Universidad: Ciencia y Tecnologla

OPTIMIZACION DEL PROCESO DE FERMENTACION PARA PRODUCIR

Bacillus thuringiensis Var. Aisawai

Vol. 2. N o . 3. Diciembre de 1992

Carolina Abarca Camacho'

Alfredo Martinez JirntnezZ
Mario A. Cam Bermiidez2
Rodolfo Quintero Ramfrez2

Un bioinsecticida es considerado como el product0 bacteriano o actividad bacteriana que da como resultado la
muerte de un insecto. Una de las formulaciones comerciales mds usadas actualmente esta basada en la bacteria B.
thuringiensis. Esta bacteria sintetiza durante su fase de esporulaci6n una proteina (delta-endotoxina), que muestra
una actividad insecticida unica. A1 ser ingerido la delta-endotoxina por larvas susceptibles, afecta el intestino de 10s
insectos causandoles la muerte. Existen endotoxinas especificas contra lepid6pteros7 dipteros, cole6pteros y
recientemente nuevas proteinas han sido aisladas contra nemdtodos y protozoarios.
En el presente trabajo se describe la optimizaci6n del medio de cultivo y las condiciones de fermentaci6n para
la producci6n de un bioinsecticida a partir de Bacillus thuringiensis var. aisawai .
Usando un diseiio experimental 2 3 ,-se encontr6 que las condiciones 6ptimas para producir delta-endotoxina de
B. thuringienesis Var. Aisawai en un fermentador de 14 L son 10s siguientes: 800 RPM, 1 w m , y control de pH igual
o mayor a 7.0. La concentraci6n final de esporas despuCs de 24 horas de fermentaci6n fu8 5 . 5 ~ 190 esplml. 10%

SUMMARY
A bioinsecticide is defined as the bacterial product or bacterial activity which causes the death of an insect.
One of the most common commercial products is obtained from the bacteria Bacillus thuringiensis. This bacteria
synthesizes during its sporulation stage a protein (delta-endotoxin), which once it has been ingested by susceptible
larvae it affects the midgut cells causing eventually death. There are specific endotoxins against lepidopters, dipters,
coleopters and recently new proteins have been isolated against nematodes and protozoa.

The main objetive ofthis work was the optimization of the growth medium and the fermentation conditions in
order to obtain a bioinsecticide based on Bacillus thuringiensis var. aisawai.
Using an experimentel design ;2 it was found that the optimal conditions for the delta-endotoxin production
of BaciNus thuringiensis Var. Aisawai in a 14 L. fermentor were the following: 800 RPM, 1 WM, and pH control
at o r higher of 7.0. The final concentration of spores after 24 hours was 5 . 5 ~ 190 sporelml. h 10%

'

Centro.de Investigaci6n en Biotecnologia.

Departamento de bioingenieria.

Abarca, C.C., Martlnez.1.A. Caro, Caro B.M.. Quintero. R.R

Optlmizacihn del proceso de krrnentacihn para producir Bacillus t.

INTRODUCCION
El control de las
de insectos que afectan a
10s cuitivos agrfcolas es uno de 10s problemas en 10s
cuales se invierte mayor cantidad de recursos. Recientemente se ha dado un gran impulso a1 uso de microorganismos en el control de plagas, debido a que el uso
indiscriminado de 10spesticidas quimicos, haconducido
a lacontaminaci6n de 10s productos agricolas y el campo.
El control biol6gico de las plagas puede definirse como
el uso de organismos naturales: virus, bacterias,hongos,
protozoanos y nemhtodos, para el exterminio de plagas.
Existen aproximadamente 1500 microorganismos o metabolitos microbianos que poseen propiedades insecticidas. El potencial del uso de estos organismos se debe a su
alta especificidad, es decir que afectan s610 a 10s insectos
y no causan daAo ecol6gico (1).
Bacillus thuringiensis (B.t), habitante de la flora
normal del suelo, es un elemento importante en el control
biol6gico. Es una bacteria gram +, que se caracteriza por
la producci6n de varias proteinas con capacidad insecticida a1 ser ingerido por larvas susceptibles especificamente del orden lepid6ptera (2). Actualmente, existen
varios productos comerciales a base de B.t. cuyo ingrediente activo insecticida es una proteina llamada deltaendotoxina contenida en una inclusi6n cristalina o cristal
protkico, liberado durante la esporulaci6n (3). Las deltaendotoxinas actGan sobre las microvellosidades del epitelio intestinal de larvas susceptibles, causando lamuerte
del insect0 (4).
Dentro del control microbiano de insectos, el B.
thuringiensis se considera como una buena alternativa
debido a que ofiece las siguientes ventajas: (5)
1.-Inocuidad a1 hombre, animales dom8sticos, flora
y fauna silvestre.
2.-Ataque especifico a1 estado larvario de lepid6pteros, cole6pteros y algunos dipteros perjudiciales.
3.-Para incrementar su actividad bi6cida, puede mezclarse con productos quimicos: feromonas, adhesivos, etc.
4.-Vida de anaquel y prolongada en forma de producto seco y concentrado.
5.-Cada vez se abaten mhs 10s costos de producci6n
debido a 10s avances tecnol6gicos, microbiol6gicos y genkticos, lo que lo hace competitivo frente
a 10s insecticidas quimicos.
La fennentaci6n de B. thuringiensis se lleva a cab0
normalmente a una temperatura entre 27C y 33"C,
siendo la temperatura 6ptima de 30C; a 45" C o mhs, se
produce una disminuci6n en la producci6n de cristales, y

por ende en una baja actividad insecticida. Por abajo de

10s 20" C se observa una clam disminuci6n en la velocidad de crecimiento de la bacteria Sherer reporta un pH
6ptimo de 7.3 para B.t. El pH initial del media es
generalmente de 6.8 a 7.2 (6).
Laproducci6n de bioinsecticida requiere el disefio
de un medio adecuado para el crecimiento, esporulaci6n
y formaci6n de la endotoxina. A este respecto es importante conocer 10s requerimientos nutricionales del microorganism~a producir. La glucosa es la mejor fuente
de carbono, aunque otros compuestos pueden ser utilizados, tales como almid6n, sacarosa, glicerol y melazas
(7).
Ademhs es esencial una adecuada fuente de nitr6geno para el crecimiento. La literatura reporta que el
amonio es la fuente preferida de nitr6geno durante la fase
exponencial de crecimiento. Sin embargo, en la fase de
esporulaci6n el microorganismo muestraunapreferencia
por 10s aminohcjdos (8).
Ahora bien, el oxigeno es requerido para el crecimiento. Algunos autores han mencionado que altas velocidades de aireaci6n son esenciales para la formaci6n de
espora y toxina (9,lO. 11,12).
Para la producci6n del bioinsecticida a partir de B.
thuringiensis existen varios estudios (Razo, 1990). La
concentraci6n de esporas y 10s tiempos de fermentaci6n
a nivel de fermentador, varian de 1 . 0 810
~ 9 a 1 . 210
~ 1d
esp./ml. y de 24 a 50 horas de fermentaci6n, respectivamente. (5)
En nuestro grupo durante 10s tres afios pasados se
ha realizado investigaci6n bhsica de microbiologia y
genktica de una cepa de Bacillus thuringiensis productora de una toxina que actua contra las larvas del gusano
cogollero del maiz (Spodoptera frugiperda), el cual
ocasionacuantiosas pkrdidas econ6micas en la agricultura mexicana. El conocimiento generado hasta la fecha
pennite plantear el desarrollo de un proyecto de optimizaci6n de condiciones de producci6n del bioinsecticidaa
nivel de plantapiloto, cuyo objetivo principal es establecer las condiciones de cultivo, reglas de escalamiento,
desarrollo de las etapas primarias de purificaci6n y
dosificaci6n del bioinsecticida.

Optimizaci6n del medio de cultivo y determinaci6n de las condiciones 6ptimas de fermentaci6n.

Universidad: Ciencia y Tecnologia

ORGANISM0 Y MEDIO DE CULTIVO: celulas de Bacillus thuringiensis var. Aisawai. Para lapreservaci6n de la cepa, esta se siembra por estria aproximadamente cada 2 meses en medio LB, a 29 'C por 48 horas.
Se inocula con una asada, un matraz erlenmeyer de 500
ml con 100 ml de medio a29 "C y 200 rpm por 12 horas,
usandose el 10% de in6culo en 10s pasos siguientes.
A) FERMENTACIONES A NIVEL MATRAZ
DE 500 mL. Se llevaron a cab0 fermentaciones bajo las
siguientes condiciones de cultivo: temperatura a 29 "C,
agitaci6n 200 RPM, y pH de 7.2-7.3 con un vol6men de
operaci6n de 100 mL. Se hicieron cineticas de crecimiento, tomando muestras a diferentes intervalos de tiempo y
se midieron 10s siguientes parhmetros: Densidad 6ptica
( 590 nm), pH, muestras a1 microsc6pio tefiidas con
cristal violeta para la observaci6n de cklulas vegetativas,
esporas y cristal.
B) FERMENTACIONES A NIVEL DE FERMENTADOR DE 2 L. Las fermentaciones se llevaron a
cab0 en un fermentador de 2 L, marca New Brunswick
Scientific (NBS) modelo Multigen. Las condiciones de
cultivo heron las siguientes: temperatura de 29 C, agitaci6n 800 RPM, con 2 impulsores Rushton, aireaci6n de
1 VVM, control de pH entre 7.0 y 7.5 durante todo el
crecimiento con KOH y H3PO4. Se hicieron cinCticas del
crecimiento, tomando muestras a diferentes tiempos y
midiendo 10s siguientes parhmetros: Densidad 6ptica
(590 nm), pH, Oxigeno disuelto, mL residuales de KOH
y H3P04 1 N, y observaci6n a1 microsc6pio de muestras
tefiidas con cristal violeta para ver la formaci6n del
cristal, conteo de esporas y cblulas vegetativas con la
camara de Neubauer.
C) FERMENTACIONES A NIVEL FERMENTADOR DE 14 L. Para este nivel se desarrollaron 10s
experimentos en un fermentador marca NBS, modelo
MF14 con 3 impulsores de 6 paletas Tipo Rushton (Fig.
A). Las condiciones de cultivo heron las siguientes:
Temperatura 29 " C, agitaci6n 400 y 600 RPM, aireaci6n
0.8 y 1.2 VVM y pH controlado a 7.0 y sin control. Se
llevaron a cab0 cineticas de crecimiento tomando muestras cada dos horas y se midieron 10s siguientes parhmetros: Densidad 6ptica, pH, Oxigeno disuelto y conteo de
cClulas vegetativas, esporas y bacilos con la chmara de
Neubauer.

Vol. 2. No. 3, Diciembre de 1992

-Para realizar la optimizaci6n del medio de cultivo

y condiciones de operaci6n, se plante6 una serie de
experimentos por medio de un disefio experimental (23)
por el metodo de B. Wilson (13), donde se variaron 3
componentes del mismo. Se tom6 como base el medio de
cultivo reportado en la tabla 1, el cual se obtuvo en base
a una revisi6n bibliogrhfica (6, 14, 15, 16) y a las
concentraciones de sales que se requieren para la propagaci6n de la cepa a nivel laboratorio.
Como primer disefio experimental se decidi6 probar niveles bajos y altos de 10s siguientes nutrientes: *
PurC de tomate 10 y 20 g/L, glucosa 25 y 30 g/L y harina
de soya 10 y 20 g/L.
LaRespuesta (Velocidad de Crecimiento) se tom6
como D.O. a 590 nm considerando solamente la fase
exponencial(l2 horas).
Se hizo un segundo disefio experimental 23 en
donde se probaron 3 parhmetros: agitaci6n (400 y 600
RPM), aireaci6n (0.8 y 1.2 VVM) y pH (con control y sin
control).
MEDIO DE CULTIVO BASE.
dl.
Componente
KH2P04
6.8
MgS04.7H2 0
0.12
ZnS04. 7H20
0.014
MnS04.H20
0.0016
FeS04.7H20
0.028
CaC12.4H20
0.1 1
Bacto-triptona
7.0
Glucosa
3.0
Ajustar el pH, con KOH 3 N, a 7.2. Los medios se
esterilizan a 121C durante 15 minutos.

RESULTADOS Y DISCUSION.
Para el medio de cultivo base reportado en materiales y mCtodos, el tiempo de crecimiento y producci6n
del cristal era hasta de 56 horas y el rendimiento bajo
durante 1as 48 horas de crecimiento ( 5 x 1 0 ~espJm1);
biomasa de 1.4 g/L.(peso seco). Ademh la glucosa no
se consume totalmente durante las 56 horas de crecimiento, por lo que se piensa que hay una asincronia en el
proceso de esporulaci6n, alarghndose.

La optimizaci6n del medio de cultivo y condiciones de operaci6n, se plante6 como se describe en la

- Para ambas fermentaciones se cuantifica el h- secci6n de materiales y mCtodos.
car residual por el mCtodo del hcido 1,2,3 dinitrosaliciliSe probaron niveles altos y bajos de 10ssiguientes
co (DNS), Summer et. a1 1935.
nutrientes: Pure de tomate, glucosa y harina de soya. Se

Abarca. C.C., Martinez.

I.A. Caro. Caro B.M.. Quintero. R.R Optlmizacidndel proceso de fermentaci6n para producir Bacillus t.

decidi6 dtilizar el pur6 de tomate como sustituto del licor

de maiz, harina de pescado, o extract0 de levadura (son
10s que reporta labibliografiacomo fuente de nitr6geno),
debido a que estos ultimos son dificiles de conseguir yl
o costosos. El pur6 de tomate se consigue fbcil y es de
bajo costo. En cuanto a1 uso de la harina de soya, se
encontr6 en reportes de la Universidad de Nuevo Lebn,
que utilizando cepas similares, han encontrado producciones elevadas de bioinsecticidas.
El medio 6ptimo de producci6n para Bacillus
thuringiensis, f u C el siguiente:
MEDIO BE CULTNO OPTIMO
Componente
Glucosa
Harina de soya
Pure de tomate

gll.
5.0
6.0
40
KH2P04
2.5
CaC03
1
MgS04-7H20
0.00011
MnS04-H20
0.04
FeS04-7H20
0.028
CaC12-4H20
0.030
Ajustar el pH, con NaOH 1 N. a 7.0. Los medios
se esterilizan a 121C durante 15 minutos.
En la figura 1 se muestra el proceso general de la
producci6n de 1.a delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis, seguido en esta investigaci6n.

D = 21.5

Acot., an cm

Caracteristicas geometricas del fermentador de 14 L

Proceso general de la Gendotoxina de B a d u s

thuringiensis.
Inocular con varias asadas proveniente de cultivo
en caja, un matraz fernbach con un litro de medio,
incubar a 29 "C y 200 rpm por 12 horas.

Se obtuvieron 10s siguientes resultados, Tabla 1,

donde se vari6 la agitaci6n7aireaci6n y el control del pH.
El analisis de 10s resultados nos permite llegar a las
siguientes conclusiones, Tabla 2.

Analisis

a) Cuando se analizan 10s efectos promedio, se

observa que hay mas significancia sobre la agitaci611, lo
cual nos indica que hay que subir m b 10s RPM. Cuando
se analiza la aireacibn se ve que hay mas significancia
sobre este que en el pH que es el que menor significancia
tiene, segun el efecto promedio.

Bibxido de carbon0 gaseosos.

b) La interaccibn de 2 factores nos dice que hay

mayor significancia entre la agitaci6n y la aireaci6n. La
agitaci6n y el control de pH tienen poco efecto sobre el
estudio, asi mismo que la aereaci6n y el control de pH.
c) Finalmente; cuando se estudia la interacci6n de
3 factores , se alcanza a notar que la combinaci6n de 10s
3 padmetros no tienen muchasignificancia entre si sobre
el estudio realizado.

CinCticas de crecimiento.
pH, Oxigeno disuelto, Oxigeno y
Densidad 6ptica a 590 nrn.
Cantidad de Azlicar.
Cantidad de esporas y cklulas vegetativas.
Titulo del cristal observando muestras a1 microsc6pio teiiidas con cristal violeta.
Transferir el in6culo a la jarra de 14 L. con 1 L. de
in6culo mas 9 L. de medio, a 29 C, 1 vvrn, 800 rpm y
controlando el pH arriba de 7.0 durante 24 horas.
Centrifugar el caldo fermentado en una centrifuga
de rotor s6lid0, utilizando un flujo de 36 Llh.
Secar la suspensi6n en un secador por aspersibn.

Vol. 2. No. 3. Diciembre de 1992

Universidad: Ciencia y Tecnologla

Tabla 3

Tabla 1
----~

Exp.
1
2
3
4
5

6
7
8

---~

Agitaci6n
400
400
400
400
600
600
600
600

Aireac. pH CIS cont.

1.2
C/C
0.8
SIC
0.8
CIC
1.2
SIC
0.8
SIC
1.2
SIC
0.8
C/C
1.2
C/C

*Respuesta: esporaslrnl a las 24 hrs. de fermentaci6n.

En esta tabla se puede ver que se tienen mejoresresultados cuando
se trabaja a 600 rpm.

Exper. RPM pH

700

Esporas (Esp.11~1)

Veloc. de Crec.
P (h-l).

a las 24 Hr. de

0.17

fermentaci6n.
4.6x109

Se observa que cuando se trabaja a pH 7 se obtienen velocidades de crecimiento mayores que a pH 8.

Tambien se nota que a 800 RPM, 1 VVM y pH 7, se
tienen concentraciones mayores de esporas alas 24 horas
de fermentaci6n (6x10') respecto a la agitaci6n de 700
RPM (Figura 2).

Tabla 2
ANALISIS DE RESULTADOS
Efectos
promedio

Interacci6n de
2 factores.

Interacci6n de
3 factores.

El = Velocidad de agitaci6n.
E;?= Velocidad de aireacidn.
E3= pH contrl sin control.
Efectos promedio: Efecto que se tiene sobre la variable
de lo que se este midiendo.
Interacci6n de Es la combinacidn que existe
2 factores:
entre dos variables.
Interacci6n de Es la combinacidn entre las
3 factores:
variables.

Se llevaron a cab0 fermentaciones a 700 y 800

RPM seg6n 10s resultados del disefio experimental. Se
tom6 1 W M como punto intermedio entre 0.8 y 1.2
VVM. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Con base en estos resultados, se decidi6 ajustar las
condiciones de agitaci6n y de pH inicial, Tabla 3.

Figura. 2. Crecimiento de Bacillus thuringiensis en

fermentador de 1 4 L. a 800 RPM, 1 V V M y pH
7.0.,con una concentraci6n de 6 x 1 0 9 ESPImL.
En la figura 2 se puede ver el comportamiento de
10s diversos padmetros cinkticos para la producci6n de
Bacillus thuringiensis. En la cual se ve que la Densidad
6ptica tiene una fase exponencial de aproximadamente 8
horas, la glucosa se consume en 10 horas, el comportamiento del pH se mantiene en 7 durante 5 horas aproximadamente y posteriormente tiende a subir, con respecto
a1 Oxigeno disuelto, se observa que la saturaci6n no llega
a ser menor del70%. En cuanto a 10s bacilos y esporas,
se ve que el comportamiento en el primer0 es aumentar
y posteriormente disminuir su concentraci611, y en las
esporas suben gradualmente. Este comportamiento es
similar para las fermentaciones que se llevaron a cab0 en
este trabajo.

Abarca, C.C., Martinez. ].A. Caro, Caro B.M.. Quintero, R.R

Optimizaci6n del proceso de fermentaci6n para producir Bacillus t.

El analisis de resultados de estos experimentos

indica lo siguiente (tabla 4):
a) Seg6n el efecto promedio; se observa que es
importante usar una agitaci6n alta para la producci6n de
B. thuringiensis. Tambibn se nota que el control de pH a
7 favorece la producci6n de espora.
b) Cuando se analiza la interacci6n de 2 factores;
se ve que la interacci6n entre el pH yla velocidad de
agitaci6n no es significativa.
De acuerdo con lo que el diseiio experimental nos
muestra como condiciones bptimas, se repitieron 10
fennentaciones las cuales nos dan una producci6n de
esporas 5.5 x 109 esplml. *lo% y una biomasa de 24 g/
L (peso seco).
Estos resultados se resumen en la tabla 4.

Tabla 4
Efectos Promedio
E l = 0 . 7 5 ~ 190

Interacci6n de 2 factores

5.-Razo, F.E. (1990). Escalamiento de un proceso por lote de nivel de

laboratorio aplanta piloto para laproducci6n deBacillus thuringiensis. Tesis de Maestrh. Instituto de Investigaciones Bibmedicas.
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Los resultados del aniilisis del diseiio experimental, demostraron que las condiciones 6ptimas para la
producci6n de B. thuringiensis a nivel fermentador de 14
L son: 800 rpm de velocidad de agitacidn, 1 VVM de
aireaci6n y control de pH igual o mayor a 7, con un
aumento en la producci6n de e s p o d m l de 5x105 a
5 . 5 ~ 1 0 ~lo%, biomasa de 1.4 a 24 g/L (peso seco), en
tiempos de fermentaci6n de 48 y 24 horas de ferrnentaci6n respectivamente. Lo cual en algunos casos rebasa a
lo reportado en la literatura y en menor tiempo de
fermentaci6n.

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