Universidad de Santiago de Chile

Facultad de Qumica y Biologa

Licenciatura en Qumica
Laboratorio de Microbiologa

Informe de laboratorio
N6:
Cuantificacin de UFC de
B.Subtilis en un producto
comercial

Asignatura: Laboratorio de Microbiologa.

Integrantes: Michel Canales.
Sidney Moreno.
Docente responsable: Miguel Castro.
Ayudante: Ruth Escobar.
Fecha de realizacin: Martes 27 de Mayo 2014.
Fecha de entrega: martes 17 de Junio 2014.
INTRODUCCIN

La bacteria Basillus Subtilis es una bacteria Gram positiva, aerbica, que se encuentra
comnmente en el suelo, aire y agua. Es capaz de generar una resistente endoespora
protectora, permitiendo as soportar condiciones ambientales extremas.
Ha sido usada para el control de enfermedades de animales, como la salmonelosis, la
cual constituye una enfermedad zoontica, que pueden ser transmitida al hombre. Esta
caracterstica est relacionada a su capacidad para desplazar y competir por el sustrato
que las bacterias patgenas necesitan para crecer y adems el poder de secretar
sustancias con caractersticas antibiticas.
Tambin acta como fungicida evidenciando un control biolgico de hongos y bacterias.
Este control biolgico es
ms ecolgicamente limpio, no deja residuos, es
biodegradable y no generan resistencia como los antibiticos.
Debido a sus diversas caractersticas es usada para el tratamiento biolgico de las camas de los
pollos broiler y pavos. Con el fin de calentar la cama para los pollos recin nacidos y durante su
crecimiento, adems sanitacin bacteriana y al mismo tiempo tratar las heces para
transformarlas en un excelente fertilizante el cual puede ser comercializado posteriormente
como abono para cultivos agrcolas.
Hay diferentes productos comerciales en el mercado, que ofrecen este tipo solucin a empresas
del rubro avcola. Nosotros elegimos el producto BIO-OXY-GEN-ATOR Potenciado, el cual
distribuido en Chile por BTS-INTRADE Laboratorios S.A. El cual se describe como una eficaz
mezcla de bacterias aerbicas y facultativas que sirven para: Acelerar el proceso de

generacin de temperatura ptima para el crecimiento de estas aves. Para la degradacin

de materia orgnica y la reduccin de olores amoniacales y sulfurosos. Disminuir la
carga microbiana que puede existir en ellas. Tambin realizar un adecuado reciclaje de
estas camas, disminuyendo costos y los residuos entre cada produccin.
Todo esto contribuye al cumplimiento de las normativas ambientales vigentes.
Este producto es importado desde Sudfrica y carece de especificaciones tcnicas por parte del
proveedor, tanto de las UFC, como del porcentaje de viabilidad. Debido a esto, existe la
necesidad de validar un protocolo, para aplicar un control de calidad, al recibir las nuevas
partidas, el cual garantice al cliente la cantidad de UFC por gramo de producto y si es posible el
porcentaje de viabilidad de ste. De la mezcla de bacterias que ofrece el producto la ms
importante y que est en mayor proporcin es la Basillus Subtilis, por lo que centraremos el

control de anlisis de tipo selectivo para esta bacteria, usando un protocolo validado por
la FDA.
OBJETIVOS
Objetivo general:

Llevar a cabo la cuantificacin de UFC de B. Subtilis en un producto comercial.

Objetivos especficos:

Ensayar un mtodo de cuantificacin de B. Subtilis, para luego certificarlo e

implementarlo en Lab. de plaguicidas.
Comparar el comportamiento de la bacteria B. Subtilis frente a 2 medios de cultivos
diferentes.
Adquirir destreza en el manejo de los materiales, equipos y reactivos implicados en los
procesos de preparacin de medios de cultivo, siembra y tincin Gram.
Manejar conceptos bsicos de Control de Calidad.

METODOLOGIA

Preparacin del medio de cultivo segn protocolo validado por la FDA

1. En una balanza granataria se pes los componentes del medio, en las siguientes cantidades:
Almidn soluble = 25g.
Peptona (Diffico) = 7,5g.
KH2PO4 = 2,5g.
MgSO4 x 7H2O = 1,25g.
Agar = 7,5g.
2. Los componentes del medio de cultivo se depositaron en una botella con tapa rosca.
3. Se afor con agua destilada un matraz de 500mL y se deposit este volumen en la botella
con los componentes del medio, agitando vigorosamente para su completa homogenizacin.
4. Se solt un poco la tapa rosca de la botella que contena la solucin y se esteriliz en una
olla a presin (autoclave) durante 30 minutos.
5. Una vez que la presin baj y se enfri el sistema, se saca la botella con el medio de cultivo
esterilizado.
6. En las cercanas de un mechero de Bunsen encendido se paque, es decir, se deposita el
medio de cultivo esterilizado sobre las placas de Petri. Luego, se esper la gelatinizacin, se
sec la tapa de placa de Petri con algodn estril y se guard las placas en un refrigerador.
Preparacin de la muestra.
1. En una balanza granataria, se pes 1g del producto comercial, masa que fue aadida a un
vaso precipitado de 250 mL.
2. Se afor un matraz de 100mL con agua destilada, la cual se deposit sobre un vaso pp que
contena el gramo de producto comercial.
3. El vaso pp con la solucin resultante, se coloc sobre un agitador magntico a temperatura
ambiente durante un tiempo de 30 minutos y luego se dej reposar por 10 minutos.
4. Se tom una alcuota de 10 mL del sobrenadante y se trasvasij aun tubo de ensayo.
5. El tubo de ensayo se coloc en un shaker incubador a una temperatura de 60C, durante un
tiempo de 20 minutos.
6. Se diluy la suspensin resultante 107, 108, 109 con agua destilada, para lo cual se llev a
cabo el siguiente procedimiento:
Se coloc en un tubo Eppendorf 900L de agua destilada y 100L de la solucin sobrenadante,
con lo que se obtiene una dilucin de 10 1. Luego, se tom 100L del tubo Eppendorf y se
trasvasija a otro tubo Eppendorf ms 900L de agua destilada, con lo cual se consigue una
dilucin de 102. Este procedimiento se repite de sucesivamente hasta llegar a una soln.de 10 9.
7. Se tom 100L del tubo Eppendorf cuya dilucin era de 107 y se deposit sobre una de las
placas que contena el medio de cultivo aprobado por la FDA. Se hizo lo mismo sobre otra placa
que contena el medio de cultivo LB y se sembr mediante la ayuda de un rastrillo de vidrio.
El mismo procedimiento se aplic para las diluciones 10 8 y 109.
8. Se incubaron las 6 placas a una temperatura de 37C durante un tiempo de 24 horas.
9. Con un plumn permanente se marc un punto sobre cada unidad formadora de colonia.

RESULTADOS DE CULTIVO EN MEDIO VALIDADO POR LA FDA.

a) Dilucin 10-7. Placa con medio de cultivo aprobado por la FDA encubada a 37C por un
periodo de 48 horas, en la cual se efectu una siembra de la solucin acuosa del producto
comercial diluida 10-7.
Se pudo apreciar el crecimiento de 81 UFC de B. Subtilis, cada una de las cuales posee un
color amarillo intenso y 3mm de dimetro aproximadamente.
Se aprecian crculos bien formados y distribucin homognea en la placa. No se observa otro
tipo de estructura, ni coloracin diferente.

b) Dilucin 10-8.Placa con medio de cultivo aprobado por la FDA encubada a 37C por un
periodo de 48 horas, en la cual se efectu una siembra de la solucin acuosa del producto
comercial diluida 10-8.
Se pudo apreciar el crecimiento de 17 UFC de B. Subtilis, cada una de las cuales posee un
color amarillo intenso y 3mm de dimetro aproximadamente.
Se aprecian crculos bien formados y distribucin homognea en la placa. No se observa otro
tipo de estructura, ni coloracin diferente.
.

c) Dilucin 10-9Placa con medio de cultivo aprobado por la FDA encubada a 37C por un
periodo de 48 horas, en la cual se efectu una siembra de la solucin acuosa del producto
comercial diluida 10-9.
Se pudo apreciar el crecimiento de 6 UFC de B. Subtilis, cada una de las cuales posee un color
amarillo intenso y 3mm de dimetro aproximadamente.
Se aprecian crculos bien formados y distribucin aislada en la placa. No se observa otro tipo de
estructura, ni coloracin diferente.

RESULTADOS DE CULTIVO EN MEDIO LB

a) Dilucin 10-7. Placa con medio LB encubada a

37C por un periodo de 48 horas..
Se pudo apreciar una gran masa de colonizacin
en la cual no se determinan UFC.No se pudo hacer
un recuento, slo se pudo observar una gran
mancha amarilla intensa (B. Subtilis) con crculos
blancos plomizo con aros de forma de pelitos
alrededor (hongos).

b) Dilucin 10-8. Placa LB encubada a 37C por un periodo de 48 horas.

Se pudo apreciar el crecimiento de 11UFC de B. Subtilis de aproximadamente 0,5 centmetro de
dimetro y de 4 colonias de hongos color blanquecino.

c) Dilucin 10-9. Placa LB encubada a 37C por un periodo de 48 horas.

Se pudo apreciar el crecimiento de 6 UFC de B. Subtilis de diferente tamao, pero a diferencia
de la dilucin anterior, las colonias de hongos crecieron unas sobre otras, con dimetros que
fluctuaban entre 0,5 a 1,5 cm, teniendo las mismas caractersticas fsicas que las otras 2 solns.

RESULTADO COMPARATIVO ENTRE AMBOS MEDIOS

a) Parte superior de la imagen: cultivos en medio validado por la FDA, en el cual se

observa la selectividad del mtodo para el crecimiento de B. Subtilis.
b) Parte inferior de la imagen: cultivo en medio LB, en el cual se observa el crecimiento
desmesurado de B. Subtilis y hongos.
RESULTADO DE LA TINCION GRAM.

Fotografa de imagen entregada por un microscopio ptico, utilizando objetivo 40x, de

la preparacin de tincin Gram. Se aprecia claramente la forma bacilar de la bacteria y
el color azul-morado que nos seala la presencia de una bacteria Gram positiva.
RESULTADO DE LA OBSERVACIN AL MICROSCOPIO
Se sac con un asa, una pequea muestra de una UFC, la cual se esparci sobre un porta objeto
y se visualiz al microscopio utilizando objetivo 100x.

Se observ aproximadamente un centenar de microrganismos con movimientos

vigorosos y desplazndose lentamente en un mismo sentido, eran de color blanco
traslucido. Por el mtodo selectivo ocupado dilucidamos que efectivamente se trata de
unidades de la bacteria en cuestin.

CLCULO DE UFC.
Para la obtencin de este clculo, se escogi la dilucin de 10 -7, puesto que el resultado obtenido
con esta dilucin fue el mejor (se notaban claramente las UFC de B. Subtilis aisladas y en mayor
nmero).
Para una dilucin de 10-1, se utiliz 100L de la solucin del producto comercial, por lo que el
volumen de esta solucin presente en la dilucin de 10 -7 est dada por:
Dilucin 10-1 100L de la solucin de producto comercial.
Dilucin 10-7 X.
X= 10-4 L de la solucin de producto comercial.
En la dilucin 10-7, se cuantific 81 UFC de B. Subtilis, por lo tanto, en 10-4 L de la solucin
del producto comercial hay 81 UFC de B. Subtilis.
Como 1g del producto comercial se diluy en 100mL (105 L) de agua, el nmero de UFC de B.
Subtilis que se forman a partir de esta masa del producto comercial est dado por:
105 L de la solucin del compuesto comercial X.
10-4 L de la solucin del compuesto comercial 81 UFC de B. Subtilis.
X= 8,1 x 1010 UFC de B. Subtilis.
Por lo tanto, por cada gramo del producto comercial, se forman 8,1 x 1010 UFC de B. Subtilis.

DISCUSIN

La esterilizacin es un procedimiento fundamental al realizar anlisis de microrganismos. Es

por ello que siempre durante esta experiencia se esteriliz constantemente el asa con hilo de
Platino y los dems materiales con la llama del mechero Bunsen que alcanza temperaturas cerca
de los 1600C, lo cual elimina todo tipo de microorganismos. (1)
En el medio de cultivo lquido, los nutrientes estn bastante disponibles, puesto que est todo en
solucin, pero en este tipo de cultivo no se puede obtener colonias de bacterias aisladas. En
cambio, en un medio de cultivo slido la disponibilidad de nutrientes es menor y slo por
difusin, pero si la siembra se lleva a cabo con una tcnica adecuada, como la de dilucin
seriada, se puede tener colonias aisladas. Este tipo de tcnicas sirven para purificar un cultivo,
puesto que cada bacteria forma una colonia y cada una de ellas es una poblacin, vale decir,
cada una de las bacterias que componen la colonia es un clon ( genticamente iguales) y a partir
de las cuales son posibles estudios sobre las propiedades de un microorganismo concreto. (1)
Como se mencion anteriormente, durante esta experiencia, adems del medio de cultivo
validado por la FDA, se utiliz medio de cultivo LB, el cual se utiliza para detectar o proliferar
principalmente bacterias, lo cual NO significa que algunas especies de hongos puedan proliferar
en este medio (2). Por esta razn, es que se observ adems de B. Subtilis, el crecimiento de
hongos en las placas con medio de cultivo LB. A diferencia del LB, el medio de cultivo
aprobado por la FDA demostr ser plenamente selectivo, puesto que slo creci B. Subtilis.
La tincin Gram es un proceso rpido que sirve para observar la presencia de bacterias en
muestras de tejidos y para diferenciar a las bacterias Gram positivas de las Gram negativas. Esta
tincin se basa en las propiedades qumicas y fsicas de la pared celular de las bacterias. (3)
El cristal violeta (CV) se disocia, en una solucin acuosa, en iones de cristal violeta (CV +) y
Cloro (Cl-). Estos iones penetran la pared y la membrana celular de las Gram positivas y las
Gram negativas. Los iones del cristal violeta interactan con los componentes de la pared que
estn cargados negativamente para teir la clula de morado. (3)
El yodo, en la forma de in negativo, interacta con los iones de cristal violeta cargados
positivamente (CV+) para formar complejos grandes de cristal violeta y yodo (complejo CV-I)
dentro de las capas internas y externas de la clula. El yodo acta como un agente que bloquea
la salida del color del cristal violeta de la clula. (3)
El decolorante, como alcohol o acetona, interacta con los lpidos de la membrana bacteriana.
Debido a esta propiedad, las bacterias Gram negativas pierden su membrana externa, por lo
tanto, el complejo de cristal violeta y yodo (CV-I) sale de la clula. Por otro lado, las bacterias
Gram positivas se deshidratan por efecto del decolorante y su pared, con mltiples capas de
peptidoglucano, retiene el complejo CV-I. Despus de la decoloracin, las bacterias Gram
positivas siguen de color morado, mientras que las Gram negativas pierden color. (3)
La forma de verificar que la bacteria que creci fue B. Subtilis fue el haber realizado una tincin
Gram, puesto que el resultado arroj Gram positivo y se observ una forma bacilar empalizada
(bacilos lado con lado y en figuras en X,V e Y). Adems, la nica bacteria que se acomoda a las
condiciones del mtodo utilizado es el B. Subtilis, puesto que ste puede esporular y sobrevivir a
los 60C, mientras que las otras bacterias contenidas en el producto comercial (Pseudomona y
Aerobacter) mueren a esa temperatura, ya que no forman endoesporas.
Otra forma de verificar que la bacteria que creci fue B. Subtilis, aunque no se llev a cabo en
esta experiencia, es haber aplicado este mtodo en una cepa de B. Subtils certificada (cepa
ATCC) y luego haber comparado el resultado obtenido con el del producto comercial, es decir,
haber utilizado la cepa ATCC como control positivo.
Para garantizar la calidad y/o caractersticas de este mtodo segn lo establecido en la norma
9001:2008 (norma bajo la cual se rige el Lab. BTS-INTRADE), ste debe ser certificado por un
organismo competente en el rea, como por ejemplo, el CITUC de la Pontificia Universidad
Catlica de Chile, con lo cual se consigue aumentar el nivel de confianza, de satisfaccin y de
fidelidad del cliente, consiguiendo as la empresa diferenciarse de la competencia.
El reclamo de cliente sobre este producto consiste en que ste objeta la cantidad de bacteria que
crecen a partir de este producto. Para atender este problema, debemos enfocarnos en encontrar
la causa basal de ste, cuyos factores posibles son el proveedor de B. subtilis (Sudfrica), la
elaboracin del producto comercial en el Lab.BTS y la forma de aplicacin del cliente.

Basndonos en los resultados obtenidos en esta experiencia, los 2 primeros factores se

descartan, puesto que se trabaj con el producto terminado y se comprob que ste s posee B.
Subtilis, determinndose un nmero apreciable de UFC por gramo de producto, por lo que el B.
Subtilis que proporciona el proveedor empresa BTS al cliente es de buena calidad y la
manufactura del producto se llev a cabo de forma correcta. Por estas razones, probablemente la
causa basal de la no conformidad se encuentre en la empresa del cliente, por lo que lo que el
comit de calidad del Lab.BTS deber ir a la empresa del cliente para ver en qu condiciones se
est aplicando el producto, es decir, llevar a cabo una auditora externa del proceso, con lo cual
se puede encontrar la causa basal de la no conformidad e implementar la accin correctiva y as
no perder al cliente.

CONCLUSIONES

De acuerdo a los objetivos planteados, se puede concluir que stos se cumplieron de manera
satisfactoria, puesto que llev a cabo la cuantificacin de UFC de B. Subtilis en un producto
comercial; se ensay un mtodo de cuantificacin de B. Subtilis, para luego ser certificado e
implementarlo en el Lab. BTS-INTRADE; se compar el comportamiento de la bacteria B.
Subtilis frente a 2 medios de cultivos diferentes; se adquiri destreza en el manejo de los
materiales, equipos y reactivos implicados en los procesos de preparacin de medios de cultivo,
siembra y tincin Gram y se manej conceptos bsicos de Control de Calidad.

El medio de cultivo aprobado por la FDA es selectivo para la bacteria B. Subtilis.

El proveedor de la empresa es confiable, puesto que provee de un liofilizado de B. Subtilis de
buena calidad y la elaboracin del producto comercial se llev a cabo de buena forma, puesto
que creci B. Subtilis sin dificultad en ambos medios de cultivo.
Probablemente la causa basal de la no conformidad se encuentre en la empresa del cliente.
Es de suma importancia conocer la o las tcnicas de esterilizacin para evitar la contaminacin
de agentes externos a las pruebas realizadas, as como evitar que los que maniobran las muestras
sean infectados por un microorganismo patgeno, por eso es necesario que el material tenga un
proceso de limpieza, procesamiento, y mantenimiento a travs del tiempo, como en esta
experiencia, ya que las muestras estuvieron almacenadas en estufa, as permitiendo la aparicin
de los organismos viales de inters para examinarlos posteriormente.

BIBLIOGRAFA
(1) Carlos Gamazo, Ignacio Lpez-Goi,Ramn Daz. Manual Prctico de Microbiologa.
Editorial Masson. Quinta edicin, pgina 3-14.
(2) Ganten D., Deichmann T., ThiloS. 2004. Vida, naturaleza y ciencia. Editorial
Santillana.Pgina 8.
(3) Gram, HC (1884). "ber die isolierte Frbung der Schizomyceten in Schnitt- und
Trockenprparaten" (in German). Fortschritte der Medizin 2: 1859.