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Cromatografia
Cromatografia
UNAM
CROMATOGRAFA
Curso de Mtodos
Semestre 2/2002
Historia de la Cromatografa.
1848
1850
1906
1930 Karrer, Kuhn, y Strain: Us adsorventes como hidrxido de calcio activado, aluminio y
magnesio
1935
1938
1938 Izmailov y Schraiber: Describieron el uso de la capa fina de alumina extendida sobre un
vidrio.
1939
1941
1944
1947
1948
1951
1952
1956
1956
1959
1964
Tiempo de retencin, tr. El tiempo que un soluto permanece en la columna, se mide desde el
momento de la inyeccin hasta la elusin del pico mximo. Es caracterstico del soluto para
condiciones de operacin constantes. Auxiliar en la identificacin de los solutos.
Tiempo muerto, to. El tiempo requerido para eluir un soluto que no se retiene en la fase
estacionaria. Tiempo que un soluto permanece en fase mvil. Representa el espacio vaco de la
columna.
Tiempo de retencin ajustado, tr. Mide el tiempo que el componente permanece en fase
estacionaria.
tr = tr - to
Ancho a la base, Wb. Es la porcin de la lnea base intersectada por las tangentes al pico. Para un
pico gaussiano es igual a 4. Tradicionalmente usado en el clculo de la eficiencia del sistema.
Ancho a la mitad de la altura, W_. Una medida mas reproducible, adecuada para evaluar
manualmente la eficiencia del sistema (platos tericos).
Nmero de platos tericos (N). Cada plato terico representa un equilibrio terico de distribucin
del soluto entre las fases. El nmero total de platos tericos de una columna representa el poder
de separacin de la columna. Una buena columna tiene un nmero alto de platos tericos. Se
calcula con cualquiera de las ecuaciones:
Comportamiento de retencin
El comportamiento de retencin refleja la distribucin del soluto entre la fase mvil y la
estacionaria. El volumen de fase mvil necesario para transportar la banda de soluto desde el
punto de inyeccin, a travs de la columna, hasta el detector (en el mximo del pico del soluto) se
define como el volumen de retencin, Vr. Se puede obtener directamente del cromatograma
multiplicando el tiempo de retencin correspondiente, tr, por el gasto o flujo volumtrico, Fc,
expresado como el volumen de fase mvil por unidad de tiempo.
Vr = tr Fc
El gasto o flujo volumtrico, en trminos de los parmetros de la columna, depende la seccin
transversal de la columna vaca, la porosidad total del relleno (empaque) de la columna y la
velocidad lineal promedio de la fase mvil.
Coeficiente de reparticin
Cuando un soluto entra al sistema cromatogrfico inmediatamente se reparte o distribuye entre la
fase mvil y la estacionaria. Si la fase mvil se para en cualquier momento el soluto establece un
equilibrio de distribucin entre las dos fases. La concentracin en cada fase est dada por el
coeficiente termodinmico de particin (o reparto):
K = Cs / Cm
donde Cs y Cm son las concentraciones de soluto en la fase estacionaria y mvil, respectivamente.
Cuando K = 1, el soluto se encuentra igualmente distribuido entre las dos fases. El coeficiente de
reparto determina la velocidad promedio de cada zona de soluto, ms especficamente, del centro
de la zona de soluto conforme la fase mvil avanza a lo largo de la columna.
Resolucin
El grado de separacin o resolucin de dos bandas adyacentes se define como la distancia entre
los picos (o centros) dividida entre el ancho promedio de las bandas. Si la retencin y el ancho de
la banda se miden en unidades de tiempo (ver figura 2), la resolucin est dada por:
2(tr,2 tr,1)
Rs =
(Wb,2+Wb,1)
donde los tiempos de retencin y los anchos se expresan en las mismas unidades. La resolucin
mnima aceptable en mezclas sencillas es 1.0 (ver figura 3), una resolucin de 1.5 representa
separacin a la lnea base.
(a-1)
Rs = _ ( N )
a
k
(1+k)
selectividad
capacidad
eficiencia
La resolucin de picos adyacentes puede mejorarse ya sea aumentando la separacin de los picos
o disminuyendo los anchos de los picos individuales. Esto involucra la selectividad de la columna
cuando se alejan ms los picos y la eficiencia cuando se intenta disminuir el ancho del pico.
Factor de Capacidad
El factor de capacidad o retencin k es la cantidad ms importante de cromatografa en columna.
Relaciona el equilibrio de distribucin de la muestra dentro de la columna con las propiedades
termodinmicas de la columna y con la temperatura. Para un conjunto dado de parmetros de
operacin, k es una medida del tiempo transcurrido en la fase estacionaria en relacin el tiempo
transcurrido en fase mvil. Se define como el cociente de los moles de un soluto en la fase
estacionaria entre los moles en la fase mvil:
Factor de capacidad k =
Cs Vs
Vs
= K
CmVm
Vm
La razn volumtrica de fases, Vm / Vs, se denota usualmente por b. As, k = K / b. Dicho de
otra forma, la razn de reparto es el tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir,
en comparacin con un soluto no retenido (para el cual k = 0), dividido entre el tiempo de
elusin de una banda no retenida:
Vr1 - V0
k =
V0
Capacidad
La capacidad en un intercambiador inico es una medida cuantitativa de su habilidad de tomar
contra-iones intercambiables. La capacidad puede ser expresada como la capacidad inica total,
capacidad disponible o capacidad dinmica. La capacidad inica total es el nmero de
sustituyentes cargados por gramo drenado de intercambiador inico o por mL de gel hidratado.
La capacidad total puede medirse por titulacin con un cido o base fuerte.
Eficiencia
La eficiencia de la columna est relacionada con el ensanchamiento de la banda que se encuentra
en la columna y puede ser calculada:
Vr1
N = 5.54
W1/2
y se expresa como un nmero de platos tericos (N) para la columna bajo condiciones
experimentales especficas. La eficiencia es conocida frecuentemente como el nmero de platos
tericos por metro de cama cromatogrfica, o expresada como H que es la longitud de la cama
(L) dividida por el nmero de platos tericos.
H=L/N
A partir de que el valor observado de N depende de factores experimentales tales como la
velocidad de flujo y la carga de la muestra, es importante que las comparaciones sean hechas bajo
condiciones idnticas. En el caso de la cromatografa de intercambio inico, la eficiencia se mide
bajo condiciones isocrticas, usando una sustancia que no interacciona con la matriz como por
ejemplo, la acetona. Mejorar la cintica del sistema aumenta la eficiencia de la separacin.
Una de las principales causas del ensanchamiento de zona en una cama cromatogrfica es la
difusin longitudinal de molculas de soluto. El efecto se minimiza si las distancias disponibles
para difusin, en ambos la fase mvil y la fase estacionaria, son mnimas. En la prctica esto se
logra usando tamaos de cuentas uniformes y pequeos. La mayor eficiencia se logra con
minicuentas de 3mm de dimetro, no porosas diseadas para aplicaciones analticas y
micropreparativas. Despus del tamao de cama, el segundo factor importante es una buena
tcnica experimental. Las camas cromatogrficas empaquetadas irregularmente y burbujas de aire
en ellas, producirn canales, ensanchamiento de la zona y prdida de la resolucin. Las buenas
separaciones requieren columnas bien empaquetadas.
Selectividad
La selectividad (a) se define la habilidad del sistema para separar los picos, por ejemplo la
distancia entre dos picos. El factor de selectividad puede ser calculado del cromatograma usando
la expresin:
k2
Vr2 - V0
a=
=
k1
V r2
=
Vr1 - V0
V r1
Una buena selectividad es un factor muy importante, mejorar la selectividad implica alterar la
termodinmica del sistema cromatogrfico.
Rs est relacionada de forma lineal con la selectividad pero relacionada de forma cuadrtica con
la eficiencia. Esto significa que un incremento de cuatro veces en la eficiencia es necesario para
duplicar la resolucin en condiciones isocrticas.
La selectividad en la cromatografa de intercambio inico depende no solo de la naturaleza y
nmero de grupos inicos en la matriz, tambin depende del pH y fuerza inica.
Tipos de cromatografa
La cromatografa puede clasificarse de acuerdo al tipo de equilibrio involucrado, mismo que es
gobernado por el tipo de fase estacionaria utilizada. As la cromatografa puede ser de (1)
adsorcin, (2) particin, (3) intercambio inico, (4) exclusin, y (5) afinidad (ver figura 4).
1. Cromatografa de adsorcin
La fase estacionaria es un slido en el que los componentes de la muestra son adsorbidos. La fase
mvil puede ser un lquido (cromatografa lquido-slido) o un gas (cromatografa gas-slido);
los componentes se distribuyen entre dos fases a travs de la combinacin de los procesos de
adsorcin y desorcin. La cromatografa de capa fina (TLC) es un ejemplo especial de
cromatografa por adsorcin en la cual la fase estacionaria es un plano, en la forma de un soporte
slido en un plato inerte.
2. Cromatografa de particin
La fase estacionaria de la cromatografa de particin es un lquido soportado en un slido inerte.
Otra vez, la fase mvil puede ser un lquido (cromatografa de particin lquido-lquido) o un gas
(cromatografa de particin gas-lquido, GLC). La cromatografa en papel es un tipo de
cromatografa de particin en la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una
hoja de papel.
Grupo funcional
-O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2
-O-CH2-CH2-N+H(CH2CH5)2-CH2-CHOH-CH3
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+H(CH3)3
Intercambiadores catinicos
Carboximetil (CM)
Sulfopropil (SP)
Metil sulfonato (S)
Grupo funcional
-O-CH2-COO-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3-
Se usan los grupos sulfnico y amino cuaternario para formar intercambiadores inicos fuertes,
los otros grupos formar intercambiadores inicos dbiles. Los trminos fuerte y dbiles se
refieren a la extensin de variacin de ionizacin con pH y no a la fuerza del enlace.
Los intercambiadores inicos fuertes estn completamente ionizados en un amplio rango de pH
mientras que con los intercambiadores inicos dbiles, el grado de disociacin y la capacidad de
intercambio varia ms marcadamente con el pH.
4. Cromatografa de exclusin por tamao
En la cromatografa de exclusin puede separarse molculas solvatadas de acuerdo a su tamao y
habilidad a penetrar en una estructura tamiz (la fase estacionaria).
La separacin en cromatografa de particin y en cromatografa de intercambio inico se logra de
diferentes interacciones de solutos con la fase mvil y la fase estacionaria. En contraste, las
separacin en cromatografa de exclusin por tamao se lleva a cabo por diferencias en tamao
molecular y la habilidad de diferentes molculas para penetrar los poros de la fase estacionaria a
diferentes tamaos o magnitudes.
Anticuerpo
Lecitina
c. nucleico
Glutatin
Iones metlicos
La matriz. Es un soporte inerte al cual un ligando puede ser directa o indirectamente acoplado.
Algunas caractersticas importantes para sta son:
adsorcin no especfica extremadamente baja es esencial ya que el xito de la
cromatografa de afinidad depende de interacciones especficas,
los grupos hidroxilo en los residuos de azcar pueden servir para unirse a un ligando,
proporcionando una plataforma ideal del desarrollo del medio de afinidad,
la estructura de poro abierta asegura una capacidad de unin alta, an para biomolculas
grandes porque el interior de la matriz estara disponible para el ataque de ligandos,
propiedades de fluido buenas para la rpida separacin,
estabilidad bajo un rango de condiciones experimentales tales como pH alto y bajo,
detergentes y agentes disociadores.
El ligando. Es la molcula que se une reversiblemente a molculas especficas o grupo de
molculas, capacita la purificacin por cromatografa de afinidad.
La seleccin del ligando para cromatografa de afinidad est influenciado por dos factores:
El ligando debe presentar una afinidad de unin especfica y reversible para la sustancia blanco y
debe tener grupos qumicamente modificables que permitan ser unidos a la matriz sin destruir su
capacidad de unin.
Brazo espaciador. El sitio de unin de una protena blanco a menudo se localizan dentro de la
molcula y un medio de afinidad preparado con pequeos ligandos acoplados directamente a la
columna puede exhibir una capacidad de unin baja debido a interferencias estricas, por
ejemplo, el ligando no podra accesar al sitio de unin de la molcula blanco. En estas
circunstancias un brazo espaciador se pone entre la matriz y el ligando para facilitar la unin
especfica. El brazo espaciador puede ser diseado para mximar la unin especfica.
APLICACIONES
La cromatografa de adsorcin es particularmente adecuada para el anlisis de molculas no
ionizantes, insolubles en agua y relativamente simples, que frecuentemente son ismeros o
compuestos muy relacionados. El intervalo de compuestos que pueden separarse se extiende
desde los hidrocarburos muy polares hasta compuestos polifuncionales fuertemente polares. Esta
cromatografa se ve poco influida por las diferencias en peso molecular y ms por los grupos