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Evaluacion de Microorganismos para Fermentacion PDF
Evaluacion de Microorganismos para Fermentacion PDF
SEDE MANIZALES
Director:
JUAN CARLOS HIGUITA VSQUEZ. PhD
Codirector:
CARLOS ARIEL CARDONA ALZATE. PhD
Agradecimientos
AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mi sincera gratitud a las siguientes personas e instituciones que de una u otra
forma hicieron posible la realizacin de este trabajo:
A mi familia por su constante apoyo y esfuerzo.
A los profesores del departamento de Ingeniera Qumica de la Universidad Nacional de
Colombia sede Manizales PhD. JUAN CARLOS HIGUITA VSQUEZ y PhD. CARLOS ARIEL
CARDONA ALZATE, quienes dirigieron cada una de las etapas del proyecto y apoyaron de
excelente forma su realizacin.
A la UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA sede Manizales por el apoyo financiero entregado
durante parte de la investigacin mediante la figura de ESTUDIANTE AUXILIAR y por facilitar
las instalaciones, equipos y materiales necesarios para el correcto desarrollo del proyecto.
A COLCIENCIAS por el apoyo financiero gracias a la beca asignada mediante el programa
JVENES INVESTIGADORES 2010.
A los integrantes del grupo de investigacin en Procesos Qumicos, Catalticos y
Biotecnolgicos por el inters demostrado y el apoyo brindado durante el desarrollo del
proyecto.
Resumen
III
RESUMEN
Este trabajo presenta un estudio de la fermentacin etanlica empleando melaza de caa de
azcar como sustrato y una cepa aislada de Saccharomyces cerevisiae. Se analizan aspectos
tericos sobre fermentaciones y se presentan algunas tcnicas de mejoramiento de
microorganismos para su uso en procesos fermentativos.
El efecto de la concentracin de azcares totales en el sustrato, la temperatura de
fermentacin y el pH inicial del medio sobre la productividad de etanol y la viabilidad celular
fue evaluado simultneamente mediante la implementacin de un diseo factorial. Los
resultados permitieron establecer que las variables ms influyentes sobre la productividad de
bioetanol son la concentracin de azcares del medio y la temperatura de fermentacin. La
cepa aislada present un mejor comportamiento que la cepa alcohlica ATCC 9763, utilizada
en este trabajo como levadura de referencia, y en el rango de valores experimentales se
alcanzaron porcentajes de eficiencia de bioetanol entre 61.87% y 95.87%. Las mejores
condiciones fueron 22Bx y 32C de acuerdo con la metodologa de superficies de respuesta
(MSR).
Expresiones matemticas para la prediccin de la productividad de etanol, la generacin de
biomasa y la eficiencia del proceso fueron calculadas y la correlacin indic que el modelo
representa adecuadamente las variables seleccionadas. Dos condiciones de operacin fueron
evaluadas experimentalmente a nivel piloto (i.e., 1 L y 300 L) y mediante simulacin de
procesos. Los resultados permitieron establecer la viabilidad energtica y econmica de
procesos realizados a temperaturas elevadas y la adaptacin de la cepa aislada a estas
condiciones. Este comportamiento permite catalogar esta cepa como una levadura
termotolerante.
Los resultados obtenidos permitieron establecer que los criterios principales seleccionados en
el diseo factorial pueden ser generalizados a escalas mayores. Por esta razn, y apoyado en
criterios tericos, se plantea un protocolo de seleccin de microorganismos aplicado a
diferentes escenarios.
Abstract
ABSTRACT
A study of ethanolic fermentation using sugarcane molasses as substrate and an isolated
yeast strain of Saccharomyces cerevisiae is presented. The analysis of fermentation
processes and a review of techniques for development of new microorganisms are also
showed.
The effect of total sugar concentration in the substrate, the fermentation temperature and the
initial medium pH on the ethanol productivity and cell viability were simultaneously evaluated
by implementing a factorial experimental design. The results indicate that the most influential
variables on the productivity of bioethanol are the concentration of sugars in the medium and
the fermentation temperature. The isolated strain presented a better performance than the
alcoholic strain ATCC 9763, used in this work as reference yeast with efficiencies of
bioethanol production between 61.87% and 95.87% of the theoretical value. The best
fermentation conditions were 22Bx and 32C according to the response surface
methodology (RSM) results.
Mathematical expressions for the prediction of the bioethanol productivity, biomass
generation and product yielding were calculated and the correlation attained indicated that
the model adequately represents the selected variables. Two conditions of high bioethanol
yielding were evaluated at pilot level (i.e., 1 L and 300 L) and using process simulation. The
results show the energetic and economical profitability of the processes performed at elevated
temperatures and the good adaptation of the isolate strain to these conditions. The isolated
strain could be catalogued as a thermotolerant strain since it reached high levels of efficiency
at 38C.
The obtained results demonstrate that the criteria selected in the factorial design can be
generalized to larger scales. For this reason, and supported by theoretical approaches, a
protocol for the selection of microorganisms applied to different scenarios are presented.
Contenido
VII
TABLA DE CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................................... I
RESUMEN ....................................................................................................................................... III
ABSTRACT ........................................................................................................................................ V
LISTADO DE SIGLAS Y ABREVIACIONES .......................................................................................... IX
LISTADO DE FIGURAS...................................................................................................................... XI
LISTADO DE TABLAS...................................................................................................................... XIII
INTRODUCCIN .............................................................................................................................. XV
CAPTULO 1: PRODUCCIN DE ETANOL VA FERMENTATIVA ........................................................... 1
1.1.
1.2.
1.3.
CONCLUSIN .............................................................................................................. 12
CONCLUSIN .............................................................................................................. 24
3.2.
3.3.
MTODOS ................................................................................................................... 27
VIII
Contenido
4.3.
4.4.
4.5.
CONCLUSIN .............................................................................................................. 59
5.2.
5.3.
5.4.
CONCLUSIN .............................................................................................................. 69
IX
Trmino
Unidad
Ecuacin
A, B ,C, D
a, b
b
Bx
DCEL
ETA
e
cel/ml
g/L
-
Ec.16
Ec. 4
Ec. 4
Ec. 7
m3/kg
kg/m3
-
Ec. 13
Ec. 13
-
kg/kg h
Ec. 14
kg/kg h
g/L
Ec. 15
Ec. 12 - 13
kg/m3
Ec. 13
g/L h
g/L h
g/L h
g/L
C
-
Ec. 14
Ec. 15
Ec.13
Ec. 11, Ec.14
cel/ml
Ec. 13 - 15
kg/m3
Ec. 13
Ec. 4
g/g
Ec. 6
kg/kg
kg/kg
Ec. 14
Ec. 15
%E
GL
Ki
Ks
LOi
mp
mx
P
Pmax
rp
rs
rx
S
T
TDP
X
X
Xmax
Y
Yi
Yps
Ypx
Yx
Ec. 16
Significado
ADH
ADN
ADP
AR
ATCC
ATP
Alcohol deshidrogenasa
cido desoxirribonucleico
Adenosn difosfato
Azcares reductores
American Type Culture Collection
Adenosn trifosfato
cido dinitrosaliclico. Reactivo utilizado para la
cuantificacin de azcares reductores
Demanda qumica de oxgeno
Entner Doudoroff
Embden Meyerhoff Parnas
Enolasa
Fructosa bifosfato aldolasa
Fructoquinasa
Glucoquinasa
Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
Hexoquinasa
2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa
Levanosacarasa
Metodologa de superficie de respuesta
Piruvato descarboxilasa
Fosfofructoquinasa
6-fosfogluconato deshidratasa
Fosfoglucosa isomerasa
3-fosfoglicerato quinasa
Fosfoglicerato mutasa
Piruvato quinasa
Revoluciones por minuto
Triosa fosfato deshidrogenasa
Triosa fosfato isomerasa
DNS
DQO
ED
EMP
ENO
FBA
FRK
GLK
GPDH
HXK
KDPA
LS
MSR
PDC
PFK
PGD
PGI
PGK
PGM
PK
RPM
TDH
TDI
Trmino
Unidad
Ecuacin
max
h1
Ec.13
Trmino
Condicin inicial
Condicin final
Contadores sumatorias
Ecuacin
Ec. 4
Tabla V: Superndices
Superndice
Trmino
Ecuacin
m
n
Ec. 13
Ec. 13
Listado de figuras
XI
LISTADO DE FIGURAS
Figura 1: Requerimientos generales de un proceso fermentativo ................................................3
Figura 2: Ruta Embden Meyerhoff Parnas para la produccin de etanol en Saccharomyces
cerevisiae........................................................................................................................................ 10
Figura 3: Ruta Entner Doudoroff para la produccin de etanol en Zymomonas mobilis .......... 12
Figura 4: Principales factores de influencia sobre levaduras silvestres .................................... 16
Figura 5: Esquema general de un programa de mejoramiento y seleccin de microorganismos
......................................................................................................................................................... 19
Figura 6: Esquema detallado de un procedimiento de seleccin o tamizaje de
microorganismos de inters industrial ......................................................................................... 21
Figura 7: Evolucin de azcares reductores durante la hidrlisis a 90C................................. 26
Figura 8: Cromatograma de una muestra de melaza diluida ..................................................... 27
Figura 9: Crecimiento de la cepa LO1 en agar de melaza ........................................................... 28
Figura 10: Biorreactor marca Biotrn ......................................................................................... 29
Figura 11: Resultados generales diseo factorial 24 .................................................................. 34
Figura 12: Representacin grfica de los efectos sobre ETA ..................................................... 35
Figura 13: Representacin grfica de los efectos sobre DCEL ................................................... 35
Figura 14: Comparacin entre los valores tericos y experimentales para la produccin de
etanol .............................................................................................................................................. 36
Figura 15: Comparacin entre los valores tericos y experimentales para la generacin de
biomasa .......................................................................................................................................... 36
Figura 16: Comparacin entre las cepas ATCC 9763 y LO1 con respecto a la produccin de
etanol .............................................................................................................................................. 39
Figura 17: Comparacin entre las cepas ATCC 9763 y LO1 con respecto a la generacin de
biomasa .......................................................................................................................................... 39
Figura 18: Resultados generales diseo factorial compuesto central ....................................... 41
Figura 19: Resultados generales del diseo factorial compuesto central en funcin de la
temperatura y la concentracin de azcares. Produccin de etanol (a) y generacin de
biomasa (b)..................................................................................................................................... 42
Figura 20: Representacin grfica de los efectos sobre ETA ..................................................... 43
Figura 21: Representacin grfica de los efectos sobre DCEL ................................................... 43
XII
Listado de figuras
Listado de tablas
XIII
LISTADO DE TABLAS
Tabla 1: Principales productos generados a nivel industrial empleando microorganismos .......2
Tabla 2: Productores mundiales de bioetanol ................................................................................3
Tabla 3: Produccin anual de alcohol carburante en Colombia y venta al mercado nacional ....4
Tabla 4: Composicin del jugo crudo de caa de azcar ...............................................................6
Tabla 5: Composicin del jugo crudo de remolacha azucarera .....................................................6
Tabla 6: Composicin promedio de las melazas de caa de azcar y de remolacha azucarera 7
Tabla 7: Produccin anual, mercado nacional y exportaciones de melaza de caa de azcar en
Colombia ............................................................................................................................................7
Tabla 8: Ventajas y desventajas segn disponibilidad y costos de diferentes materiales para
fermentacin .....................................................................................................................................8
Tabla 9: Principales microorganismos productores de etanol con aplicacin o potencialidad
industrial ............................................................................................................................................9
Tabla 10: Reportes en la literatura cientfica sobre parmetros evaluados en fermentaciones
etanlicas ....................................................................................................................................... 18
Tabla 11: Microorganismos utilizados en el desarrollo experimental ........................................ 25
Tabla 12: Cantidades mnimas de nutrientes recomendadas para fermentar 100 kg de melaza
......................................................................................................................................................... 26
Tabla 13: Factores seleccionados y dominio experimental establecido en el diseo factorial 2 4
......................................................................................................................................................... 33
Tabla 14: Matriz de experimentos para el diseo factorial 24 .................................................... 33
Tabla 15: Efectos estimados para las variables de respuesta ETA y DCEL ............................... 34
Tabla 16: Resultado ANOVA para el diseo factorial 24 .............................................................. 35
Tabla 17: Factores seleccionados y dominio experimental del diseo factorial compuesto
central ............................................................................................................................................. 40
Tabla 18: Matriz de experimentos para el diseo factorial compuesto central ........................ 40
Tabla 19: Rendimiento de etanol y eficiencia alcanzada en cada experimento del diseo
factorial compuesto central........................................................................................................... 41
Tabla 20: Efectos estimados para las variables de respuesta ETA y DCEL para el diseo
factorial compuesto central........................................................................................................... 43
Tabla 21: Resultado ANOVA para el diseo factorial compuesto central .................................. 44
XIV
Listado de tablas
Introduccin
XV
INTRODUCCIN
El auge actual de los biocombustibles y la necesidad de aumentar su produccin a nivel
nacional e internacional ha impulsado la investigacin concerniente a la obtencin de
bioetanol a partir de diferentes materias primas, empleando diferentes microorganismos y
bajo diferentes tecnologas.
La rentabilidad de la produccin de bioetanol depende de la disponibilidad y costo de las
materias primas utilizadas, de la eficiencia del proceso de conversin biolgica, del tipo de
microorganismo empleado y de la configuracin de la etapa de separacin de productos y
subproductos [1]. Aunque este bioproceso puede ser mejorado en cada una de las fases
descritas, el xito de las modificaciones en las etapas de pretratamiento de materias primas y
de purificacin de productos depende en cierta medida de la fermentacin, ms
especficamente de las caractersticas metablicas y fisiolgicas del microorganismo utilizado.
La produccin nacional de etanol a nivel industrial (para consumo humano y biocombustible)
est fundamentada en la utilizacin de materias primas provenientes del proceso de
produccin de azcar [2]. Por esta razn y debido a la alta demanda de bioetanol, la
disponibilidad de estos materiales ha disminuido y sus costos han aumentado lo que hace
necesario elevar los rendimientos del proceso o buscar nuevas alternativas de materias
primas, para lo cual emplear microorganismos apropiados es importante [3].
Seleccionar microorganismos adecuados para la fermentacin, cuyas caractersticas
metablicas se ajusten con el tipo de sustrato, las condiciones de operacin y otros
requerimientos particulares, permite maximizar la productividad de etanol y tener un mejor
control y conocimiento del proceso desarrollado [4]. Debido a que la fermentacin etanlica
es un proceso complejo y dada la cantidad de variables que intervienen, los procedimientos
de seleccin de microorganismos no son realizados con frecuencia en las industrias
productoras de bioetanol. Esto se debe principalmente a los elevados costos de
experimentacin, a los altos requerimientos de tiempo y de personal especializado adems de
la carencia de estudios que generen criterios y presenten herramientas claras para la
valoracin y seleccin de microorganismos, especialmente aquellos enfocados a la utilizacin
de materias primas azucaradas.
De esta manera, el desarrollo de un trabajo experimental que estandarice algunas de las
tcnicas microbiolgicas particulares de procesos de produccin de bioetanol y genere un
protocolo de seleccin basado en el efecto generado por las principales variables de
operacin, es de utilidad para disminuir los requerimientos de los procedimientos de
seleccin. Este desarrollo soportado en la evaluacin del comportamiento de
microorganismos utilizando diseo experimental y simulacin de procesos aumenta el
conocimiento y las herramientas para la seleccin de condiciones de fermentacin. Esto
puede permitir emplear microorganismos aislados que presenten una mayor adaptacin a las
condiciones de operacin impuestas en procesos fermentativos a nivel piloto e industrial.
XVI
Introduccin
HIPTESIS
Es posible elaborar un protocolo general que presente herramientas para la evaluacin y
criterios para la seleccin de microorganismos (entre un conjunto de posibilidades) que se
ajusten a condiciones de proceso y a sustratos definidos, generando rendimientos elevados
en la produccin de etanol en sistemas de fermentacin en estado lquido.
OBJETIVOS
GENERAL
Evaluar el efecto generado por las variables de operacin ms representativas sobre el
comportamiento y productividad de algunos microorganismos en la fermentacin etanlica
(fase lquida) de sustratos azucarados a escala laboratorio y piloto.
ESPECFICOS
1. Implementar y documentar tcnicas microbiolgicas de aislamiento, incubacin,
reactivacin y siembra de microorganismos, que son necesarios en los ensayos de
laboratorio por realizar y que se ajusten a las caractersticas de cada microorganismo
por evaluar.
2. Aplicar un modelo terico para estudiar y predecir como la fermentacin alcohlica es
afectada por factores como tiempo de fermentacin, temperatura, concentracin de
azcares totales, entre otros, as como el efecto de su interaccin.
3. Analizar los principales factores que afectan los procesos de fermentacin y que han de
ser evaluados en la simulacin del proceso y en su seguimiento a escala piloto.
4. Generar un protocolo global para el anlisis y seleccin de microorganismos para la
produccin de etanol a partir de una materia prima determinada.
Captulo 1
CAPTULO 1
PRODUCCIN DE ETANOL VA FERMENTATIVA
El etanol (C2H5OH) tambin conocido como alcohol etlico, como alcohol carburante cuando es
empleado como combustible o aditivo a la gasolina, o como bioetanol si es obtenido a partir
de biomasa (i.e., materias primas ricas en azcar, almidn o lignocelulosa), es el alcohol ms
ampliamente utilizado en el sector transporte a nivel mundial. Su uso masivo como fuente
energtica es reciente, mientras que las aplicaciones como bebida, solvente, antisptico, etc.
son muy antiguas. Por esta razn, los avances investigativos concernientes a la produccin de
este compuesto qumico son muy amplios y tienen enfoques hacia cada una de las partes que
componen la cadena productiva, estimulado actualmente por su aplicacin como combustible
y justificado en los beneficios ambientales que su uso conlleva.
En este captulo se presentan generalidades acerca de procesos fermentativos, enfocndose
principalmente en la produccin de bioetanol, considerando los sustratos empleados y los
principales microorganismos con capacidad productora.
1.1.
Microorganismo
Biomasa
1.2.
La produccin de etanol por la accin de levaduras sobre malta o extractos de fruta ha sido
llevada a cabo a gran escala por muchos aos y fue el primer proceso industrial para la
produccin de un metabolito microbiano. Es por la va fermentativa que se obtiene la mayor
cantidad de etanol a nivel mundial. El 95% del etanol en el mundo se obtiene por
fermentacin a partir de materias primas que contengan carbohidratos [10].
Captulo 1
3
FERMENTACIN
FERMENTACIN
Microorganismo
Microorganismo
Sustrato
Micronutrientes
Microorganismo
Sustrato
Sustrato
Micronutrientes
Micronutrientes
Condiciones de
fermentacin
Identificacin y
aislamiento de la cepa
Adicionar y mezclar
Identificacin y
Adicionar y mezclar
Identificacin y
aislamiento de la cepa
Preservacin
de
cepa
Formulacin
Esterilizacin
dellalamedio
aislamiento de
cepa
Preservacin de la cepa
Esterilizacin
Propagacin
delycepa
Preservacin
de la
acondicionamiento
microorganismo del
Inoculacin del
microorganismo
Condiciones de
fermentacin
Condiciones de
Recuperacin
fermentacin y
purificacin
Recuperacin y
purificacin
Recuperacin y
Tratamiento
purificacinde
efluentes
Propagacin del
Inoculacin del
microorganismo
microorganismo
Condiciones estriles
Inoculacin del
microorganismo
Aire estril
Vapor
Control de temperatura
Control de pH
Interrupcin actividad
Operaciones
celularunitarias
diversas
Interrupcin actividad
celular
Operaciones unitarias
diversas
Aire estril
Condiciones estriles
Vapor
Aire estril
Fsicos
Qumicos
Control de temperatura
Vapor
Biol{ogicos
Biolgicos
Fsicos
Qumicos
Fsicos
Biol{ogicos
Qumicos
Biol{ogicos
Control de pH
Control de temperatura
Mediciones de oxgeno
disuelto
Control
de pH
Aspersin de aire
Aspersinde
deoxgeno
aire
Mediciones
disuelto
Condiciones de
agitacin
Aspersin
de aire
Condiciones de
agitacin
Condiciones de
agitacin
Mediciones de oxgeno
disuelto
Tratamiento de
Empaque, mercadeo y
efluentes
economa del proceso
Tratamiento de
Empaque, mercadeo y
Empaque,
mercadeo
y
efluentes
economa del proceso
economa del proceso
Interrupcin actividad
celular
Operaciones
unitarias
Condiciones
estriles
diversas
medio
Propagacin del
microorganismo
FERMENTACIN
La gran aplicabilidad del etanol en procesos tradicionales (e.g., solvente, alimento, bebidas,
etc.) y el actual inters que presenta como combustible lquido, promovido como solucin
para una variedad de problemas complejos relativos a energtica y medio ambiente, lo
convierten en uno de los compuestos de mayor importancia para la industria qumica y de
mayores prospectos en el futuro, siendo por ejemplo el mercado de alcohol carburante el de
ms rpido crecimiento en Amrica y Europa [11,12]. La obtencin de combustibles lquidos
para el sector transporte a partir de biomasa renovable ha sido un campo antiguo de
investigacin [13] que arroja resultados con gran velocidad. Muestra de ello es el crecimiento
de la produccin de bioetanol en aproximadamente 10% cada ao durante la ltima dcada
[14], destacndose la produccin de Estados Unidos y Brasil, cuyas cifras se presentan en la
Tabla 2 [15].
Colombia ocupa el puesto 15 entre los productores mundiales de etanol, con un creciente
aumento en las cifras desde el inicio de la produccin en 2005, ao en el cual los ingenios
azucareros incluyeron este compuesto como un coproducto de la cadena azucarera,
estimulado gracias a la poltica de biocombustibles establecida desde el ao 2001 [2]. La
Tabla 3 [15] presenta las cifras de produccin y comercializacin nacional del bioetanol.
Tabla 2: Productores mundiales de bioetanol [15]
Productor
Estados Unidos
Brasil
Unin Europea
China
India
Otros Europa
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
7942
11525
2628
3050
1422
1262
9416
12735
2559
3150
1397
1322
11885
14568
2506
3400
1392
1379
14158
15344
2491
3500
1133
1335
16044
16120
2811
3500
1215
1379
19689
17703
3402
3550
1780
1288
26008
22221
3587
3900
2077
1359
36399
27092
4315
4150
2100
1318
Productor
Otros Asia
Canad
Otros Norte y
Centroamrica
Otros
Suramrica
Tailandia
Pakistn
Surfrica
Otros frica
Colombia
Oceana
Total
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
1102
333
1010
330
1078
330
915
330
875
355
1159
365
1160
800
1009
1000
409
390
407
423
446
519
373
642
428
411
444
472
454
498
553
584
77
42
346
164
0
176
30906
202
63
353
161
0
182
33681
207
80
358
182
0
164
38380
247
100
385
198
0
149
41180
309
137
404
204
27
149
44429
390
230
409
220
266
172
51640
411
350
378
274
272
203
63926
577
405
382
302
256
224
80755
Tabla 3: Produccin anual de alcohol carburante en Colombia y venta al mercado nacional [15]
Ao
Produccin
(millones de litros)
Ventas al mercado
nacional
(millones de litros)
2005
2006
2007
2008
2009
27
266
272
256
325
23
262
283
247
339
Captulo 1
Algunas de las materias primas ricas en azcares que son utilizadas en la produccin de
bioetanol se presentan a continuacin.
Jugos de caa de azcar y de remolacha azucarera
El jugo de caa es un lquido de color verdoso obtenido durante la molienda de la caa
azucarera, primera etapa de la produccin de azcar. Su composicin es muy variable de
acuerdo con la variedad de caa cultivada, la regin de la cual proviene y las condiciones de
la molienda, pero valores promedio de la composicin de la caa de azcar y de la remolacha
azucarera son presentados en la Tabla 4 [2,11] y la Tabla 5 [18] respectivamente.
Tabla 4: Composicin del jugo crudo de caa de azcar [2,11]
Componente
Contenido (%w/w)
Agua
Slidos solubles
Sales
Protenas
Gomas - Almidones
Sacarosa
Glucosa
Fructosa
Materia orgnica
(no azcares)
Compuestos inorgnicos
Cuerpos nitrogenados
81 - 85
15 - 19
0.23 0.67
0.08 0.11
0.05 0.11
12.5 16.72
0.3 0.76
0.3 0.76
0.5 - 1
0.2 0.6
0.5 - 1
Contenido (%w/w)
Slidos
Sacarosa
Rafinosa
Monosacridos
Polisacridos
Nitrgeno total
Sodio
Potasio
Cloruros
Nitritos
Nitratos
Fosfatos
Sulfatos
17.3
16.5
0.07
0.15
0.019
0.105
0.015
0.125
0.003
0.005
0.015
0.047
0.0199
Captulo 1
Unidad
Bx
Gravedad especfica
Slidos totales
Azcares totales
Protena cruda
Cenizas
Calcio
Fsforo
Potasio
Sodio
Cloro
Azufre
Caa de azcar
Remolacha azucarera
79.5
1.41
75
46
3
8.1
0.8
0.08
2.4
0.2
1.4
0.5
79.5
1.41
77
48
6
8.7
0.2
0.03
4.7
1
0.9
0.5
(%w/w)
Las melazas de caa de azcar se han venido utilizando en nuestro pas como materia prima
principalmente en la produccin de alimentos para animales, y en la industria microbiolgica
para la produccin de una gran variedad de sustancias y materiales como la levadura de
panificacin, acido ctrico y etanol (incluyendo el etanol para consumo humano). En este
ltimo caso su bajo costo y gran disponibilidad la hacen una materia prima ampliamente
utilizada [19,20]. La produccin nacional de melazas y especialmente la oferta al mercado
nacional y extranjero ha disminuido en los ltimos aos debido a su uso directo por parte de
los ingenios azucareros para la produccin de alcohol carburante. La Tabla 7 presenta estas
cifras [15].
Tabla 7: Produccin anual, mercado nacional y exportaciones de melaza de caa de azcar en Colombia [15]
Ao
Produccin
(toneladas)
Mercado
Nacional
Exportaciones
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
489.3
480.3
572.5
594.6
618.5
581.3
270.2
250.3
226.5
278.6
400.1
402.8
411.8
427.6
470.9
404.1
235.6
233.2
218.2
243.1
89.2
28.5
145.6
113.6
130
106.1
36
142
24.6
Materiales amilceos
El almidn es un polmero compuesto exclusivamente por unidades de glucosa, lo que lo
constituye una materia prima muy importante para la produccin de etanol. Tradicionalmente
Disponibilidad
Azcares
Amilceos
Lignocelulsicos
Relativa *
Alta
Muy Alta
Costos
Materia prima
Procesamiento
Bajo *
Bajo
Muy Bajo
Moderado
Alto **
Muy Alto **
Captulo 1
Saccharomyces cerevisiae
La levadura Saccharomyces cerevisiae, es el organismo universal para la produccin de
bioetanol usando materias primas ricas en azcar y almidn, razn por la cual esta levadura
constituye uno de los ms importantes microorganismos para el campo de la biotecnologa
[21]. Este microorganismo (el cual es usado actualmente para la produccin de bioetanol en
pases como Brasil, Estados Unidos y Colombia) presenta grandes ventajas bioqumicas y
fisiolgicas, adems de contar con miles de aos de adaptacin y domesticacin.
Tabla 9: Principales microorganismos productores de etanol con aplicacin o potencialidad industrial [12,14]
Microorganismo
Saccharomyces
cerevisiae
Schizosaccharomyces
pombe
Kluyveromyces
marxianus
Candida shehatae
Pichia stipitis
Pachisolen tannophilus
Zymomonas mobilis
Clostridium
thermocellum
Thermoanaerobacter
thermosaccharolyticum
Sustratos
fermentables
Glucosa
Fructosa
Sacarosa
Maltosa
Maltotriosa
Galactosa
Manosa
Glucosa
Fructosa
Maltosa
Sacarosa
Glucosa
Glucosa
Xilosa
Glucosa
Xilosa
Glucosa
Xilosa
Glicerol
Glucosa
Fructosa
Sacarosa
Glucosa
Celulosa
Glucosa
Xilosa
Condiciones de
fermentacin
Anaerbico
30 - 37C
Anaerbico
30 - 35C
Anaerbico
40 - 45C
Microaeroflico
20 - 31C
Microaeroflico
26 - 35C
Microaeroflico
Anaerbico
30C
Anaerbico
55 - 65C
Anaerbico
60C
Ec. 1
10
Transportador
de hexosa
Glucosa
Glucosa
ATP
HXK
Glucosa -6 fosfato
PGI
Fructosa6-fosfato
ATP
PFK
Fructosa1,6-difosfato
FBA
Dihidroxiacetona
fosfato
Etanol
Gliceraldehido-3fosfato
TPI
Etanol
NAD+
TDH
NADH +
H+
1,3-difosfoglicerato
PGK
ATP
3-fosfoglicerato
ADH
PGM
2-fosfoglicerato
ENO
Fosfoenol piruvato
PDC
Acetaldehido
CO2
PK
Piruvato
CO2
Membrana Celular
Figura 2: Ruta Embden Meyerhoff Parnas para la produccin de etanol en Saccharomyces cerevisiae [14]
De acuerdo con la Ecuacin 1, se determina que el rendimiento terico alcanzado por esta
ruta es de 0.51143 gramos de etanol por cada gramo de glucosa consumida. Pero este
rendimiento terico nunca es alcanzado en la prctica, debido principalmente a las siguientes
razones:
Los 2 ATP generados en la gluclisis son empleados de inmediato para la biosntesis
celular. De esta manera, el crecimiento est fuertemente ligado a la produccin de
etanol, por lo que la biomasa puede considerarse un subproducto de la fermentacin
generado a partir de glucosa [22].
Captulo 1
11
12
Fructosa
FRK
Glucosa
ATP
ATP
GLK
Fructosa -6 fosfato
Glucosa -6 fosfato
PGI
GPDH
6-fosfogluconato
H2O
PGD
2-Ceto-3-desoxigluconato-6fosfato
KDPA
Gliceraldehido-3fosfato
Etanol
NAD+
TDH
NADH +
H+
1,3-difosfoglicerato
PGK
ATP
3-fosfoglicerato
ADH
PGM
2-fosfoglicerato
ENO
Fosfoenol piruvato
PDC
Acetaldehido
PK
Piruvato
CO2
Figura 3: Ruta Entner Doudoroff para la produccin de etanol en Zymomonas mobilis [14]
1.3.
CONCLUSIN
Captulo 1
13
Captulo 2
15
CAPTULO 2
FACTORES AMBIENTALES, CONDICIONES DE
ESTRS Y MEJORAMIENTO DE MICROORGANISMOS
EN PROCESOS FERMENTATIVOS
El proceso fermentativo es el mayor componente dentro del rpido desarrollo de los procesos
para la produccin de etanol y debido a su potencial es necesario adquirir un completo
entendimiento de cada una de las etapas del proceso con el fin de avanzar en estrategias de
optimizacin e identificacin de oportunidades para su mejoramiento. Por esta razn, el
proceso global debe ser discriminado (i.e., pretratamiento, fermentacin, separacin y
purificacin), identificando en cada etapa las caractersticas principales y los parmetros ms
relevantes. La fermentacin es el principal paso en el proceso general, ya que limita la forma
como las materias primas deben ser brindadas al microorganismo y la generacin de
productos debe ser considerada en las etapas de separacin.
El uso de microorganismos no adaptados en la produccin de bioetanol, justifica el
incremento en las investigaciones y los esfuerzos para mejorar las capacidades metablicas
de cada especie implementada. En general, los procesos fermentativos deben ser
constantemente optimizados con el fin de maximizar el potencial de cada una de las cepas
[28], debido a que la produccin de etanol depende de la actividad microbiana,
particularmente de las levaduras [29].
Por lo tanto, existen diversas metodologas que buscan hallar microorganismos con
metabolismos extremos, adaptarlos a nuevas condiciones o brindarle genticamente nuevas
propiedades. Cada aproximacin est fundamentada en el conocimiento de los factores que
afectan el metabolismo y la fisiologa de los microorganismos, en especial como afectan al
ms utilizado a nivel industrial para la produccin de etanol: la levadura Saccharomyces
cerevisiae.
En este captulo se presentan algunos de los factores fisicoqumicos que afectan el
comportamiento fermentativo de algunos microorganismos. Con base en esto, se muestran
algunos de los principales criterios reportados en la literatura para la seleccin y bsqueda de
nuevos microorganismos productores de bioetanol y algunos campos de aplicacin.
16
2.1.
cido lctico
> 0.8% (w/v)
Temperatura
35-38C
Levadura
cido actico
> 0.05 (w/v)
pH < 3.5
In sodio
> 500 mg/L
Captulo 2
17
Todos estos factores causan que los rendimientos tericos no sean alcanzados debido a que
estas condiciones afectan la fisionoma y el metabolismo de los microorganismos. Una
descripcin ms detallada de las principales condiciones de estrs es presentada a
continuacin:
Concentracin de Etanol
Este factor afecta el comportamiento de los microorganismos fermentadores causando la
inhibicin del crecimiento microbiano, la asimilacin y la conversin de nutrientes. En el caso
de S. cerevisiae, 10% (v/v) es la concentracin mxima que permite el crecimiento de la
levadura mientras que 15% (v/v) es la mxima para el metabolismo fermentativo. El etanol
ocasiona el aumento en la fluidez y la permeabilidad de la membrana celular, generando
fugas de iones y metabolitos intracelulares [14].
Temperatura
Algunos microorganismo como Z. mobilis pueden crecer a temperaturas entre 25C y 40C
con una temperatura optima de crecimiento de 30C. La composicin, la estructura y la
concentracin de fosfolpidos en la membrana citoplasmtica son afectadas cuando la
temperatura alcanza niveles cercanos a 40C, causando la prdida de la integridad
estructural de la membrana. Adems de esto, la alta temperatura y la alteracin de la
membrana ocasionan una acumulacin intracelular de etanol, lo cual tiene un efecto negativo
sobre la viabilidad celular [32]. En el caso de levaduras como S. cerevisiae, la tasa de
produccin de etanol incrementa constantemente hasta 30C y suavemente hasta 36C,
pero decrece a temperaturas por encima de 37C. Algunas cepas pueden crecer a
temperaturas superiores de 37C y son comnmente referidas como termoflicas, mientras
otras tienen una mxima temperatura de crecimiento superior a 45C y son clasificadas
como termotolerantes [33].
Las principales ventajas de implementar fermentaciones a temperaturas elevadas incluyen el
incremento en las tasa de produccin de etanol, ahorros energticos a travs de la reduccin
de volmenes de agua de enfriamiento, disminucin de constantes paradas del proceso por
recalentamiento del medio de fermentacin (problemas usualmente encontrados en reas y
temporadas con elevadas temperaturas ambientales), facilita la extraccin continua de etanol
durante la fermentacin, reduce la posibilidad de contaminacin del medio causada por
microorganismos mesoflicos, entre otras ventajas [34,35]. Un creciente inters en el uso de
cepas termotolerantes es estimulado por la implementacin de procesos hbridos tales como
sacarificacin y fermentacin simultneas [35].
Los reportes cientficos que evalan caractersticas diversas en los procesos fermentativos
para la produccin de bioetanol son muy amplios. Estos estudios estn dirigidos a evaluar el
comportamiento del microorganismo ante ciertas condiciones de estrs durante el proceso, al
mejoramiento gentico de cepas para facultarlas de caractersticas particulares, entre otros.
Una recopilacin de las algunas variables reportadas se presenta en la Tabla 10.
18
Sustrato
Zymomonas mobilis
Melaza
Saccharomyces cerevisiae
Melaza
Levadura de panadera
Saccharomyces cerevisiae
Melaza
Melaza
Levaduras de laboratorio e
industriales
Glucosa
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Zygosaccharomyces bailii
Levaduras de laboratorio
Saccharomyces cerevisiae
Zygosaccharomyces bailii
2.2.
Parmetro evaluado
Referencia
Sacarosa
Medio YEPD
Medio YP
Temperatura y concentracin de
azcares
Termotolerancia, tolerancia a la
concentracin de sales
Microfiltracin del medio de cultivo
Esterilizacin del medio de cultivo
Actividad del agua, inhibicin del
etanol, efecto de iones metlicos y
sales.
Muerte programada
Electropermeabilidad
Fermentacin de xilosa
Glucosa
[43]
Glucosa
Propiedades antibacteriales
[44]
Medio GPY
[45]
MEJORAMIENTO DE MICROORGANISMOS
PRODUCCIN DE ETANOL VA FERMENTATIVA
[36]
[37]
[38]
[39]
[40]
[41]
[42]
[31]
PARA
LA
Debido a la importancia de los procesos fermentativos y dado que parte de ellos no se llevan
a cabo en condiciones ptimas, es necesario mejorarlos. Los procedimientos para este
mejoramiento pueden dirigirse hacia una gran cantidad de aspectos, que pueden resumirse
en [5]:
Captulo 2
19
Debe generar alto rendimiento del producto y este debe ser fcilmente separable del
medio de fermentacin.
Esta gran cantidad de caractersticas que hacen ideal algn microorganismo reflejan la
complejidad de los procesos fermentativos y aun ms, los problemas de encontrar
microorganismos adecuados por rutas de mejoramiento y seleccin, aunque estos
procedimientos suelen generar grandes beneficios.
20
Mutacin Inducida
La mutacin inducida tambin se considera un mtodo aleatorio, en el que se lleva a cabo el
proceso de mutacin a travs de un agente especfico, ya sea fsico o qumico, que induce
transiciones y combinaciones del material gentico del microorganismo [9,47].
Recombinacin Gentica
Es el proceso en el cual los elementos genticos contenidos en dos genomas separados se
unen. Consiste en la incorporacin de material gentico derivado de una especie en otra
donde este material se puede expresar. Esto significa que las caractersticas especiales slo
se conceden a un microorganismo nativo que no las tena previamente. Este es un mtodo
directo, aunque debe ir acompaado de una bsqueda de las condiciones de operacin
apropiadas [47,48].
La modificacin y mejoramiento de las caractersticas metablicas es solo una parte del
proceso global. El conjunto de microorganismos obtenidos despus de la implementacin de
algn mtodo de mejoramiento debe ser evaluado, con el fin de:
Colecciones de cultivos.
Captulo 2
21
Tamizaje
Es una determinacin cualitativa para confirmar que la actividad deseada es expresada por el
cultivo (tamizaje primario) y la evaluacin del rendimiento del producto principal del
microorganismo aislado (tamizaje secundario). El tamizaje secundario es un proceso
importante, pues permite eliminar falsos positivos o falsos negativos rpidamente, antes de
encaminarse en optimizacin de la produccin y escalado [5,9].
Tamizaje secundario
Produccin
22
2.2.2. CAMPOS DE
MICROORGANISMOS
APLICACIN
DE
PROGRAMAS
DE
SELECCIN
DE
Industria de vinos
La produccin tradicional de esta bebida alcohlica se ha llevado a cabo mediante
fermentaciones espontneas por parte de cepas silvestres de diferentes microorganismos,
principalmente levaduras. Estas cepas estn presentes en las uvas y en las instalaciones
donde se realiza la fermentacin. Todos los microorganismos involucrados en este tipo de
fermentacin proveen bebidas con especiales y especficas caractersticas sensoriales. En
estos procesos existe la gran necesidad de implementar cepas adaptadas que permitan
estandarizar las condiciones de operacin y las caractersticas deseadas del producto [49].
Para ello, una gran cantidad de estudios para la seleccin de microorganismos se han
publicado reportando la aparicin de levaduras (principalmente silvestres y cepas
recombinantes de Saccharomyces cerevisiae) con caractersticas fisiolgicas y metablicas
especiales [23].
Industria de la produccin de etanol
Los estudios actuales se enfocan fundamentalmente en la bsqueda de microorganismos con
actividades especficas por medio de la tecnologa de recombinacin de ADN para la mejora
de las cepas parentales [50]. Las principales tendencias son la obtencin de
microorganismos (especialmente levaduras y cepas de bacteria) con capacidad para la
degradacin de materiales alternativos como materiales lignocelulsicos, el aislamiento de
cepas termotolerantes, microorganismos con una resistencia alta al etanol y, en general, el
aislamiento de microorganismos que puedan sobrevivir en condiciones extremas [50].
Este conjunto de cambios genticos son posibles solo con un amplio conocimiento de las vas
bioqumicas relacionadas con el metabolito de inters y el conocimiento de los mecanismos
de regulacin enzimtica [51].
2.3.
Captulo 2
23
del sistema y del agente biolgico. Este mtodo, aparte de implicar mayor cantidad de
experimentos, puede solo proporcionar informacin parcial que limitara el alcance del
anlisis [54]. Por ejemplo, no mostrara si existe interaccin entre factores de operacin,
siendo esta una limitacin para los procesos de obtencin de bioetanol en los cuales,
interacciones entre factores (e.g., la concentracin de etanol y la temperatura del sistema
generan un efecto sinrgico sobre la actividad de la levadura Saccharomyces cerevisiae) son
de gran influencia en los rendimientos de etanol alcanzados y en algunas circunstancias
llegan a ser ms representativos que efectos individuales [14].
El diseo estadstico de experimentos contempla una amplia variedad de estrategias
experimentales que son ptimas para generar y analizar la informacin que se busca y la que
se obtiene. Una de las estrategias ms utilizadas son el diseo factorial y la Metodologa de
Superficie de Respuesta (MSR), las cuales son una serie de tcnicas estadsticas y
matemticas de utilidad para el desarrollo, mejoramiento y optimizacin de procesos [55].
Algunos de los reportes cientficos que hacen uso de este tipo de estrategias estadsticas para
el planteamiento y anlisis de experimentos referentes a la produccin de bioetanol se
presentan a continuacin.
Ergun y Mutlu [52] desarrollaron un diseo experimental para evaluar la influencia del pH, la
concentracin de sustrato y la influencia de la adicin de un compuesto nitrogenado en la
productividad de etanol a partir de melaza de remolacha azucarera empleando la levadura
Saccharomyces cerevisiae, en un sistema de fermentacin por lotes (batch). Se implement
un diseo factorial de tres niveles y de acuerdo con el anlisis de los resultados se ajustaron
expresiones matemticas que simularon la influencia de los factores analizados y con esto,
determinar las mejores condiciones de fermentacin.
La produccin de etanol a partir de melazas de caa de azcar empleando la bacteria
Zymomonas mobilis fue analizada experimentalmente por Cazzeta et l. [36]. En este estudio,
se aplic un diseo factorial para conocer la influencia de la temperatura, la concentracin de
sustrato, la agitacin del medio de cultivo y el tiempo de fermentacin de melazas de caa de
azcar, as como su interaccin en la produccin de etanol y generacin de biomasa. Adems
de ratificar la potencialidad de este microorganismo como productor de bioetanol, gracias a
su alta productividad y a sus propiedades de osmotolerancia y etanol tolerancia, los
resultados indicaron que la concentracin de sustrato es el factor ms influyente en esta
fermentacin, seguido de la temperatura. El anlisis de los resultados permiti establecer
condiciones ideales tales como concentraciones cercanas a 200 g/L de azcares reductores
totales y una temperatura de 30C, alcanzando con esto concentraciones de producto (i.e.,
etanol) de aproximadamente 56 g/L.
Los procesos productivos que hacen uso de biomasa como materias primas contienen un
nmero de variables en trminos de tecnologa y costos que deben ser considerados durante
las etapas de diseo y optimizacin. En el caso de materias primas no convencionales, como
es el caso de materiales lignocelulsicos para la produccin de etanol va fermentativa, la
cantidad de factores y sus interacciones aumentan. Aspectos como la tecnologa de
recoleccin y de conversin de materias primas son incluidos, lo que dificulta el anlisis
econmico del proceso. En este sentido, Grado y Chandra [56] compararon el impacto relativo
de varios parmetros sobre los costos de produccin de bioetanol, aplicando un diseo
factorial de 3 y 5 niveles. Entre los factores analizados se incluyen el tamao de las
instalaciones para la produccin de bioetanol a partir de residuos madereros, el deterioro de
las materias primas a causa del almacenamiento, el costo de las materias primas y la
eficiencia de la conversin enzimtica de la madera, principalmente. Este estudio representa
una gua para la reduccin de los costos finales de produccin de bioetanol.
24
2.4.
2.5.
CONCLUSIN
Captulo 3
25
CAPTULO 3
MATERIALES Y MTODOS
3.1.
MICROORGANISMOS UTILIZADOS
Denominacin
Procedencia
LO1
Microorganismo aislado de un
proceso fermentativo realizado
el da 17 de abril de 2009
LO2
Microorganismo aislado de un
proceso fermentativo realizado
el da 31 de marzo de 2009
LO3
Microorganismo aislado de un
proceso fermentativo realizado
el da 6 de marzo de 2009
ATCC 9763
Saccharomyces cerevisiae
Observaciones
Proceso fermentativo realizado
empleando melaza diluida
hasta 17Bx, temperatura de
33C
Proceso fermentativo realizado
empleando melaza diluida
hasta 18Bx, temperatura de
31C
Proceso fermentativo realizado
empleando melaza diluida
hasta 15Bx, temperatura de
30C
Empleada para la produccin
de etanol
26
Materiales y mtodos
3.2.
Melaza de caa provista por el Ingenio La Cabaa, diluida a diferentes concentraciones para
ser utilizada como medio de crecimiento y fermentacin lquido, o slido al mezclarse con
agar.
3.2.1. PRETRATAMIENTO
Dilucin: Se utiliza agua destilada o potable, segn el nivel de experimentacin (laboratorio o
piloto).
Eliminacin de slidos suspendidos: Mediante centrifugacin a 6000 RPM durante 10
minutos, son separados los slidos y la fase lquida es utilizada como medio de crecimiento
slido al ser mezclada con agar (1% w/v). La melaza utilizada en las etapas de crecimiento y
fermentaciones en medio lquido no es sometida a esta remocin.
Hidrlisis: Con el fin de desdoblar la sacarosa presente en la melaza y aumentar la cantidad
de sustrato directamente asimilable (glucosa, fructosa), se lleva a cabo una hidrlisis
empleando acido sulfrico. Las condiciones de temperatura y el tiempo de hidrlisis fueron
establecidos en 90C durante 3 horas.
100
90
80
70
60
50
0
50
100
150
200
250
300
Tiempo (min)
Adicin de nutrientes: Con el fin de suplir las deficiencias de nutrientes que tiene el medio de
fermentacin, especialmente de nitrgeno y fsforo, se adicionan los nutrientes en las
cantidades especificadas en la Tabla 12 [61], en forma lquida a partir de soluciones stock.
Tabla 12: Cantidades mnimas de nutrientes recomendadas para fermentar 100 kg de melaza [61]
Sustancia
Cantidad / 100 kg
Fosfato trisdico
Urea
Cloruro frrico
Sulfato de magnesio
101.2 g
212.2 g
1.1 g
1.1 g
Captulo 3
27
Esterilizacin: Con el fin de eliminar microorganismos que puedan interferir con la actividad
de la levadura, el medio de fermentacin o crecimiento es esterilizado. Para cantidades
menores a 1 L se emplea una esterilizacin en autoclave a 121C durante 20 minutos.
Niveles de 80 L y superiores son esterilizados solo con el sometimiento al calor durante la
etapa de hidrlisis.
3.3.
MTODOS
28
Materiales y mtodos
3.4.
3.5.
FERMENTACIONES DE 1 L, 80 L Y 300 L
Captulo 3
29
Captulo 4
31
CAPTULO 4
EVALUACIN EXPERIMENTAL DE FACTORES EN LA
FERMENTACIN DE MELAZA UTILIZANDO
LEVADURA
Con el fin de determinar la influencia de diferentes factores sobre la productividad y viabilidad
de dos cepas de Saccharomyces cerevisiae en fermentacin anaerbica empleando melaza
de caa de azcar como sustrato, se utilizan dos diseos experimentales: 1) un diseo
factorial 24 (en el cual se evala la concentracin de azcares totales, el pH inicial del medio,
la temperatura de fermentacin y el comportamiento de dos cepas de levadura) y 2) un
diseo factorial compuesto central (para evaluar con mayor precisin el efecto de la
temperatura, de la concentracin de azcares totales, determinar rendimientos alcanzados y
consumo de sustratos) a partir de los cuales se obtienen relaciones matemticas entre las
variables de respuesta (etanol, generacin de biomasa) y las variables de entrada. Un anlisis
estadstico de cada conjunto de experimentos permite determinar la influencia de cada uno
de los factores as como la evaluacin de efectos sinrgicos. Se implement la Metodologa
de Superficies de Respuesta (MSR) con el fin de seleccionar condiciones ptimas del proceso.
Dos condiciones de fermentacin con elevados rendimientos de producto segn el anlisis
MSR fueron seleccionadas con el fin de realizar procesos a nivel piloto. Fermentaciones de 1
L y 300 L fueron llevadas a cabo con el fin de determinar el nivel de generalizacin de los
resultados obtenidos a nivel de laboratorio, analizar el comportamiento de las cepa LO1 bajo
estas condiciones y ajustar los parmetros de un modelo cintico para el proceso de
produccin de bioetanol a partir de melaza de caa de azcar. Mediante simulacin y anlisis
econmico se compararon los requerimientos energticos y la viabilidad econmica del
proceso fermentativo llevado a cabo bajo las condiciones seleccionadas.
La cepa LO1, por presentar mejor comportamiento y rendimiento de etanol en las
fermentaciones anteriormente descritas, fue utilizada para evaluar procesos no
convencionales. Se realizaron fermentaciones con elevada concentracin de azcares totales
en el sustrato y con aireacin para evaluar el comportamiento de los microorganismos bajo
estas condiciones (efecto Crabtree).
32
4.1.
4.2.
DISEO FACTORIAL 24
Captulo 4
33
efecto de cada factor es cuantificado segn la influencia que tiene sobre la productividad de
bioetanol (g/L) y sobre la generacin de biomasa (cel/ml).
Tabla 13: Factores seleccionados y dominio experimental establecido en el diseo factorial 24
Cdigo de valores
Variables
A: Concentracin de melaza (Bx)
B: pH inicial del medio
C: Temperatura de fermentacin (C)
D: Cepa utilizada
(-1)
(+1)
12
4
28
ATCC 9763
20
5.2
35
LO1
Variables
A
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
-1
+1
+1
-1
-1
+1
+1
-1
-1
+1
+1
-1
-1
+1
+1
+1
+1
+1
+1
-1
-1
-1
-1
+1
+1
+1
+1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
+1
+1
+1
+1
+1
+1
+1
+1
34
70
2,5E+8
Etanol (g/L)
Biomasa (cel/ml)
60
2,0E+8
1,5E+8
40
30
1,0E+8
B I OMASA (cel/ml)
50
20
5,0E+7
10
0,0E+0
10
11
12
13
14
15
16
EX PERIMENTO
Tabla 15: Efectos estimados para las variables de respuesta ETA y DCEL
Efecto
ETA*
(g/L)
DCEL*
(cel/ml)
Promedio**
A
B
C
D
AB
AC
AD
BC
BD
CD
34.48 1.66
20.36 3.33
2.96 3.33
-9.14 3.33
7.54 3.33
3.50 3.33
-7.49 3.33
8.43 3.33
0.81 3.33
-7.16 3.33
-0.19 3.33
1.32x108 3.39x106
-1.04x107 6.79x106
5.24x107 6.79x106
-1.17x108 6.79x106
3.46x107 6.79x106
1.63x107 6.79x106
-1.59x107 6.79x106
-4.51x106 6.79x106
-1.51x107 6.79x106
-1.02x107 6.79x106
-7.39x106 6.79x106
La importancia de cada efecto sobre las variables de respuesta puede ser determinada de
mejor manera mediante un anlisis de varianza (ANOVA), con respecto a los valores del
estadstico F. Los resultados de este anlisis se muestran en la Tabla 16.
Captulo 4
35
48
ETANOL (g/L)
44
40
36
32
28
24
BRIX
PH
CEPA
(X 1,E7)
19
DCEL (cel/ml)
17
15
13
11
9
7
BRIX
PH
CEPA
ETA (g/L)
DCEL (cel/ml)
Valor-P*
Valor-P*
0.0017
0.4151
0.0406
0.0729
0.3412
0.0742
0.0524
0.8175
0.0841
0.955
0.1874
0.0006
0
0.0038
0.0614
0.0666
0.5356
0.0772
0.1928
0.3261
La tabla ANOVA particiona la variabilidad de ETA y de DCEL en piezas separadas para cada
uno de los efectos. Entonces prueba la significancia estadstica de cada efecto comparando
su cuadrado medio contra un estimado del error experimental. En este caso, 2 efectos tienen
36
una valor-P menor que 0.05 (para el etanol) y 3 efectos tienen un valor-P menor que 0.05
(para la generacin de biomasa), indicando que son significativamente diferentes de cero con
un nivel de confianza del 95%.
A partir del conjunto de experimentos, se correlacionan los datos experimentales con el fin de
presentar un modelo de cada variable de respuesta. La correlacin entre los valores
predichos por el modelo ajustado y los valores experimentales se muestran en las Figuras 14
y 15 as como en las Ecuaciones 2 y 3, para ETA y DCEL respectivamente.
65
55
45
35
R = 0,9316
25
15
15
25
35
45
55
65
Figura 14: Comparacin entre los valores tericos y experimentales para la produccin de etanol
3E+8
2E+8
1E+8
R = 0,9878
0E+0
0E+0
1E+8
2E+8
3E+8
Figura 15: Comparacin entre los valores tericos y experimentales para la generacin de biomasa
Ec. 2
Captulo 4
cel
7
7
8
6
DCEL
= -7.9210 + 917187 A + 9.8710 D + 1.0210 B + 8.9110 C - 564063 AD
ml
+ 3.40106 AB - 566518 AC + 8.51106 DB - 1.055106 CD - 3.59106 BC
37
Ec. 3
38
corrobora lo establecido, mostrando como las variables A (Bx) y C (T) tienen un efecto
estadsticamente mayor sobre la productividad de etanol, mientras que C (C) y B son ms
influyentes sobre la generacin de biomasa en ambas cepas de levadura.
La interaccin entre factores se muestra tambin en las Tablas 15 y 16. La interaccin ms
representativa estadsticamente sobre la produccin de etanol son AC, AD y BD. De acuerdo
con esto, la interaccin entre A y D es positiva, indicando que la productividad de etanol es
mejorada empleando la cepa LO1 y una concentracin de melaza de 20Bx, combinacin que
genera en promedio un aumento en el nivel de etanol de 8.43 g/L. Otra interaccin positiva
es entre A y B, mostrando que la productividad de etanol se favorece a pH altos y
concentraciones elevadas de melaza. Cabe destacar que su efecto no es tan considerable,
aumentando la concentracin de etanol producida en 3.5 g/L. Por su parte, efectos negativos
son generados por la interaccin entre la concentracin de melaza y temperatura (AC) y entre
pH y la cepa utilizada (BD).
El anlisis de efectos interactivos sobre la generacin de biomasa indica que las
interacciones ms importantes son aquellas establecidas entre AB, AC y BC. Concentraciones
altas de sustrato generan mayor cantidad de biomasa cuando el pH del medio es cercano a
5.2, indicando que medios ms cidos potencian el efecto negativo de la presin osmtica
sobre la viabilidad celular. El efecto negativo que genera la interaccin entre la concentracin
de azcares y la temperatura afecta en promedio la generacin celular en 1.59x107 cel/ml
cuando se emplean medios con altos niveles de azcares y temperaturas altas o de baja
concentracin y baja temperatura.
Correlacin entre variables
Los experimentos relacionados permitieron obtener un modelo que relaciona con buen ajuste
las variables de operacin principales sobre la produccin de etanol y la generacin de
levadura durante un proceso fermentativo. La correlacin obtenida es de 93.2% y 98.8% para
el etanol producido y la biomasa generada despus de 24 horas de fermentacin
respectivamente.
Comparacin entre las cepas LO1 y ATCC 9763
La cepa LO1 presenta un mejor comportamiento comparada con la cepa ATCC 9763 como se
plante anteriormente. Las Figuras 16 y 17 presentan la comparacin entre ambas cepas en
condiciones de fermentacin similares en la produccin de etanol y en la generacin de
biomasa.
En trminos generales, ambas cepas presentaron un mejor comportamiento a pH de 5.2 en
comparacin con pH de 4, condiciones bajo las cuales se alcanz un mayor nivel de etanol y
de biomasa. La cepa ATCC 9763 alcanz mayor productividad de etanol que la LO1 a bajas
concentraciones de azcares totales (12Bx), resultado que se invierte a condiciones de
20Bx. Como se mostr anteriormente, en promedio la cepa LO1 presenta un mejor
comportamiento que la cepa de levadura ATCC 9763, influenciado por su mejor adaptacin a
concentraciones mayores de sustrato. La cepa LO1 genera mayores niveles de biomasa en
cualquier condicin de fermentacin. Las mejores condiciones de fermentacin para ambas
cepas son 20Bx, 28C y pH de 5.2.
Captulo 4
39
70
ATCC 9763
LO1
60
E TANOL (g/L)
50
40
30
20
10
(20 - 35 - 5.2)
(20 - 35 - 4)
(20 - 28 - 5.2)
(20 - 28 - 4)
(12 - 35 - 5.2)
(12 - 35 - 4)
(12 - 28 - 5.2)
(12 - 28 - 4)
(BRIX - T - PH)
Figura 16: Comparacin entre las cepas ATCC 9763 y LO1 con respecto a la produccin de etanol
3,0E+8
ATCC 9763
LO1
D CEL (cel/ml)
2,5E+8
2,0E+8
1,5E+8
1,0E+8
5,0E+7
(20 - 35 - 5.2)
(20 - 35 - 4)
(20 - 28 - 5.2)
(20 - 28 - 4)
(12 - 35 - 5.2)
(12 - 35 - 4)
(12 - 28 - 5.2)
(12 - 28 - 4)
(BRIX - T - PH)
0,0E+0
Figura 17: Comparacin entre las cepas ATCC 9763 y LO1 con respecto a la generacin de biomasa
4.3.
De acuerdo con los resultados del diseo factorial anterior, se establece que las variables
ms influyentes sobre la produccin de etanol son la concentracin de azcares totales y la
temperatura. Por esta razn, con el fin de mejorar el anlisis del proceso fermentativo y la
correlacin entre variables de operacin, se realiz un diseo factorial compuesto central
para estudiar el efecto de estos dos factores.
La concentracin de azcares iniciales en el medio (A, Bx) y la temperatura de fermentacin
(B, C) fueron elegidos como variables independientes en el diseo experimental. Las
variables de respuesta o variables dependientes de inters son la produccin de etanol (ETA,
g/L) y la generacin de biomasa (DCEL, cel/ml).
40
Variables
A: Concentracin de melaza (Bx)
B: Temperatura (C)
(-2)
(-1)
(0)
(+1)
(+2)
10
28
12
30
16
34
20
38
22
40
Exp No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
-1
-1
+1
+1
0
0
+2
0
-2
-1
+1
-1
+1
0
-2
0
+2
0
i 1
i 1
i j
Ec. 4
Captulo 4
41
YPS =
%E =
(PF - PO )
(SO - SF )
Ec. 6
100 (PF - PO )
0.511 (SO - SF )
Ec. 7
Donde Yps representa el rendimiento de producto con respecto al sustrato consumido (g/g) y
%E es la eficiencia de la produccin de etanol con respecto al valor terico. S y P representan
la concentracin de sustrato (azcares totales) y de producto (g/L) respectivamente. Los
subndices F y O corresponden a estado final e inicial.
70
3,0E+8
Etanol (g/L)
Biomasa (cel/ml)
60
2,5E+8
2,0E+8
40
1,5E+8
30
1,0E+8
B I OMASA (cel/ml)
50
20
5,0E+7
10
0,0E+0
1
EX PERIMENTO
Tabla 19: Rendimiento de etanol y eficiencia alcanzada en cada experimento del diseo factorial compuesto
central
Exp No.
Yps (g/g)
%E
1
2
3
4
5
6
0.497
0.496
0.452
0.485
0.434
0.480
95.87
95.57
86.98
93.32
83.54
92.35
42
Yps (g/g)
%E
7
8
9
Promedio
0.318
0.423
0.424
0.445
61.17
78.98
81.88
85.52
42
ETANOL (g/L)
3,43
40
31,61
B: Temperatura (C)
38
48,03
2
36
22,33
34
41
39,39
32
30
31,71
49,97
28
41,73
26
8
10
12
14
16
18
20
22
24
A: BRIX
(a)
42
CEL (cel/ml)
8,4x105
40
7,4x107
B: Temperatura (C)
38
4,8x107
2
36
1,5x108
34
1,7x108
1,9x108
32
30
2x108
2,7x108
28
2,5x108
26
8
10
12
14
16
18
20
22
24
A: BRIX
(b)
Figura 19: Resultados generales del diseo factorial compuesto central en funcin de la temperatura y la
concentracin de azcares. Produccin de etanol (a) y generacin de biomasa (b)
El efecto de cada uno de los factores sobre las variables de respuesta es mostrado tanto en la
Tabla 20 como en las Figura 20 y 21. El efecto de la interaccin entre ambos factores
tambin se presenta en la Tabla 20.
Captulo 4
43
Tabla 20: Efectos estimados para las variables de respuesta ETA y DCEL para el diseo factorial compuesto central
Efecto
ETA*
(g/L)
DCEL*
(cel/ml)
Promedio**
A
B
AB
43.74 16.15
25.35 16.84
-21.10 16.84
-3.28 36.83
1.96x108 5.54x106
2.48x107 5.78x106
-2.56x108 5.78x106
-1.06 x108 1.26 x107
ETANOL (g/L)
49
39
29
19
10,0
22,0
28,0
BRIX
40,0
T
(X 1,E7)
29
DCEL (cel/ml)
24
19
14
9
4
-1
10,0
22,0
BRIX
28,0
40,0
T
La importancia de cada efecto sobre las variables de respuesta puede ser determinada de
mejor manera mediante un anlisis de varianza, con respecto a los valores del estadstico F.
Los resultados de este anlisis se muestran en la Tabla 21.
La tabla ANOVA particiona la variabilidad de ETA y de DCEL en piezas separadas para cada
uno de los efectos. Entonces prueba la significancia estadstica de cada efecto comparando
su cuadrado medio contra un estimado del error experimental. En este caso, ninguno de los
efectos tiene un valor-P menor que 0.05 (para la concentracin de bioetanol) y los 3 efectos
44
tienen un valor-P menor que 0.05 (para la generacin de biomasa), indicando que son
significativamente diferentes de cero con un nivel de confianza del 95%.
Tabla 21: Resultado ANOVA para el diseo factorial compuesto central
Efecto
ETA (g/L)
DCEL (cel/ml)
Valor-P*
Valor-P*
0.2293
0.2991
0.9346
0.0233
0.0000
0.0036
A:Concentracin
B:Temperatura
AB
A partir del conjunto de experimentos, se correlacionan los datos experimentales con el fin de
presentar un modelo para la produccin de bioetanol como para la generacin de biomasa en
funcin de la concentracin de sustrato y la temperatura de fermentacin. Las superficies de
respuesta y los grficos de contorno se presentan en las Figuras 22 y 23. Las ecuaciones del
modelo ajustado y la respectiva correlacin se muestran en las Ecuaciones 8 y 9.
sign-Expert Software
ctor Coding: Actual
nol
Design points above predicted value
Design points below predicted value
54.9677
Design-Expert Software
Factor Coding: Actual
Etanol
Design Points
54.9677
22.969
Bioetanol
(g/L)
Etanol (g/L)
40.00
54.0874
50.4439
49.066
22.969
= A: Concentracin
= B: Temperatura
60
Temperatura
44
36
28
22.00
20
B: Temperatura (C)
Etanol (g/L)
Bioetanol (g/L)
37.00
X1 = A: Concentracin
X2 = B: Temperatura
52
32.2261
35.8697
39.5132
43.1568
27.5844
31.00
49.066
50.4439
19.00
40.00
37.00
46.8003
34.00
16.00
34.00
B: Temperatura
Temperatura(C)
13.00
31.00
A: Concentracin
Sustrato (Brix)
54.0874
28.00
10.00
28.00 10.00
13.00
16.00
19.00
22.00
A: Sustrato (Brix)
Concentracin
Figura 22: Superficie de respuesta para la produccin de bioetanol como funcin de la concentracin de sustrato y
la temperatura de fermentacin
Captulo 4
45
Design-Expert Software
Factor Coding: Actual
Biomasa
Design points above predicted value
Design points below predicted value
2.72446E+008
Design-Expert Software
Factor Coding: Actual
Biomasa
Design Points
2.72446E+008
4.82745E+007
Biomasa
(cel/ml)
Biomasa
40.00
6.04778E+007
4.82745E+007
3E+008
X1 = A: Concentracin
X2 = B: Temperatura
1.01911E+008
37.00
X1 = A: Concentracin
X2 = B: Temperatura
Temperatura
2E+008
1.5E+008
1E+008
5E+007
B: Temperatura (C)
(cel/ml)
Biomasa (cel/ml)
Biomasa
2.5E+008
1.43344E+008
1.84778E+008
34.00
2.26211E+008
0
31.00
28.00
22.00
2.67644E+008
31.00
19.00
34.00
16.00
A:Concentracin
Sustrato (Brix)
37.00
13.00
B: Temperatura
Temperatura(C)
28.00
10.00
13.00
16.00
19.00
A: Sustrato (Brix)
10.00 40.00
Concentracin
Figura 23: Superficie de respuesta para la generacin de biomasa como funcin de la concentracin de sustrato y
la temperatura de fermentacin
g
ETA = 199.33 + 9.29 A - 15.02 B - 0.173 A2 - 0.0045 A B + 0.235 B 2
L
R 2 = 0.9077
Ec. 8
cel
9
7
8
5
2
6
6
2
DCEL
= - 2.52610 + 8.3610 A + 1.4110 B - 9.6710 A - 1.4810 A B - 2.0510 B
ml
R 2 = 0.9985
Ec. 9
100
FRU
GLU
SAC
90
80
%C o nsumo
70
60
50
40
30
20
10
0
28
30
34
38
40
22.00
46
Captulo 4
47
4.4.
48
Condicin 1
Cepa
Temperatura (C)
Concentracin de sustrato (Bx)
pH
Tiempo de fermentacin (h)
%E a nivel experimental*
Condicin 2
LO1
28
16
38
20
4
24
92.35
93.32
Temperatura
(C)
Concentracin
(Bx)
30
12
38
12
100 ml
38
20
28
16
38
20
1L
28
16
38
20
300 L
28
16
Nivel experimental
Nivel industrial
Nivel industrial con medios ricos en sacarosa
%E
Referencia
95.87
95.57
93.32
92.35
88.7
90.1
85.74
88.16
90 - 95%
87 - 93%
93%
Este trabajo
[63]
[13]
Ec. 10
dS
-rs
dt
Ec. 11
dP
-rp
dt
Ec. 12
m
rx max
S
X
P
exp -Ki S 1 1 X
Ks S
Xmax Pmax
rp Ypx rx mp X
Ec. 14
Ec. 13
Captulo 4
49
r
rs x mx X
Yx
Ec. 15
Ec. 16
Donde TDP representa cada uno de los parmetros dependientes de la temperatura, a y b son
las constantes ajustadas y T la temperatura de fermentacin (C).
En la Tabla 24 se presentan los valores de los parmetros ajustados del modelo cintico. La
Figura 25 muestra el ajuste par a las fermentaciones realizadas bajos las Condiciones 1 y 2
descritas anteriormente. El porcentaje de error alcanzado es de 7.2% y 9.1% para ambas
condiciones. Estos valores son satisfactorios debido a los bajos niveles de error y este modelo
puede ser utilizado confiablemente.
Tabla 24: Parmetros ajustados para el modelo cintico
Parmetro
Unidades
Valor
Ks
Ki
mp
mx
m
n
kg/m
kg/m
kg/kg h
kg/kg h
-
4.1
0.0028
0.1
0.2
1
1
max
Xmax
Pmax
Yx
Ypx
h-1
kg/m
kg/m
kg/kg
kg/kg
A
6.3738
-2261.2
-254
6.2057
-108.49
B
-0.0196
7.5962
0.9623
-0.0197
0.3652
50
Xpred
Spred
Ppred
120
100
120
80
60
40
20
Xpred
Spred
Ppred
100
80
60
40
20
0
0
10
15
20
25
30
10
15
20
25
30
Tiempo (h)
Tiempo (h)
(a)
(b)
Figura 25: Ajuste del modelo cintico para la Condicin 1 (a) y la Condicin 2 (b)
4.5.
Gas
Yeast
5
Sugarcane
molasse
Sulfuric
acid
Azeotropic
ethanol
4
Fermentation
gases
Water
Inoculum
3
1
Yeast
recycle
10
Bottoms
Culture
broth
Regenerate
6
Condensed
water
Anhydrous
ethanol
Concentrated
stillage (Fertilizer)
Figura 26: Diagrama de la produccin de bioetanol a partir de melaza de caa de azcar. 1. Mezclador, 2. Reactor
de hidrlisis, 3. Intercambiador de calor, 4. Tanque de propagacin de levadura, 5. Columna de absorcin, 6.
Tanque de fermentacin, 7. Columna de concentracin, 8. Columna de rectificacin, 9. Evaporador para
tratamiento de vinazas, 10. Deshidratacin va tamices moleculares
Captulo 4
51
52
inters anual del 16.02% (tpico de la economa colombiana), teniendo en cuenta el mtodo
de depreciacin en lnea recta y un impuesto sobre la renta del 33%. Los precios y los datos
econmicos utilizados en este anlisis corresponden a las condiciones colombianas y se
determinan con una tasa de cambio de 1800 pesos colombianos por dlar de los EE.UU. La
informacin de costos de materia prima, costos de servicios y los costos de los productos se
muestran en la Tabla 26.
Tabla 25: Informacin principal utilizada en la simulacin del proceso
Caracterstica
Valor
Condicin 1
Condicin 2
Materia prima
Melaza de caa de azcar
Composicin
Agua 18.8%, Hexosa 8.9%, Sacarosa 71.3%, Cenizas 0.89%
Pretratamiento
Hidrlisis cida
Agente
H2SO4
Concentracin del cido
13.5 g/kg melaza
pH
4
Temperatura
90C
Presin
1 atm
Tiempo de residencia
3h
Fermentacin
Proceso por lotes
Agente
Saccharomyces cerevisiae LO1
Pre inculo
10% del volumen total de fermentacin
Densidad celular inicial
5x106 cel/ml
Temperatura
28C
38C
Concentracin de azcares
16Bx
20Bx
pH
4
Tiempo de residencia
20 h
23 h
Separacin
Concentracin y rectificacin.
Numero de etapas
10
Tipo de condensador
Total
Presin
1 atm
Deshidratacin de bioetanol
Tamices moleculares
Nmero de unidades
2
Temperatura
116C
Presin
1.7 atm (adsorcin), 0.14 atm (desorcin)
Tiempo de ciclo
10 min
Captulo 4
53
Unidad
Costo
US$/kg
0*
US$/kg
0.0204
US$/kWh
US$/m3
US$/ton
0.03
0.01
8.18
US$/h
US$/h
3.3
4.95
Tabla 27: Flujos msicos y composiciones de algunas corrientes de proceso para la produccin de bioetanol bajo
la Condicin 1
Corriente
Componente
Etanol
Agua
Sacarosa
Hexosa
Ceniza
Levadura
Otros
Total (kg/h)
Medio de
Melaza diluida
fermentacin
(%w/w)
(%w/w)
0
84.77
13.38
1.67
0.16
0
0
134475
0.07
84.73
4.43
10.22
0.23
0.06
0.25
133743.26
Bioetanol
anhidro
(%w/w)
Vinazas
concentradas
(%w/w)
99.5
0.41
0
0
0
0
0.09
7771.32
0.02
42.46
6.27
17.89
0
0
33.35
985.15
Tabla 28: Flujos msicos y composiciones de algunas corrientes de proceso para la produccin de bioetanol bajo
la Condicin 2
Corriente
Componente
Etanol
Agua
Sacarosa
Hexosa
Ceniza
Levadura
Otros
Total (kg/h)
Medio de
Melaza diluida
fermentacin
(%w/w)
(%w/w)
0
80.97
16.72
2.09
0.2
0
0
107601.62
0.1
81.03
0.45
0.75
0.26
0.03
17.36
106921.93
Bioetanol
anhidro
(%w/w)
Vinazas
concentradas
(%w/w)
99.5
0.34
0
0
0
0
0.16
8070.43
0.01
42.55
6.14
17.76
0
0
33.53
992.85
La cantidad de vinaza generada en el proceso por cada litro de etanol obtenido a partir de la
simulacin (i.e., 11.4 y 8.46 L de vinaza / L de bioetanol, tanto para la Condicin 1 y
Condicin 2) est dentro del rango reportado por Quintero et l. [2] a partir de datos
54
0.5
Vinaza / Bioetanol
Bioetanol / Melaza
12
0.45
0.35
0.3
0.25
6
0.2
0.15
0.4
10
0.1
2
0.05
C ondicin 1
C ondicin 2
Figura 27: Relacin entre el bioetanol producido, vinaza generada y melaza alimentada para la Condicin 1 y la
Condicin 2
Captulo 4
55
20000
16000
12000
8000
4000
C ondicin 1
C ondicin 2
Unidad
Condicin 1
Condicin 2
Mill. US$/ao
Mill. US$/ao
Mill. US$/ao
Mill. US$/ao
Mill. US$/ao
Mill. US$/ao
Mill. US$/ao
Mill. US$/ao
Mill. L/ao
US$/L
1.119
0.118
0.129
3.529
5.454
2.082
0.160
7.376
77.125
0.096
0.850
0.118
0.117
3.223
5.138
2.013
0.161
6.890
80.060
0.087
El coste del bioetanol producido por los dos procesos analizados se presenta en la Tabla 30.
Este valor se compara con los costos reportados en la literatura con diferentes materias
primas. El costo de bioetanol a partir de melaza de caa de azcar es claramente ms
econmico, debido principalmente a los costos de pre-tratamiento (i.e., en el caso de la
melaza de caa de proceso es tecnolgicamente sencillo) y el costo de las materias primas,
56
4.6.
Materia prima
Costo de produccin
(US$/L)
0.16 - 0.22
0.25 - 0.42
0.38 - 0.48
0.28 - 0.77
0.087 - 0.096
Referencia
[2]
[66]
Este trabajo
Captulo 4
57
Crabtree 1
Crabtree 2
V inculo (L)
V mosto (L)
Agitacin (RPM)
pH inicial
AR iniciales (g/L)
T inicial (C)
7
79.5
300
4.1
264
31.2
7
80
340
4.3
130
32.5
Variable
Crabtree 1
Crabtree 2
ARo (g/L)
ARmx (g/L)
ARf (g/L)
Celo (cel/ml)
Celmx (cel/ml)
Celf (cel/ml)
Etanolf (g/L)
Yps
Eficiencia (%)
264.4
312.5
86.4
56.4
0.178
34.9
130.4
169.9
25.2
53.3
4.9x107
6.8x107
53.3
0.2629
51.5
350
70
300
60
250
50
200
40
150
30
100
20
50
10
0
0
10
20
30
t (h)
40
AR
50
Etanol
Etanol (g/L)
AR (g/L)
58
8E+7
180
7E+7
160
120
Cel/ml
5E+7
100
4E+7
80
3E+7
60
2E+7
AR - Etanol (g/L)
140
6E+7
40
1E+7
20
0E+0
0
0
10
20
30
t (h)
40
Biomasa
50
AR
Etanol
Captulo 4
4.7.
59
CONCLUSIN
Captulo 5
61
CAPTULO 5
PROTOCOLO PARA LA SELECCIN DE
MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN LA
PRODUCCIN DE ETANOL VA FERMENTATIVA
Los enfoques empleados en la actualidad para mejorar la eficiencia y rendimiento de
sustratos azucarados, amilceos y lignocelulsicos son de tipo tecnolgico y microbiolgico,
siendo el primero altamente dependiente del segundo. Est claro que el xito del proceso de
produccin de bioetanol depende del desempeo de un microorganismo particular y este a su
vez est restringido por las caractersticas metablicas. Un ejemplo del anterior postulado es
que la utilizacin de microorganismos con ciertas caractersticas (e.g., el consumo directo de
material lignocelulsico y produccin de etanol) hara innecesarios el uso de algunas
operaciones de pretratamiento de materias primas [46].
Como se present en el Captulo 2, un procedimiento de seleccin debe incluir una gran
cantidad de factores y variables (lo que aumenta su grado de complejidad y disminuye el
porcentaje de xito), que pueden analizarse de acuerdo con distintas perspectivas. Una de
ellas es el enfoque experimental, en el cual se evala el comportamiento de los
microorganismos ante condiciones de operacin a nivel de laboratorio o nivel piloto,
seleccionando aquel que cumpla con los requerimientos de productividad, viabilidad y
estabilidad planteados. Aunque a simple vista es el mtodo ms preciso y exitoso, los altos
costos incurridos, la duracin de los experimentos y anlisis, las innumerables caractersticas
que afectan o favorecen el comportamiento metablico de determinado microorganismo y la
necesidad de personal especializado, hacen de la experimentacin exhaustiva una ruta poco
factible para su aplicacin a nivel industrial. Por esta razn, un protocolo sencillo, que haga
uso de informacin terica, criterios bioqumicos y microbiolgicos, y en menor proporcin de
experimentacin, es de gran utilidad en los procesos de produccin de bioetanol a partir de
una materia prima especfica y bajo determinadas condiciones de operacin [46].
Los dos criterios de mayor importancia para seleccionar un microorganismo son la obtencin
de niveles elevados de etanol en tiempos cortos. Pero no son los nicos criterios a considerar,
ya que de acuerdo con la materia prima a emplear, el tipo de aplicacin del producto a
obtener y restricciones ambientales y econmicas, deben cumplirse otros requisitos. Una
posible secuencia de pasos para la seleccin de los microorganismos ms apropiados para la
produccin de bioetanol es presentado a lo largo de este captulo, para los tres tipos
principales de materias primas (e.g., materiales azucarados, amilceos y lignocelulsicos). Se
consideran los microorganismos de actual o potencial utilizacin, pero de real y libre
comercializacin.
62
5.1.
CONSIDERACIONES INICIALES
Captulo 5
63
Tipo de sustrato
Criterios de seleccin
Sustratos asimilables
Temperatura de operacin
pH de operacin
Tolerancia al etanol
Modo de operacin (por lotes, por
lotes alimentados o continuo)
Sustratos asimilables
Tolerancia a compuestos txicos
Temperatura de operacin
Tolerancia al etanol
Temperatura de operacin
pH de operacin
Concentracin de sustrato
Tolerancia al etanol
Temperatura de operacin
Amilceos
Bacterias y levaduras
Lignocelulsicos
Azucarados
5.2.
CRITERIOS PRINCIPALES
MICROORGANISMOS
PARA
LA
SELECCIN
DE
64
Procesos hbridos son muy atractivos para generar grandes ahorros a nivel energtico.
La diferencia entre las temperaturas de sacarificacin (65C, optima de la
glucoamilasa) y de fermentacin (30 32C, adecuada para la levadura) implica
requerimientos de enfriamiento. Por lo tanto, procesos de sacarificacin y
fermentacin simultneas del almidn pueden requerir del uso de microorganismos
que toleren temperaturas cercanas a los 50C sin perder su actividad fermentativa
[12,29,71].
Captulo 5
65
66
5.3.
Captulo 5
67
Este conocimiento debe ser relacionado con las condiciones de operacin y con las
caractersticas de la materia prima con el fin de construir el criterio de seleccin 1,
fundamentado principalmente en los aspectos mencionados a lo largo de este captulo. Una
relacin nula o escasa entre la hoja de vida de cada microorganismo y las caractersticas del
proceso, arroja un rechazo del mismo. A su vez la carencia de informacin bibliogrfica y el
acoplamiento entre las condiciones del proceso y la actividad del microorganismo obligan a
establecer nuevos criterios fundamentados en informacin experimental.
68
Rpida propagacin del preinculo: entre 10 y 15 horas para alcanzar niveles que
garanticen una concentracin inicial de microorganismos 1x106 cel/ml en el medio de
fermentacin.
Los criterios 3 y 4 adems de cumplir con las condiciones mostradas en el criterio 2, debe
cumplir con:
En esta seccin debe existir concordancia entre los resultados obtenidos en cada nivel. Este
es un parmetro de importancia ya que permite garantizar en un mayor porcentaje la
reproducibilidad de la informacin obtenida a niveles de fermentacin a gran escala. Por esta
razn, la determinacin de la concordancia entre resultados es el ltimo criterio establecido
antes de seleccionar el microorganismo con la mayor productividad y estabilidad, para pasar
posteriormente a pruebas a gran escala.
Los microorganismo rechazados en esta etapa pueden ser sometidos a procedimientos de
evaluacin posteriores, modificando las variables ms influyentes sobre su actividad
productiva (e.g., para la produccin de etanol a partir de melazas se mostr en el Captulo 4 el
efecto de la concentracin de sustrato y de la temperatura de fermentacin sobre la
productividad y viabilidad de la levadura S. cerevisiae), pero tales modificaciones deben estar
dentro de los lmites de operacin del proceso.
Captulo 5
5.4.
69
CONCLUSIN
Conclusiones generales
71
CONCLUSIONES GENERALES
El desarrollo del programa experimental y de las generalidades tericas presentadas en este
trabajo, permiten concluir que:
La importancia de los procesos fermentativos a nivel econmico y ambiental justifican los
esfuerzos investigativos para mejorarlos constantemente. Adems, la escasez de materias
primas y los nuevos requerimientos ambientales hacen necesario para las industrias
adelantar constantemente este tipo de procedimientos, implementar nuevas tecnologas,
buscar nuevos microorganismos y nuevos criterios de seleccin para aumentar la
productividad de bioetanol.
El anlisis experimental del proceso fermentativo para la produccin de bioetanol a partir de
melaza de caa de azcar permite conocer con mayor claridad las caractersticas de la cepa
LO1 y de la cepa ATCC 9763. Del correcto planteamiento de un diseo experimental depende
la obtencin de informacin de calidad, concluyente y que permita conocer el comportamiento
del microorganismo ante determinadas condiciones de operacin. Por eso se demostr en
este trabajo que el diseo factorial y sus variantes permiten obtener informacin amplia a
costa de limitados experimentos.
Un ejemplo de aislamiento de microorganismos se present en este trabajo. La escala bajo la
cual se desarroll (i.e., aislamiento de un microorganismo de un proceso fermentativo a nivel
piloto) muestra la posibilidad de desarrollar estrategias a otros niveles como en industrias de
mayor tamao, ambientes naturales etc. Se resalta la importancia de conocer tcnicas
microbiolgicas para el aislamiento, purificacin, adaptacin y siembra de microorganismos.
Se aisl una cepa de Saccharomyces cerevisiae (LO1) que tiene un buen comportamiento en
la fermentacin a nivel experimental y piloto de melazas de caa de azcar para la
produccin de bioetanol, tanto en condiciones de operacin convencionales como no
convencionales. Se destacan sus caractersticas de nativa, no modificada genticamente y
termotolerante.
Se obtuvo una cepa que alcanz porcentajes de eficiencia superiores al 90% en
fermentaciones a nivel experimental y superiores a 80% en niveles mayores (i.e., 1 L y 300 L).
Su productividad es mayor que la demostrada por la cepa comercial etanlica ATCC 9763.
Estos valores de eficiencia la pueden catalogar como un buen candidato para su uso en
escalas mayores o en posteriores procesos de adaptacin y optimizacin, que puedan mejorar
su capacidad fermentativa.
El diseo experimental planteado es una buena herramienta para la evaluacin y prediccin
del comportamiento de un microorganismo, para comparar microorganismos y para
seleccionar condiciones de operacin que maximicen la productividad del proceso, incluyendo
nuevas alternativas de operacin.
72
Conclusiones generales
Perspectivas futuras
73
PERSPECTIVAS FUTURAS
El desarrollo de este trabajo permite plantear algunas perspectivas futuras:
El diseo factorial puede incluir mayor nmero de variables. Esto permite aumentar la
exactitud del proceso de seleccin, seleccionar condiciones de operacin ptimas y
establecer criterios de seleccin ms exactos.
Otros microorganismos (otras levaduras y bacterias) pueden ser incluidas dentro del diseo
experimental, as como otros sustratos de inters como materiales amilceos y residuos
lignocelulsicos.
Explorar nuevas fuentes para el aislamiento de microorganismos tales como procesos
industriales, cultivos de caa de azcar, entre otros.
Implementar diferentes tcnicas de adaptacin con el fin de obtener microorganismos con
capacidad fermentativa a temperaturas mayores de 40C y concentraciones de sustrato
elevadas, debido a su gran aplicabilidad a nivel industrial.
Desarrollar procesos a nivel piloto con la cepa LO1 bajo condiciones de operacin controladas
con el fin de cuantificar el real potencial de esta cepa a escalas de fermentacin mayores.
Incluir condiciones de operacin como temperaturas elevadas y alta concentracin de
sustrato.
La cepa LO1 demostr ser una cepa de S. cerevisiae que presenta potencial para su
implementacin en procesos fermentativos. La aplicacin de programas de mejoramiento a
este microorganismo para conocer sus lmites de operacin y para conferirle diferentes
caractersticas deseadas es un objetivo de inters por realizar al interior del grupo de
investigacin.
El protocolo de seleccin planteado puede ser refinado incluyendo nuevos criterios de
seleccin fundamentados en recientes avances y reportes cientficos. Estos nuevos criterios
pueden permitir ampliar el tipo de microorganismos por evaluar, materias primas alternativas
y otros productos obtenidos va fermentativa. Tambin debe establecerse nuevos parmetros
de cuantificacin de compuestos y biomasa, con el fin de hacer ms exactos los parmetros
de evaluacin y garantizar con esto una mayor reproducibilidad de los resultados.
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