Hiptesis: Obtencin de un organismo genticamente

modificado. Para la produccin de Tenascina c (TNC)

en ganado bovino lechero.
Etapas de experimentacin.
I.

Identificacin del carcter deseable en organismo.

La Leche materna posee una protena, la Tenascina-C (TNC), que impide
que madres portadoras del virus HIV contagien a sus hijos durante el
amamantado de los mismos.
Basados en las investigaciones de un grupo de cientficos de la
universidad de Duke coordinados por el El doctor Juli Blanco, del Instituto de
Investigacin del Sida IrsiCaixa, quien explica que la TNC se une a las
protenas exteriores del VIH, las rodea y evita que el virus entre en contacto
con las clulas CD4, las dianas que utiliza el virus. Presentamos este trabajo
con el objetivo de ahondar en la bsqueda viable de una produccin controlada
de la protena de inters.
El mismo Dr. Blanco sostiene Si esta protena resultara fcil de producir,
podra ser una manera simple y eficaz de proteger a los nios del virus.
Es por esto que dicho carcter, la TNC, presente en la leche materna resulta
de primordial inters en la lucha contra el virus HIV.
II.

Encontrar al gen que lleva las instrucciones para esta

caracterstica, aislarlo y caracterizarlo.
Cuando se encuentra una caracterstica en un organismo que resulta
interesante para transferir a otro organismo debe verificarse que es producto
de un gen. Si la caracterstica se atribuye a una protena, que es producto
directo de un gen, ser ms sencillo transferir esa caracterstica a un
organismo que no la tiene. En nuestro caso de anlisis, la caracterstica es la
barrera inmunolgica que la leche materna presenta frente al virus HIV,
impidiendo el contagio por parte del lactante. Gracias a las investigaciones del
Dr, Blanco y sus colegas podemos saber que la mencionada caracterstica es
producto de la accin de la Tenascina-C.
III.
Clonar el Gen.
Clonar un gen significa tenerlo puro en el tubo de ensayos, o mejor an, dentro
de un vector (una molcula mayor de ADN que permite guardar fragmentos de
ADN en forma estable y prctica por ms tiempo). La tarea de clonar un gen

involucra varias tcnicas i) Extraccin de ADN; ii) Bsqueda de un gen entre la

mezcla de genes del ADN; iii) Secuenciacin; iv) Construccin del vector
recombinante.
El ADN de inters se inserta en plsmidos-vectores que son molculas de ADN
lineales o circulares en las cuales se puede guardar (clonar) un fragmento de
ADN. Los ms usados son los plsmidos de origen bacteriano.

Los plsmidos pueden

extraerse de las bacterias e
incorporarse a otras, a travs
del proceso de
transformacin. Los
plsmidos fueron modificados
para ser empleados como
vectores (vehculos). As, el
gen de inters puede
insertarse en el plsmidovector e incorporarse a una
nueva clula.
En nuestro caso proponemos insertar el gen que codifica para la Tenascina-C
en un plsmido e implantar este primero en fibroblastos embrionarios de ratn.
Y luego, sujeto a resultados, en clulas de ganado bovino lechero.
El desarrollo de estas tcnicas fue posible en gran medida por el
descubrimiento de las enzimas de restriccin. Dichas molculas reconocen
secuencias determinadas en el ADN. De esta
manera, conociendo la secuencia de un
fragmento de ADN, es posible aislarlo del
genoma original para insertarlo en otra
molcula de ADN.
Mtodo de accin de enzimas de
restriccin.
Estas enzimas reconocen secuencias de 4, 6 o
ms bases y cortan generando extremos
cohesivos. Estos extremos, generados en
diferentes molculas de ADN, pueden sellarse
con la enzima ADN ligasa y generar as una
molcula de ADN nueva, denominada recombinante.

Amplificacin.
Para obtener gran cantidad y posible disponibilidad del ADN de inters, el
vector se inserta dentro de bacterias, las cuales crecen fcil y rpidamente. O
sea, la bacteria se utiliza como multiplicadora del vector, y por ende del
inserto de inters. Esta es una etapa de amplificacin del ADN para poder
tener gran cantidad para secuenciarlo, caracterizarlo, y luego poder crear con
l, ADN recombinante. En nuestro caso proponemos utilizar como multiplicador
una colonia de Escherichia coli.
Multiplicacin.
En placas de Petri se cultivan las bacterias. Se originan colonias de bacterias
iguales (clones). Las bacterias transformadas, que incorporaron el plsmido y
el gen de inters, se seleccionan por medio de antibiticos y por reacciones
con indicadores de color.
IV.
Caracterizar el gen de inters.
A partir de conocer la secuencia del gen se puede, mediante bioinformtica,
comparar esta secuencia con las de genes ya conocidos para determinar a qu
gen se parece, y se le asigna una posible funcin. Una vez predicha la funcin
del gen clonado por medio de anlisis informtico, se debe proceder a
confirmar la funcin real in vivo, o sea corroborar que en un sistema biolgico
funciona acorde a lo que se prev. Para ello se transfiere el gen a un organismo
modelo, en el cual se pueda expresar el gen y medir su funcin. En nuestro
caso, se plantea utilizar ratones para comprobar la viabilidad de nuestra
hiptesis insertando el gen que codifica para la tenascinaC junto con un
marcador, en dichos ratones, verificando luego la presencia de la protena.
Los ratones transgnicos se obtienen por:
-

microinyeccin del ADN en el vulo fecundado: el ADN se introduce por

medio de un capilar, bajo el microscopio, en el ovocito fecundado. Esto
se debe hacer muchas veces porque en ocasiones los ovocitos o los
ncleos se rompen y los vulos transformados resultan escasos.

microinyeccin del ADN en clulas embrionarias: el organismo adulto

ser una quimera ya que no todas las clulas incorporan el nuevo gen.
Entonces, se utilizarn solo los animales que tengan el gen en sus
gametas y por lo tanto lo transmitan a su descendencia. Esta tcnica es
ms fcil y eficiente que la anterior a pesar de que se descarten
animales.

Los ratones transgnicos se utilizan fundamentalmente:

Como herramientas de laboratorio para estudiar los genes, su funcin, y

cmo se regula su expresin si se cambia el lugar o el tiempo de
expresin de ese gen. Por ejemplo, se puede hacer que la protena se
manifieste en todos los tejidos, o que se exprese en adultos en lugar del
organismo recin nacido.
Como modelos de enfermedades para el desarrollo de drogas y
estrategias de tratamiento.

Como mencionramos antes el proceso consistira en tomar un lote de

fibroblastos embrionarios de ratn y modificarlos agregando los vectores
previamente construidos. De esta manera se haran crecer los ratones y luego
se evaluara la presencia de la TNC analizando la presencia del ARN mensajero
y de la protena recombinante codificados por el transgn.
Es necesario aclarar que en esta etapa tambin tiene lugar la modificacin el
gen de inters. Mecanismo que refiere a la posibilidad de agregar, deletar o
mutar secuencias dentro de la regin codificante, y agregar secuencias
(promotor, terminador, intrones) para que se pueda expresar en el sistema de
inters. Esto es: si se clona un gen que codifica para la produccin de una
protena en humanos para luego introducirlo en otro organismo, se deber
agregar un promotor que funcione bien en el organismo en cuestin, es decir,
que permita que las clulas expresen la protena de inters. El promotor es una
regin fundamental del gen ya que determina cundo y dnde se expresar el
gen. En nuestro caso tambin es importante destacar que para que la protena
de inters no interfiera en el desarrollo del organismo modificado el promotor
tambin determinar que la Tenascina-c solo sea producida en la glndula
mamaria.

V.
Transformacin de un organismo con el gen de inters.
Transferir el gen de inters, previamente introducido en el vector adecuado, al
organismo receptor.
Una vez hecha la construccin gentica con el gen y promotor deseado y
habiendo comprobado su viabilidad biolgica en un organismo modelo, se
procede a determinar un mtodo de transformacin del organismo elegido. En
nuestro caso el organismo a modificar genticamente es ganado bovino de
raza pampa mansa. Para esto se tomar la metodologa utilizada por los
creadores de pampa mansa.
Dicha metodologa consiste en tomar una clula fetal (no somtica como en el
caso de Dolly), un Fibroblasto embrionario. E insertar en l nuestro plsmido
modificado.

Este mecanismo permite introducir genes de inters farmacolgico para

producir bovinos transgnicos. De esta manera la idea es implantar nuestro
gen de inters (codifica para Tenascina-C) introducido en el vector, dentro de
una fibroblasto embrionario de pampa mansa para lograr un clon que produzca
leche con nuestra protena de inters incluida. La produccin de determinadas
protenas en la leche de animales transgnicos es particularmente interesante
cuando esas protenas se requieren en gran cantidad o son muy complejas. La
produccin en leche permite, adems, una purificacin relativamente simple de
la protena de inters. Como la produccin de la nueva molcula no debe
interferir con el crecimiento y metabolismo del animal, se introduce el gen de
inters junto con una secuencia (promotor) que permite su expresin
nicamente en la glndula mamaria.

VI.
Caracterizacin del OGM.
Una vez obtenido el OGM, se lo analizar desde el punto de vista molecular y
biolgico. Para el anlisis molecular se deber demostrar, entre otras cosas, si
tiene una (o ms) copias del transgn, y cmo y en qu tejidos se expresa el
gen.
Para analizar en qu tejido, momento y cantidad se expresa el gen, se
analizar la presencia del ARN mensajero y de la protena recombinante
codificados por el transgn.
Para la caracterizacin biolgica, el OGM se analiza desde el punto de vista del
objetivo (en nuestro caso, si la vacas desarrolladas efectivamente producen la
protena Tenascina-C en la leche).