PROCEDIMIENTO DE ELECTROFORESIS

1. Fundir la solucin C en bao mara y mantenerla lquida hasta

terminar de colocar las muestras en los pozos.
2. Colocar 13 L de cada muestra en su pozo correspondiente
intercambiando puntillas entre cada muestra hasta completar el total.
3. Colocar 13 L de la solucin C lquida en cada pozo intercambiando
puntillas entre cada muestra hasta completar el total.
4. Despus de 5 minutos comprobar que las muestras han gelificado
inclinando el gel procurando que no fluya.
5. Colocar los vidrios sin separar en la cmara de electroforesis sujetando
con una pinza de cada lado.
IMPORTANTE: Conocer siempre la ubicacin del primer carril
para no perder el orden de secuencia
6. Agregar la solucin D a la cmara:
25 mL de solucin D, aforar con agua destilada estril a 250 mL
Eliminar las burbujas golpeando levemente la cmara
7. Conectar la fuente de poder y los electrodos ( +Rojo, -Azul)
8. Programar:
60v durante 30 min.
Despus a 110v durante 1hr 20 min. Hasta que todo el colorante
haya salido del gel

TINCIN
1. Desprender cuidadosamente el gel de los vidrios con ayuda de un
separador.
Cortar la esquina inferior del primer carril
2. Colocar el gel en el recipiente con solucin E durante 30 min.
10 mL de solucin E y aforar a 100 mL con agua
destilada estril
3. Retirar la solucin anterior y adicionar la solucin F por 30 min.
1 mL de solucin F en 100 mL de agua destilada estril
4. Retirar la solucin anterior y hacer un lavado con agua destilada estril
5. Adicionar la solucin G
1 mL de solucin G aforada a 100 mL con NaOH al 3%
Agitar levemente hasta observar las bandas en el carril de
la muestra control positivo
6. Retirar la solucin y parar la reaccin con solucin H (cido actico
glacial al 1%)
1 mL de cido actico en 50 mL de agua destilada estril

NOTA: Utilizar guantes desechables durante la tcnica.

TCNICA DE ROTAFORESIS PARA EL DIAGNSTICO DE

ROTAVIRUS
Es un mtodo basado en la identificacin directa del RNA viral. Las 11
molculas que constituyen su material gentico dan un patrn caracterstico
despus de someterlo a electroforesis en gel de poliacrilamida.

EXTRACCIN DE RNA VIRAL A PARTIR DE

MATERIA FECAL
1. Muestra de heces:
- Consistencia slida: Colocar 0.6 g de la muestra en un tubo
Eppendorf de 1.5 mL con suero salino fisiolgico (SSF) estril y
mezclar en vortex.
- Consistencia lquida: Colocar 300 L
2. Agregar 300 L de solucin A. Mezclar en vortex.
3. Agregar 300 L de solucin B. Mezclar en vortex.
4. Agregar 300 L de cloroformo. Mezclar en vortex.
5. Centrifugar a 10,000 rpm. Durante 15 min.
6. Tomar el sobrenadante con pipeta Pasteur y pasarlo a otro tubo
Eppendorf
7. Almacenar a 4 C hasta su uso

PREPARACIN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA

1. Lavar los dos vidrios y secarlos perfectamente.
2. Colocar los separadores de tefln entre los dos vidrios.
3. Montarlos sobre el estuche de preparacin del gel y colocar el peine
entre los vidrios
4. En un vaso de precipitado de 50 mL colocar:
a. 1.32 mL de acrilamida bis-acrilamida.
b. 2 mL de TRIS
c. 4.56 mL de agua bidestilada estril
d. 500 L de Persulfato de Amonio
e. 10 L de catalizador TEMED (2 gotas con pipeta pasteur)
f. Mezclar suavemente y llenar el espacio entre el peine y los vidrios
DEBE HACERSE RPIDAMENTE para evitar que se polimerice la
solucin
g. Una vez polimerizada la solucin, retirar los peines de entre los
vidrios
h. Agregar agua destilada estril para limpiar los pozos
i. Secar los pozos con tiras de papel filtro hasta que estn
completamente secos

j. El gel est listo para colocar las muestras en los pozos