CUARTA PARTE

ENUMERACION BACTERIANA: EL NUMERO MAS

PROBABLE
EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia efeciente de
estimacin de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluacin
cuantitativa de clulas individuales no es factible. La tcnica se basa en la determinacin
de presencia o ausencia (pos o neg) en rplicas de diluciones consecutivas de atributos
particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por
lo tanto, un requisito importante de este mtodo es la necesidad de poder reconocer un
atributo particular de la poblacin(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado
de densidad poblacional se obtiene del patrn de ocurrencia de ese atributo en diluciones
seriadas y el uso de una tabla probabililstica.
Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamaos poblacionales
basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede
determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en
una muestra de suelo usando el mtodo de infeccin de plantas, (ii) provee una
recuperacin uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados, (iii)
determina slo organismos vivos y activos metablicamente, y (iv) suele ser ms rpido e
igual de confiable que los mtodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo,
entre otros.
En este ejercicio, se utilizar una variante de esta metodologa para estimar la densidad
total de bacterias presentes en una muestra. El atributo particular a utilizarse ser la
capacidad de microorganismos a formar colonias en medios slidos de crecimiento.

EL NUMERO MAS PROBABLE

Materiales & Equipos:

Muestras ambientales (lodos activados, ros, charcas, suelo, etc.)

Placas Petri con medio de crecimiento (R2A, LB, TSA u otro)
Tubos de dilucin con 9 ml de 0.85% NaCl
Micropipetas de 20 l
Puntas para micropipeta
Incubadora a 25C
Vortex

METODOLOGIA
1. Muestras: Colecte aspticamente muestras frescas de suelo (10 g) de varios
lugares u obtenga muestras de agua (10 ml) de lagos, ros o charcas.
2. Extraccin de microorganismos viables: Para muestras de suelo, las clulas podrn
ser removidas y homgenizadas aadiendo 1 g de muestra a un tubo de ensayo que
contenga 9 ml de solucin salina. Agite moderadamente por 5 minutos en un vortex.
3. Diluciones en serie: El extracto de suelo puede ser diluido seriadamente transfiriendo
1 ml a un tubo con 9 ml de 0.85% NaCl. Cada transferencia corresponde a una
dilucin de 1 en 10. Repita en serie el procedimiento de dilucin hasta alcanzar la
dilucin 10-7. Para muestras lquidas, mezcle bien la muestra y proceda a preparar
las diluciones seriadas como fueron descritas anteriormente.
4. Placas Petri: Utilizando un marcador, divida la placa petri en cinco zonas de igual
tamao. Use una placa por cada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilucin
a ser inculado:
10-3
10-4
10-7

10-6

10-5

EL NUMERO MAS PROBABLE

5. Inoculacin: Transfiera 5 l de la dilucin apropiada al rea correspondiente. Repita

esta operacin cinco veces por cada dilucin:

10-3

10-3
10-4

10-4

10-7

10-7

10-6

10-5

10-6

10-5

6. Permita que el incculo seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa con un
tirillade parafina. Invierta la placa e incube a 25C por 7 das.
7. Evaluacin de crecimiento: Para cada dilucin en asendencia evalue el crecimiento o
no crecimiento sobre cada rplica incoculada. Reporte los resultados como se indican
en el ejemplo a continuacin:
10-3
10-4
10-7

10-6

10-5

Diluciones 10-3 - 10-4 - 10-5 - 10-6 - 10-7 :: 5 - 5 - 3 - 2 - 0

Datos & Anlisis:
Utilizando los valores ofrecidos en la tabla 1, determine la poblacin estimada para su
muestra (ej., 5-5-3-2-0: 1,383). De su patrn de respuestas no estar en la tabla, promedie
el valor estimado del patrn superior e inferior presente en la tabla 1 (ej., 5-4-1-1-0 no
est en la tabla, entonces promedie 5-4-1-0-0 (169) y 5-4-2-0-0 (216) como el resultado
ms apropiado: 5-4-1-1-0 = (169+216)/2 = 193). Este valor obtenido es el NMP sin ajustar.
Para calcular la densidad poblacional de la muestra, entonces tendr que multiplicar el
NMP sin ajustar por el factor de correcin de volumen (ver nota Tabla 1) por el recproco
del factor de dilucin menor inoculado en la placa (ej., 5-5-3-2-0: 1,383 X 200 X 1000 =
2.78 x 108 clulas/g de suelo).

EL NUMERO MAS PROBABLE

Tabla 1.

El nmero ms probable para series de diluciones en rplicas

de cinco por nivel de dilucin (Woomer, 1994)*.

Nm. Respuestas
Pos. por Nivel de
Dilucin
1-2-3-4-5-6
1-0-0-0-0-0
1-1-0-0-0-0
2-0-0-0-0-0
2-1-0-0-0-0
3-0-0-0-0-0
3-1-0-0-0-0
3-2-0-0-0-0
4-0-0-0-0-0
4-1-0-0-0-0
4-2-0-0-0-0
4-3-0-0-0-0
5-0-0-0-0-0
5-0-1-0-0-0
5-1-0-0-0-0
5-1-1-0-0-0
5-2-0-0-0-0
5-2-1-0-0-0
5-3-0-0-0-0
5-3-1-0-0-0
5-3-2-0-0-0
5-4-0-0-0-0
5-4-1-0-0-0
5-4-2-0-0-0
5-4-3-0-0-0
5-5-0-0-0-0
5-5-0-1-0-0
5-5-1-0-0-0
5-5-1-1-0-0
5-5-2-0-0-0
5-5-2-1-0-0
5-5-3-0-0-0
5-5-3-1-0-0
5-5-3-2-0-0
5-5-4-0-0-0
5-5-4-1-0-0

Poblacin estimada

1.9
4.0
4.4
6.8
7.7
10
13
12
16
21
27
23
31
33
45
49
69
78
107
138
127
169
216
270
230
312
327
453
488
692
780
1070
1383
1275
1690

Nm. Respuestas
Pos. por Nivel de
Dilucin
1-2-3-4-5-6
5-5-4-2-0-0
5-5-4-3-0-0
5-5-5-0-0-0
5-5-5-0-1-0
5-5-5-1-0-0
5-5-5-1-1-0
5-5-5-2-0-0
5-5-5-2-1-0
5-5-5-3-0-0
5-5-5-3-1-0
5-5-5-3-2-0
5-5-5-4-0-0
5-5-5-4-1-0
5-5-5-4-2-0
5-5-5-4-3-0
5-5-5-5-0-0
5-5-5-5-0-1
5-5-5-5-1-0
5-5-5-5-1-1
5-5-5-5-2-0
5-5-5-5-2-1
5-5-5-5-3-0
5-5-5-5-3-1
5-5-5-5-3-2
5-5-5-5-4-0
5-5-5-5-4-1
5-5-5-5-4-2
5-5-5-5-4-3
5-5-5-5-4-4
5-5-5-5-5-0
5-5-5-5-5-1
5-5-5-5-5-2
5-5-5-5-5-3
5-5-5-5-5-4

Poblacinestimada

2159
2716
2305
3126
3282
4532
4922
6918
7797
10702
13826
12753
16902
21589
27150
23054
31225
32720
45261
49224
69148
78127
107022
138269
127528
169028
215899
271557
334051
230546
328192
492238
781272
1312535

* Esta es la densidad poblacional estimada asumiendo 1 ml de inculo. Este valor debe ser ajustado
por el factor de dilucin y el volumen de inculo (por ejemplo, si usted inocul en cada placa un
volumen de 10 l, entonces el valor de la tabla debe ser correjido multiplicndolo por 100 [10 X 100 =
1,000 l 1 ml]).

EL NUMERO MAS PROBABLE

Observaciones:

PREGUNTAS...
1. Qu tiempo de incubacin de sera el ms apropiado?
2. Cules son algunas desventajas del mtodo de NMP?
3. Qu otras aplicaciones tiene este mtodo?
4. Si luego de preparar diluciones en serie de 10-2 hasta 10-6 de una muestra de una
laguna usted obtuvo un patrn de respuestas positivas 5-5-4-3-1, Cul es la
densidad poblacional en la laguna?
5. Qu tendra usted que hacer si luego de incubar los resultados son 5-5-5-5-5-5?