana
I
ff
Penidlllum roquefortl
Morfologa de la colonia
a las 72 horas
Morfologa microscpica
a la semana
Sin amortiguador
Con amortiguador
CAtDO
.
MICROINOCULACIN
PH5.0
PH7.0
PH9.0
PH5.0
PH7.0
PH9.0
Escherichia col!
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbanda(D.O.;
Pseudomonas
fuorescens
r\
r\
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia(D.O.)
Lactobadllus sp.
i
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbanda(D.O.)
79
manual de prcticas del
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Cuestionario
1.
Cules son las temperaturas cardinales y como se clasifican los microorganismos de acuerdo a su temperatura ptima de crecimiento?
2.
Como influy el pH en el crecimiento de hongos y baaerias? Que diferencias se observaron en los medios
de cultivo amortiguados y sin amortiguar?
3.
Explique brevemente cules son los mecanismos celulares que los microorganismos termfilos extremos y
psicrfilos han desarrollado para adaptarse a condiciones extremas de temperatura y pH.
4.
Explique cul es la relacin que existe entre condiciones ptimas de crecimiento en el laboratorio y las
condiciones del habitat de origen de las poblaciones microbianas.
5.
Bibliografa consultada
(0
ffl
Referencias bibliogrficas
Harrigan, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. 1998. Academic Press. 3a. Edition.
Jay, J.M.1994. Microbiologa Moderna de los Alimentos. Tercera Edicin. Editorial Acribia, Zaragoza, Espaa.
Holt, J. C , N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
Bacterilogo 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
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Objetivos
Que el estudiante conozca las respuestas de crecimiento de diferentes cultivos microbianos, frente al
estrs osmtico causado por la adicin de azcares, la adicin de NaCI
y la desecacin. Que el alumno comprenda el efecto de estos factores
sobre la actividad de agua y los mecanismos de adaptacin que han desarrollado los microorganismos.
introduccin
El agua lquida es esencial para todos los procesos bioqumicos. Para los
microorganismos, un factor crtico es la disponibilidad de agua lquida
ms que la cantidad total de agua presente en el ambiente. El total de
agua realmente disponible para uso microbiano se expresa como la actividad de agua (aw).
Los efectos de las altas concentraciones de solutos sobre los microorganismos pueden deberse a los solutos mismos o a los efectos del
soluto sobre la aw. Cada vez que se disuelven sustancias en el agua
pura se disminuye la cantidad de agua disponible o agua libre. La
actividad de agua en trminos termodinmicos proporciona una
medida de agua libre y es definida por la ecuacin
a-
Po
nt +n2
PE ftCltIB0LlGA SEEff AL
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Materiales
1 asa de inoculacin
1 Espectrofotmetro
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 10% de sacarosa (p/v)
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 30% sacarosa
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 60% de sacarosa
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 1 % NaCI (p/v)
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 5 % NaCI
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 10 % de NaCI
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 10% sacarosa
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 30% sacarosa
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 60% de
sacarosa
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 1 % NaCI
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 5 % NaCI
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 10 % NaCI
36 tubos de ensayo vacos y estriles
5 pipetas de 1mL estriles
Procedimiento
El profesor proporcionar cultivos lquidos de bacterias: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Pseuc/omonas sp. y hongos: Saccharomyces rouxii, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum. En series de tres
cajas de Petri y 6 tubos de cada medio se inocularn por equipo tres de los microorganismos.
Inocular en el centro de las cajas de Petri, con una gota de cada una de las cepas de hongos.
2.
Inocular con 0.1 mL de cultivo de dos de las cepas de bacterias en dos tubos de ensaye con 7mL de cada uno
de los medios.
3.
Incubar las cajas en forma invertida a 30C y los tubos de caldo a 35C durante 48 horas y hacer las observaciones. Incubar nuevamente y a la semana realizar observaciones de la morfologa de los cultivos en cajas y
en tubos medir la turbidez de los cultivos en caldo nutritivo a las 24-48 horas.
Efecto de la desecacin
1.
En series de seis tubos de ensayo vacos y estriles, con una pipeta estril, colocar una gota de una suspensin de cada uno de los siguientes cultivos bacterianos: Bacillus subtilis, Escherichia co/iy en un tercer tubo
una gota de una suspensin de esporas de Aspergillus niger
2.
3.
84
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4.
5.
6.
Repetir la instrucciones de los puntos 3-5, despus de dos y tres semanas en los tubos restantes.
Resultados
A.
Reportar los resultados en los Cuadros 11-13. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-),
crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++).
B.
C.
Investigar los resultados bibliogrficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la o
prctica
a
o
Cuadro 11
Efecto de la presin osmtica y aaividad de agua en el crecimiento de baaerias
0.990)
CEPA
Sacarosa
10%
0.940)
= 0.970)
NaC11%
Sacarosa
30%
Staphylococcus sp.
Nac 5%
Sacarosa
60%
r\
NaCI 10%
Crecimiento a las
24 horas
Densidad ptica:
Escherichia coli
r\
Crecimiento a las
24 horas
Densidad ptica:
Baclllus subtlis
r\
Crecimiento a las
24 horas
Densidad ptica:
85
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Cuadro 12
Efecto de la presin osmtica y actividad de agua en el crecimientos de hongos
(aw = 0.990)
CEPA
Sacarosa
10%
Nac 1 %
( ^ = 0.970)
Sacarosa
30%
Nac 5%
( ^ = 0.940)
Sacarosa
60%
NaC110%
Sacharomyces
rouxll
m
o
Morfologa de la colonia
a las 72 horas:
Morfologa de la colonia
despus de una semana:
AspergIIus nlger
Morfologa de la colonia
a las 72 horas:
Morfologa de la colonia
despus de una semana:
Penlcllllum
chrysogenum
Morfologa de la colonia
a las 72 horas:
Morfologa de la colonia
despus de una semana:
86
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Cuadro 13
Efeao de la desecacin en la recuperacin de cepas microbianas de bacterias y hongos
.1
r\
!
Escherchla col!
SEMANA
>
**
1
i.;.
<J
/->
KJ
0)
Crecimiento: superficial,
depsito:
Absorbanda (D.O.):
Badilus subtilis
r\ r\
r\ /^\
<J
\J
Crecimiento: superficial,
depsito:
Absorbanda (D.O.):
AspergIIus nlger
r\ r\
r\
r\
r\
<J
U
Crecimiento: superficial
depsito:
Absorbanda (D.O.):
Cuestionarlo
1.
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2.
Cules son las hiptesis que tratan de explicar la osmofilia y la halofilia de poblaciones microbianas?
3.
Explique cul es la importancia de controlar la artividad de agua en procesos de conservacin de alimentos? Que es la plasmoptisis? Que es la plasmlisis?
4.
5.
Como se explica la mayor tolerancia de los hongos a valores de aw reducidos que en bacterias?
6.
Bibliografa consultada
0)
Referencias bibliogrficas
Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. USA.
Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prcticas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa Mxico.
Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biologa de los Microorganismos. Octava Edicin.
Prentice Hall. Espaa.
Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiologa. Cuarta Edicin. McGraw Hill Interamericana.
Mxico.
88
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1O
O
O
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introduccin
Objetivos
Que el estudiante conozca las fases
de una curva de crecimiento en un
cultivo en lote de Escherichla colL
Que el alumno aprenda a calcular
parmetros cinticos (/*, td) caractersticos de las especies bacterianas.
ti
es
a
o
3
o
u
tiempo
A) fase de retardo, de adaptacin o fase lag, B) fase de crecimiento
exponencial o fase log, C) fase estacionaria y D) fase de declinacin o muerte. La forma de cada porcin de la curva y el tiempo de
duracin de cada fase depender de: la especie de microorganismo, la preparacin del inoculo, la composicin qumica del medio
de cultivo y las condiciones ambientales de incubacin.
Durante la fase de adaptacin no hay divisin celular, la clula est sintetizando nuevos componentes, durante la fase exponencial los
microorganismos que se dividen por fisin binaria lo hacen a intervalos regulares, finalmente el crecimiento de la poblacin disminuye y la curva se vuelve horizontal debido al agotamiento de
nutrimentos o la acumulacin de productos residuales txicos hasta que la poblacin disminuye.
En general las bacterias crecen con mayor rapidez que los
microorganismos eucariticos y los eucariticos pequeos se desarrolla ms rpidamente que los grandes.
El metabolismo energtico tambin influye sobre la velocidad de crecimiento, debido a la ganancia energtica que se obtiene de cada va
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catablica de obtencin de energa. As, los microorganismos fermentadores crecern mas lentamente que
los respiradores.
Materiales
1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio
lquido (Anexo 2.18)
2 Matraces Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de solucin
salina isotnica estril
6 Pipetas de 10 mL estriles
16 Pipetas de 1 mL estriles
1 Potencimetro
1 Mechero Fisher
1 Espectrofotmetro y celdas
1 Gradilla
16 Tubos con 9 mi de solucin salina isotnica estril
1 Varilla doblada en "L"
12 Cajas de Petri con Agar Nutritivo (Anexo 2.2)
Procedimiento
El profesor inocular Escherichia co/fen un matraz Erlenmeyer con medio lquido complejo 12 horas antes de
iniciar la prctica, que se utilizar como inoculo para los cultivos en matraces Erlenmeyer con diferente concentracin de glucosa.
Los estudiantes cuantificarn el crecimiento peridicamente durante 6 horas de incubacin. Se aplicarn los mtodos turbidimtrico y el de diluciones y siembra en placa (prctica* 7) para cuantificar el crecimiento bacteriano.
Inocular en condiciones estriles un matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo complejo
con 10 mL de un cultivo de Escherichia coli
2.
Homogeneizar cuidadosamente agitando el matraz e inmediatamente tomar una muestra de 5 mL con una
pipeta estril y vaciarla en una celda del espectrofotmetro. Esta muestra corresponder al tiempo cero
(t=0). De la misma manera se tomarn muestras a las 0.5, 1, 2, 3 y 4 horas. Para el tiempo de 6 horas de
incubacin se tomarn 6 mL
3.
Determinar la turbidez de las muestras en un espectrofotmetro a 560 nm. Leer el valor de la densidad
ptica (Figura 9).
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2.
En la muestra de 6 horas adems de evaluar la turbidez, se deber poner 1 mL del cultivo en un matraz
Erlenmeyer con 99 mL de solucin salina isotnica (ssi) estril. Del matraz con la muestra diluida, hacer una
serie de diluciones en tubos con 9 mL de ssi estril, hasta 108. Cuidando de homogeneizar las muestras
cada vez que se haga una nueva dilucin.
3.
Enseguida inocular 0.1 mL de las ltimas tres diluciones en dos cajas de Petri con agar nutritivo y distribuir
la muestra con una varilla de vidrio doblada en "L".
4.
Dejar que se absorba el lquido en las cajas y posteriormente incubarlas en forma invertida durante 24-48
horas.
5.
t(0
a
o
o
10 mL
055
(5)
(6)
Figura 9. Tratamiento de muestras para medicin del crecimiento microbiano y elaboracin de una curva de crecimiento.
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Resultados
A.
Se registran los resultados de cuantificacin del crecimiento de Escherichla co/ien el Cuadro 14.
B.
El alumno reportar tambin en forma grfica la relacin entre dos variables, la variable independiente
siempre ser el tiempo que se colocar en el eje X, para cada concentracin de glucosa
a. Una grfica de D.O. contra el tiempo
b. En la grfica a) identificar las fases de crecimiento y duracin
c. Determinar la tasa de crecimiento promedio (k) de la frmula k=( log N- log No)/ log 2 (t), donde No=# de
UFC al tiempo "0" y N = # de UFC al final del experimento
d. Calcular la tasa de crecimiento especifica ( JU ) de la frmula fi = In2 (k) con este valor determinar el tiempo
de generacin de Escherichia co/ con la relacin td= In2/fi
Cuadro 14
Resultados de mediciones del crecimiento de Escherichia coll en un
cultivo por lote con diferentes concentraciones de glucosa
Tiempo de muestreo (h)
Turbidez (D.O.)
UFC/mL
0.5
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Cuestionario
1.
Cmo se define el crecimiento en Microbiologa y cules son los eventos a nivel celular que ocurren en
cada una de las etapas de crecimiento?
2.
3.
Cmo se define el tiempo de duplicacin? Cmo se relaciona con la tasa de crecimiento especfica
4.
Bibliografa consultada
95
manual de prcticas del
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Referencias bibliogrficas
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a
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Preparacin de soluciones
y colorantes
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1.
Azul de lactofenol
Disolver cuidadosamente 10 g de fenol (cristales)
en 20 ml_ de agua destilada, agregar 20 g de cido lctico y 40 g de glicerol. Posteriormente disolver 0.05 g de azul de metilo.
2.
Verde de malaquita
Disolver 5.0 g del colorante verde de malaquita
en 100 mL de agua destilada.
5.
Solucin de lugol
En un matraz aforado de 50 mL, disolver 0.333 de
yoduro de potasio en 20 mL de agua destilada y
enseguida agregar lentamente 0.166 g de yodo,
mezclar completamente y aforar con agua destilada.
6.
7.
Alcohol al 70%
8.
Safranina
En un matraz aforado de 50 mL colocar 5 mL de
alcohol etilico y disolver 0.125 g de safranina. Aforar con agua destilada
9.
Solucin de Fenol al 2%
En un matraz aforado de 100 mL colocar 2.0 g de
fenol cristales y disolver con un poco de agua poco
a poco, despus aforar con agua destilada.
3.
4.
Cristal violeta
Este colorante se prepara en dos partes,
a. Solucin a: en un vaso de precipitados de 50
mL colocar 10 mL de alcohol etlico y disolver
1 g de cristal violeta. Solucin b: en otro vaso
se disuelven 0.4 g de oxalato de amonio en
40 mL de agua destilada.
b. Mezclar cuidadosamente las soluciones a)
y b)
c. Guardar la mezcla en un frasco mbar en
obscuridad durante 24 hrs. Filtrar en papel
Whatman No. 1 antes de utilizarlo.
PH
2.8
3.6
4.4
5.2
6.0
6.8
7.6
8.4
9.2
10
K2HPO4
0.2 M (mL)
0.3
0.6
0.9
1.1
1.3
1.5
1.9
-
cido Ctrico
0.1 M (mL)
cido Brico
0.2 M (mL)
1.7
1.4
1.1
0.9
0.7
0.5
0.1
-
1.7
1.3
1.0
NaOH
0.2 M (mL)
0.3
0.7
1.0
Caldo Nutritivo
(mL)
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
8.0
103
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104
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1.
Caldo nutritivo (CN). Es un medio lquido complejo de uso general para el cultivo de bacterias
ingredientes
Peptona de casena
NaCI
Extracto de carne
PH
<g/L)
5.0
8.0
3.0
6.5-7.0
a.
b.
c.
d.
2.
Agar nutritivo (AN). Es un medio slido complejo de uso general para el cultivo de bacterias exigentes
ingredientes
Peptona de casena
NaCI
Extracto de carne
Agar
PH
a.
b.
c.
d.
e.
(g/t)
5.0
8.0
3.0
15.0
6.5-7.0
3.Medio Mnimo de Sales (MM). Es un medio qumicamente definido de uso general para el cultivo de bacterias
poco exigentes.
ingredientes (g/L)
Glucosa"
(NH4)2SO4
MgSO47H2O
K2HPO4
FeSO4-7H2O
DH
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
Medio 1.
10.0
5.0
2.0
2.0
0.1
6.5-7.0
107
manual de prcticas del \ - ".": \ ? Va\O :*T:
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4.
Agar de Eosina azul de metileno (EMB-agar). Es un medio de cultivo comercial utilizado para identificacin y diferenciacin de enterobacterias.
Ingredientes
Peptona de gelatina
Lactosa
Sacarosa
K2HPO4
Eosina
Azul de metileno
Agar
<g/L)
10.0
5.0
5.0
2.0
0.4
0.065
13.5
(0
ca
a.
b.
c.
d.
5.
Agar para Estafilococos No. 110. Es un medio selectivo comercial para el aislamiento e identificacin de
estafilococos.
ingredientes
Extracto de levadura
Peptona de casena
Gelatina
Lactosa
D-Manitol
NaCI
K2HPO4
Agar
pH final
a.
b.
c.
d.
6.
PH
a.
b.
c.
d.
e.
(g/L)
2.5
10.0
30.0
2.0
10.0
75.0
5.0
15.0
7.0
(g/L)
20.0
4.0
15.0
5.6
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7.
Papa Dextrosa Agar rosa de bengala Es un medio slido complejo de uso general para el aislamiento de
hongos
Ingredientes
Glucosa
Extracto de papa
Rosa de bengala
Agar
pH
(g/L)
20.0
4.0
0.03
15.0
5.6
a.
b.
c.
d.
e.
8.
Czapek-Dox Agar (CDA) Es un medio de sales, de uso general para el cultivo de hongos poco exigentes.
Ingredientes
Sacarosa
NaNO3
KH2PO4
MaSO4-7H2O
KCI
FeSO4-7H2O
Agar
PH
9.
Caldo rojo de fenol Es un medio con diferentes azucares (glucosa, sacarosa, manitol) para pruebas de
fermentacin
Ingredientes
(g/L)
Azcar
20.0
a.
b.
c.
d.
e.
30.0
2.0
1.0
0.5
0.5
0.01
15.0
5.6
Extracto de levadura
Rojo de fenol
pH final
<g/u
a.
b.
c.
d.
KH 2 PO 4
K 2 HPO 4
(0
9.1
9.5
0.1
0.01
6.8-7
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10.
Ingredientes
Citrato de Sodio
K2HPO4
NH4H2PO4
MgSCy7H 2 O
NaCI
FeSCy 7H2O
Agar
Azul de bromotimol
PH
(0
CQ
0
Medio citrato de Simmons Agar. Medio complejo de prueba de utilizacin de citrato en enterobacterias
a.
b.
c.
d.
e.
f.
(g/U
2.0
1.0
1.0
0.2
5.0
0.01
15.0
0.08
7.0
11. Caldo urea. Se emplea para la identificacin de bacterias, particularmente para diferenciar los miembros del
gnero Proteus de Salmonella yShlgella
Ingredientes
Urea
KH2PO4
K2HPO4
Extracto de levadura
Rojo de fenol
pH final
a.
b.
c.
<g/U
20.0
9.1
9.5
0.1
0.01
6.8
12. Medio SIM. Medio semisiido usado rutinariamente en la diferenciacin e identificacin de cultivos de
Enterobacterias y que detecta la produccin de sulfuras, indol y movilidad de las mismas.
Ingredientes
Peptona de casena
Peptona de carne
Sulfato de hierro y amonio
Tiosulfato de sodio
Agar
pH final
a.
b.
c.
(g/L)
20.0
6.1
0.2
0.2
3.5
7.3
110
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ingredientes
(g/U
Almidn
Peptona de casena
NaCI
Extracto de carne
Agar
pH
10.0
5.0
8.0
3.0
15.0
6.5-7.0
ti
a.
b.
c.
d.
(8
a
o
T3
14. Medio de leche con tornasol. Medio comercial para diferenciar microorganismos sobre la base de sus
mltiples reacciones metablicas en un medio lcteo
ingredientes
(g/L)
Leche descremada deshidratada 100
Polvo de tornasol
0.75
a.
b.
c.
15. Agar de hierro y triple azcar TSI. Medio comercial para identificar y diferenciar enterobacterias. Se basa
en la formacin de sulfuros y fermentacin de glucosa, sacarosa y lactosa.
ingredientes
Mezcla de peptonas
NaCI
Lactosa
Sacarosa
Dextrosa
Sulfato de amonio frrico
Tiosulfato de sodio
Rojo fenol
Agar
pH final
a.
b.
c.
d.
e.
(g/L)
20.0
5.0
10.0
10.0
1.0
0.2
0.2
0.025
13.0
7.3
(g/U
5.0
3.0
120.0
6.8
a.
b.
c.
17.
Medio de agar nutritivo blando.- Es un medio semisiido complejo de uso general para determinar movilidad de bacterias
Ingredientes
Peptona de casena
NaCI
Extracto de carne
Agar
PH
a.
b.
c.
d.
e.
(0/L)
5.0
8.0
3.0
3.5
6.5-7.0
18. Medio de cultivo complejo. Para la curva de crecimiento microbiano probando diferentes concentraciones
de sustrato carbonado. (1-20 g/L)
Ingredientes
Glucosa
Peptona de casena
Extracto de levadura
K2HPO4
PH
a.
b.
c.
d.
(g/L)
10.0
2.0
0.5
0.5
6.5
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19.
Caldo microinoculacin. Medio comercial para cultivar y preparar inculos de Lactobacilos y otros
microorganismos utilizados en ensayos microbiolgicos.
ingredientes
Extracto de levadura
Mezcla de peptonas
Dextrosa
KH2PO4
Polisorbato 80
PH
a.
b.
c.
<g/U
20.0
5.0
10.0
2.0
0.1
6.5
w
o
113
manual de prcticas del
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CITRATO DE SIMMONS
USINA DESCARBOXILASA
a: negativo, b: y c: positiva
TRIPLE A Z C A R H I E R R O
a: negativo, b: cido/cido
c: cido/alcalino con gas
LECHE TORNASOLADA
a: negativo, b:, c: y d: positiva
AISLAMIENTO DE Rhodotorula
sp.
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N.E. 0534
$17.00
101412
9 789703
Manual de prac.
lab de
microbiologa general,
publicaciones CBS
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