Qumica analtica

UNIDAD VII
Cromatografa

Profa. Lilia Araujo.

Prof. Avismelsi Prieto.

Qumica analtica

INTRODUCCIN A LA CROMATOGRAFA
La cromatografa abarca un grupo de tcnicas de separacin que permite adems de
aislar; identificar y cuantificar componentes presentes en mezclas complejas, cuando se
le acopla a otras tcnicas analticas.

Mecanismo:
Los componentes de una mezcla son transportados a travs de una fase estacionaria por
accin de una fase mvil que fluye. Las separaciones se basan en las diferencias de
velocidad de migracin entre los diferentes componentes de la muestra.

FASES ESTACIONARIAS

1. Slido fino sostenido en un tubo de

vidrio o metal.
2. Papel Poroso.
3. Slido fino, soportado por una placa
de vidrio o plstico.
4. Lquido inmovilizado inmiscible con
la fase mvil.

FASE MVIL
Lquido o gas que se desplazan por efecto de la gravedad, percolacin, accin
capilar o presin.

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CLASIFICACIN

a. Segn la geometra del medio fsico que soporta la fase estacionaria:

Cromatografa en Columna: La fase estacionaria est empaca en un tubo.
Cromatografa Plana: La fase estacionaria esta sostenida en una placa de
Vidrio, plstica o papel.
b. Segn el estado fsico de la fase mvil:
Fase mvil
Lquida

Cromatografa Lquida

Cromatografa Lq-Slido
Cromatografa Lq-Lq
Cromatografa en Capa Fina
Cromatografa en Papel
Cromatografa Inica
Cromatografa de Permeacin de Gel

Fase mvil
Gaseosa

Cromatografa Gaseosa

Cromatografa Gas-Lquido
Cromatografa Gas-Slido

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c.

Segn el mecanismo por el cual los solutos se separan.

C.1- Cromatografa de Adsorcin

Los solutos se separan segn su capacidad para adsorberse sobre la fase
estacionaria.

ANALITO
1,2-bencenodiol
(pirocatecol)

C.2.- Cromatografa de Reparto o Particin

La fase estacionaria esta formada por una pelcula de un lquido
inmovilizado que reviste la superficie de un slido inerte, la separacin de
los componentes de una mezcla, se debe a la diferencia del equilibrio de
reparto de los solutos entre la fase estacionaria lquida y la fase mvil
(lquido o gas).

ANALITO
Naftaleno

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C.3.- Cromatografa de Intercambio Inico

Utiliza fases estacionarias slidas con grupos funcionales aninicos (Ej. R-SO3-) o
catinicos (Ej. R-N(CH3)3+) unidos por enlaces covalente a resinas polimricas. los
solutos inicos son atrados por las fuerzas electrostticas.

R-SO3R-N(CH3)3+

sulfonico
aminas cuaternarias

C.4.- Cromatografa de Exclusin por Tamaos

La separacin se debe a la diferencia de tamao de los solutos. La _
fase estacionaria suelen ser geles porosos que pueden ser penetrados
por los solutos de menor tamao.

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APLICACIONES EXPERIMENTALES

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PROCESO CROMATOGRFICO: Elusin en columnas

SOLVENTE

Cromatograma: Registro de la seal de deteccin en funcin del tiempo de elusin

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Por que ocurren las separaciones cromatogrficas?

Teora cintica de la cromatografa

I. Una vez introducida la muestra en la columna, el flujo de fase mvil

arrastra los componentes de la mezcla y se inicia la distribucin de las
especies qumicas entre la fase mvil y la fase estacionaria.
II. Las molculas son
sometidas a miles de
transferencias entre las fases
estacionaria y mvil.

Fase mvil

III. El tiempo de residencia puede ser

corto en algunas transferencias y
largo en otras (tiempo de residencia
irregular).

Fase
estacionaria
Transferencias de una
especie entre las fases
mvil y estacionaria

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IV. El movimiento de las distintas especies solo puede producirse

mientras las especies qumicas estn en la fase mvil.
V. La velocidad promedio en la que una
especie migra en la columna
Fase mvil
depende de la fraccin de tiempo
que permanece en la fase mvil.

Transferencias de una
especie entre las fases
mvil y estacionaria

Fase
estacionaria

VI. Una sustancia retenida fuertemente por

la fase estacionaria presentar una velocidad de migracin promedio baja.
VII. Las diferencias de velocidad de migracin, hacen que los componentes
de la mezcla se separen en bandas o zonas estrechas.

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Descripcin cuantitativa de la eficiencia de una columna

Se emplean dos trminos para expresar la eficiencia de una columna:
1)La altura equivalente de un plato terico ( H o HETP) y
2)El nmero de platos tericos
N=L/H

donde L es la longitud de la columna

El trmino altura de plato terico H proviene de la teora de Martin y Synge en la

que se considera que en cada plato (segmento de la columna) se debera
tericamente establecer el equilibrio de una especie qumica entre las fases
mvil y estacionaria.
Una pequea altura de plato terico da lugar a picos estrechos y esto
permite a su vez mejores separaciones.
Similarmente se obtienen excelentes separaciones cuando se tiene un
elevado nmero de platos tericos.

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Considerando un pico cromatogrfico como una curva gaussiana:

H = 2 / L
Adems

= LW / 4tr

H = LW2 / 16tr2

Sustituyendo H en
N=L/H
N = L / (LW2 / 16tr2)
N = 16( tr / W )2
N = 5,54(tr /W )2
Se obtienen excelentes separaciones cuando se tiene un
elevado nmero de platos tericos.

tr = tiempo de retencin W = anchura de base de pico W1/2 = anchura a mitad del pico

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Variables cinticas que influyen en la eficiencia de la columna

El ensanchamiento de pico refleja una prdida de la eficiencia de la
columna .

Este ensanchamiento se debe a un avance diferente de las

molculas de una misma especie a travs de la columna.
No todas las molculas de una misma especie fluyen de igual
forma, en el mismo instante de tiempo, es decir, no presentan un
comportamiento ideal. Este comportamiento no ideal se debe a tres
factores descritos por la ecuacin de Van Deemter:
H = A + B/u +

Cu

1. Caminos mltiples o difusin en remolino (trmino A).

2. Difusin longitudinal (trmino B/u).
3. Tiempo de equilibrado o resistencia a la transferencia de materia
(trmino Cu).
U = velocidad lineal de la fase mvil
H = altura del Plato terico

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(trmino A).

Caminos mltiples

Resistencia a la transferencia de materia

Qumica analtica

La ecuacin de Van Deemter expresa cmo influye la columna y la

velocidad de flujo en el ensanchamiento de la altura del plato terico.
Caminos mltiples

Difusin longitudinal

H = A + B/u +

Cu

Tiempo de equilibrio ente las fases

Columnas empaquetadas A, B, C es 0
Columnas tubulares abiertas A = 0

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CL

CG

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1 Tiempo de Retencin (tr): Es el que tarda un soluto

en desplazarse desde el inyector hasta el detector.

2 Anchura de Base (w): es el ancho (medida) de la banda

cromatogrfica de un soluto medida sobre la lnea base.
Unidades de w: tiempo, volumen o longitud.

Seal del Detector

Caractersticas de un Pico Cromatogrfico

tr
tm
W

3 Tiempo muerto (tm): es el tiempo necesario para que los

Solutos no Retenidos se desplacen desde el inyector al
detector.

Tiempo de Retencin

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PARMETROS CROMATOGRFICOS

RESOLUCIN (R) es una medida cuantitativa del grado de separacin entre dos
picos cromatogrficos A y B.
RESOLUCIN (R)

R=0.75
A

R=1.25
A

R=1.50
A

t R,B - t R,A
0.5(w B w B )

t R
wB wA

Se observa que a medida que R

aumenta mejora la separacin
entre los picos

La resolucin puede mejorar, segn la ecuacin

a) Aumentando tr
b) Disminuyendo w
El tr depende de la interaccin de los solutos con la fase estacionaria.
W: la anchura del pico depende de la cintica asociada al movimiento del soluto
entre la fase mvil y estacionaria

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La resolucin depende de 3 factores:

Factor de capacidad (K) o factor de retencin (k)
Factor de selectividad ()
Nmero de platos tericos (N)

1 K
R 4
n

K 1
1

R =Resolucin entre los picos de A y B

Selectividad Eficiencia Capacidad

Se puede lograr disminucin de los anchos de picos y mejor resolucin si

experimentalmente se adoptan las siguientes medidas:
1. Se disminuye el tamao de las partculas de la fase estacionaria slida
2. Empleando capas mas finas de pelcula lquidas inmovilizadas sobre la
fase estacionaria.
3. Disminuyendo la viscosidad de la fase mvil.

4. Aumentando la temperatura.
5. Optimizando la velocidad o el flujo de la fase mvil
6. Seleccionando apropiadamente las polaridades de las fases mvil y
estacionaria.

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Eficacia de la columna

tr
N 16

Factor de Capacidad o Retencin (K`)

Medida de la fortaleza con que la fase estacionaria retiene un analito dado

tr tm
tm

K 0

Factor de Selectividad ():

Medida de la afinidad de la fase estacionaria respecto a dos analitos

K B

K A

K A K B

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ANLISIS CROMATOGRFICO:
Cualitativo

Tiempo de retencin, espectros de masas, infrarrojos.

Cuantitativo

Cantidad de analito en la muestra: rea o Altura

TIPOS DE CUANTIFICACIN
1. Normalizacin del rea (no requiere patrn)

A A A
i

%A1

A3 ... An

A1
100
A
i

Los analitos deben tener el mismo factor de

respuesta con el detector
Ej.: hidrocarburos/ Detector de ionizacin a la
llama (FID)

2. Calibracin con estndares externos:

Se emplea una serie de soluciones patrn
que contienen mezclados los analitos que
se desean cuantificar. Se determinan las reas
y se grafica para cada analito

rea o
altura de la
seal de Xi
Concentracin del analito Xi

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3. Estndar interno (EI)

Se adiciona a cada mezcla de soluciones
patrn, una sustancia (que no este presente
en la muestras) con una concentracin
fija. Se determinan las reas de los analitos
y del EI y se grafica para cada analito

AX
AEI

CX
Mejor mtodo de cuantificacin, corrige variaciones experimentales.

4. Adicin de patrn
Se adiciona cantidades creciente de soluciones
patrn, con o sin estndar interno, a un volumen
fijo de muestra. Se determinan las reas de los
analitos (y del EI) y se grafica para cada analito

AX
AEI
Es recomendable cuando se presente
interferencia de matriz.
0 P1

CM= Corte / Pendiente

P2

Cp

P3

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Cromatografa de intercambio inico.

Intercambio reversible de especies cargadas elctricamente entre una disolucin
en movimiento y un slido.

( ac)

R X ( s ) U ( ac)

R J ( s ) M ( ac)

R M ( s ) J ( ac)

R U

(s)

Resinas de intercambio aninico:

R---N(CH3)3+OHR---NH3+OH-

(base fuerte)
(base dbil)

Resinas de intercambio catinico:

R---SO3-H+
R---COO-H+

(cido fuerte)
(cido dbil)

Eluentes: Para intercambio catinico

soluciones cidas
Para intercambio aninico
soluciones bsicas
En ocasiones se aaden bajas cantidades de solventes orgnicos polares.

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Grupos de aplicacin

Separacin de iones inorgnicos.

-Separacin de molculas orgnicas cargadas elctricamente.
Factores que afectan la retencin de los analitos
1.- Carga de los iones
Los iones polivalentes se retienen mas que las especies con una sola
carga. Tambin se dan diferencias relacionadas con el tamao del ion
hidratado entre mayor sea el radio de hidratacin menor es la retencin.
Para una
resina de
intercambio
catinico fuerte
:
2
2
2
2
Ba
Pb
Sr
Ca
Ni 2 Cd 2
Cu 2 Zn 2 Mg 2 UO2

Tl Ag

Cs Rb K NH 4 Na H

Li

Para una resina de intercambio aninico fuerte:

Citrato 3 SO42 C2O4

I NO3 CrO4

Br SCN Cl CHCOO CH 3COO

OH F

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2. Concentracin del eluente o fase mvil

Si la concentracin del eluente es muy alta, los analitos eluyen a K=0; se debe ajustar la
concentracin del eluente para obtener K`=1 a 5

3. pH del sistema.
Afecta los iones en equilibrio con una forma molecular. Para incrementar la retencin, el
valor del pH debe promover la existencia de la forma inica.
Aniones: pH= pKa+ 1,5
Cationes: pH= pKb- 1,5

4. Temperatura
Los equilibrios de intercambio inico comnmente son ms rpidos a altas
temperaturas. Los cambios de temperatura tambin afectan a pKa o pKb. Un
incremento de la temperatura disminuye a K`.

5. Modificador Orgnico
Los solventes orgnicos modifican; la solubilidad, Ka, Kb, radio inico velocidad de
intercambio inico y la absorcin.

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Eluyente
Esquema del
cromatgrafo inico.

Muestra

Inyector
Columna

Analtica

Sin sistema supresor

de la conductividad
del eluyente.

Membrana Supresora

o
Columna supresora
de la conductividad del
eluyente

Detector

(Conductividad)
Registrador

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1) Sin sistema supresor de la conductividad de la fase mvil:

La deteccin se basa en las pequeas diferencias de conductividad entre los iones
de las muestras y los iones del eluyente. Para aumentar estas diferencias, se
utilizan eluyentes de bajas concentraciones (Ej HCl 2x10-3 M) y resinas de baja
capacidad intercambiadora, hacen posible la elucin de los iones de la muestra.
Mtodo menos sensible que los sistemas que
O J O
suprimen la conductividad de la fase mvil.
2) Empleo de una columna supresora de la conductividad: Es una 2da columna
que se coloca despus de la columna analtica pero de carcter opuesto.
Presenta la desventaja de saturacin de las columnas con poco tiempo de uso, lo que
hace necesario regeneral la columna supresora.
En la separacin de cationes:
H+(ac) + Cl-(ac) + Resina+ OHResina+ Cl- + H2O(l)
Eluyente

columna supresora

En la separacin de aniones:
2Na+(ac) + CO32-(ac) + 2Resina- H+
Eluyente

columna supresora

columna supresora

2Resina- Na+ + H2CO3(ac)

columna supresora

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3) Empleo de una membrana supresora

Membrana supresora para determinar cationes

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Aplicaciones

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CROMATOGRAFA DE GASES
Principio: Los componentes de una muestra vaporizada se fraccionan como
consecuencia de la particin entre una fase gaseosa mvil y una fase estacionaria
mantenida en una columna.

Crom. Gas-Slido (CGS)

Crom. Gas-Lquido (CGL)

Equilibrio de Adsorcin Gaseosa

Equilibrio de particin Gas-Lquido

Mtodo Cromatogrfico ms utilizado.

La Cromatografa gaseosa es la tcnica empleada para separar

compuestos orgnicos e inorgnicos trmicamente estables y voltiles.
Ejemplos: Hexano, Acetona, decano, antraceno, Acetato de etilo, DDT,
sulfuro de hidrgeno, fenol, trihalometanos, etanol, hidrocarburos livianos,
Dixido de carbono, xidos de nitrgeno, etc.

Qumica analtica

Qumica analtica

Qumica analtica

Inyectores (Liner o Inserto)

Tubo de vidrio calentado a una temperatura suficientemente alta para convertir en
forma instantnea la muestra liquida en un tapn de vapor. Volmenes tpicos entre 110 L para columnas empacadas.
Para columnas capilares se inyecta 1 L en un inyector-divisor. En el modo de trabajo
split (con divisin) solo entra a la columna 0.01 L.
Temperatura del inyector: sobre los 50 C por encima del soluto menos voltil.

Formas de inyeccin
1.
2.
3.
4.

Muestrador o inyector automtico

Inyeccin por la cabeza gaseosa (headspace)
Purga y atrapamiento
Manual

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Modo Split: muestra dividida

Se usa para analitos con altas
concentraciones. Se expulsa
solvente y analitos.

Modo Splitless: muestra no dividida.

.Se usa para Analitos con bajas
Concentraciones.
Se expulsa solo el solvente-

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Columnas cromatogrficas

Qumica analtica

Presentar adecuada retencin y afinidad con los analitos

Qumica analtica

Polidimetilsiloxano 95%
con 5% di fenil

300 C

En general para analitos no polares:

Plaguicidas, hidrocarburos,
Esteres, cetonas, aldehdos etc.

Qumica analtica

TERMOSTATIZACION DE LA COLUMNA
Control de temperatura de la columna ayuda a obtener Tr reproducibles
Barrido
Cromatogrficos

Isotrmicos
Programa de temperatura: aumento de la temperatura de la
columna en forma escalonada

80 C
Efecto de la
temperatura
sobre los
cromatogramas
de gases.

150 C

30

200 C

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DETECTOR
Es un dispositivo capaz de responder rpidamente a bajas concentraciones de los solutos
a medida que son eluidos de la columna.
Propiedades
Reproducibilidad de la respuesta
Rapidez de respuesta
Alta sensibilidad
Respuesta lineal
Estabilidad de la lnea base

Detector de Conductividad Trmica (TDC)

Entrada

Salida

Las conductividades trmicas de H2 y He son aprox. 6-10 mayores que la de los

compuestos orgnicos o inorgnicos (Ej. H2O, H2S, N2O, CH4, C6H6).
Detector no selectivo, no destruye la muestra, poco sensible, universal.

Anlisis de gas natural utilizando un detector de

Conductividad trmica

Qumica analtica

Detector de Ionizacin a la Llama (FID)

Compuestos

Orgnicos

+ Llama H2

Intermedios
Inicos

CO2 + H2O

La corriente electrnica atraviesa la llama

Detector que destruye la muestra, aceptable sensibilidad, no responde al H2O, CO,
CO2, SO2, CS2, NH3, N2O, NO, NO2 ; solo a compuestos orgnicos.

Anlisis de solventes aromticos empleando el

Detector de ionizacin a la llama

Qumica analtica

Se genera un
plasma (600-800 C)
que produce
intermediarios
inicos con N o P.

Especfico para compuestos orgnicos que contienen N o P, tales como

aminas, plaguicidas carbamatos y organofosforados

Determinacin de plaguicidas oganonitrogenados y

Organofosforados utilizando el detector NPD

Qumica analtica

(N2 generalmente)

Altamente sensible a compuestos orgnicos que contienen grupos

electronegativos: halgenos, perxidos, quinonas, grupos nitro.

Deteccin de plaguicidas organoclorados utilizando

El detector ECD

Qumica analtica

Detector de espectrometra de masas

1. Los analitos que emergen de la columna cromatogrfica son
bombardeados por un haz de electrones.
ABCDE + e- ABCDE.+ + 2 e2. El ion molecular formado se fragmenta siguiendo un patrn de
fraccionamiento nico para cada especie qumica
ABCDE.+ AB. + CDE+
ABCDE.+ AB+ + CDE.
ABCDE.+ A+ + BCDE.
3. Los fragmentos inicos formados son separados magnticamente
de acuerdo con sus relaciones masa/carga (M/Z).

Qumica analtica

Espectrometro de masas de cuadrupolo

Qumica analtica

Espectro de masas
del o-cresol

20

40

60

80

100

120

m/Z
- CO

m/Z = 80

m/Z = 108

- (CO + H)

m/Z = 79

Anlisis de contaminantes en el aire

Utilizando el detector de espectrometra de masas

Qumica analtica

Qumica analtica

Qumica analtica

Qumica analtica

Componentes del aceite del limn

Qumica analtica

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)

Qumica analtica

Esquema de un Cromatgrafo Liquido

Qumica analtica

Qumica analtica

Deposito de Fase mvil: Envase de Acero Inoxidable o Vidrio

de volmenes mayor a 500 mL.
Desgasificadores: Las burbujas de gases disueltos en la fase
mvil causan problemas de estabilidad en la presin, al igual
que la presencia de partculas de polvo, esto hace necesario:

Eliminar las burbujas mediante:

Agitacin y calefaccin
Vibracin
Purga con un gas inerte no soluble en la fase mvil
Aplicacin de vaco

Qumica analtica

Vlvula de distribucin de disolvente

Este componente permite realizar:
Elucin ISOCRATICA: se mantiene igual la composicin de la fase mvil durante todo
el barrido.

Fase mvil:
B = CH3CN
A = Buffer pH:3,5

Qumica analtica

Elucin en GRADIENTE: la fase mvil cambia en forma continua producto

de un programa de mezcla de 2 o mas solventes con diferentes polaridades a lo
largo de la corrida. Se obtiene mayor eficacia en la separacin.
1: Alcohol bencilico
2: Fenol
3: 3,4-dimetoxiacetofenona
4: Benzoina
5: Benzoato de etilo
6: Tolueno
7: 2,6-dimetoxitolueno
8: 0-metoxibifenilo

Condiciones:
Columna C-18, 5 m,
0,46 x 25 cm.
Flujo: 1,0 mL/min

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Sistemas de Bombeo
Funciones:

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Detectores empleados en HPLC

Fase mvil

Al desecho

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Deteccin de carbohidratos empleando

Un detector de indice de refraccin

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Qumica analtica

Deteccin de aminas utilizando un

Detector UV-visible

Qumica analtica

Qumica analtica

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Qumica analtica

Deteccin amperomtrica de Vitamina A

y beta-caroteno

Qumica analtica

Qumica analtica

Qumica analtica

Qumica analtica

Slicas
modificadas
quimicamente

Si-O-Si-O-Si-O-SiSi-O-Si-O-Si-O-H
Si-O-Si-O-Si-O- Si-

Algunas terminaciones OH son sustituidas

por radicales orgnicos
Se Nombra: radicaSilano

Qumica analtica

TIPOS DE CROMATOGRAFA LQUIDA SEGN LA POLARIDAD

DE LA FASE MVIL Y LA FASE ESTACIONARIA.

Cromatografa
Fase Normal

Cromatografa
Fase reversa

Fase estacionaria: Polar

Fase mvil: No Polar
Ej: Fase Estacionaria: silica,
Alumina, cianopropil, diol,
aminopropil
Fase Mvil: Hexano, Eter
Dietilico, isopropanol.

Fase Estacionaria: No polar

Fase Mvil: Polar
Ej: Fase Estacionaria: Octadecil Silano
(C18), octil silano (C8).
Fase Mvil: Agua, Buffer, Metanol, Etanol,
Acetonitrilo, Tetrahidrofurano o mezclas.

Las sustancias no-polares

eluyen primero y las ms
polares eluyen al final.

Las sustancias polares

eluyen primero y las menos
polares eluyen al final.

Qumica analtica

Seleccin del modo cromatogrfico apropiado

Primera seleccin

Fase reversa

Razones:
1) Es la modalidad mas robusta y reproducible. Las columnas son
ms estables y eficientes.
2) Se logra una mejor deteccin en esta modalidad , debido a los tipos
de solventes utilizados, especialmente con el detector UV.
3) Aunque muchos compuestos orgnicos tienen limitada solubilidad en
fases mvil polares, esto no representa una limitacin ya que solo ng o g
de la muestra con inyectados en la columna.

Qumica analtica

Qumica analtica

aminocidos

Plaguicidas
organofosforados