Preparacin de clulas qumicamente competentes para uso en transformacin por

choque trmico (adaptacin del mtodo de Inoue: Inoue et al., 1990 Gene 96:23)
1. A partir de un inculo previo, cultivar en matraz clulas de Escherichia coli en
medio LB a 37 C con buena agitacion (180-250 rpm), hasta una OD600 ~ 0,3 (u
ptimamente, cultivar a 23 C hasta una OD 600 de 0,4 0,6). El volumen del
inculo no debe superar el 1% del volumen total del cultivo.
2. Al alcanzar la OD deseada, dejar el matraz en hielo por al menos 10 minutos.
Colectar las clulas por centrifugacin (a 4 C, por 10 minutos a 3000 RPM). El
freno de la centrifuga debe ser lo ms bajo (o sea, la disminucin de velocidad
debe ser la ms lenta), para disminuir la posibilidad de estrs en las clulas.
3. Eliminar el sobrenadante y lavar el pellet, resuspendindolo suavemente en 40
mL de solucin de Inoue (preenfriada) por cada 40 mL de cultivo. Despus de
dejar 10 minutos en hielo, se centrifuga igual que en el paso anterior.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender por cada pellet de 40 mL de cultivo en 4
mL de solucin de Inoue.
5. Mantener los tubos por 30 minutos (mnimo) en hielo.
6. Agregar 70 l de DMSO/ mL de suspensin de clulas y mezclar suavemente.
Dejar en hielo por al menos 10 minutos.
7. Repartir en alcuotas de 200 a 300 l en tupos Eppendorf estriles, previamente
enfrados (esto se puede hacer encerrando el recipiente de tubos cerrado en el
freezer por al menos 2 horas).
8. Opcional: utilizar un bao de etanol + hielo seco para congelar rpidamente las
alcuotas de cada tubo. Si no se tiene hielo seco, una papilla de agua y etanol
guardadas en el refrigerador a -80 C puede servir bien.
9. Guardar las alcuotas a -80 C. En almacenamiento pueden permanecer por
meses sin perder significativamente la competencia.
NOTAS
Si las clulas se descongelan y vuelven a congelarse a -80 C, la eficiencia de
ellas para ser transformadas disminuye notablemente.
Asegrese que los materiales que se usarn para preparar las clulas estn
libres de detergente.
Todos los pasos deben hacerse en estricta esterilidad.
Es importante que el tratamiento de las clulas sea suave (por ejemplo,
evitar el pipeteo al resuspenderlas en la solucin de Inoue)
Solucin de Inoue: 10mM PIPES (HEPES tambin sirve!); 15mM CaCl2; 250mM
KCl. Se ajusta pH hasta 6.7 con KOH o HCl y luego agregar una solucin MnCl 2 (lo
suficiente hasta una concentracin 55mM) con jeringa y filtro de 0,45 m, y ajustar con
agua (lo ms pura posible) hasta el volumen final planificado. La solucin se guarda a
4 C.
Para transformar: una alcuota de 100-200 l de clulas descongeladas en hielo es
transferida a un tubo Falcon de 15 ml; se mezcla suavemente un volmen mximo de 5
uL de DNA y se deja 30 minutos en hielo. Luego, se deja 45 segundos sin agitacin en
bao de agua a 42 C y se deja, sin agitacin, en hielo por 2 minutos. Luego se agrega
900 l de caldo SOC y se deja 1 hora a 37C con agitacin y aeracin. Luego se
plaquean alcuotas de 20, 50 y 100 l en placas de LB (ms antibitico) previamente

preincubados por 1 hora a 37 C. Si se usa ampicilina, el tiempo de incubacin de las

placas no debe superar las 18 horas, a fin de evitar el crecimiento de colonias satlite.