Fundamentos Analisis Cromatografico

INTRODUCCI
INTRODUCCIN A LA HPLC
FUNDAMENTOS DEL ANALISIS
CROMATOGRAFICO.
Cromatografa Lquida de
Alta Resolucin
Dr. JOS ANTONIO FERNNDEZ LPEZ

Depto. Ingeniera Qumica
Grupo de Investigacin QUIMYTEC
UPCT
INTRODUCCI
Cromatografa = escribir en colores
Elementos que participan en una
cromatografa
1. Fase estacionaria
2. Fase mvil
3. Muestra
Cmo interaccionan?
En general, una cromatografa se realiza
permitiendo que la mezcla de molculas que se
desea separar (muestra) interaccione con un
medio o matriz de soporte que se denomina fase
estacionaria. Un segundo medio (la fase mvil)
que es inmiscible con la fase estacionaria se hace
fluir a travs de sta para "lavar" (eluir) a las
molculas en la muestra.
2
INTRODUCCI
Inicialmente se refera a:
High Pressure Liquid Chromatography
En la actualidad hace referencia a:
High Performance Liquid Chromatography
La alta presin permite usar relleno de tamao de partcula reducido

para lograr la separacin de componentes a flujos razonables.
INTRODUCCI
HPLC = high performance liquid chromatography
fase mvil
(Lquido)
cromatografa lquida de alta resolucin
Otras acepciones equivalentes:

high pressure liquid chromatography
high patient liquid chromatography
high priced liquid chromatography
bombas que permiten presiones de hasta 6000 psi (414

atm) hacen pasar la fase mvil por el interior de
4
columnas de acero (2-5 mm x 3-25 cm) que contienen
la fase estacionaria con flujos de 0,1 10 ml/min.
INTRODUCCI
Las muestras no necesitan ser vaporizadas para
su anlisis. Cualquier sustancia puede

potencialmente analizada por esta tcnica.
ser
El desarrollo instrumental es posterior al de la CG
debido a dificultades para lograr un flujo estable

en el eluyente.
INTRODUCCI
Una muestra en estado lquido es arrastrada por una

corriente lquida llamada eluyente.
Como fase estacionaria acta un slido finamente

dividido (dimetro de partcula 3, 5, 10 m), o una
pelcula lquida a l adherida.
Dependiendo de la retencin de los componentes de la

muestra por la fase estacionaria y de su solubilidad en
el eluyente se provocar su migracin diferencial.
INTRODUCCI
Caractersticas:
Parmetros:
Selectividad
Naturaleza de la fase estacionaria
Reproducibilidad
Tamao de partcula
Sensibilidad
Eluyente (composicin y flujo)
Rapidez
Detector
Fase Directa:
fase estacionaria polar
fase mvil de baja polaridad
Fase Reversa:
fase estacionaria de polaridad baja
fase mvil de polaridad alta
INTRODUCCI
Principales
mecanismos
cromatografa lquida:
de
interaccin
en
Adsorcin superficial
Particin
Intercambio inico
Exclusin molecular
INTRODUCCI
CROMATOGRAFA DE ADSORCIN
La fase estacionaria es slida. La separacin se logra

por las diferencias en solubilidad (en fase mvil) y de
retencin por adsorcin (en fase estacionaria) de la
mezcla de solutos.
INTRODUCCI
CROMATOGRAFA DE ADSORCIN
Slica (90%) y almina (10%) son las fases estacionarias
ms comunes.
Tanto las molculas de solutos como de disolvente son
atradas hacia los lugares activos polares de la fase

estacionaria.
Unos solutos sern ms atrados que otros por la fase
estacionaria y as se lograr su migracin diferencial.

Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poder
de elucin y la selectividad adecuadas. Normalmente un

disolvente apolar (n-hexano) unido a otro ms activo
10
(acetona, cloruro de metilo, etc.).
INTRODUCCI
CROMATOGRAFA DE PARTICIN
La separacin se basa en el reparto o distribucin de

los solutos entre una fase mvil lquida y otra
estacionaria inmiscible, soportada sobre un slido
inerte. La discriminacin se produce por diferencias de
solubilidad.
11
INTRODUCCI
El mecanismo de actuacin es similar al de un modelo de
extraccin en contracorriente.
Las especies ms retenidas sern las que presenten
mayor afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que

por la fase mvil (eluyente).
La separacin de los solutos se basa en las diferencias en
esta solubilidad relativa.
12
INTRODUCCI
Existen dos modos bsicos de operacin:

) Fase normal. Cuando se trabaja con fase estacionaria polar
y fase mvil no polar.

) Fase reversa. Cuando se emplea una fase estacionaria no
polar y fase mvil polar.

Inicialmente tuvo ms auge la fase normal pero en la
actualidad son ms comunes los mtodos cromatogrficos en fase reversa dada la naturaleza hidroflica de
las muestras de mayor inters (clnico, contaminacin,
alimentos).
13
INTRODUCCI
Segn empleemos fase directa o fase reversa se nos

va a alterar el orden de elucin de bandas y el
tiempo de anlisis.
14
INTRODUCCI
Materiales comerciales empleados como soportes
en cromatografa de adsorcin y particin.
Tipo
Nombre
comercial
Slice
Hypersil
5-7
200
Slice
Lichrospher
100
10
25
Slice
Partisil
5, 10, 20
400
Slice
Spherosil
5, 10, 20
600
90
Almina Spherisorb
A5W
Tamao
Area especfica
partcula (m) (m2/g)
15
INTRODUCCI
CROMATOGRAFA DE PARTICIN Y ADSORCIN
Principales fases estacionarias en HPLC
Mecanismo
-R
Fase Directa
Slica
Nombre comercial
Nucleosil, Kromasil,
Inertsil, Partisil,
Fase Directa
-(CH2)3-CN
Nucleosil-CN, Micropak-CN,
Fase Directa
-(CH2)n-NH2
Nucleosil-NH2, Lichrosorb-NH2,
Bondpak-NH2,
Fase Reversa
-C18H37
Nucleosil-C18, Lichrosorb RP18,

Spherisorb ODS2,
Fase Reversa
-C8H17
Nucleosil-C8, Lichrosorb RP8,
Fase Reversa
-C6H5
Bondpak-Phenyl
16
INTRODUCCI
CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO
Tanto fase estacionaria como fase mvil son de

naturaleza inica. La iones de la fase estacionaria son
de carga opuesta a los del eluyente.
R A+ +
B+
'
R B+ +
A+
R+ A +
'
R+ B +
17
INTRODUCCI
18
INTRODUCCI
Se emplea para el anlisis de todo tipo de iones
(inorgnicos y orgnicos).
Las molculas intercambiadoras se ligan a soportes
especficos.
El material intercambiador de la fase estacionaria es de
dimetro de partcula pequeo (1-10 m) y estructura

microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy
baja respecto al material intercambiador convencional
(10-2 10-3 meq/g).
19
INTRODUCCI
Separacin de aniones inorgnicos por

cromatografa de intercambio inico.
20
INTRODUCCI
CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR
La separacin se basa en el tamao molecular. Como
fase estacionaria se emplean sustancias de tamao
de poro determinado. Tambin se denomina
cromatografa de permeabilidad por gel (GPC).
21
INTRODUCCI
Como fase estacionaria se emplea un material poroso
inerte (gel) que permite la discriminacin entre los

solutos segn su tamao.
Los analitos de mayor tamao no pueden penetrar en los
poros de la fase estacionaria y son excluidos, viajando

con la fase mvil en el frente de la misma.
Se muestra especialmente til para determinar el rango
molecular de polmeros, protenas, etc.
22
INTRODUCCI
Separacin de polmeros de poliestireno por GPC.
23
INTRODUCCI
EL EXPERIMENTO CROMATOGRFICO
Ilustracin de un experimento por HPLC.
24
INTRODUCCI
EL EXPERIMENTO CROMATOGRFICO
Parmetros de un cromatograma.
25
INTRODUCCI
MAGNITUDES CROMATOGRFICAS
MAGNITUD
SMBOLO
Tiempo de retencin de
una sustancia no retenida
seg.
tM
Tiempo de retencin
seg.
tR
Tiempo de retencin
reducido
seg.
tR= tR tM
--
= tR2/ tR1
Amplitud de bandas a
media altura
seg.
Relacin de capacidad
--
k= tR/tM
Resolucin
--
RS = 2 [(tR2- tR1) / (w2 + w1)]
Retencin relativa
26
INTRODUCCI
EQUIPO
Equipo bsico para HPLC.
27
INTRODUCCI
FASE MVIL
Alta pureza (calidad HPLC).
Inactividad frente a la fase estacionaria.
Baja viscosidad.
Compatibles con la muestra.
Facilitar la recuperacin de la muestra.
Compatibilidad con el sistema de deteccin.
Segn su composicin vare o no con el tiempo:
Elucin isocrtica
Elucin en gradiente
28
INTRODUCCI
FASE MVIL
Los
disolventes deben desgasificarse antes de uso

empleo en HPLC.
La desgasificacin reduce el riesgo de formacin de
burbujas en la columna o en el detector.

Posibilidades:
Desplazamiento con un gas menos soluble (He)
Aplicacin de vaco
Sonicacin
Calentamiento
29
INTRODUCCI
BOMBAS
Presin estable hasta 5000 psi

1 atm = 14,696 psi
(400 atm)
Flujo libre de pulsaciones
Amplio rango de flujos (0,1 a
10 mL/min)
Control,
exactitud y reproducibilidad del flujo
Componentes
inertes y
corrosin
qumicamente
resistentes a la
30
10
INTRODUCCI
SISTEMAS DE INYECCIN
Se emplean vlvulas inyectoras de volumen (loop) constante
Pueden ser manuales o automticas
Para variar el volumen de inyeccin se debe cambiar el
loop correspondiente
Se debe evitar la entrada de burbujas en el sistema de
inyeccin
31
INTRODUCCI
PRECOLUMNAS
Se trata de una pequea columna (0,5 3 cm) colocada
entre el inyector y la columna

Ayuda a prevenir la entrada de suciedad, procedente de la
muestra o del eluyente, en la columna analtica

Va a permitir alargar la duracin de las columnas
Debe ser del mismo relleno que el de la columna analtica
32
INTRODUCCI
COLUMNAS
Gran avance en la ltima
dcada por el progreso en

la tecnologa de rellenos y
columnas
Rellenos ms uniformes y
de menor tamao
Fases qumicamente liga-
das
a
los
soportes
aumentando su eficacia y
resolucin
Mejora en los mtodos de
empaquetado
33
11
INTRODUCCI
COLUMNAS
Al disminuir el tamao del relleno aumenta la
eficiencia pero tambin la presin de trabajo

Las columnas constan de:
Cuerpo normalmente de acero inoxidable
Relleno material con i.d. definido
Algunas
casas comerciales permiten la

renovacin del relleno sin tener que comprar
la columna completa
Existen columnas de compresin radial, cuyo
cuerpo puede ser presurizado para aumentar

su eficiencia
34
INTRODUCCI
COLUMNAS
Fase Normal
Slica
Almina
Amino (-NH2)
Ciano (-CN)
Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
C-2 o RP-2
(-SiCH2CH3)
C-8 o RP-8
(-Si-(CH2)7-CH3)
C-18 o RP-18
(Si-(CH2)17-CH3)
35
INTRODUCCI
COLUMNAS
36
12
INTRODUCCI
COLUMNAS
Influencia de la longitud de la columna y del tamao de
partcula en la duracin del cromatograma
37
INTRODUCCI
COLUMNAS
Ventajas de la High Speed HPLC con columnas cortas

Tiempo de anlisis reducido
Menor consumo de disolventes
Menor dispersin de los solutos a analizar
Ahorro de costes
Mayor sensibilidad
38
INTRODUCCI
DETECTORES
Cualquier propiedad fsica o qumica
que se pueda medir en la disolucin

podra usarse como mtodo de
deteccin
Los
detectores en HPLC no son

destructivos
Detectores
una
Detectores
una
que
miden
propiedad de los solutos
Sensibilidad
Linealidad
Se pueden clasificar en:

que
miden
propiedad de la fase mvil
Rapidez
Reproducibilidad
Estabilidad
39
13
DETECTOR
Principales detectores empleados en HPLC:

UV/Vis
Fotodiodos
ndice de refraccin
Fluorescencia
Conductividad
Dispersin de luz
Espectrometra de masas
40
DETECTOR
Comparacin de detectores usados en HPLC
Detector
UV/VIS
ndice de refraccin
Dispersin de luz
Lmite deteccin
Permite
Gradiente
0,1 1 ng
100 1000 ng
No
0,1 1 ng
Fluoresecencia
0,001 0,01 ng
Conductividad
0,5 1
No
0,1 1 ng
Espectrometra de masas
41
DETECTOR UV/VIS
Para sustancias que absorben radiacin UV/VIS
El ms usado
Con lmparas de deuterio, xenon o wolframio
Desde 190 a 900 nm
Camino ptico de la microcelda de un detector

UV/VIS. Las celdas ordinarias tienen 0,5 cm de
camino ptico y contienen 8 L de lquido
42
14
DETECTOR UV/VIS
Longitudes de onda de corte en el UV de disolventes
usados en HPLC
Disolvente
Longitud de onda
Acetona
330 nm
Acetonitrilo
190 nm
Agua
190 nm
Cloroformo
245 nm
ter Dietlico
215 nm
n-Hexano
195 nm
Metanol
205 nm
Tetrahidrofurano
212 nm
Tolueno
284 nm
43
DETECTOR FOTODIODOS
Permite registrar la absorbancia simultnea en todo el
rango UV/VIS.
La muestra es atravesada por luz blanca (todas las ) y el
policromador dispersa la luz en las diversas que la
componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos. En cada
diodo incide una diferente, que manda la informacin al
sistema de anlisis de datos.
44
INTRODUCCI
DETECTOR FOTODIODOS
0,60
0,55
0,50
0,45
0,40
Posibilidades de un
detector de fotodiodos.
0,35
AU
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
-0,05
250,00
30 0,00
350,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
6,00
6,50
7,00
Minutes
0,60
300,00
280,00
0,40
nm
260,00
Cafena - 5,357
AU
0,20
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
Minutes
5,00
240,00
220,00
1,00
6,00
7,00
2,00
3,00
4,00
Minutes
5,00
6,00
7,00
45
15
INTRODUCCI
DETECTOR DE NDICE DE REFRACCIN
Van a medir variaciones en el ndice de refraccin del
eluato con respecto al del disolvente puro.

Slo se pueden usar si la elucin es isocrtica.
Responden casi todos los solutos pero con escasa baja
sensibilidad.
Son muy sensibles a las variaciones de temperatura.
Deben estar termostatizados.
46
INTRODUCCI
DETECTOR DE FLUORESCENCIA
Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados
fluorescentes.
Se seleccionar la exc y la em.
Son de alta sensibilidad.
No se ven interferidos por los disolventes al no tener
stos naturaleza fluorescente.
47
INTRODUCCI
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD
Son detectores basados en una respuesta diferencial y
no absoluta.
Empleados fundamentalmente en cromatografa de
intercambio inico.
Inconvenientes:
Baja sensibilidad
Sensibles a impurezas de la fase mvil.
48
16
INTRODUCCI
DETECTOR DE DISPERSIN DE LUZ
Vlido para aquellos solutos que
sean claramente menos voltiles

que la fase mvil.
El eluyente es evaporado con una
corriente de N2 dejando una nube

de finas partculas slidas que
entran en la zona de deteccin.
Las partculas se detectan por la
luz que procede de un diodo lser

y llega al fotodetector por
dispersin.
Slo tampones voltiles en la fase
mvil.
49
INTRODUCCI
APLICACIONES
50
INTRODUCCI
APLICACIONES
51
17
INTRODUCCI
APLICACIONES
52
18

Fundamentos Analisis Cromatografico

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INTRODUCCI

Dr. JOS ANTONIO FERNNDEZ LPEZ

La alta presin permite usar relleno de tamao de partcula reducido

cromatografa lquida de alta resolucin

Otras acepciones equivalentes:

bombas que permiten presiones de hasta 6000 psi (414

su anlisis. Cualquier sustancia puede

El desarrollo instrumental es posterior al de la CG

debido a dificultades para lograr un flujo estable

Una muestra en estado lquido es arrastrada por una

Como fase estacionaria acta un slido finamente

Dependiendo de la retencin de los componentes de la

Naturaleza de la fase estacionaria

Eluyente (composicin y flujo)

La fase estacionaria es slida. La separacin se logra

atradas hacia los lugares activos polares de la fase

estacionaria y as se lograr su migracin diferencial.

de elucin y la selectividad adecuadas. Normalmente un

La separacin se basa en el reparto o distribucin de

El mecanismo de actuacin es similar al de un modelo de

mayor afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que

esta solubilidad relativa.

Existen dos modos bsicos de operacin:

y fase mvil no polar.

polar y fase mvil polar.

Segn empleemos fase directa o fase reversa se nos

Nucleosil-C18, Lichrosorb RP18,

Nucleosil-C8, Lichrosorb RP8,

Tanto fase estacionaria como fase mvil son de

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

Se emplea para el anlisis de todo tipo de iones

dimetro de partcula pequeo (1-10 m) y estructura

Separacin de aniones inorgnicos por

Como fase estacionaria se emplea un material poroso

inerte (gel) que permite la discriminacin entre los

poros de la fase estacionaria y son excluidos, viajando

molecular de polmeros, protenas, etc.

Ilustracin de un experimento por HPLC.

RS = 2 [(tR2- tR1) / (w2 + w1)]

Equipo bsico para HPLC.

disolventes deben desgasificarse antes de uso

La desgasificacin reduce el riesgo de formacin de

burbujas en la columna o en el detector.

Desplazamiento con un gas menos soluble (He)

Presin estable hasta 5000 psi

exactitud y reproducibilidad del flujo

entre el inyector y la columna

muestra o del eluyente, en la columna analtica

dcada por el progreso en

eficiencia pero tambin la presin de trabajo

Relleno material con i.d. definido

casas comerciales permiten la

Existen columnas de compresin radial, cuyo

cuerpo puede ser presurizado para aumentar

Ventajas de la High Speed HPLC con columnas cortas

que se pueda medir en la disolucin

detectores en HPLC no son

Se pueden clasificar en:

Principales detectores empleados en HPLC:

Camino ptico de la microcelda de un detector

Van a medir variaciones en el ndice de refraccin del

eluato con respecto al del disolvente puro.

Deben estar termostatizados.