Analisis de Diversidad de Ustilago Maydis

Instituto Politcnico Nacional-CBG
ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENTICA Y

ANLISIS MOLECULAR DEL LOCUS b DE
Ustilago maydis
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGA
GENMICA
PRESENTA
MARA FERNANDA JIMNEZ BECERRIL
DIRECTORES DE TESIS
M.C. SANJUANA HERNNDEZ DELGADO
DR. JUAN MANUEL GONZLEZ PRIETO
Reynosa, Tamaulipas
febrero, 2010
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NDICE
NDICE DE CUADROS ..................................................................................................................... 6
NDICE DE FIGURAS ....................................................................................................................... 7
ABREVIATURAS ............................................................................... Error! Marcador no definido.
I. INTRODUCCIN ......................................................................................................................... 14
II. ANTECEDENTES ....................................................................................................................... 16
2.1 Generalidades de Ustilago maydis. ......................................................................................... 16
2.1.1 Ciclo de vida ........................................................................................................................... 16
2.1.2 Control de apareamiento y patognesis.................................................................................... 17
2.1.3 Organizacin y estructura del locus a y b ................................................................................ 20
2.1.4 Anlisis sexual del apareamiento in vitro ............................................................................... 22
2.1.5 Variabilidad gentica ............................................................................................................... 23
2.1.6 Uso de marcadores moleculares para estudiar variabilidad gentica ...................................... 24
2.1.7 Marcadores moleculares AFLP ............................................................................................... 25
2.1.8 Anlisis de variabilidad gentica en U. maydis....................................................................... 26
2.1.9 Anlisis moleculares realizados en el locus b en U. maydis .................................................... 27
III. JUSTIFICACIN ..................................................................................................................... 29
IV. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 30
4.1 Objetivo general .......................................................................................................................... 30
4.2 Objetivos especficos .................................................................................................................. 30
V. HIPTESIS .................................................................................................................................. 31
VI. MATERIALES Y MTODOS ................................................................................................... 32
6.1 Obtencin de tumores de U. maydis en diferentes Regiones y localidades de la Repblica
Mexicana ........................................................................................................................................... 32
6.2 Obtencin y purificacin de teliosporas a partir de tumores. ...................................................... 33
6.3 Germinacin de teliosporas a partir de tumores. ......................................................................... 34
6.4 Determinacin del tipo sexual de U. maydis in vitro .................................................................. 34
6.5 Diseo de oligonucletidos ..................................................................................................... 35
6.5.1 Obtencin de DNA genmico de U. maydis ........................................................................... 36
6.5.2 Amplificacin del locus b de U. maydis ............................................................................... 37
6.5.3 Purificacin del DNA............................................................................................................... 38
6.5.4 Preparacin de muestras para la determinacin de la secuencia nucleotdica.......................... 39
Pgina 4
6.5.5 Purificacin de Reaccin de Secuenciacin ............................................................................. 40

6.5.6 Anlisis Bioinformtico de las secuencias del locus b de U. maydis ....................................... 40
6.6 Tcnica AFLP ............................................................................................................................. 41
6.6.1 Anlisis de Datos AFLP ........................................................................................................... 42
VII. RESULTADOS ......................................................................................................................... 43
7.1 Muestreo y coleccin de aislados para la deteccin de variantes allicas de U. maydis ............. 43
7.2 Determinacin del tipo sexual de U. maydis mediante Reaccin Fuzz....................................... 46
7.3. Amplificacin del locus b por Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). .......................... 47
7.4 Anlisis Bioinformtico de las secuencias del locus b de U. maydis de la Repblica Mexicana.
........................................................................................................................................................... 48
7.5 Anlisis AFLP ............................................................................................................................. 62
VIII. DISCUSIN ............................................................................................................................ 70
IX. CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 75
X. RECOMENDACIONES .............................................................................................................. 77
XI. BIBLIOGRAFA ........................................................................................................................ 78
XII. GLOSARIO ............................................................................................................................... 81
XIII. ANEXOS.................................................................................................................................. 82
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NDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Oligonucletidos diseados empleados en los ensayos de amplificacin del locus b de U.

maydis por PCR. .......................................................................................................................................... 35
Cuadro 2. Condiciones de reaccin de la amplificacin del locus b de U. maydis..................................... 37
Cuadro 3. Componentes y cantidades empleadas en la reaccin de la amplificacin del locus b de
U. maydis ..................................................................................................................................................... 38
Cuadro 4. Condiciones de reaccin de la amplificacin del locus b de U. maydis para la
determinacin de la secuencia nucleotdica. ................................................................................................ 39
Cuadro 5. Estados de las diferentes regiones de la Repblica Mexicana muestreados para la
deteccin de variantes allicas de U. maydis. .............................................................................................. 44
Cuadro 6. Variantes alelicas encontradas en los diferentes estados y localidades de la Republica
Mexicana ......................................................................................................... Error! Marcador no definido.
Cuadro 7. Aislamientos de U. maydis sometidos al analisis AFLP. ............................................................ 50
Cuadro 8. Productos AFLP amplificados por combinacin en especmenes de U. maydis........................ 67
Cuadro 9. Anlisis de varianza Molecular de diferentes individuos de U. maydis colectados de
diferentes localidades y estados de la Repblica Mexicana ......................................................................... 68
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NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Enfermedad del huitlacoche en el maiz ............................. Error! Marcador no definido.

Figura 2. Etapas del Ciclo biologico de U. maydis, (1) inicia cuando dos celulas sexualmente
compatibles se aparean, (2) formacion de los tubos de conjugacion, (3) conjugacion de esporidias,
(4) formacion del dicarion que penetra e invade la planta(5) formacin de teliosporas, (6)
cariogamia, (7) germinacin de teliospora y formacin de promicelio, (8) promicelio constituido por
cuatro
basidioesporas.
Tomado
de
(Ruiz
y
Martinez,
1998).Error! Marcador no definido.
Figura 3. Interacciones entre dos loci de apareamiento durante el desarrollo de U. maydis. El locus a
bialelico codifica para una feromona y un receptor y el reconocimiento de estos desencadena la
fusion celular. Despues de la fusion, alelos diferentes del locus b inducen el desarrollo micelial y
patognico. Tomado de (Bolker, 2001)
Error! Marcador no definido.
Figura 4. Organizacion y estructura de los alelos a1 y a2 del locus a de U. maydis. ................ Error!
Marcador no definido.
Figura 5. Organizacion y estructura del locus b multialelico de U. maydis...... Error! Marcador no
definido.
Figura 6. Reaccion Fuzz.................................................................... Error! Marcador no definido.
Figura 7. Regiones donde existen diferentes razas del maiz ............. Error! Marcador no definido.
Figura 8. Localidades de la Republica Mexicana donde se colectaron tumores de U. maydis . Error!
Figura 9. Prueba de la reaccion Fuzz en placa. Las cepas que mostraron reaccion positiva se
observan macroscopicamente como una colonia micelial. ............................................................... 46
Figura 10. Morfologia colonial de una reaccion Fuzz positiva de cepas de U. maydis ............ Error!
Figura 11. Gel de agarosa al 0.8% mostrando productos de PCR correspondientes al gen bE de U.
maydis, tamao de fragmento esperado sealado con flecha............ Error! Marcador no definido.
Figura 12. Grafica que muestra la frecuencia de variantes alelicas distribuidas en la Republica
Mexicana. .......................................................................................... Error! Marcador no definido.
Figura 13. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Aguascalientes con base en la
secuencia nucleotidica del locus b de U. maydis .............................................................................. 54
Pgina 7
Figura 14. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Chiapas con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis. .............................................................................................. 54
Figura 15. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Guanajuato con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis ............................................... Error! Marcador no definido.
Figura 16. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Jalisco con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis ............................................................................................... 56
Figura 17. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Nuevo Leon con base en la secuencia
Figura 18. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Michoacan con base en la secuencia
Figura 19. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Oaxaca con base en la secuencia
Figura 20. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Nayarit con base en la secuencia
Figura 21. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Puebla con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis ............................................................................................... 59
Figura 22. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Queretaro con base en la secuencia
Figura 23. Dendrograma de las variantes alelicas presentes San Luis de Potosi con base en la
secuencia nucleotidica del locus b de U. maydis. ............................................................................. 60
Figura 24. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Tamaulipas con base en la secuencia
Figura 25. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Veracruz con base en la secuencia
Figura 26. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Zacatecas con base en la secuencia
Figura 27. Dendrograma de las relaciones geneticas de U. maydis con base en el metodo UPGMA
entre estados de la Republica Mexicana ........................................................................................... 69
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ABREVIATURAS
a1 = locus a1.
a2 = locus a2
a.a = Aminocidos.
AFLP = Siglas en ingls Polimorfismos en la Longitud de Fragmentos Amplificados.
AMOVA = Siglas en ingles Anlisis de Varianza Molecular.
bE = gen bE.
bW = gen bE.
C = Grado centgrado.
DNA = Acido desoxirribonucleico.
DNAc = Acido desoxirribonucleico complementario.
DNAg = Acido desoxirribonucleico genmico.
EAFs = Siglas en ingls Fragmentos de restriccin asociados a extremos.
EDTA = Etilen Diamino Tetra actico.
EFs = Siglas en ingls Fragmentos de restriccin en el extremo.
g = Gramos.
h = Hora.
HCL = Acido Clorhdrico.
HD = Homeodominio.
ID = ndice de Diversidad.
kb = Kilobases.
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L = Litros.
mg = Miligramo.
min = minuto.
ml = Mililitros.
mM = Milimolar.
NaCl = Cloruro de Sodio.
NCBI = Centro Nacional de Informacin sobre Biotecnologa.
pb = Pares de bases.
PCR = Siglas en ingls de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa.
PCR-RFLP = Siglas en ingls Reaccin en Cadena de la Polimerasa- Polimorfismos en
la Longitud de Fragmentos de Restriccin.
PDA = Agar Papa Dextrosa.
pH = Potencial Hidrogeno.
PK = Proteinasa K.
RAPDs = Siglas en ingls ADN Polimrfico Amplificado al Azar.
rpm = Revoluciones por minuto.
SDS = Dodecilslfato Sdico.
TBE = Tris Borato EDTA.
TE = Tris EDTA.
L= Microlitro.
UPGMA = Agrupamiento de Muestras no Ponderadas con Medias Aritmticas.
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RESUMEN
Ustilago maydis (DC) De Candole es un hongo, basidiomiceto, dimrfico,

patgeno, especfico del maz, y el teozintle, agente causal del "huitlacoche" o carbn
comn, cuyas caractersticas principales son el desarrollo de tumores en las partes areas de
la planta. El hongo necesita de la planta para completar su ciclo de vida. El apareamiento y
patognesis de U. maydis est controlado por dos locus (a y b), el locus a encargado del
apareamiento y consta de dos alelos, (a1 y a2), el locus b controla la patognesis y posee
25 alelos a la fecha conocidos. Mxico es el lugar de origen, domesticacin, y diversidad
gentica del maz y por la estrecha coevolucin que existe con el hongo en el presente
trabajo nos dimos a la tarea de estudiar molecularmente el patgeno proveniente de
diferentes localidades y estados de la Repblica Mexicana. El anlisis del locus b
multiallico, mediante secuenciacin automtica por electroforesis capilar identific en
total 11 variantes allicas (b1, b3, b7, b9, b13, b14, b15 b17, b18, b18a y b19), distribuidas
en todas las Regiones (Occidente, Altiplano Central, Centro, Maya, Oaxaca y Noreste)
siendo el alelo b7 el ms frecuente e identificado en todas las regiones mencionadas ; el
alelo b1 y b3 menos frecuentes, el primero identificado nicamente en el estado de hidalgo
perteneciente a la Regin del altiplano Central y el segundo identificado nicamente en
Nayarit perteneciente a la Regin Occidente. Con la tcnica AFLP, se evalu la diversidad
gentica de dicho hongo, el anlisis mostro un polimorfismo del 98% y el AMOVA indico
moderada diferenciacin gentica entre U.maydis. El anlisis de conglomerados con base
en datos AFLP indico que U. maydis es ampliamente diverso ya que no se observaron
agrupamientos bien definidos con base en las regiones mencionadas anteriormente. Los
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especmenes de U. maydis de Michoacn pertenecientes a la Regin Occidente fueron

genticamente distintos de la Regin Altiplano Central, Centro, Noreste y Maya.
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SUMMARY
Ustilago maydis (DC) De Candole is a mushroom, basidiomycete, dimorphic
pathogen-specific maize and teozintle, causal agent of "huitlacoche" or common coal,
whose main features are the development of tumors on aerial parts of the plant . The fungus
needs the plant to complete its life cycle. The mating and pathogenesis of U. maydis is
controlled by two loci (b) to charge the mating locus and has two alleles (a1 and a2), the
locus b controls the pathogenesis and has 25 alleles known to date. Mexico is the place of
origin, domestication and genetic diversity of maize and the close coevolution with fungus
that exists in the present work we took on the task of studying the molecular pathogen from
different localities and states of Mexico. The analysis of the multiallelic b locus by
automated sequencing by capillary electrophoresis identified a total of 11 allelic variants
(b1, b3, b7, b9, b13, b14, b15 b17, b18, b19 and B18A), distributed in all regions (West,
Central Highlands, Central, Maya, Oaxaca, and Northeast) being the most frequent allele b7
and identified in all the regions mentioned, the b1 and b3 allele less frequent, the first found
only in the state of gentleman belonging to the Central Highlands region and the latter
found only in Nayarit belonging to the Western Region. With the AFLP technique, we
assessed the genetic diversity of the fungus, the analysis showed a 98% polymorphism and
AMOVA indicated moderate genetic differentiation between U.maydis. Cluster analysis
based on AFLP data indicated that U. maydis is widely diverse and that there were no welldefined groupings based on the above regions. Specimens of U. maydis Michoacn
belonging to the Western Region were genetically different from the Central Plateau
Region, Central, Northeast and Maya.
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I. INTRODUCCIN
El huitlacoche (carbn comn) es una enfermedad especfica del maz (Zea mays) y
de su antecesor, el teozintle (Zea mays ssp parviglumis) (Ruz, 2008), caracterizada por la
formacin de tumores en los tejidos areos de la planta hospedera, causada por el hongo
Ustilago maydis. U. maydis es un patgeno, basidiomiceto y dimrfico, que durante su
ciclo de vida presenta dos formas; a) una forma unicelular (esporidia), la cual es haploide
uninucleada y presenta crecimiento saproftico; b) una forma filamentosa dicaritica, la
cul es parastica y patgenica (Banuett, 1995). El ciclo de vida de U. maydis est regulado
por el sistema de reconocimiento tetrapolar el cual consiste del loci de reconocimiento tipo
a y b. El locus biallico a codifica para un sistema feromona/receptor requerido para la
fusin de las esporidias. El locus multiallico b codifica para protenas con homeodominios
bE/bW, las cuales en combinaciones no allicas se dimerizan para formar un factor de
transcripcin activo crucial para el desarrollo patognico (Banuett, 1995).
Para determinar el tipo sexual del hongo se hace un anlisis in vitro conocido como
reaccin Fuzz. Es importante mencionar que mientras ms variantes allicas existan en el
locus b de U. maydis, aumentar el nmero de apareamientos, recombinacin y variabilidad
gentica, por lo tanto tambin aumentar la probabilidad de patognesis del hongo en la
planta. Mxico es el lugar de origen, domesticacin, mayor distribucin y diversidad
gentica del maz y por la estrecha coevolucin entre el hongo y la planta, se puede suponer
que en la Repblica Mexicana tambin existe la mayor variabilidad gentica de dicho
hongo, sin embargo; a la fecha existen muy pocos anlisis de variabilidad gentica por
ejemplo. (Valverde y col.,2000) mediante anlisis RFLP analizaron la diversidad gentica
de 32 especmenes de U. maydis pertenecientes a cinco estados diferentes de la Repblica
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Mexicana, trabajo en el cual reportan un alto grado de polimorfismo y una amplia

diversidad gentica de dicha especie, distribuida en todos los sitios analizados, tambin
(Saleh y col., 2006) realizaron anlisis de diversidad gentica de U. maydis en siete
diferentes localidades de Egipto y la diversidad gentica encontrada entre poblaciones fue
del (85.86%), y a la fecha no existe ningn anlisis del locus b. Es necesario tener un
conocimiento ms amplio para entender el apareamiento y patognesis en U. maydis. En
dicho hongo se han realizado pocos anlisis de variabilidad gentica entre los que se
incluyen tcnicas que utilizan enzimas de restriccin y marcadores moleculares de ADN
como son: Fragmentos de restriccin en el extremo (EFs), Fragmentos de restriccin
asociados a extremos (EAFs) (Snchez y col, 1996), y ADN polimrfico amplificado al
Azar (RAPDs). En cuanto a estudios del locus b solamente se han realizado anlisis del
tipo de polimorfismo en la longitud de fragmentos de restriccin por medio de reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR-RFLP) . Por lo anterior es necesario tener conocimiento ms
amplio para entender el apareamiento y patognesis en U. maydis, adems de estudiar la
variabilidad gentica y molecular del locus b del hongo, en aislados colectados de
diferentes zonas rurales de la Repblica Mexicana. En el presente trabajo se analiz la
diversidad gentica mediante Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de
amplificacin (AFLP), y el locus b de U. maydis se analiz mediante la secuenciacin de
sus bases nucleotdicas.
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II. ANTECEDENTES
2.1 Generalidades de Ustilago maydis.
Ustilago maydis (DC) De Candole es un hongo, patgeno, basidiomiceto,

dimrfico, que causa enfermedad en el cultivo de maz comnmente conocida como
huitlacoche carbn comn, que se caracteriza por inducir clorosis, necrosis,
hiperplasia e hipertrofia, causando el desarrollo de tumores en tallo, hojas, espigas y en los
granos de elote (Figura 1), (Agrios, 1998). En cuanto a su taxonoma U. maydis pertenece
al Reino: Fungi, Subreino: Eumycota, Phylum: Basidiomycota Clase: Basidiomicetes,
Subclase:
Heterobasidiomycetydae, Orden: Ustilaginales, Familia: Ustilaginaceae,
Gnero: Ustilago, Especie: maydis, (Holliday, 1974). Ustilago maydis presenta dos formas
de crecimiento, fuera de la planta es levaduriforme, saprfita, haploide no patognica, y
dentro de la planta es micelial, parastica, diploide y patognica, (Holliday, 1974). U.
maydis tiene dos tipos sexuales: el a y el b, determinados por las regiones que controlan el
apareamiento y la patognesis denominadas locus a y locus b.
2.1.1 Ciclo de vida
Cuando dos clulas sexualmente compatibles se encuentran cerca, se atraen

mediante feromonas y emiten tubos de conjugacin que se dirigen hacia la clula opuesta
en un ngulo que va de 30- 45, (Snetselaar y col, 1996), las clulas se fusionan y forman
un micelio dicaritico siendo ste la forma parastica del hongo. El micelio penetra a la
planta a travs de los estomas (Banuett y Herskowitz, 1996) por las partes areas de la
planta. Posteriormente invade los tejidos y estimula a las clulas de la planta para que se
dividan incontrolablemente, formando tumores que van desde 1cm hasta 30 cm de dimetro
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(Villanueva, 2007) reemplazando a los granos del maz. El tumor es una masa negruzca
cubierta por una membrana llamada peridio (Villanueva, 2007) y dentro de ste, se
encuentran millones de teliosporas que son liberadas al suelo o dispersadas por el viento a
grandes distancias cuando se rompe el tumor. Si las condiciones son favorables, la
teliospora germina y forma el promicelio o basidio, que produce basidiosporas de diferente
tipo de compatibilidad sexual y nuevamente comienza el ciclo de vida de U. maydis (Figura
2) (Banuett, 1992; Ruiz y Martnez 1998).
2.1.2 Control de apareamiento y patognesis

El apareamiento de U. maydis est controlado por el locus a biallico (a1 y a2) cada
alelo contiene los genes mfa y pra que codifican para una feromona y un receptor
respectivamente (Figura 3) (Banuett, 1995). Cuando se une la feromona con el receptor
opuesto de la clula opuesta desencadenan una seal que activa un factor de transcripcin,
y ste a su vez se une en la zona intergnica del locus b, que contienen los genes bW y bE,
los cuales codifican para protenas regulatorias que forman un heterodmero activo bE-bW,
y ste desencadena el crecimiento micelial, activando tambin diversos genes involucrados
en la patognesis, (Basse y Steinberg, 2004; Bolker, 2001; Romeis y Col., 1997).
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Figura 1. Enfermedad del huitlacoche en el maiz.

.
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Figura 2. Etapas del Ciclo bilogico de U. maydis, (1)inicia cuando dos clulas sexualmente compatibles
se aparean, (2)formacin de los tubos de conjugacin, (3) conjugacin de esporidias, (4)formacin del
dicarin que penetra e invade la planta, (5) formacin de teliosporas, (6) cariogamia, (7) germinacin
de teliospora y formacin de promicelio, (8) promicelio constituido por cuatro basidioesporas. Tomado
de (Ruiz y Martinez, 1998).
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Figura 3. Interacciones entre dos loci de apareamiento durante el desarrollo de U. maydis. El locus a
bialelico codifica para una feromona y un receptor y el reconocimiento de estos desencadena la fusin
celular. Despues de la fusin, alelos diferentes del locus b inducen el desarrollo micelial y patognico.
Tomado de (Bolker, 2001).
2.1.3 Organizacin y estructura del locus a y b
Los alelos a1 y a2 son disimilares, uno de 4.0 kb y el otro de 8.5 kb

respectivamente, cada alelo tiene el gen (mfa) que codifica para una feromona y el gen
(pra) que codifica para un receptor, el alelo a1 tiene los genes pra1 y mfa1, mientras que el
alelo a2 tiene los genes pra2 y mfa2 (Figura 4). El locus b consiste de 25 alelos mltiples
que controla el crecimiento filamentoso y la patogenicidad, (Banuett,1995). De acuerdo a
su estructura molecular, la organizacin del locus b, consta de dos genes divergentes, bE y
bW, ambos codifican para los polipptidos bE de 410 a.a y bW de 626 a.a, conteniendo un
motivo homeodominio (HD) (Figura 5). Los genes bE y bW no muestran una secuencia
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similar pero su organizacin es parecida, poseen una regin variable de 120 a.a en el
extremo amino terminal para el polipptido bE y una regin conservada en el extremo
carboxilo terminal, de igual manera el polipptido bW tiene una regin variable de 130 a.a
en el extremo amino terminal y una regin conservada en el extremo carboxilo terminal.
Entre ellos existe una regin intergnica aprox. De 260 pb (Banuett, 1992, Banuett, 1995).
Figura 4. Organizacin y estructura de los alelos a1 y a2 del locus a de U. maydis.
Figura 5. Organizacin y estructura del locus b multiallico de U. maydis.
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2.1.4 Anlisis sexual del apareamiento in vitro
Para determinar el tipo sexual del hongo se recurre a la reaccin Fuzz descrita por
(Banuett, 1995), consiste en colocar una gota de la suspensin celular (a1b1) de U. maydis
sobre una caja petri que contenga PDA con carbn activado al 1% esto con la finalidad de
dar contraste a las colonias crecidas, cuando se observa que la gota esta seca sobre esta
misma se coloca otra gota con la suspensin celular (a2b2), lo anterior se realiza con la
finalidad de aparear dichas clulas (Figura 6). La reaccin fuzz es positiva cuando
fenotpicamente se observa una colonia blanca con apariencia algodonosa, indicando que
las clulas confrontadas presentan alelos a y b diferentes. Por el contrario la reaccin Fuzz
es negativa cuando fenotpicamente se observa una colonia cremosa y brillante que nos
indica que las clulas confrontadas presentan los dos alelos idnticos.
Figura 6. Reaccin Fuzz.
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2.1.5 Variabilidad gentica
La variabilidad gentica se refiere a la variacin en el material gentico dentro y

entre poblaciones de organismos. La variacin surge por recombinacin y mutacin del
material hereditario, es un requisito necesario para que la especie evolucione y se adapte a
nuevas condiciones (Jimnez y Collada 2000). A partir de los aos sesenta las tcnicas
desarrolladas para estudiar la variacin a nivel molecular abrieron la posibilidad de estudiar
caracteres con un control gentico sencillo, como las diferencias de movilidad en protenas;
con el paso del tiempo ha sido posible estudiar la variacin en el ADN. Al estudiar la
variabilidad fenotpica se desconoca la variacin subyacente en el genoma, al cuantificar la
variacin molecular, ignoramos el efecto que tiene sobre el fenotipo, o por el contrario
puede ser nulo, pues a veces se estudian fragmentos de ADN que no codifican para ningn
carcter. Por lo tanto, existen dos tipos de variacin gentica: la primera es una diversidad
neutral, la cual no se ve afectada por la seleccin natural, y la segunda diversidad
corresponde a los caracteres con valor adaptativo. Para determinar la cantidad y
distribucin de la diversidad gentica en una especie se requiere el anlisis de ambos tipos
de variacin, pues la accin de distintos procesos evolutivos sobre cada tipo de caracteres
hace que los patrones de variacin no se correspondan entre s. La seleccin no acta de
igual modo en todas las partes del genoma, mientras que las tasas de migracin son iguales
para todos los genes, por lo que los marcadores neutrales no predicen necesariamente los
patrones de variacin de los rasgos sujetos a seleccin diferencial (Jimnez y Collada
2000).
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2.1.6 Uso de marcadores moleculares para estudiar variabilidad gentica
Los marcadores moleculares son biomolculas que se pueden relacionar con un

rasgo gentico. Las biomolculas que pueden ser marcadores moleculares son las protenas
(antgenos e isoenzimas) y el DNA (genes conocidos o fragmentos de secuencia y funcin
desconocida) (Claros ,2008). Un marcador molecular monomrfico es invariable en todos
los organismos estudiados, pero cuando presenta diferencias en el peso molecular, actividad
enzimtica, estructura, o sitios de restriccin, se dice que es polimrfico. Los marcadores
moleculares nos dan una estimacin de la diversidad gentica neutral. Existen diversos
tipos de tcnicas, que brindan distinto tipo de informacin dependiendo de las
caractersticas de la molcula o fragmento de la molcula analizado. Lo ms comn es la
deteccin de diferencias de tamao; a partir de las frecuencias con que aparecen cada una
de las distintas variantes (alelos) se calculan diversos parmetros que dan la medida de la
diversidad neutral y adems permiten comparar entre especies y/o estudios, (Jimnez y
Collada 2000). Los estudios con marcadores son relativamente baratos y ofrecen
rpidamente resultados, los grupos de marcadores se dividen en dos tipos: los que se basan
en el anlisis de protenas (anlisis isoenzimtico, polimorfismo posicional de pptidos), y
los que se basan en el anlisis del ADN. Las caractersticas de los marcadores moleculares,
frente a los proteicos: no se ven afectados por variaciones ambientales ni de desarrollo.
Permiten seleccionar regiones concretas dentro de la molcula de ADN para estudios
determinados, el nmero de polimorfismos detectables es tericamente ilimitado, permiten
analizar tanto la informacin que se expresa como la que no y en la actualidad se han
desarrollado un gran nmero de tcnicas adecuadas a diferentes situaciones.
Pgina 24
2.1.7 Marcadores moleculares AFLP

La tcnica polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP), por
sus siglas en ingls, es una tcnica molecular descrita por (Vos y col. 1995), que consiste en
una combinacin de las tecnologas de RFLP y PCR, basada en la amplificacin selectiva
mediante PCR, de fragmentos de restriccin obtenidos de DNA genmico total y DNAc
digerido con 2 enzimas. Es un mtodo altamente sensible para caracterizar el ADN sin
importar su origen ni complejidad, (Blears y col. 1998). La tcnica comprende tres etapas,
en la primera etapa se digiere el ADN con enzimas de restriccin diferentes, una de corte
frecuente (MseI) y una de corte poco frecuente (EcoRI). Despus, se ligan adaptadores
oligonucletidos que son especficos a los extremos de los fragmentos de ADN digeridos,
con el objetivo de ser la base para la amplificacin selectiva. Posteriormente, se amplifican
subconjuntos especficos de los productos de digestin, utilizando combinaciones de
oligonucletidos selectivos, y por ltimo el polimorfismo se detecta empleando
radioistopos, tincin de plata, colorantes fluorescentes y fluorforos. En cuanto a las
reacciones de PCR, se realiza una primera PCR preselectiva, utilizando oligonucletidos
que son complementarios al adaptador y a los sitios de restriccin. Luego se aade un
nucletido para seleccionar un subconjunto de fragmentos. Los productos de la
amplificacin preselectiva son sometidos a otra PCR con la finalidad de seleccionar un
subconjunto de fragmentos, cabe mencionar que en la segunda amplificacin selectiva se
aaden otros dos nucletidos y finalmente los productos amplificados son separados por
medio de electroforesis en geles de poliacrilamida. Las ventajas que ofrecen los AFLP
comparado con otras tcnicas es que permiten explorar rpidamente los polimorfismos del
genoma entero, como generan un gran nmero de bandas, cada marcador da una huella
Pgina 25
identificadora de ADN que es sumamente informativa, (Blears y col. 1998., Bensch y

Akesson 2005). Adems son altamente reproducibles y no es necesaria la informacin
previa de las secuencias ni hay que generar sondas de hibridacin. Los AFLP se pueden
aplicar para evaluar la diversidad gentica, construccin de mapas genticos, clonacin
posicional de genes (Bensch y Akesson 2005), identificacin y caracterizacin de hongos y
bacterias, (Blears y col. 1998), es muy til en anlisis de paternidad y estudios de flujo
gentico, anlisis de filogenia, y en anlisis de distancia gentica. (Jimnez y Collada
2000).
2.1.8 Anlisis de variabilidad gentica en U. maydis

A la fecha se han realizado pocos anlisis de variabilidad gentica en U. maydis, por
ejemplo en siete localidades de Egipto se obtuvieron ocho diferentes tipos de locus b, con
aproximadamente frecuencias iguales, siendo los alelos b1, b3 y b8 los ms frecuentes. La
diversidad total calculada de todas las poblaciones fue de un 85.86% y el promedio dentro
de las poblaciones fue de un 82.79 % y la diversidad de genes entre poblaciones fue de 3.07
indicando que la mayora de la diversidad gnica ocurri en una escala espacial pequea.
(Saleh y col. 2006). En 10 muestras de U. maydis, de cuatro regiones geogrficas de Egipto
con diferentes tipos de apareamiento por medio de RAPD se generaron 40 bandas de ADN
en un rango de 150-2500 pb de las cuales 27 fueron polimrficas (67.50%) con un
promedio de 8 bandas por iniciador. Por lo tanto estos resultados indicaron que no hay
relacin entre los RAPD y los sitios geogrficos de donde se colectaron las muestras (Saleh
y col. 2006). Otro de los anlisis de variabilidad gentica en U. maydis, usando sondas
derivadas de secuencias telomricas, se realizaron en cuatro grupos de diferentes reas
geogrficas de Mxico, para identificar patrones de huella gentica discriminativos,
Pgina 26
mediante anlisis de fragmentos de restriccin en el extremo (EFs) y fragmentos de

restriccin asociados a extremos (EAFs) de los cromosomas. La mayora de los EFs en dos
grupos de cepas mostr una longitud similar y los otros dos grupos se distribuyeron en
longitudes de diferentes clases, y en el caso de los EAFs, permitieron predecir patrones de
huella gentica para cada grupo de cepas, basados en la ocurrencia de bandas amplificadas.
(Snchez y col, 1996). Por otro lado (Valverde y col.,2000) mediante anlisis RFLP
analizaron la diversidad gentica de 32 especmenes de U. maydis pertenecientes a cinco
estados diferentes de la Repblica Mexicana trabajo en el cual reportan un alto grado de
polimorfismo y una amplia diversidad gentica de dicha especie, distribuida en todos los
sitios analizados.
2.1.9 Anlisis moleculares realizados en el locus b en U. maydis
Tambin a la fecha existen muy pocos anlisis moleculares en el locus b de U.

maydis, por ejemplo, en cuatro localidades de Minnesota se realizaron anlisis de los
niveles de diversidad poblacional en U. maydis del locus b de apareamiento, combinando
anlisis de apareamiento en placa y polimorfismo en la longitud de fragmentos de
restriccin (RFLP) y por PCR se demostraron altos niveles de diversidad del locus b dentro
de poblaciones, con un rendimiento poblacional de 17, de un total de 18 tipos b; los valores
Pairwise Gst fueron de 0.02 a 0.05, encontrndose los tipos de apareamiento comn en
distancias geogrficas amplias. Estos resultados demostraron que hay muy bajos niveles de
diferenciacin entre poblaciones de U. maydis con respecto a la variacin del locus b
(Zambino y col.1997). Los tipos b de apareamiento fueron representados en
Pgina 27
aproximadamente frecuencias iguales dentro de todas las poblaciones de Minnesota

(Zambino y col.1997).
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III. JUSTIFICACIN
Mxico es el lugar de origen y domesticacin del maz (Zea mays), en el que existe
la mayor diversidad gentica de esta planta, adems es importante mencionar que el maz se
cultiva en casi toda la Repblica Mexicana. U. maydis es el hongo que produce la
enfermedad del huitlacoche nicamente en el maz y teocintle para poder concluir su ciclo
de vida. Por lo tanto entre husped-hospedero existe una estrecha coevolucin. Con
respecto a lo anterior, es de esperarse que tambin en U. maydis exista una amplia
diversidad gentica. Se sabe que el locus b del hongo presenta a la fecha 25 variantes
allicas, adems es el encargado de controlar la patognesis y desencadenar la enfermedad
en la planta del maz; por lo anterior es posible que existan mas variantes allicas y como
consecuencia de esto aumenta la recombinacin sexual y gentica, aumentando la
probabilidad de que el hongo cause la enfermedad en el maz. A la fecha, en Mxico no hay
suficientes reportes de estudios de diversidad gentica y tampoco en el locus b de
apareamiento de U. maydis. realizar estudios en el locus b de U. maydis permitir conocer
la distribucin de la variantes allicas en la Repblica Mexicana, los estudios anteriores
permitirn complementar el conocimiento sobre los mecanismos de apareamiento y
patognesis del hongo, para que en un futuro puedan servir de base y buscar mejores
alternativas para disminuir la probabilidad de patognesis en el cultivo del maz o por el
contrario aumentar la patognesis, ya que el huitlacoche constituye una ganancia para el
agricultor, ya que para muchos agricultores una mazorca infectada tiene un valor de
mercado varias veces mas alto que el de una sana. Cabe destacar que Instituciones
Mexicanas han puesto un inters especial por la biodiversidad de especies mexicanas, y U.
maydis es una especie de la que casi no se conoce nada.
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IV. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Determinar la diversidad gentica de U. maydis e identificar sus variantes allicas
en el locus b de aislamientos de la Repblica Mexicana.
4.2 Objetivos especficos

Identificar las variantes allicas del locus b de U. maydis presentes en aislamientos
de Repblica Mexicana
Analizar genticamente aislamientos de U. maydis de la Repblica Mexicana.
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V. HIPTESIS
Existe diferenciacin gentica significativa entre aislamientos de U. maydis de la
Repblica Mexicana.
Existen variantes allicas en el locus b de aislamientos de U.maydis de la Repblica

Mexicana.
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VI. MATERIALES Y MTODOS

6.1 Obtencin de tumores de U. maydis en diferentes Regiones y localidades de la
Repblica Mexicana
Se realizaron colectas de tumores a pie de carretera, presentes en cultivos de maz

de zonas rurales de la Repblica Mexicana, con base en las regiones donde existen
diferentes razas de maz, dichas regiones son: Occidente, Altiplano central, Centro, Maya y
Oaxaca (Muoz, 2005); otra regin que se incluy en el presente trabajo fue el noreste
(Figura 7 y 8). Los tumores se cortaron cuidadosamente con la mano y se guardaron en
bolsas de papel destrasa (previamente rotuladas) con el objetivo de mantenerlos secos y
fueron trasladados al laboratorio, donde se almacenaron a -70 C hasta su procesamiento.
Figura 7. Regiones donde existen diferentes razas del maz.
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Figura 8. Localidades de la Repblica Mexicana donde se colectaron tumores de U. maydis.
6.2 Obtencin y purificacin de teliosporas a partir de tumores.

Los tumores colectados, fueron macerados en un mortero con agua destilada estril
para liberar las teliosporas, se filtraron y colectaron en tubos Falcon de 50 ml,
posteriormente se trataron con una solucin de sulfato de cobre al 0.5% durante una hora en
agitacin constante, para eliminar clulas vegetales y contaminantes (Holliday, 1974) se
elimin la solucin de sulfato de cobre por centrifugacin durante 5 min a 3500 rpm,
despus se les aadi 2.5 mL de una solucin de antibiticos (0.5g/L de ampicilina, 0.5g/L
kanamicina, 0.5g/L estreptomicina y 0.4g/L gentamicina), finalmente las teliosporas se
almacenaron a 4 C.
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6.3 Germinacin de teliosporas a partir de tumores.
Se tom una alcuota de la solucin de teliosporas y se coloc en un portaobjetos

para observar al microscopio que dichas esporas estuvieran
libres de bacterias y
contaminantes vegetales, despus de la solucin de teliosporas se tomaron 25 l de la

dilucin 10-1 para ponerlas a germinar en Agar Papa Dextrosa y finalmente se incubaron a
30C durante 24 h.
6.4 Determinacin del tipo sexual de U. maydis in vitro
De cada tumor se germinaron y aislaron tres colonias, a las que llamamos A, B y C

y en una caja Petri con medio compuesto de 4% de dextrosa, 4% peptona, 2% de extracto
de levadura, 1% de carbn activado, 2.7% de agar y 100 mL de agua destilada (Holliday
y 1974); se cofrontaron entre s, la presencia de una colonia blanca con aspecto algodonoso
indic crecimiento micelial del hongo y por lo tanto la Reacin Fuzz se consider positiva
esto indic que esa colonia presentaba alelos a y b diferentes, la cepa FB2 se us como
control negativo.(Banuett, 1995).
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6.5 Diseo de oligonucletidos
Con base en el alineamiento de las secuencias parciales de los alelos b disponibles

en la base de datos del Centro Nacional de Informacin Biotecnolgica (NCBI)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), realizado con el Software Seqman del paquete (DNAstar
versin 6), se disearn oligonucletidos (Cuadro 1) de zonas cien por ciento idnticas de
los genes bE y bW del locus b de U. maydis.
Cuadro 1. Oligonucletidos diseados en zonas invariables del locus b de U. maydis.
Nombre
Tm (C)
Secuencia de 5 a 3
bE1484S
CATAGCGTGAGCTGATGAAC
60.4
bE1946S
CTCGTTGAGGCACTCCAAG
62.32
bE1965R
CTTGGAGTGCCTCAACGAG
62.32
bW3480R
CCGCTCGACTCTGACGAC
64.46
bW3174R
CTTCTTCCCTTTCCGGTTAC
60.4
bW2719R
GTGTCCACGACCAGTCTTG
62.32
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6.5.1 Obtencin de DNA genmico de U. maydis
Se us el mtodo modificado de Hoffman y Wriston (1987). Se inocul una asada

de una colonia fresca del hongo en 10 mL de medio rico, y se incub durante 16-18 h en
agitacin constante y con buena aeracin. Luego el cultivo se centrifug para obtener una
masa celular, la cual se lav con 0.5 mL de agua estril, posteriormente se transfiri a un
tubo eppendorf, luego se centrifug por 30 s y se descart el sobrenadante. Las clulas se
resuspendieron en 0.2 mL de solucin de lisis (tritn X-100, 2%; SDS, 1%; NaCl, 0.1M;
Tris-HCL pH8, 10mM y EDTA, 1mM, despus se aadi 0.2 mL de fenol-cloroformo (1:1)
y 0.3 g de perlas de vidrio de 0.45 mm de dimetro. El tubo se agit en un agitador tipo
vortex por 1 min., y se dej reposar en hielo durante 1 min (este paso se repiti 3 veces),
despus se aadieron 0.2 mL de TE 10:1 (Tris 10 mM y EDTA 1mM) y se centrifug
durante 10 min a 12000 rpm. Posteriormente la fase acuosa se transfiri a un tubo nuevo y
se aadieron 30 g de RNAsa de 10 mg mL-1 Luego de una incubacin de 5 min a 37 C, se
agregaron 10 L de acetato de amonio 4M y 1 mL de etanol al 100%. El tubo se mezcl
por inversin y se dej reposar 15 min. a -20 C. Se centrifug por 5 min a 12000 rpm y se
lav el precipitado con 100 L de etanol al 70%. Despus el sobrenadante se elimin y el
precipitado se sec durante 1-2 min a una temperatura de 55 C. Finalmente el DNA
obtenido se resuspendi en 50 l de TE 10:1 y se guard a -20 C hasta su uso.(Figura 12).
Pgina 36
6.5.2 Amplificacin del locus b de U. maydis
El locus b fue amplificado en un termociclador Applied Biosystems modelo 9800

Fast, y se usaron aproximadamente 100 ng de DNA genmico con los oligonucletidos 5'
1484CATAGCGTGAGCTGATGAAC 3' (sentido) para el gen bE y 3' 3480
CCGCTCGACTCTGACGAC 5' (antisentido) para el gen bW a una concentracin de 1.5
g L-1. Los deoxinucletidos (dNTPs) se usaron a una concentracin de 10 mM, 1.5 L
de Cloruro de Magnesio a 50 mM, 5 L de buffer 10X y 0.5 U de enzima Taq DNA
polimerasa (Invitrogen) en un volumen final de 50 L. Las condiciones, componentes y
cantidades empleadas para la amplificacin del locus b se describen en el (Cuadro 2 y 3 ).
Cuadro 2. Condiciones de reaccin de la amplificacin del locus b de U. maydis
Condiciones
Tiempo
T(C)
Ciclos
TC
3 min
94
desnaturalizacin
1 min
94
TC alineamiento
1 min
56
TC extensin
2 min
72
TC mantenimiento
30
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Cuadro 3. Componentes y cantidades empleadas en la reaccin de la amplificacin del locus b de U.

maydis.
Componente
Volumen
DNAg
Oligo bE1484S
bW2719R
MgCL
Buffer
dNTP's
Agua MQ
Enzima Taq
1L
1L
1L
1.5L
5 L
1L
39 L
0.5 L
Concentracin
100ng
500 ng/L
500 ng/L
50mM
10X
10 mM
5U/L
6.5.3 Purificacin del DNA
La purificacin de los productos amplificados por PCR del locus b de U. maydis se

llev a cabo con el estuche comecial Wizard SV and PCR Clean-up System de la marca
Promega, y consisti en que una vez obtenidas las bandas de DNA en el gel de agarosa por
electroforesis, fueron cortadas cada una cuidadosamente con un bistur, y despus se
colocaron en un tubo eppendorff de 1.5 mL. posteriormente se aadieron 250 L de la
solucin de unin a la membrana, se di un vortex por 5 seg y despus se incubaron en el
termomixer a 65C hasta observar que la agarosa se disolvi completamente, despus esta
disolucin fue aadida cuidadosamente sobre la minicolumna y luego se centrifug a
13,000 rpm durante 1min, posteriormente se desech el filtrado y se aadieron 700 L de la
solucin de lavado de la membrana, nuevamente se centrifug a 16,000 rpm durante 1 min
y el filtrado se desech, enseguida se aadieron 500 L de la solucin de lavado de la
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membrana y se volvi a centrifugar a 16,000 rpm durante 1 min, luego cuidadosamente la

minicolumna se transfiri a un tubo eppendorf nuevo y finalmente el ADN obtenido se
resuspendi en 40 l de TE 10:1y se guard a -20 C hasta su uso. (Figura 13).
6.5.4 Preparacin de muestras para la determinacin de la secuencia nucleotdica
Para determinar la secuencia nucleotdica del locus b de U. maydis, se llev a cabo

una amplificacin por PCR en un termociclador BIORAD modelo i cycler, usando 5 L
de ADN como templado a una concentracin de
50 ng, oligonucletidos a una
concentracin de 5 M, 4L de buffer Big Dye v3.1, 5X, 6 L de agua milli Q estril, 4L

de buffer Big Dye v3.1 Ready mix, en un volumen final de 20 L. Las condiciones en que
se llevaron a cabo las amplificaciones se muestran en el (Cuadro 4).
Cuadro 4. Condiciones de reaccin de la amplificacin del locus b de U. maydis para la determinacin de
la secuencia nucleotdica.
Condiciones
Desnaturalizacin
Desnaturalizacin
Alineamiento
Alineamiento
T C mantenimiento (tiempo
indefinido)
Tiempo
1 min
10 seg
5 seg
4 min
-
T(C)
96
96
50
60
4
Ciclos
25
25
-
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6.5.5 Purificacin de Reaccin de Secuenciacin
Para la purificacin de la reaccin de secuenciacin se utiliz el kit Bigdye

Xterminator Purification, de la reaccin de secuenciacin se tomaron 10 L y se
depositaron en un tubo junto con 45 L de solucin SAM, despus se agit vigorosamente
hasta observar una mezcla homognea, luego al mismo tubo se le aadieron 10 L de
solucin Xterminador, posteriormente el tubo se agit fuertemente a una temperatura de 25
C a 1400 rpm por 30 min y despus de una centrifugacin de 2 min a 12000 rpm, el
sobrenadante fue separado, y de ste se colocaron 10 L en la placa del secuenciador
automtico ABI 3130, mediante electroforesis capilar.
6.5.6 Anlisis Bioinformtico de las secuencias del locus b de U. maydis
Para el anlisis de las secuencias nucleotdicas del locus b de U. maydis se utiliz el

programa computacional Chromas Lite. En internet se utilizaron las herramientas de la base
de
datos
del
Centro
Nacional
de
Informacin
Biotecnolgica
(NCBI)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). La regin analizada comprende parte del gen bW y del gen

bE (Anexo), ambos genes incluyeron la regin variable y el homeodominio, as como la
regin intergnica, el tamao de las secuencias analizadas fue de 600 pb, y finalmente las
secuencias fueron comparadas con la base de datos blast en el NCBI.
Pgina 40
6.6 Tcnica AFLP

El ADNg total se digiri con dos enzimas de restriccin (MseI y PstI) que se ligaron
a los adaptadores. Posteriormente, se realizaron dos amplificaciones selectivas mediante
PCR utilizando oligonucletidos que contienen secuencias comunes a los adaptadores y de
uno a dos nucletidos arbitrarios sern secuencias selectivas. El total de bandas
polimrficas obtenidas de la reaccin se determin por la especificidad con los iniciadores
de las endonucleasas de restriccin usadas para digerir el DNA genmico, el nmero y la
opcin para la eleccin de iniciadores selectivos en el extremo 3' de los iniciadores de las
enzimas de restriccin as como el tamao y complejidad del ADN. El ADNg del hongo fue
digerido con las enzimas Mse I y Pst I a 37C por 2 h, despus se calent 70 C durante 15
min con la finalidad de inactivar las enzimas. Posteriormente los fragmentos se ligaron a
los adaptadores Mse I y Pst I durante 2h a 20 C. Una vez concluida la reaccin, la muestra
de ligacin fue diluida con agua estril y se llev a cabo la pre-amplificacin por 20 ciclos
en la PCR. La amplificacin preselectiva y selectiva se llev a cabo como lo describen
Vos y col. (1995). Los fragmentos amplificados fueron separados mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida al 6.5 % con un precorrimiento en un sistema de secuenciacin
semiautomtica IRD (modelo 4200-029; Li-cor ; Lincoln, NE, EUA) con amortiguador
TBE 1X por 30 min a 2000 V y la separacin de los fragmentos fue por 3 h al mismo
voltaje.Los datos AFLP de las muestras marcadas con el fluorforo IRDye 800 se
obtuvieron del equipo en tiempo real.
Pgina 41
6.6.1 Anlisis de Datos AFLP

Los cuatro geles se analizaron y las bandas polimrficas y monomrficas se
registraron. Se asumi que las bandas de un mismo peso molecular en diferentes individuos
son idnticas. La presencia de una banda fue indicada por un uno (1) y la ausencia como
cero (0); una vez obtenida la matriz binaria se construy una matriz de distancias genticas
empleadas para construir un dendrograma con el algoritmo UPGMA (Mtodo de
Agrupamiento de pares no Ponderados con Medias Aritmticas; Avise, 1994);
dicho
anlisis se llevo a cabo con el software Statistica versin 7 ( StatSoft, 2004); Luego se
realiz un anlisis de varianza molecular (AMOVA) con el paquete estadstico Info-gen/P
(Balzarini y Di Rienzo., 2004) para determinar si hay diferencias estadsticas entre y dentro
de las cepas de U. maydis de los diferentes aislados de la Repblica. El ndice de diversidad
gentica fu calculado como ID = 1 pi2, donde pi es la frecuencia del alelo in; en este
caso cada alelo individual se considera locus nico y a su vez un fragmento de
amplificacin (Powell y col.1996).
Pgina 42
VII. RESULTADOS
7.1 Muestreo y coleccin de aislados para la deteccin de variantes allicas de U.
maydis
Los estados de la Repblica Mexicana muestreados para identificar las variantes

allicas fueron 16 (Tamaulipas, Nuevo
len, Hidalgo, Chiapas, Veracruz, Puebla,
Guanajuato, Oaxaca, Tlaxcala, Zacatecas, Nayarit, Jalisco, San Luis Potos, Michoacn,
Quertaro y Aguascalientes) dicho muestreo se realiz con base en las zonas de mayor
produccin y diversidad de las razas del maz, que se dividen en cuatro (Occidente,
Vertiente del golfo, Altiplano central y Oaxaca); incluyendo tambin dos estados del norte
de la Repblica Mexicana (Tamaulipas y Nuevo Len). Es importante resaltar que en los
estados de Jalisco, Guanajuato, Hidalgo, Zacatecas y Puebla se analizaron un mayor
nmero de muestras, debido a que el centro de la Repblica Mexicana es el origen, mayor
domesticacin, diversidad, y recombinacin del maz y por la estrecha coevolucin que
tiene con U. maydis, asumimos que tambin encontraramos la mayor diversidad de
variantes allicas. (Cuadro 5).
Pgina 43
Cuadro 5. Estados de las diferentes regiones de la Repblica Mexicana muestreados para la deteccin
de variantes allicas de U. maydis.
Regiones
Estados
Occidente
Nayarit
Jalisco
Michoacn
Altiplano
Central
Hidalgo
Zacatecas
Puebla
Regin
Centro
Localidad
es
2
13
Localidades
Variantes allicas
Los balastros
Jala
Ixtln del
Rio
Autln de
Jalisco
jurez
El grullo
b3, b18
Unin de
tula
San Agustn
b15
El banco
b14, b15
La paz
Cihuatln
Cocula
b9
El saucillo
b15, b13
Palo chino
b15,18a, b7
Magdalena
b15
Los cuartos
b17, b9
Tequila
b7
Villa
Hidalgo
Querndaro
b7, b19
Charo
b18
Jess Mara
b7
Morelia
b7
Progreso
Mixquihuala
Teocalco
Cruz Azul
Juchipila
b19,b19,b7,b7,b7,b7,b7,b7,b1,b15,b18,b18,b18,
Felipe
Angeles
San Luis de
Costique
Villanueva
b7, b14
Jalpa
b9, b7, b18, b17, b19
Moyahua
b17, b17, b7
Quetzalapa
b13, b15
Sebastian
Zinacatepec
Cuesta
Blanca
Esperanza
b15, b15, b15, b15, b15, b17, b18
b18, b17, b17, b17, b7
Tlaxcala
Ciudad
Serdn
Huamantla
Quertaro
Cadereyta
Guanajuato
Camarco
San Luis de
la Paz
b13, b13, b7
b19, b19, b15
b18
b7
b9
b7, b9, b15
14, 14, 14, 7,7, 7, 7,7, 13, 13, 13, 17, 17, 18, 18
b7, b17
b7, b18a, b18
b14
b15, b19, b19
b19, b15
b13, b7
b15, b15, b7, b7, b7, b7, b7, b14, b14, b14, b14,
b18, b17, b17
b7, b14
b19, b18
b14, b9, b13, b14, b14, b7
Pgina 44
Regin Maya
Noreste
Oaxaca
Aguascalie
ntes
Chiapas
Nuevo
Len
Tamaulipas
1
3
1
3
San Luis
Potos
Oaxaca
Irapuato
b18, b18, b7
Tomelpez
b14, b18
Temporales
Victoria
Hacienda de
Higueras
Victoria
Milpillas
b17, b15, b15, b18, b18, b18a
Dolores
Hidalgo
La cuevita
b7
Victoria
carretera
Juventino
Rosas
Apozotln
b14
Chichilca
municipio de
Comitan
Riviera de la
Victoria
Rincn
Chamula
San cayetno
de vacas
San
Lorencito
Rancho
Nuevo
Reynosa
b17, b17, b7, b7, b7, b7, b7, b7, b7, b7, b13,
b13, b13, b13, b13, b13, b19, b19,
Entronque
Real de
catorce
Unin
b18
b18, b18
b9
b7, b17, b7
b17, b17
b7
b13, b17, b17, b18, b14
b7, b17
7
b14, b7, b7
b15, 1b9
b17, b7
Zapata
Santiago
b7
Tilantongo
Pgina 45
7.2 Determinacin del tipo sexual de U. maydis mediante Reaccin Fuzz.

La tcnica in vitro para detectar el tipo sexual del hongo consisti en la observacin
y comparacin macroscpica y microscpica de las cepas de U. maydis cultivadas que
fueron confrontadas en medio completo con carbn activado, el crecimiento de una colonia
blanca con aspecto algodonoso
(Figura 9) nos indic que las cepas confrontadas se
aparearon y por lo tanto presentaron alelos a y b diferentes y se considera una Reaccin

Fuzz positiva (Cuadro 6), el crecimiento de una colonia blanca brillante con aspecto
cremoso se consider una Reaccin Fuzz negativa. La confirmacin de una Reaccin Fuzz
positiva consisti en la observacin del crecimiento micelial en microscopio (Figura 10); la
cepa FB2 se utiliz como control negativo.
Figura 9. Prueba de la reaccin Fuzz en placa. Las cepas que mostraron reaccin positiva se observan
macroscpicamente como una colonia micelial.
.
Pgina 46
Figura 10. Morfologia colonial de una reaccin Fuzz positiva de cepas de U. maydis.
7.3. Amplificacin del locus b por Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
Figura 11. Gel de agarosa al 0.8% mostrando productos de PCR correspondiente al gen bE de U.
maydis, tamao de fragmento esperado sealado con flecha.
Pgina 47
7.4 Anlisis Bioinformtico de las secuencias del locus b de U. maydis de la Repblica

Mexicana.
Los criterios considerados para analizar las secuencias nucleotdicas del locus b de
U. maydis fueron que presentaran un alto porcentaje de cobertura e identidad que vari del
90 al 100% y posteriormente fueron comparadas con la base de datos del NCBI. Es
importante mencionar que a la fecha existen 25 variantes allicas reportadas (b1, b2, b3, b4,
b5, b6, b7, b19, b14, b12, b18, b18a, b9, b15, b10a, b16, b11, b10, b8, b4a, b4b, b13, b6a,
b6b, b6c), y en nuestro trabajo de las 25 variantes allicas reportadas encontramos 11
(b7,b14, b15, b19, b18, b1, b17, b13, b9, b18a, y b3), distribuidas en diferentes localidades
y estados de la Repblica mexicana, vase (cuadro) En total se encontraron 52 alelos b7,
este fue el ms frecuente y corresponde al 30.4%, el segundo alelo con mayor frecuencia
fue el b18 y corresponde al 14%, el tercer alelo con mayor frecuencia fue el b15 y
corresponde al 12.2%; el alelo b17 corresponde al 10.5%; el alelo b13 corresponde al 9.9%;
el alelo b14 corresponde al 9.3%; el alelo b19 corresponde al 7.6%; el alelo b9 corresponde
al 4%; y los alelos con menor frecuencia fueron el b18a, b3y b1, cada uno corresponde al
0.5% del total de las secuencias analizadas, vase (figura 12). Ver (Figura 13, 14, 15,16,17,
18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26).
Pgina 48
Figura 12. Grfica que muestra la frecuencia de variantes allicas distribuidas en la Repblica
Mexicana.
Pgina 49
Cuadro 6. Variantes alelicas encontradas en los diferentes estados y localidades de la Repblica

Mexicana.
Muestra
(nomenclatura)
Variante
alelica
Cobertura
Identidad
(%)
Coordenadas
Tumor3/cepa13
Tumor7/cepa4
Tumor6/cepa1
Tumor11/cepa1
Tumor11/cepa1
Tumor9/cepa16
Tumor2/cepa3
Tumor8/cepa14
Tumor1/cepa3
Tumor12/cepa2
Tumor1/cepa2
Tumor4/cepa2
Tumor1/cepa4
Tumor 12/cepa2
Tumor 2/cepa2
Tumor 4/cepa 3
Tumor 5/cepa 16
Tumor16/cepa3
Tumor18/cepa3
Tumor17/cepa3
Tumor6/cepa12
Tumor15/cepa2
tumor4/cepa3
Tumor 5/cepa 16
Tumor16/cepa3
Tumor18/cepa3
Tumor17/cepa3
Tumor6/cepa12
Tumor15/cepa2
Tumor4/cepa3
Tumor 13/cepa1
Tumor 3/cepa12
Tumor 4 /cepa5
Tumor14/cepa11
Tumor3/cepa13
Tumor6/cepa12
Tumor1/cepa3
Tumor1/cepa1
Tumor21/cepa1
Tumor23/cepa3
Tumor9/cepa13
Tumor7/cepa7
Tumor22/cepa13
Tumor11/cepa14
Tumor20/cepa3
Tumor18/cepa10
Tumor1/cepa3
Tumor14/cepa3
b19
b7
b1
b15
b7
b18
b7
b18
b7
b18
b7
b19
b7
b14
b13
b7
b13
b13
b14
b13
b17
b18
b7
b13
b13
b14
b13
b17
b18
b7
b7
b14
b17
b7
b7
b18
b7
b17
b7
b17
b7
b7
b7
b7
b13
b19
b13
b7
99
100
85
95
98
100
99
100
98
100
99
99
94
99
99
99
100
100
90
98
99
100
89
100
100
90
98
99
100
89
99
90
99
99
99
99
90
99
87
80
96
100
100
99
100
100
97
100
98
98
97
96
98
99
94
94
99
99
98
97
97
97
97
98
91
94
93
97
89
98
98
91
94
93
97
89
98
98
86
99
89
98
97
99
98
97
86
93
97
99
98
98
100
98
91
99
Lat 20 1331 N
Lon 99 10 42 W
Lat 20 5 38 N
Lon 99 17 27 W
Lat 19 59 26 N
Lon 99 20 44 W
Lat 16 14 49 N
Lon 92 5 46 W
Pgina 50
Tumor23/cepa15
Tumor5/cepa9
Tumor8/cepa5
Tumor17/cepa7
Tumor2/cepa2
Tumor23/cepa2
Tumor9/cepa2
Tumor1/cepa9
Tumor1cepa1
Tumor1cepa1
b13
b19
b13
b7
b13
b17
b13
b7
b7
b7
100
98
100
97
100
100
92
99
100
100
97
98
98
97
98
98
98
99
96
96
Tumor3/cepa9
Tumor4/cepa10
Tumor1/cepa11
Tumor1/cepa2
Tumor3/cepa7
Tumor 1/cepa2
Tumor1/cepa3
Tumor1/cepa2
Tumor1/cepa1
Tumor8/cepa1
Tumor5/cepa2
Tumor3/cepa2
Tumor1/cepa1
Tumor6/cepa3
Tumor 4/cepa3
Tumor 2/cepa3
Tumor2/cepa2
Tumor2/cepa2
Tumor1/ cepa1
Tumor1/ cepa1
Tumor1/ cepa 2
Tumor1/cepa1
Tumor3/cepa1
Tumor1/cepa3
Tumor 4/cepa1
Tumor4/cepa2
Tumor2/cepa10
Tumor5/cepa7
Tumor1/cepa13
Tumor4/cepa6
Tumor3/cepa9
Tumor5/cepa14
Tumor2/cepa2
Tumor3/cepa1
Tumor3/cepa3
Tumor2/cepa1
Tumor1/cepa3
Tumor7/cepa2
Tumor2/cepa1
Tumor6/cepa3
Tumor4/cepa2
Tumor8/cepa1
b13
b17
b18
b14
b17
b7
b13
b15
b15
b15
b15
b15
b17
b15
b18
b15
b19
b19
b15
b13
b7
b18
b17
b17
b7
b17
b14
b9
b13
b14
b14
b7
b18
b18
b7
b14
b18
b17
b18
b15
b15
b18
100
99
100
99
100
94
90
99
100
97
100
99
100
98
98
99
100
100
96
100
98
96
99
99
100
99
100
92
100
100
93
94
100
99
100
91
99
99
100
100
100
100
98
88
97
90
88
97
97
100
99
85
99
99
99
98
91
99
99
99
96
99
97
93
91
93
95
99
98
89
99
99
96
97
99
99
94
90
92
98
100
96
95
99
Lat 16 54 14 N
Lon 93 26 46 W
Lat 18 19 52 N
Lon 97 15 11 W
Lat 18 49 22 N
Lon 97 29 27 W
Lat 18 51 55 N
Lon 97 23 21 W
Lat 19 0 56 N
Lon 97 27 39 W
Lat 20 39 7 N
Lon 101 21 28 W
Pgina 51
Tumor1/cepa3
Tumor2/cepa2
Tumor3/cepa2
Tumor1/cepa1
Tumor1/cepa2
Tumor5/cepa1
Tumor3/cepa1
Tumor4/cepa2
Tumor1/cepa2
Tumor1/cepa2
Tumor1/cepa 1
Tumor 1/cepa 2
Tumor 1/cepa 3
Tumor 5/cepa 2
Tumor 6/cepa 3
Tumor 1/cepa 3
Tumor 4/cepa 1
Tumor 7/cepa1
Tumor7/cepa 2
Tumor 4/cepa 6
Tumor2/cepa 2
Tumor 1/cepa 1
Tumor 3/cepa 1
Tumor 5/cepa 1
Tumor 3/cepa 3
Tumor 6/cepa1
Tumor4/cepa2
Tumor 1/cepa 1
Tumor 3/cepa 3
Tumor 2/cepa 1
Tumor 1/cepa 2
Tumor 1/ cepa1
Tumor 1 / cepa1
b18a
b18
b18
b9
b7
b7
b17
b17
b14
b17
b7
b7
b7
b15
b7
b7
b14
b18
b15
b17
b7
b14
b14
b7
b7
b14
b17
b7
b14
b7
b7
b15
b19
96
99
99
84
99
99
90
90
100
91
99
99
98
100
93
96
100
86
98
98
98
41
100
92
96
100
99
88
97
96
100
97
98
97
99
100
88
94
98
90
91
99
90
99
93
99
99
96
98
95
91
86
96
80
80
98
98
98
98
99
98
97
95
96
88
98
Tumor 3/cepa 1
Tumor 1/cepa 3
Tumor 2/cepa 3
Tumor 2/cepa 1
Tumor 1/cepa 3
Tumor 1/cepa 1
b18a
b7
b18
b7
b14
b14
60
75
100
99
96
95
96
95
97
95
97
98
Tumor 3/cepa 1
Tumor 1/cepa 2
Tumor 5/cepa 2
Tumor 5/cepa 1
Tumor 2/cepa 2
Tumor 3/cepa 3
Tumor 4/cepa 2
Tumor 1/cepa 2
Tumor 3/cepa 3
Tumor 1/cepa 2
Tumor 2/cepa 3
Tumor 2/cepa 2
Tumor 1/cepa 3
Tumor 2/cepa 3
Tumor 4/cepa 3
b15
b19
b19
b9
b7
b18
b17
b19
b17
b17
b7
b3
b18
b13
b7
100
100
98
100
100
100
100
99
100
98
100
99
99
99
96
98
97
93
92
100
98
84
97
100
96
100
96
99
92
98
Lat 16 55 25 N
Lon 96 24 45 W
Lat 17 27 33 N
Lon 97 13 28 W
Lat 23 23 54 N
Lon 99 24 23 W
Lat 21 25 56 N
Lon 6 9 00 W
Lat 22 33 3 N
Lon 102 47 32 W
Lat 21 58 30 N
Lon 102 52 52 W
Lat 21 4 14 N
Lon 104 26 40 W
Lat 21 15 45 N
Lon 103 09 35 W
Lat 21 4 9 N
Lon 104 26 53 W
Lat 21 2 11 N
Lon 104 23 39 W
Lat 20 25 9 N
Lon 103 37 8 W
Pgina 52
Tumor 1/cepa 1
Tumor 2/cepa 2
Tumor 2/cepa 1
b13
b19
b19
100
100
99
90
98
88
Tumor 3/cepa 2
Tumor 1/cepa 3
b15
b18
99
99
95
98
Lat 19 59 48 N
Lon 104 11 16 W
Tumor 1/cepa 2
b15
99
97
Lat 20 5 8 N
Lon 104 12 10 W
Tumor 1/cepa 3
Tumor 1/cepa 2
Tumor 2 /cepa2
b7
b14
b15
99
99
80
97
83
95
Tumor 1/cepa 2
Tumor 1/cepa 3
b9
b9
99
100
90
92
Tumor 1/cepa 1
Tumor 2/cepa 2
Tumor 2/cepa 2
b15
b13
b15
100
99
100
96
90
95
Tumor 2/cepa 3
Tumor 1/cepa 3
Tumor 1/cepa 2
b18a
b7
b15
36
97
94
94
97
95
Tumor 1/cepa 2
Tumor 2/ cepa 3
Tumor 1 /cepa 1
b17
b9
b7
100
100
98
91
91
96
Tumor 1/cepa 1
Tumor 1/ cepa 3
Tumor 2/cepa 2
b7
b19
b18
97
99
100
98
99
99
Tumor 3/cepa 2
Tumor 5/cepa 2
Tumor 7/cepa 2
b7
b9
b15
87
99
99
94
93
98
Lat 19 45 9 N
Lon 101 2 46 W
Tumor 1 /cepa 3
b18
100
100
Lat 20 00 22 N
Lon 102 57 32 W
Tumor 1/cepa 1
b7
100
100
Tumor 1/ cepa 3
b7
89
98
Tumor 1/cepa 1
Tumor 2/cepa 2
b7
b14
100
99
99
87
Lat 21 6 30 N
Lon 19 43 14 W
Tumor 1/cepa 3
Tumor 2/cepa 3
b19
b18
94
99
97
99
Lat 23 59 01 N
Lon 100 25 27 W
Tumor 1/cepa 1
b7
100
100
Tumor 1/cepa 3
Tumor 1/cepa 2
b17
b17
100
98
97
90
Lat 19 49 9 N
Lon 104 14 1 W
Lat 19 46 56 N
Lon 104 14 14 W
Lat 20 21 38 N
Lon 103 53 11 W
Lat 21 1 40 N
Lon 104 10 8 W
Lat 19 29 45 N
Lon 104 34 56 W
Lat 20 16 0 N
Lon 103 56 2 W
Lat 20 52 38 N
Lon 103 48 58 W
Lat 23 50 36 N
Lon 100 48 58 W
Lat 19 48 25 N
Lon 100 52 33 W
Lat 20 41 47 N
Lon 99 43 54 W
Pgina 53
Figura 13. Dendrograma de las variantes allicas presentes en Aguascalientes con base en la secuencia
nucleotidica
del locus b de U.
Figura 14. Dendrograma
de maydis.
las variantes allicas presentes en Aguascalientes con base en la secuencia
nucleotdica del locus b de U. maydis
Figura 14. Dendrograma de las variantes allicas presentes en Chiapas con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis.
Pgina 54
Figura 15. Dendrograma de las variantes allicas presentes en Guanajuato con base en la secuencia
nucleotdica del locus b de U. maydis
Pgina 55
Figura 16. Dendrograma de las variantes allicas presentes en Jalisco con base en la secuencia
Pgina 56
Figura 17. Dendrograma de las variantes allicas presentes en Nuevo Len con base en la secuencia
nucleotdica del locus b de U. maydis.
Figura 18. Dendrograma de las variantes allicas presentes en Michoacn con base en la secuencia
Pgina 57
Figura 19. Dendrograma de las variantes allicas presentes en Oaxaca con base en la secuencia
Figura 20. Dendrograma de las variantes allicas presentes en Nayarit con base en la secuencia
Pgina 58
Figura 21. Dendrograma de las variantes allicas presentes en Puebla con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis
Pgina 59
Figura 22. Dendrograma de las variantes allicas presentes en Quertaro con base en la secuencia
Figura 23. Dendrograma de las variantes allicas presentes San Luis de Potos con base en la secuencia
Pgina 60
Figura 24. Dendrograma de las variantes allicas presentes en Tamaulipas con base en la secuencia
Figura 25. Dendrograma de las variantes allicas presentes en Veracruz con base en la secuencia
Pgina 61
Figura 26. Dendrograma de las variantes allicas presentes en Zacatecas con base en la secuencia
Pgina 62
7.5 Anlisis AFLP
Se probaron seis combinaciones de oligonucletidos AFLP, pero cuatro fueron las

mas polimrficas y generaron informacion en los 60 individuos de U. maydis (Cuadro),
colectados en distintas regiones geogrficas y localidades de la Repblica Mexicana. Las
cuatro combinaciones de oligonucletidos selectivos amplificaron un total de 273 productos
de los cuales 267 (98 %) fueron polimrficos y 6 monomrficos (2%) ( Figura 21). El
anlisis de varianza molecular (AMOVA) indic la existencia de diferencias significativas
(p<0.0001) entre estados en U. maydis. Asimismo, se observ que el factor estado explic
la mayor parte de la varianza detectada en el AMOVA (92 %) (Cuadro 8), en cambio el
factor de variacin dentro de poblaciones solo explic el (8%) de la varianza; el valor Fst
obtenido fue de 0.07 el cual explica que existe una diferenciacin gentica moderada. El
anlisis de conglomerados con base en datos AFLP (Figura 22) mostr la formacin de dos
grupos principales de individuos de U. maydis, donde las distancias genticas variaron de
2.3 a 6.2 %. En primer lugar se agrupan los especmenes de U. maydis colectados de
Hidalgo, Guanajuato, Zacatecas y Jalisco con distancias genticas que varan de 2.8-3.5 %.
En el segundo grupo estn incluidos los especmenes de U. maydis colectados en los
estados de Tamaulipas, San Luis Potos, Quertaro, Nayarit, Tlaxcala, Chiapas, Puebla, y
Michoacn con distancias genticas que varan de 2.3- 6.3. Sin embargo los especmenes de
U. maydis no se agruparon con base en las regiones de mayor diversidad de las razas de
maz, aunque los especmenes de U. maydis colectados de la regin noreste son los nicos
incluidos dentro de un mismo grupo. Con los especmenes de U. maydis empleados para los
AFLP, se realiz un dendrograma con base en las secuencias nucleotdicas, en el cual se
formaron claramente 6 grupos de conglomerados, se observ que se agruparon en base al
Pgina 63
tipo de variante allica, el alelo b18 form el mayor grupo, el alelo b7 formo dos grupos, el
alelo b14, b15 y b19, estn agrupados claramente; el alelo b18 fue el ms frecuente y el
alelo b3 es el menos frecuente, segn el dendrograma el alelo b7 esta mas estrechamente
relacionado con el alelo b19 y b13, los alelos b3 y b9 tambin estn estrechamente
relacionados, el alelo b17 tiene una relacin menor con respecto al b7, b19, b13, b14, b18,
b15,b3, b9.
Cuadro 7. Aislamientos de U. maydis sometidos al anlisis AFLP
Estado
Localidad
No. De Muestras
Hidalgo
Teocalco 15/2
Teocalco 7/1
Teocalco 12/2
Progreso 9/16
Progreso 3/13
Progreso 7/4
Oaxaca
Santiago Tilantongo 1/2
Tlaxcala
Huamantla 4/1
Huamantla 5/2
Huamantla 7/1
Chiapas
Rincn Chamula 1/11
Rincn Chamula 3/15

Chichilca Comitan 7/7
Pgina 64

Rivera de Victoria 21/1
Guanajuato
SLPZ 21/1
SLPZ 2/10
SLPZ 3/9
Temporales 7/2
Hacienda de Higueras 2/2
Milpillas 1/1
Dolores Hidalgo 1/1
Irapuato 2/2
Puebla
Esperanza 1/1
Sebastian 5/2
Quetzalapa 3/2
Tamaulipas
Rancho Nuevo 2/1
Rancho Nuevo 3/3

San Lorenzo 1/1
Jalisco
El grullo 1/3
Autlan 1/2
Autlan 2/2
Palo chino 1/3
Los cuartos 1/2
Magdalena 1/2
Pgina 65
Hastotipaquillo 1/1
Autlan 1/3
Nayarit
Los balastros 2/2
Ixtlan del rio 4/3

Ixtlan del rio 2/3
Michoacan
Querendaro 7/2
Queredaro 9/2
Querendaro 5/2
Queretaro
Cadereyta 1/1
Camarco 1/3
Zacatecas
Villa Nueva 2/3
Villa Nueva 5/2

Apozotlan 3/3
Villa Nueva 3/1
Juchipila 3/1
Jalpa 4/2
Jalpa 3/3
Juchipila 2/3
SLP
Real de Catorce 1/2
Real de Catorce 2/2

Nuevo Len
San Diego de Vacas 1/1
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Figura 21. Productos AFLP de individuos de U. maydis colectados de diferentes localidades y estados de
la Repblica Mexicana. M pb = Marcador de pares de bases; * Numero de accesin.
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Cuadro 8. Productos AFLP amplificados por combinacin en especmenes de U. maydis
Combinacin AFLP
Productos amplificados
Polimorfismo (%)
Monomrficos Polimrficos Total
AG/AC
45
46
97.8
AG/AT
64
65
98.4
AG/AG
102
104
98.0
AC/ AC
57
58
98.2
Total/Media
67
273
98.1
Cuadro 9. Anlisis de Varianza Molecular de diferentes individuos de U. maydis colectados de

diferentes localidades y estados de la Repblica Mexicana.
Fuente de
Variacin
Suma de
Cuadrados
Grados
de
libertad
Cuadrados
Medios
p-valor
Iter. #
varianza
explicada
(%)
Entre
estados
Dentro de
poblaciones
Total
15433.18
11.00
1403.02
< 0.0001
750
92
1343.98
36.00
37.09
< 0.0001
750
16777.16
54
310.69
100
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27. Dendrograma de las relaciones geneticas de U. maydis con base en el metodo UPGMA entre estados
de la Republica Mexicana.
.
.
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VIII. DISCUSIN
A la fecha se han reportado 25 variantes allicas en el locus b de U. maydis, en el

presente trabajo fueron analizadas 173 secuencias nucleotdicas de dicho locus, para
conocer la diversidad de variantes allicas presentes en diferentes localidades, estados y
regiones de la Repblica mexicana, en nuestro trabajo solo se encontraron 11 variantes
allicas (b7, b14, b15, b19, b18, b1, b17, b13, b9, b18a, y b3) de un total de 26, y los que
no encontramos fueron (b2, b4, b5, b6,b12,b10, b10a, b11, b16, 4a, 4b, 6a, 6b, 6c,); era de
esperarse que como Mxico es el centro de origen del maz domesticacin, y mayor
diversidad, por la estrecha coevolucin que tiene con U. maydis tambin estaran presentes
la mayora de las variantes allicas y sin embargo no fue as, probablemente se debe a que
los que no encontramos no son tan frecuentes, o valdra la pena analizar un mayor nmero
de muestras es posible que en los estados y localidades no muestreados estn presentes. En
total de las secuencias analizadas el alelo b7 fue el ms frecuente y el menos frecuente fue
el b1 ya que solo se encontr en la localidad de Progreso Mixquihuala, (Saleh y col., 2006)
reportan haber identificado 8 variantes allicas (b1, b2, b3, b4, b5, b6, b7 y b8) en 7
localidades de Egipto, a diferencia de nosotros ellos identifacarn con frecuencias iguales
los alelos b1, b3 y b8, siendo los alelos b4 y b6 los menos frecuentes, los alelos
identificados que tenemos en comn con (Saleh y col., 2006) son el b1, b3 y b7. Jalisco fue
el estado donde se encontr una mayor diversidad de variantes allicas en dicho estado
estn presentes 10 alelos b de un total de 11, en Jalisco el alelo b15 fue el mas frecuente y
esta disperso en 5 localidades diferentes, en este estado no se observo que existir relacin
geogrfica con algn tipo de variante alelica; en el estado de Gto.se muestrearon 6
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localidades y tambin se encontraron 6 alelos b diferentes, se observ que existe una

relacin geogrfica entre las localidades del Norte de Guanajuato (San Luis de la Paz y
Victoria) con el alelo b14, esto se debe posiblemente a que dichas localidades son cercanas;
es importante mencionar que el alelo b14 tambin fue el ms frecuente en Guanajuato; por
otro lado tambin se observo que existe una relacin geogrfica entre las localidades del
centro de Gto.( Irapuato y Tomelpez) con el alelo b18, ya que este tipo de alelo no se
encontr en ninguna otra localidad de Gto. Hidalgo es el segundo estado con mayor
diversidad de variantes allicas ya que se identificaron 8 de un total de 11, siendo el alelo
b7 el mas frecuente, cabe mencionar que de todos los estados analizados la variante allica
b7 se identific con mayor frecuencia en dicho estado; en el estado de Puebla se
identificaron 5 variantes allicas diferentes, siendo el b15 el ms frecuente y se observo que
existe una relacin geogrfica y el tipo de variante alelica en la localidad de Sebastian con
el alelo b15; en el estado de Zacatecas se identificaron 7 variantes allicas diferentes y 2
estn en frecuencias iguales (b19 y b17), en esta caso no observ que alguna variante
allica tuviera afinidad con alguna localidad o bien con el mismo estado como en los casos
anteriormente mencionados. En el estado de Oaxaca a pesar de que solo se analizaron dos
localidades diferentes observamos que en la localidad de Santiago tilantongo nicamente
est presente el alelo b7, en Tlaxcala a pesar de que solo se analiz un localidad estn
presentes 5 tipos de alelos diferentes, siendo el mas frecuente el b7. En el estado de San
Luis Potos solo se analiz una localidad encontrndose nicamente el alelo b18; y en
Nuevo len se analizaron 2 localidades y en una identificamos el alelo b7 y en la otra el
b17, en el caso del estado de Nayarit se analizaron 2 localidades diferentes encontrndose 4
alelos diferentes (b13, b7, b18, y b3), en la localidad de Ixtln del Rio el alelo b13 es el mas
frecuente, En Michoacn encontramos 5 variantes allicas diferentes y en la localidad de
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Querndaro estn presentes (b7, b9, y b15); en Quertaro fueron analizadas 2 localidades
diferentes en la primera se encuentran (b19, y b18), en la segunda estan presentes el alelo
(b14 y b7), Finalmente en nuestro trabajo se incluy el estado de Tamaulipas porque
observamos que existen varios ejidos en los que se siembra maz y nos pareci interesante
conocer que variantes allicas del locus b de U. maydis estn presentes, los alelos b
identificados fueron (b19, b15,b14 y b7), siendo el b7 el ms frecuente. Finalmente
podemos decir que solo en algunos casos mencionados lneas atrs, si existe relacin
geogrfica con el tipo de variante alelica.
Por otro lado en la regin occidente se encuentran la mayora de los alelos b
encontrados a excepcin de los alelos b1 y b18a esto concuerda que en dicha regin
tambin se siembran varios tipos de maz segn (Muoz, 2005) que son aproximadamente
10 razas (Chapalote, Reventador, Tablilla de ocho, Tabloncillo, Harinoso de ocho, Maz
dulce, Maz conejo, Cnico Norteo, Celaya, y Jala) ; La Regin del Altiplano Central es la
segunda regin donde existen varias razas de maz y tambin en nuestro trabajo la segunda
con mayor diversidad de variantes allicas ( b1, b7, b13, b14, b15, b17, b18 y b19) en dicha
regin segn (Muoz, 2005) estn presentes 8 razas diferentes de maz ( Palomero,
Toluqueo, Cnico, Cacahuacintle, Elotes cnicos, Pepitilla, Ancho, y Chalqueo ; en la
Regin Centro tambin se encontraron 8 variantes allicas diferentes, finalmente segn
(Muoz, 2005) en la Regin Maya existen 7 razas de maz diferentes (Nal- tel Olotillo,
Olotn, Tehua, Tepecintle, Vandeo y Comiteco) y en el presente trabajo en dicha regin
tambin existe el menor nmero de variantes allicas (b7, b13, b14, b17, b18 y b19), con
base en lo anterior se puede sugerir que existe una relacin proporcional entre la diversidad
de variantes allicas con las regiones donde se siembran varias razas de maz, es decir a
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mayor nmero de razas de maz mayor numero de variantes allicas. Con base en los
resultados obtenidos en la presente investigacin se sugiere que 10 de las variantes allicas
encontradas ninguna est relacionada con una raza de maz, ya que por ejemplo el alelo b7
esta distribuido en todas las regiones analizadas y entre ellas no existen razas de maz en
comn, sin embargo el alelo b1 nicamente se encontr en la regin Altiplano Central.
El anlisis AFLP detect alto nivel de polimorfismo (98%) en las poblaciones de U.
maydis analizadas y discrimin entre individuos de uno y otro estado, el anlisis de
conglomerados mostr la formacin de dos grupos de especmenes de U. maydis de
acuerdo a su origen, los especmenes de estados ms cercanos (Guanajuato, Jalisco,
Hidalgo y Zacatecas) formaron un grupo, y los especmenes oriundos de estados ms
lejanos ( Nayarit, Chiapas, Tamaulipas y San Luis Potos, Tlaxcala, Puebla y Michoacn)
estn incluidos en otro grupo. Genticamente los especmenes del estado de Michoacn son
los ms diferentes en comparacin con el resto de los estados, y los especmenes de U.
maydis de los estados de Guanajuato y Zacatecas fueron genticamente los ms parecidos;
pero en el trabajo de (Valverde y Col., 2000) con base en algoritmo UPGMA observaron
que entre los estados de Oaxaca y Pachuca existe la mayor identidad poblacional. La
diversidad gentica de U. maydis entre estados fue alta (92%); (Saleh y col., 2006)
realizaron anlisis de diversidad gentica de U. maydis en siete diferentes localidades de
Egipto y la diversidad gentica encontrada entre poblaciones fue del (85.86%). En sus
trabajos (Valverde y Col., 2000) y (Zambino y Col., 1997) mencionan haber encontrado
mayor diversidad gentica en escalas espaciales pequeas que en escalas macro
geogrficas. En el presente trabajo se analizaron especmenes de U. maydis de 39
localidades diferentes de la Repblica mexicana y a pesar de que (Saleh y col., 2006) solo
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analizaron 7 localidades, tambin obtuvieron un alto porcentaje de diversidad gentica; es

importante mencionar que mediante anlisis RAPD (Saleh y col., 2006) analizaron solo
diez muestras de U. maydis pertenecientes a cuatro localidades diferentes de Egipto y
reportan un polimorfismo del 67.50%. Los resultados obtenidos en el presente trabajo en
cuanto a diversidad gentica y polimorfismo son ms altos, debido a que se analizaron un
mayor nmero de especmenes y de localidades comparado con el trabajo de (Saleh y col.,
2006). Los especmenes de U. maydis no se agruparon con base a la regin de origen, ya
que en el primer grupo de conglomerados estn incluidas cuatro regiones diferentes de las
seis que se analizaron, y en el segundo grupo tampoco se observ agrupamiento de las
regiones pero en este caso estn incluidas todas las regiones de mayor diversidad de las
razas de maz; las muestras de U. maydis colectadas en la regin noreste estn incluidas en
el segundo grupo, lo anterior demuestra la amplia diversidad gentica de dicha especie y
por lo tanto es de suponer que a mayor diversidad gentica mayor recombinacin gentica
y tambin mayor nmero de variantes allicas en el locus b de U. maydis.(Valverde y
col.,2000) mediante anlisis RFLP analizaron la diversidad gentica de 32 especmenes de
U. maydis pertenecientes a cinco estados diferentes de la Repblica Mexicana distribuidos
en el norte, centro y sur del pas, trabajo en el cual reportan un alto grado de polimorfismo
y una amplia diversidad gentica de dicha especie, distribuida en todos los sitios analizados
( Irapuato, Oaxaca, Pachuca, Toluca y Culiacn) lo cual coincide con el presente trabajo;
cabe mencionar que (Valverde y col.,2000) concluyen en su trabajo que no existe una
correlacin entre distancias genticas con distancias geogrficas, altitud, o precipitacin
anual en poblaciones de U. maydis; en el presente trabajo tambin se observ que no existe
una correlacin entre distancias genticas con distancias geogrficas por regin ni por
estados de los especmenes de U. maydis analizados. Por ejemplo a pesar de que el estado
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de Michoacn se encuentra geogrficamente ms cerca de Gto., Hidalgo, Zacatecas y

Jalisco, presenta la mayor distancia gentica. Nuestros resultados demostraron que la
tcnica AFLP es una herramienta capaz de detectar la variacin gentica en poblaciones de
U. maydis, adems de discriminar las poblaciones entre estados.
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IX. CONCLUSIONES
La variabilidad gentica de U. maydis en la Repblica Mexicana es significativa y

los aislamientos pueden diferenciarse con base en su origen geogrfico.
Existen 11 variantes allicas (b7, b14, b15, b19, b18, b1, b17, b13, b9, b18a, y b3),
distribuidas en la Repblica Mexicana.
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X. RECOMENDACIONES
Resultara interesante el estudio y evaluacin de un mayor nmero de muestras de

U. maydis de las regiones del Norte y Sur de Mxico, con la finalidad de obtener un
panorama ms amplio de la distribucin de las variantes alelicas.
Tambin resultara interesante evaluar un mayor nmero de aislamientos para tener
conocimiento de las localidades y estados que presentan mayores niveles de diversidad
gentica, ya que en el presente trabajo nicamente sesenta aislamientos fueron sometidos al
anlisis.
Existen escasos trabajos como el que aqu se describe, se sugiere que se contine
desarrollando investigaciones sobre U. maydis ya que sus caractersticas biolgicas,
bioqumicas, genticas, moleculares, patognesis y gastronmicas, lo han hecho atractivo
para la ciencia.
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XI. BIBLIOGRAFA
Abel Muoz Orozco., (2005), Centli Maiz. Ed. OCP Mxico, S.A., Estado de Mxico. pp
19-31.
Agrios, G. 1998. Fitopatologa. Segunda edicin. Ed. Limusa, S.A de C.V. pp 495-498.
Banuett F., (1992), Ustilago maydis, the delightful blight, Tig Trends In Genetics May, 8:
174-180.
Banuett F., (1995), Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in
maize, Annual Review Genetics, 29: 179-208.
Banuett F. y I. Herskowitz, (1996), Discrete developmental stages during teliospore
formation in the corn smut fungus, Ustilago maydis, Development, 122: 2965-2976.
Basse C.W. y G. Steinberg, (2004), Ustilago maydis, model system for analysis of the
molecular basis of fungal pathogenicity, Molecular plant Pathology, 5: 83-92.
Bensch S. y M. Akesson, (2005), Ten years of AFLP in ecology and evolution: Why so few
animals?, Molecular Ecology, 14:28992914.
Blears M.J, S.A De Grandis, H. Lee y J.T. Trevors, (1998), Amplified fragment length
polymorphism (AFLP): a review of the procedure and its applications, Journal of
Industrial Microbiology & Biotechnology, 21, 99114.
Bolker M., (2001), Ustilago maydis- a valuable model system for the study of fungal
dimorphism and virulence, Microbiology, 147: 1395-1401.
Claros M.G, (2008). Marcadores moleculares: Qu son, cmo se obtienen y para qu valen.
(V).
Hoffman, C. S. and Wriston, F (1987) A ten minute DNA preparation from yeast
efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.
Gene. 57, 267272.
Pgina 78
Holliday, R. (1974). Ustilago maydis. In Handbook of Genetics, pp. 575-595. Edited by

R.C. King. New York: Plenum.
Ioerger T. R., A.G, Clark., y T. Kao., (1990). Polymorphism at the self-incompatibility
locus in Solanaceae predates speciation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 97329735.
Jimnez P., C. Collada, (2000), tcnicas para la evaluacin de la diversidad gentica y su

uso en los programas de conservacin, Invest Agr Sist For, 2: 237-248.
Kahmann R. and Kamper J., (2004), Ustilago maydis: how its biology relates to pathogenic
development, New Phytologist, 164: 31-42.
Ruiz J. and A.D. Martinez, (1998), The fungus Ustilago maydis, from the Aztec cuisine to
the research laboratory, International Microbiology, 1: 149-158.
Romeis T., J. Kamper., y R. Kahmann, (1997), Single-Chain fusions of two unrelated
homeodomain proteins trigger pathogenecity in Ustilago maydis, Proc. Natl.
Academic. Sci., 94: 1230-1234.
Saleh F.M., M.M. El-Defrawy, R.F. Abdou., y A.F. Mohammed, (2006), Genetic
Variability at The b-Mating Type Locus In Ustilago maydis In Egypt and its
Molecular Identification, Assiut Journal of Agricultural Science, 37: 153-170.
Sanchez P., M.E. Valverde., O. Paredes., y P. Guzman, (1996), Detection of genetic
variation in Ustilago maydis strains by probes derived from telomeric sequences,
Microbiology, 142: 2931-2936.
Snetselaar K.M., M. Bolker., R. Kahmann, (1996), Ustilago maydis Hyphae Orient Their
Growth toward Pheromone Sources, Fungal Genetics and Biology, 20: 299-312.
Statsoft, Inc. (2004). STATISTICA for Windows [ Computer program manual]. Version
7.0 Tulsa, OK. USA.
Pgina 79
Clemente Villanueva Verduzco., (2007), El huitlacoche y su cultivo. Ed. Mundi Prensa

Mxico, S.A., Mxico, D.F. pp 36-38.
Valverde, M.E., Vandemark G.J., Paredes-Lopez O. (2000), Genetic diversity of Ustilago
maydis strains, World Journal of Microbiology & Biotechnology, 16: 49-55.
Vos. Y Col., 1995, AFLP: a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids
Research, 23: 4407-4414.
Zambino et al., 1997, Variation at the b Mating Type Locus of Ustilago maydis, Ecology
and Population Biology, 87: 1233-1239.
Pgina 80
XII. GLOSARIO
Basidiomiceto = basidios. Son hongos con micelio tabicado que producen esporas en
estructuras especializadas llamadas
Buffer = Solucin amortiguadora.
Dendrograma = Representacin grafica de datos en forma de rbol que organiza los datos
en subcategorias que se van dividiendo en otros hasta llegar al nivel de detalle deseado.
Diversidad = Diferencia entre las caractersticas de un conjunto o entre los de una misma
clase.
Iniciador = Secuencia sinttica de oligonucletidos que se utiliza para reconocer por

apareamiento complementario secuencias blanco en ADN molde, que consiste
generalmente en ADN genmico.
MseI = Enzima de restriccin derivada de Micrococcus species que corta el ADN dentro de
cada una de las cadenas de forma palndrome (5'TTAA3').
PstI = Enzima de restriccin producida por el microorganismo Providencia stuartii que

posee una diana de restriccin en el ADN de cadena doble dependiente de una secuencia no
metilada, palindrmica y asimtrica, sobre la cual su actividad cataltica hidrolasa genera
extremos cohesivos.
Radioistopos = a aquel istopo que es radiactivo e indica que todos los tipos de tomos de
un mismo elemento se encuentran en el mismo sitio de la tabla peridica.
Pgina 81
XIII. ANEXOS
Figura 9. Representacin esquemtica de las secuencias parciales alineadas de los 25 alelos b de U. maydis, a apartir de las zonas en verde
(Homeodominio), punteada (Regin intergnica y caf (Regin variable), se realiz el anlisis de las secuencias. Las lneas en azul y rojo
delimitando la zona de estudio.
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Analisis de Diversidad de Ustilago Maydis

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Instituto Politcnico Nacional-CBG

ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENTICA Y

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

6.5.5 Purificacin de Reaccin de Secuenciacin ............................................................................. 40

Cuadro 1. Oligonucletidos diseados empleados en los ensayos de amplificacin del locus b de U.

Figura 1. Enfermedad del huitlacoche en el maiz ............................. Error! Marcador no definido.

Ustilago maydis (DC) De Candole es un hongo, basidiomiceto, dimrfico,

especmenes de U. maydis de Michoacn pertenecientes a la Regin Occidente fueron

Mexicana, trabajo en el cual reportan un alto grado de polimorfismo y una amplia

Ustilago maydis (DC) De Candole es un hongo, patgeno, basidiomiceto,

Heterobasidiomycetydae, Orden: Ustilaginales, Familia: Ustilaginaceae,

2.1.1 Ciclo de vida

Cuando dos clulas sexualmente compatibles se encuentran cerca, se atraen

2.1.2 Control de apareamiento y patognesis

Figura 1. Enfermedad del huitlacoche en el maiz.

2.1.3 Organizacin y estructura del locus a y b

Los alelos a1 y a2 son disimilares, uno de 4.0 kb y el otro de 8.5 kb

Figura 4. Organizacin y estructura de los alelos a1 y a2 del locus a de U. maydis.

Figura 5. Organizacin y estructura del locus b multiallico de U. maydis.

2.1.4 Anlisis sexual del apareamiento in vitro

Figura 6. Reaccin Fuzz.

2.1.5 Variabilidad gentica

La variabilidad gentica se refiere a la variacin en el material gentico dentro y

2.1.6 Uso de marcadores moleculares para estudiar variabilidad gentica

Los marcadores moleculares son biomolculas que se pueden relacionar con un

2.1.7 Marcadores moleculares AFLP

identificadora de ADN que es sumamente informativa, (Blears y col. 1998., Bensch y

2.1.8 Anlisis de variabilidad gentica en U. maydis

mediante anlisis de fragmentos de restriccin en el extremo (EFs) y fragmentos de

2.1.9 Anlisis moleculares realizados en el locus b en U. maydis

Tambin a la fecha existen muy pocos anlisis moleculares en el locus b de U.

aproximadamente frecuencias iguales dentro de todas las poblaciones de Minnesota

4.2 Objetivos especficos

Existen variantes allicas en el locus b de aislamientos de U.maydis de la Repblica

VI. MATERIALES Y MTODOS

Se realizaron colectas de tumores a pie de carretera, presentes en cultivos de maz

Figura 7. Regiones donde existen diferentes razas del maz.

Figura 8. Localidades de la Repblica Mexicana donde se colectaron tumores de U. maydis.

6.2 Obtencin y purificacin de teliosporas a partir de tumores.

6.3 Germinacin de teliosporas a partir de tumores.

Se tom una alcuota de la solucin de teliosporas y se coloc en un portaobjetos

contaminantes vegetales, despus de la solucin de teliosporas se tomaron 25 l de la

6.4 Determinacin del tipo sexual de U. maydis in vitro

De cada tumor se germinaron y aislaron tres colonias, a las que llamamos A, B y C

6.5 Diseo de oligonucletidos

Con base en el alineamiento de las secuencias parciales de los alelos b disponibles

Cuadro 1. Oligonucletidos diseados en zonas invariables del locus b de U. maydis.

6.5.1 Obtencin de DNA genmico de U. maydis

Se us el mtodo modificado de Hoffman y Wriston (1987). Se inocul una asada

6.5.2 Amplificacin del locus b de U. maydis

El locus b fue amplificado en un termociclador Applied Biosystems modelo 9800

Cuadro 2. Condiciones de reaccin de la amplificacin del locus b de U. maydis

Cuadro 3. Componentes y cantidades empleadas en la reaccin de la amplificacin del locus b de U.

6.5.3 Purificacin del DNA

La purificacin de los productos amplificados por PCR del locus b de U. maydis se

membrana y se volvi a centrifugar a 16,000 rpm durante 1 min, luego cuidadosamente la

6.5.4 Preparacin de muestras para la determinacin de la secuencia nucleotdica

Para determinar la secuencia nucleotdica del locus b de U. maydis, se llev a cabo

50 ng, oligonucletidos a una

concentracin de 5 M, 4L de buffer Big Dye v3.1, 5X, 6 L de agua milli Q estril, 4L

6.5.5 Purificacin de Reaccin de Secuenciacin

Para la purificacin de la reaccin de secuenciacin se utiliz el kit Bigdye

6.5.6 Anlisis Bioinformtico de las secuencias del locus b de U. maydis

Para el anlisis de las secuencias nucleotdicas del locus b de U. maydis se utiliz el