& ICONTEC NORMA TECNICA NTC COLOMBIANA 5025 2001-12-19 LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS. DETERMINACION DEL CONTENIDO DE NITROGENO E: MILK AND MILK PRODUCTS. DETERMINATION OF NITROGEN CONTENT CORRESPONDENCIA: DESCRIPTORES: leche; producto lacteo; nitrégeno; proteina, LC.S.:67.100.10 Ediada por et hallulo Coomblana de Normas Técnicas y Coricadn (CONTEC) Apartado 14237 Bogoid, D.C, - Te. 6078888 - Fax 2221435, Protibida su reproducién Edltada 2002-01-91PROLOGO El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Cerificacién, ICONTEC, es el organismo nacional de normalizacién, seguin el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de cardcter privado, sin animo de lucro, cuya Misién es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccién al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del pais, para lograr ventajas competitivas en los mercados intemo y externo. La representacién de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacién Técnica esta garantizada por los Comités Técnicos y el perfodo de Consulta Publica, este ultimo caracterizado por la participacién del ptiblico en general La NTC 5025 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2001-12-19. Esta norma esté sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuacién se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participacién en el Comité Técnico 311201 Leche y productos lacteos. ALGARRA S.A. INSTITUTO COLOMBIANO ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. AGROPECUARIO, ICA BIOCONTROL S.A. INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA CARULLA VIVERO S.A DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS, CONSEJO NACIONAL DE LA LECHE Y INVIMA PREVENCION DE LA MASTITIS LAALQUERIA S.A. CONSEJO NACIONAL LACTEO LARKIN LTDA COOPERATIVA DE LECHEROS DE. MEALS DE COLOMBIA S.A. ANTIOQUIA, COLANTA NESTLE DE COLOMBIA S.A. CHRISTIAN HANSEN ~ CENTRO PARMALAT COLOMBIA LTDA. — AGROLECHERO PROCESADORA DE LECHES S.A, INDEPENDIENTE - HUGO PARDO PROLECHE INDUSTRIA COLOMBIANA DE LECHES PLASTILENE S.A. S\A., INDUCOLSA ‘Ademas de las anteriores, en Consulta Publica el Proyecto se puso a consideracién de las siguientes empresas. ASOCIACION NACIONAL DE JAIRO PASACHOA ~ INGENIERO DE INDUSTRIALES ALIMENTOS ASOCIACION NACIONAL DE LA CAMPINA S.A, LECHEROS, ANALAC MINISTERIO DE SALUD COOPERATIVA DE LECHEROS DE LA SECRETARIA DISTRITAL DE SALUD COSTA, COOLECHERA TETRA PAK LTDA. FRIESLAND COLOMBIA — COLPURACE UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO FRSKALECHEICONTEC cuenta con un Centro de Informacién que pone a disposicién de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales. DIRECCION DE NORMALIZACIONNORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS DETERMINACION DEL CONTENIDO DE NITROGENO 1. OBJETO Esta norma especifica los métodos para la determinacién del contenido de nitrégeno en la leche y en productos ldcteos. 2, TERMINOS Y DEFINICIONES Para los propésitos de esta norma, se aplican los siguientes términos y definiciones. 2.1 Contenido de nitrégeno: fraccién mésica de sustancias determinadas por los procedimientos especificados en las Partes de la 1, 2 y 4 de esta norma, 2.2 Contenido de nitrégeno no proteico: fraccién masica de sustancias determinadas por el procedimiento especificado en la parte 3 de esta norma. Nota, El contenido de nitrégeno, el contenido de nitrogeno proteice y el contenido de nitrégeno no proteico se lexpresan como porcentaje en masa. 3. REACTIVOS ‘S6lo se emplean reactivos de grado analitico reconocido, a menos que se especifique de otra manera, y agua destilada o desmineralizada o agua de pureza equivalente. 3.1 SULFATO DE POTASIO (K,SO,) Con bajo contenido de nitrégeno 3.2 SOLUCION DE SULFATO DE COBRE(II) PENTAHIDRATADO (CuSO, 5H;0) Se disuelven 5,0 g de sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO, SHO) en agua, en un matraz volumétrico de 100 mi. Se diluye hasta completar los 100 ml y se mezcla.NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 3.3 ACIDO SULFURICO Por lo menos del 95 % (m/m) - 98 % (m/m), libre de nitrégeno, pz. aproximadamente = 1,84 g/ml 3.4 SOLUCION DE HIDROXIDO DE SODIO Con bajo contenido de nitrégeno, que contenga 50 g de hidréxido de sodio (NaOH) por 100 g. Nota, Se puede emplear una solucién de hidréxido de sodio al 40 % (m/m) en lugar del 50 % (m/m), si se presentan problemas de taponamianto dal sistoma de flujo en una Unidad automatica de destilacién 3.5 SOLUCION INDICADORA Se disuelven 0,1 g de rojo de metilo en etanol al 95 % (V/V) y se diluye con etanol hasta completar 50 ml. Se disuelven 0,5 g de verde de bromocresol en etanol al 95 %(V/V) y se diluye con etanol hasta completar 250 ml. Se mezcla una parte de la solucién de rojo de metilo con 5 partes de la solucién de verde de bromocresol. 3.6 | SOLUCION DE ACIDO BORICO (H;B0;) Se disuelven 40,0 g de Acido bérico (HjBQs) en un litro de agua caliente. Se deja enfriar ta solucién y se ajusta el volumen hasta completar nuevamente 1 litro. Se adicionan 3 ml de la solucién indicadora (véase el numeral 4.5), se mezcla y almacena la solucién en una botella de vidrio de borosilicato, (La solucién sera de color naranja palido). Se protege la solucién contra la luz y fuentes de vapor de amoniaco, durante el almacenamiento. 3.7 SOLUCION VOLUMETRICA ESTANDAR DE ACIDO CLORHIDRICO ‘o(HCl) = (0,1 + 0,0005) moll 3.8 SULFATO DE AMONIO [(NH,),S04] Minimo de 99,9 % m/m sobre materia seca. Inmediatamente antes de emplearse, se seca el sulfato de amonio a 102 °C + 2 °C durante minimo 2 h, Se enfria a temperatura ambiente en un desecador. 3.9 TRIPTOFANO (Ci1H;2N20,) © CLORHIDRATO DE LISINA (CisH;sCIN,O2) Minimo de 99 % m/m. No se deben secar estos reactivos en el homo antes de emplearse. 3.10 SACAROSA Con contenido de nitrégeno inferior a 0,002 % (mm/m). 3.11 SOLUCION DE ACIDO TRICLOROACETICO Se disuelven 15,0 g de dcido tricloroacético (CCIsCOOH) en agua en un matraz volumétrico de 100 ml. Se diluye hasta la marca y se mezcla, No se deben emplear otras concentraciones de Acido tricloroacético, ni vollimenes de soluciones diferentes a las especificadas.NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 Nota, Otras concentraciones o volimenes de soluciones modificarén el desempefio del método con respecto a su valor medio y caracteristicas de desemper. 4. APARATOS Y EQUIPOS Aparatos comunes de laboratorio y en especial los siguientes: 4.1 BANO DE AGUA Capaz de mantenerse un temperatura de 38 °C +1 °C. 4.2 MATRACES KJELDAHL De 500 ml y 800 ml de capacidad. 4.3 BALANZA ANALITICA Con capacidad para pesar con aproximacién a 0,1 mg. 4.4 REGULADORES DE EBULLICION Granulos de 6xido de aluminio, Al,0; fundido, anfétero, de alta pureza, tamajio de malla 10, los cuales no se deben reutiizar. También se pueden utilizar perlas de vidrio, 4.5 BURETA 0 PIPETA AUTOMATICA Con capacidad para medir volimenes de 1,0 mi de solucién de sulfato de cobre (véase el numeral 4.2), 4.6 PROBETAS GRADUADAS De 50 mi, 100 ml y 500 ml de capacidad, respectivamente. 4.7 APARATOS DE DIGESTION Con el fin de mantener los matraces Kjeldahl (véase el numeral 4.2) en una posicién inclinada (aproximadamente 45°); con calentadores eléctricos o quemadores de gas que no calienten los matraces por encima del nivel de su contenido, y con sistema de extraccién de vapores. Se recomienda ajustar el calentador con el fin de poder determinar el ajuste maximo que se debe usar durante la digestién. Con el propésito de evaluarlo, se precalienta al punto de ajuste del calentador. En el caso de los quemadores de gas el periodo de precalentamiento debe ser de 10 min y para calentadores eléctricos, de 30 min. Se determina el punto de ajuste del calentador con el que se logra llevar 250 mi de agua, incluyendo de 5 a 10 reguladores de ebullicién, desde una temperatura inicial de 2° C hasta alcanzar una ebullicién gradual en 5 min © 6 min para cada uno de los calentadores. Este es el maximo ajuste del calentador que se debe usar durante la digestién 4.8 APARATO DE DESTILACION Elaborado en vidrio de borosilicato u otro material adecuado al que pueda acondicionarse un matraz Kjeldahl (véase el numeral 4.2) que conste de una cabeza difusora eficiente conectada a un condensador recto y a un tubo de salida de menor diametro conectado a su extremo 3NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 inferior. Las mangueras de conexién y el (los) tapdn(es) deben ajustarse con precision y preferiblemente deben ser de neopreno. 4.9 MATRACES CONICOS O ERLENMEYER De 500 ml de capacidad, graduados cada 200 ml. 4.10 BURETA De 50 mi de capacidad, graduada por lo menos cada 0,1 ml, que retina los requisitos de la NTC 2175 (ISO 385), clase A. 4.11 BLOQUE DE DIGESTION Bloque de aleacién de aluminio o aparato equivalente, acondicionado con un control de temperatura ajustable y dispositive para medicién de la temperatura del bloque. 4.12 TUBOS DE DIGESTION Con capacidad de 250 ml, acondicionados para ser usados con el bloque de digestion (véase el numeral 4.11). 4.13 RECOLECTOR DE VAPORES Para usarlo con los tubos de digestion (véase el numeral 4.11). 4.14 APARATO LAVADOR CENTRIFUGO 0 BOMBA DE FILTRACION 0 ASPIRADORA Construido de material resistente al acido y para uso con suministro de agua corriente. 4.15 UNIDAD DE DESTILACION Manual 0 semiautomdtica, para destilacién al vapor, adecuada para recibir los tubos de digestion de 250 mi (véase el numeral 4.12) y los matraces cénicos o erlenmeyers de 500 mi (véase el numeral 4.9), Nota. Dependiendo del método seleccionado para la determinacién del nitrégeno en el fitrado, ya sea mediante of método Kjeldahl (parte 1) 6 el método de digestién de bloque (parte 2), se requleren los aparatos mencionados en dicho método, con excepcién de los mencionados a continuacién que se requieren en la parte 3, 4.16 MATRACES CONICOS Con capacidad de 25 mi 4.17 PIPETAS De capacidades de 10 ml y 20 ml 4.18 EMBUDO DE VIDRIO PARA FILTRACION De 75 mm de diémetro.NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 4.19 PAPEL DE FILTRO De 15 om de didmetro, libre de nitrégeno, Whatman No 1, 0 equivalente. 4.20 VASO DE PRECIPITADO De 50 mi de capacidad, Nota. Dependiendo del método seleccionado para la determinacién del ntrégeno en el fitrado, ya sea mediante ef Imétodo Kjeldahl (parte 1) 6 0! método de digestion de bloque (parte 2), se requieren los aparatos mencionados en dicho método, con excepcién de os siguientes adicionales que se requieren para el método de la Parte 4 4.21 PIPETAS, De 5 mi de capacidad, 4.22 PIPETA AUTOMATICA Pipeta de bomba de pistén para suministro de porciones de 10 ml de la solucién de Acido tricloroacético (véase el numeral 4.11), 5. PARTE 1. DETERMINACION DE NITROGENO MEDIANTE EL METODO KJELDAHL 5.1 PRINCIPIO Se digiere una muestra para ensayo con una mezcla de Acido sulfuirico concentrado y sulfato de potasio, empleando sulfato de cobre (I!) como catalizador para asi convertir el nitrogeno orgénico presente en sulfato de amonio. Se adiciona hidréxido de sodio en exceso a la muestra digerida enfriada para liberar amoniaco, Se destila el amoniaco, el destilado se recoge en un exceso de solucién de dcido bérico y_ se titula con solucién de acido clorhidrico. Se calcula el contenido de nitrégeno a partir de la cantidad de amoniaco. 5.2 TOMA DE MUESTRAS La toma de muestras no hace parte del método especificado en la presente norma. En la NTC 666 (ISO 707) se ofrece un método de muestreo recomendado, Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no se haya deteriorado durante el transporte o almacenamiento. 5.3. PREPARACION DE LA MUESTRA PARA ENSAYO Se calienta la muestra a 38 °C + 1 °C en el bafio de agua (véase el numeral 4.1). Se mezcla con suavidad la muestra inmediatamente antes de pesarla (véase el numeral 5.4.1). 5.4 PROCEDIMIENTO 5.4.1 Muestra para ensayo y tratamiento previo En un matraz Kjeldahl limpio y seco (véase el numeral 4.2), se adicionan de 5 a 10 reguladores de ebullicién (véase el numeral 4.4), 15 g de sulfato de potasio (véase el numeral 4.1), 1,0 ml de la solucién de sulfato de cobre (véase el numeral 4.2), aproximadamente 5 ml + 0,1 mi dela 5NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 muestra para ensayo preparada (véase el numeral 6.3), pesada con aproximacién a 0,1 mg y 25 mi del acido sulfirico (véase el numeral 4.3). Los 25 ml de acido sulfuirico se usan para lavar cualquier solucién de sulfato de cobre, sulfato de potasio o muestra para ensayo remanente en el cuello del matraz. Se mezcla con suavidad el contenido del matraz Kjeldahl. 5.4.2, Determinacién 5.4.2.1 Digestion. Se enciende el sistema de extraccién de vapor del aparato de digestion (véase el numeral 4.7) antes de comenzar. Se calienta el matraz Kjeldahl y su contenido (véase el numeral 5.4.1) en el aparato de digestién regulando el ajuste del calentador lo mas bajo posible de manera que la muestra para ensayo digerida no suba hasta alcanzar el cuello del matraz Kjeldahl. Se realiza la digestién con este ajuste del calentador durante al menos 20 min © hasta que aparezca vapor blanco en el matraz. Se incrementa la temperatura del calentador hasta la mitad del ajuste maximo determinado en el numeral 4.7 y se continua el periodo de calentamiento durante 15 min. Al finalizar dicho periodo se incrementa el calor al ajuste maximo determinado en el numeral 4.7. Después que la muestra para ensayo ha sido digerida (presenta color azul verdoso claro) se contintia la ebullicién durante 1h a 1,5 h en el ajuste maximo, Si el liquid no hierve, puede ser que el calentamiento sea muy bajo. El tiempo de digestion total estard entre 1,8 h y 2,25 h. Notas 1) Con el fin de determinar el tiempo de ebulicién especifico requerido para las condiciones de analisis en un laboratorio particular empleando un conjunto especffice de aparatos para andlisis de leche, se selecciona luna muestra de leche con contenido de proteinas y contenido graso altos y se determina su contenido proteinico empleando diferentes tiempos de ebullcién (1 h a 1,5 h) después de que aclare. El resultado medio de proteinas se incrementa al aumentar el tiempo de ebulicién, se hace consistente y luego disminuye cuando el tiempo de ebullicién es demasiado largo. Se selecciona el tiempo de ebullcién que produce el resultado maximo de proteinas. 2) Sial finalizar la digestisn se evidencian pequefios puntos de material no digeridos adheridos a las paredes dol matraz Kjeldahl, se deja entriar el matraz, se lavan las parades de éste con agua, para arrastrar las particulas a la superficie del acido sulfurico. Se debe reiniciar el calentamiento muy suavemente hasta la fevaporacién total del agua. El calentamiento progresivo debe permitir la desaparicién normal de las particulas no digeridas. AA finalizar la digestién, la muestra para ensayo digerida debe ser clara y hallarse libre de material no digerido, Se deja enfriar la muestra para ensayo digerida en el Acido, en matraces abiertos, en una ‘campana separada a temperatura ambiente durante un periodo de aproximadamente 25 min. Si se dejan los matraces sobre los quemadores calientes para que se enfrien, llevara més tiempo alcanzar la temperatura ambiente. La muestra para ensayo digerida y enfriada debe ser iquida o liquida con algunos cristales pequerios en el fondo del matraz, al finalizar el periodo de entriamiento de 25 min. No se debe dejar la muestra para ensayo digerida sin dilur, en los matraces, toda la noche, ya que puede cristalizarse durante este periodo y seré muy dificil su disolucién con el fin de evitar esta situacion 3) La cristalizacién excesiva después de 25 min es el resultado de una pérdida indebida de acido durante la digestion y puede originar valores de ensayo bajos. La pérdida indebida de Acido se debe a la excesiva aspiracion de vapores, o al tiempo de digestién excesivamente prolongado, causado por un ajuste maximo, Incorrecto det calentador. ‘Se adicionan 300 mi de agua a los matraces Kjeldahl de 500 ml, 6 400 mi de agua al emplear los matraces Kjeldahl de 800 ml. También se emplea agua para lavar el cuello del matraz. Se mezcia el contenido de los matraces, por completo, asegurandose que se disuelva cualquier cristal que se separe. Se adicionan de 5 a 10 reguladores de ebullcién (véase el numeral 4.4). Se deja enfriar nuevamente la mezcia a temperatura ambiente antes de Ia destilacién. Las muestras de ensayo digeridas y diluidas se pueden tapar y mantener para la destilacién mas tarde.NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 5.4.2.2 Destilacion. Se abre la llave de suministro de agua al condensador, en el aparato de destilacién (véase el numeral 4,8). Se adicionan 75 mi de solucién de hidréxido de sodio (véase el numeral 4.4) a la muestra para ensayo digerida diluida (véase el numeral 5.4.2.1) vertiendo cuidadosamente la solucién en el cuello inclinado del matraz Kjeldahl de manera que forme una capa en el fondo del bulbo del matraz. Deberia existir una interfase limpia entre las dos soluciones. Inmediatamente después de la adicién de la solucién de hidréxido de sodio al matraz Kjeldahl, se conecta al aparato de destilacién (véase el numeral 4.8), el cual cuenta con un tubo de salida del condensador, cuya punta se encuentra inmersa en 50 mi de la solucién de dcido bérico (véase el numeral 4.6) contenido en un matraz cénico (véase el numeral 4.9) Se revuelve vigorosamente el matraz Kjeldahl para mezclar su contenido por completo hasta que ya no sean visibles capas separadas de solucién en el matraz. Se coloca el matraz en el calentador, Se enciende éste para lograr una temperatura lo suficientemente alta para hervir la mezcla. Se continia la destilacién hasta que comience la ebullicién irregular (ebullicién intermitente) e inmediatamente se desconecta el matraz Kjeldahl y se apaga el calentador. Se cierra el suministro del agua del condensador. La velocidad de destilacién debe ser tal, que se retnan cerca de 150 mi de destilado cuando la ebullicién irregular (ebullicién intermitente) inicie y el volumen del contenido del matraz cénico sea aproximadamente de 200 ml. Si el volumen del destilado recogido es menor a 150 ml, es probable que haya menos de 300 mi de agua adicionada para diluir la muestra para ensayo digerida. La eficiencia del condensador debe ser tal que la temperatura del contenido del matraz cénico no exceda los 25° C durante la destilacion 5.4.2.3 Titulacién. Se titula la solucién receptora de Acido bérico con la solucién de Acido clorhidrico volumétrico estandar (véase el numeral 4.7) hasta la primera traza de color rosa. Se registra la lectura de la bureta por lo menos con aproximacién a 0,05 ml. Una placa de agitacién iluminada puede contribuir a la visualizacién del punto final. 5.5 ENSAYO DE LOS BLANCOS Se mantiene un registro de los valores obtenidos para los blancos. Si éstos cambian, se debe identificar la causa, ‘Siempre se titulan los blancos con el mismo titulante que se emplea para las muestras de ensayo. Se realiza un ensayo blanco siguiendo el procedimiento descrito en los numerales 5.4.2.1 5.4.23. Se reemplaza la muestra para ensayo con 5 ml de agua con aproximadamente 0,85 g de sacarosa (véase el numeral 4.10), Se mantiene un registro de los valores obtenidos para los blancos. Si éstos cambian, se identifica la causa, Notas: 1) El propésito de la sacarosa an un blanco o norma de recuperacién es actuar como material organico para consumir una cantidad de Acido sulfarico durante la digestion que es escasamente equivalente a una muestra. Si la cantidad del Acido sulfirico libre residual al final de la digestion es demasiado baja, la recuperacién de nitrégeno mediante ambos ensayos de recuperacién en los numerales 5.6.1 y 5.6.2 sera baja. Si la cantidad de Acido residual presente al final de la digestién es suficiente para retener todo el nitrégeno, pera las condiciones de temperatura y tiempo durante la digastién no fueron las adecuadas para liberar todo el nitrégeno de una muestra, entonces la recuperacion de nitrégeno en la seccién 6.6.1 serd ceptable y la recuperacién de nitrégeno en el numeral 5.6.2 sera baja 2) La cantidad de titulante empleada en el blanco deberia ser siempre superiar a 0,00 mi. Los blancos dentro del mismo laboratorio deberian ser consistentes en el tiempo. Si el blanco ya es rosado antes de comenzar la titulacién, algo esté fallando, Por lo general, en dichos casos, los matraces cénicos 0 erlenmeyers no estén limpios 0 el agua que se puede condenser del aire, en la parte extema del aparato condensador, ha caido dentro del matraz de recoleccién causando contaminacién,NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 5.6 ENSAYOS DE RECUPERACION 5.6.1 Se recomienda verificar la precisién del procedimiento en forma regular mediante los siguientes ensayos de recuperacién, realizados de acuerdo con los numerales del 5.4.1 al 54.23. 5.6.2 Se verifica que no ocurra pérdida de nitrogeno mediante una muestra para ensayo de 0,12 g de sulfato de amonio (véase el numeral 4.8) junto con 0,85 g de sacarosa (véase el numeral 4.10) Nota. La verificacion de la recuperacion de sulfato de amonio no ofrece informacién acerca de la capacidad de las. condiciones de digestion para liberar el nitrogen que esta enlazado en las estructuras proteinicas. EI porcentaje de nitrégeno recuperado debe estar entre 99,0 % y 100,0 % para todas las posiciones en el aparato. En caso que las recuperaciones de nitrégeno excedan un porcentaje del 100 %, el sulfato de amonio sélo es util para determinar si ha ocurrido perdida de nitrégeno 0 la normalidad del titulante es inferior al valor establecido. Para recuperaciones inferiores al 99 %, la pérdida podria estar en el paso de digestin o de destilacién. Es posible emplear una mezcla de sulfato de amonio y una pequefia cantidad de dcido sulfurico (la cantidad que permanece como residuo al finalizar una digestién) en un matraz Kjeldahl. Se diluye con el volumen normal de agua, se adiciona la cantidad normal de hidréxido de sodio y se destila, Si la recuperacién del nitrégeno aun es baja con la misma cantidad, la pérdida de nitrégeno se encuentra en el aparato de destilacién y no en el de digestion. La probable causa seria un tubo con fuga en un sistema tradicional o que las extremidades de los condensadores no estén sumergidas por debajo de la superficie del dcido bérico al comienzo de la destilacién. El aparato debe pasar este ensayo antes de verificar las recuperaciones mediante el procedimiento especificado en el numeral c) 5.6.3 Se verifica la eficiencia del procedimiento de digestién mediante el uso de 0,16 g de clothidrato de lisina 6 0,18 g de triptéfano (véase el numeral 4.9) junto con 0,67 g de sacarosa (véase el numeral 4.10). Se debe recuperar por lo menos el 98 % del nitrégeno. Si la recuperacién es inferior al 98 % después de contar con una recuperacién del 99 % a 100 % en sulfato de amonio, entonces la temperatura o el tiempo de digestién es insuficiente (se sigue el procedimiento en el numeral 5.4.2.1 parrafo 3) 0 existe material de muestra sin digerir (es decir carbén) en el interior del matraz Kjeldahl. La evaluacién final de desempefio se realiza mejor mediante la participacion en un sistema de ensayos de aptitud de! método. 5.6.4 Resultados inferiores ya sean en el ensayo de recuperacién (o mayores al 100,0% en el numeral 5.6.2) indican fallas en el procedimiento y/o una concentracién imprecisa de la solucién de Acido clorhidrico volumétrico estandar (véase el numeral 4.7). 5.7 CALCULO Y EXPRESION DE RESULTADOS, 5.7.1 Calculo Se calcula el contenido de nitrégeno, expresado como porcentaje en masa, mediante la siguiente ecuaciérNORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 Donde: W,= es el contenido de nitrégeno de la muestra, expresado como porcentaje en masa; es el valor numérico del volumen de la solucién volumétrica esténdar de acido clorhidrico (véase el numeral 3.7) empleado en la determinacién (véase el numeral 5.4.2.3), en mililitros, expresados por lo menos con aproximacién a 0,05 mi; Vs es el valor numérico de! volumen de la solucién volumétrica estandar de acido clorhidrico (véase el numeral 3.7) empleado en el ensayo blanco (numeral 5.5), en mililitros, expresado por lo menos con aproximacién a 0,05 ml; es el valor numérico de la molaridad exacta de la solucién volumétrica estandar de acido (véase el numeral 3.7), expresado con cuatro decimales; es la masa de la muestra para ensayo (véase el numeral 5.4.1) en gramos, expresada con aproximacién a 0,1 mg. 5.7.1.1 Expresién de resultados. Se expresa el contenido de nitrégeno con cuatro decimales. 5.7.2 Calculo del contenido de proteina cruda El contenido de proteina cruda, expresado como porcentaje en masa, se obtiene mediante la multiplicacién del contenido de nitrégeno (véase el numeral 5.7.1) por 6,38 5.7.3 Expresién de resultados Se expresan los resultados de ensayo con tres decimales. 5.8 PRECISION 5.8.1 Ensayo interlaboratorio Los valores para Ia repetibiidad y reproduciblidad se derivaron del resultado de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la norma ISO 5725”, En la referencia [1] del anexo B (Bibliografia) se resumen los detalles del ensayo interlaboratorio del método, Los valores derivados de este ensayo interlaboratorio pueden no ser aplicables a los rangos de concentracién y matrices diferentes a los determinados. 5.8.2 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo tinico obtenidos con el mismo método sobre material de ensayo idéntico, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, empleando el mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo, en el 5% de los casos no podra ser mayor a 0,006 % ‘Se empled la norma ®° §725:1986, Precisién de los métodos de ensayo, Determinacién de la repetibilidad y reproducibilidad para un método de ensayo estandar mediante ensayos interlaboratorio (ahora anulada y reomplazada por la ISO 5725-2:1994 (véase la NTC 3529-2:1999), con el fin de obtener los datos de precision. 9NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 5.8.3 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo Unicos, obtenida con el mismo método, en material de ensayo idéntico, en diferentes laboratorios, con diferentes operadores, empleando diferente equipo, en el 5 % de los casos no podra ser mayor a 0,007 7 %. 5.9 INFORME DEL ENSAYO El informe del ensayo debe especificar: - toda la informacién requerida para la completa identificacién de la muestra; - el método de muestreo empleads, si se conoce; - el método empleade, citando esta norma; - todos los detalles de operacién no especificados en la presente norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el (los) resultado(s); - el (los) resultado(s) de ensayo obtenidos; - los resultados finales obtenidos, si se ha verificado la repetibilidad; - los resultados finales obtenidos, si la recuperacién ha sido verificada 6 PARTE 2. DETERMINACION DE NITROGENO MEDIANTE EL METODO DE DIGESTION DE BLOQUE (METODO MACRO) 61 PRINCIPIO Se digiere una muestra para ensayo, con una mezcla de dcido sulfirico concentrado y sulfato de potasio, empleando sulfato de cobre (II) como catalizador para asi convertir el nitrégeno organico presente en sulfato de amonio. Se adiciona hidréxido de sodio en exceso a la muestra para ensayo digerida y enfriada para liberar amoniaco, Se destila el vapor del amoniaco empleando una unidad de destilacién de vapor, manual 0 semi-automatica; se recoge el destilado en un exceso de solucién de acido bérico y se titula con Acido clorhidrico. 62 MUESTREO EI muestreo no hace parte del método especificado en la presente norma. En la NTC 666 (ISO 707) se ofrece un método de muestreo recomendado. Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no se haya deteriorado durante el transporte o almacenamiento. 63 PREPARACION DE LA MUESTRA PARA ENSAYO Se calienta la muestra a 38 °C + 1 °C mediante el bafio de agua (véase el numeral 4.1). Se mezcla con suavidad la muestra inmediatamente antes de pesar la muestra para ensayo (véase el numeral 6.4.1), 10NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 6.4 PROCEDIMIENTO 6.4.1 Muestra para ensayo 6.4.1.1 Muestra para ensayo y tratamiento previo. Se adicionan 12 g de sulfato de potasio (véase el numeral 3.1), 1,0 ml de la solucién de sulfato de cobre (véase el numeral 3.2), aproximadamente 5 ml + 0,1 ml de la muestra para ensayo preparada (véase el numeral 6.3), pesada con una aproximacién de 0,1 mg y 20 ml del acido sulfurico (véase el numeral 3.3) en un tubo de digestion limpio y seco (véase el numeral 4.12). El acido sulfirico se adiciona para lavar cualquier solucién de sulfato de cobre, sulfato de potasio o muestra para ensayo remanente en las paredes del cuello del tubo de digestién. Se mezcla con suavidad el contenido del tubo. 6.4.2 Determinacién 6.4.2.1 Digestién. Se coloca el bloque de digestién (véase el numeral 4.11) a una temperatura ial baja para controlar la formacién de espuma (aproximadamente a una temperatura entre 180 °C a 230 °C). Se transfiere el tubo al bloque de digestién y se pone el recolector de vapores (véase el numeral 4.13) que se conecta por si mismo a un lavador centrifugo de dispositivo similar (véase el numeral 4.14), en la parte superior del tubo. La tasa de succién de dicho lavador centrifugo 0 dispositivo similar debe ser apenas suficiente para remover los vapores. Es posible que se requiera mantener el aparato completo dentro de una campana extractora de vapores. Se realiza la digestion de la muestra para ensayo durante 30 min 6 hasta que se desarrollen vapores blancos. Luego se incrementa la temperatura del bloque de digestion hasta una temperatura entre 410 °C a 430 °C y se continua con la digestién de la muestra para ensayo hasta que ésta, una vez digerida, sea clara. Notas: 1) Para controlar la formacién de espuma puede ser necesario incrementar la temperatura de manera gradval durante un periodo de aproximadamente 20 min. En ningin evento, se permite que la espuma suba mas de 4 cm a5 cm por debajo de la superficie del recolector de vapores que se encuentra insertado en la parte superior del tubo de digestién. Después que la muestra para ensayo digerida se aclara (presenta color azul verdoso claro) se continda la digestién a una temperatura entre 410° C a 430 ° C, durante minimo 1 h. En este periodo el Acido sulfirico debe estar hirviendo. Si la ebullcién visible del liquide claro no se hace evidente a manera de burbujas formandose en la superficie del liquido caliente alrededor del perimetro del tubo, entonces la temperatura del bloque puede ser demasiado baja. El tiempo de digestion total estard entre 1,75 h y 2,5 h Para determinar el tiempo de ebulicién especifico requerido para las condiciones de andlisis en un laboratorio empleando un aparato cualquiera, se selecciona una muestra de alto contenido de proteinas y {grasas y se determina su contenido proteinico empleando diferentes tiempos de ebullicién (1h -1,5 h) despues de la limpieza, El contenido medio de proteinas se incrementa al aumentar el tiempo de ebulicin, se hace consistente y luego disminuye cuando el tiempo de ebullicién es demasiado prolongado. Se selecciona el tiempo de ebullicién que produzca el resultado maximo de proteinas. 2) Sial finalizar la digestién se evidencian pequefios puntos de material no digeridos adheridos a las paredes del matraz Kjeldahl, se deja enfriar el matraz, se lavan las paredes de éste con agua, para arrastrar las particulas a la superficie del acido sulfirico. Se debe reiniciar el calentamiento muy suavemente hasta la fevaporacién total del agua. El calentamiento progresivo debe permitir la desaparicién normal de las particulas no digeridas. AA finalizar la digestion, la muestra para ensayo digerida debe ser clara y debe hallarse libre de material no digerible. Se retra el tubo del bloque con el recolectar de vapores en su lugar. "NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 ‘Se deja enfriar hasta temperatura ambiente durante un perfodo de aproximadamente 25 min, La muestra para ensayo digerida y enfriada debe ser sélo Iiquida, o liquida con unos pocos cristales pequefios en el fondo del tubo. No se deben dejar las muestras de ensayo digeridas, enfriadas, sin dur toda la noche, ya {que pueden solidficarse y serd muy dificl solubizarlas con agua 3) La cristalizacién excesiva después de 25 min es el resultado de una pérdida indebida de cido durante la digestion y puede originar valores de ensayo bajos. La pérdida indebida de dcido se debe a la excesiva aspiracion de vapor o a un tiempo de digestién excesivamente prolongado causado por digestiones durante lun perfodo demasiado prolongado a una temperatura por debajo de la temperatura maxima del andliss. ara reducir la pérdida de acido, se reduce la velocidad de aspiracién del vapor. Después que se ha enfriado la muestra para ensayo digerida a temperatura ambiente, se retira el recolector de vapores y cuidadosamente se adicionan 85 ml de agua a cada tubo. Se agita para mezclar y disolver cualquier cristal que se separe. Se deja enfriar de nuevo el contenido del tubo a temperatura ambiente. 6.4.2.2 Destilacién. Se abre el agua de refrigeracién del condensador del aparato de destilacién. Se pone el tubo de digestion que contiene la muestra para ensayo digerida y diluida, a la unidad de destilacién (véase el numeral 4.15). Se pone un matraz cénico (véase el numeral 4.9) que contenga 50 mi de la solucién de acido bérico (véase el numeral 4.6) debajo de la salida del condensador, en forma tal que el tubo de salida se encuentre por debajo de la superficie de la solucién de acido bérico, Se ajusta la unidad de destilacién para dispensar 55 ml de solucién de hidréxido de sodio (véase el numeral 4.3) Nota. Cuando se emplee el 40 % (n/m) de la solucién de hidréxido de sodio se recomienda ajustar el volumen dispensado a 85 ml. Si el suministro automatico de la solucién de hidréxido de sodio es extremadamente variable debido al taponamiento parcial del tubo de suministro, entonces ocurrra gran variabilidad en el resultado det duplicado. Teniendo en cuenta las instrucciones del fabricante, se opera la unidad de destilacién en forma tal que se evapore el destilado de amoniaco liberado mediante la adicién de la solucin de hidréxido de sodio, recogiendo el destilado en la solucién de dcido bérico. Se contintia con el proceso de destilacién hasta que se haya recolectado por lo menos 150 mi de destilado. Se retira el matraz cénico de la unidad de destilacién 6.4.2.3 Titulacién. Se titula la solucién receptora de acido bérico con la solucién de dcido clorhidrico volumétrico estandar (véase el numeral 3.7) hasta obtener la primera traza de color rosa. Se toma la lectura de la bureta por lo menos con aproximacién a 0,05 ml. Una placa de agitacién iluminada puede contribuir a la visualizacién del punto final. 65 ENSAYO DE LOS BLANCOS Siempre se titulan los blancos con el mismo titulante que se emplea para las muestras de ensayo. Se realiza un ensayo blanco siguiendo el procedimiento deserito en los numerales 6.4.2.1 a 6.4.2.2. Se reemplaza la muestra para ensayo con 5 mi de agua que contenga aproximadamente 0,85 g de sacarosa (véase el numeral 3.10). Se mantiene un registro de los. valores de los blancos. Si éstos cambian, se identifica la causa Nota 1. El propésito de la sacarosa en un blanco o norma de recuperacién es actuar como material orgénico para ‘consumir una cantidad de Acido sulfirice durante la digestiGn que es escasamente equivalente a una muestra para ensayo. Sila cantidad de dcido sulfirico libre residual al final de la digestién es demasiado bajo, la recuperacién de ritrégeno mediante ambos ensayos de recuperacion en los numerales 66.1 y 6.6.2 serd baja. Si la cantidad de Acido residual presente al final de la digestion es suficiente para retener todo el nitrageno, pero las condiciones de temperatura y el tiempo durante la digestién no fueron los adecuados para liberar todo el nitrégeno de una muest 12NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 entonces la recuperacién de nitrégeno de acuerdo con el numeral 6.6.1 sera aceptable y la recuperacién de ritrégeno en el numeral 6.6.2 serd baja, El titulante empleado en el ensayo blanco debe ser siempre superior a 0,00 mi. Los blancos dentro del mismo laboratorio deben ser consistentes en el tiempo. Si el blanco ya es rosado antes de comenzar la titulacién, algo esta fallando. Por lo general, en dichos casos, los matraces cénicos 0 erlenmeyers no estan limpios o el agua que se puede condensar del aire, en la parte extema del aparato condensador ha caido dentro del matraz de recoleccién causando contaminacién 6.6 _ ENSAYOS DE RECUPERACION 6.6.1 Se recomienda verificar la precisién del procedimiento en forma regular mediante los siguientes ensayos de recuperacién, realizados de acuerdo con los numerales del 6.4.1 al 6.4.2.2. 6.6.2 Se verifica que no ocurra perdida de nitrégeno mediante una muestra para ensayo de 0,12 g de sulfato de amonio (véase el numeral 3.8) junto con 0,85 g de sacarosa (véase el numeral 3.10). Nota. La verificacién de la recuperacién de sulfato de amonio no oftece informacién acerca de la capacidad de las condiciones de la digestién para liberar nitrogeno que esta enlazado a las estructuras proteinicas. El porcentaje de nitrégeno recuperado debe estar entre 99,0 % y 100,0 % para todas las posiciones en el aparato. En caso que las recuperaciones de nitrégeno excedan un porcentaje del 100 %, el sulfato de amonio sélo es util para determinar si ha ocurrido pérdida de nitrégeno 0 la normalidad del titulante es inferior al valor establecido, Para recuperaciones inferiores al 99 %, la pérdida podria estar en la digestion o destilacién. Es posible emplear una mezcla de sulfato de amonio y una pequefia cantidad de dcido sulftrico (la cantidad de remanente residual al finalizar una digestion) en un matraz Kjeldahl. Se diluye con el volumen normal de agua, se adiciona la cantidad normal de hidréxido de sodio y se destila. Si la recuperacién del nitrogeno atin es baja con la misma cantidad, la pérdida de nitrégeno se encuentra en el aparato de destilacién y no en el de digestion. La probable causa seria un tubo con fuga en un sistema tradicional o que los extremos de los condensadores no estén sumergidos por debajo de la superficie del cido bérico al comienzo de la destilacién. El aparato debe aprobar este ensayo antes de pasar a verificar las recuperaciones mediante el procedimiento especificado en el numeral 6.6.1 6.6.3 Se verifica la eficiencia del procedimiento de digestion mediante el uso de 0,16 g de Clorhidrato de lisina 6 0,18 g de triptéfano (véase el numeral 3.9) junto con 0,67 g de sacarosa (véase el numeral 3,10). Se debe recuperar por lo menos el 98 % del nitrégeno, Si la recuperacién es inferior al 98 % después de contar con una recuperacién del 99 % a 100 % en sulfato de amonio, entonces la temperatura o tiempo de digestién es insuficiente (se sigue el procedimiento en el numeral 6.4.2.1 parrafo tercero, o existe material de muestra sin digerir (es decir carbén) en el interior del matraz Kjeldahl. La evaluacién final de desempefio se realiza mejor mediante la participacién en un sistema de ensayos de aptitud del método. 6.6.4 Resultados inferiores ya sean en el ensayo de recuperacién (véase el numeral 6.6.1) indicaran fallas en el procedimiento y/o concentracién imprecisa de la solucién volumétrica estandar de acido clorhidrico (véase el numeral 3.7), 13NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 6.7 CALCULO Y EXPRESION DE RESULTADOS 6.7.1 Calculo Se calcula el contenido de nitrégeno, expresado como porcentaje por masa, mediante la siguiente ecuacién: yy, = 4007-0, ~ 7 ») Me W,= es el contenido de nitrégeno de la muestra, expresado como porcentaje en masa; es el valor numérico de! volumen de la solucién volumétrica estandar de Acido empleada en la determinacién (véase el numeral 6.4.2.3), en milimetros, expresados con aproximacién a 0,05 ml; V,= es el valor numérico del volumen de la solucién volumétrica estandar de acido empleado en el ensayo blanco (véase el numeral 6.5), en milimetros, expresado por lo menos con aproximacién a 0,05 ml; M= es el valor numérico de la molaridad exacta de la solucién volumétrica esténdar de Acido (3.7), expresado con cuatro decimales; W,= es el valor numérico de la masa de la muestra para ensayo (véase el numeral 6.6.1) en gramos, expresada con aproximacién a 0,1 mg. 6.7.1.1 Expresidn de resultados. Se expresa el contenido de nitrégeno con cuatro decimales. 6.7.2. Calculo de contenido de proteina cruda El contenido de proteina cruda, expresado como porcentaje en masa, se obtiene mediante la multiplicacién del contenido de nitrégeno (véase el numeral 6.7.1.1) por 6,38. 6.7.3 Expresién de resultados Se expresan los resultados del ensayo con 3 decimales. 68 PRECISION 6.8.1 Ensayo interlaboratorio Los valores para la repetibilidad y reproducibilidad se derivaron del resultado de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la norma ISO 5725”. En la referencia [1] del anexo B (Bibliografia) se resumen los detalles del ensayo interlaboratorio del método, 68.2 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo tinico obtenidos con el mismo método sobre material de ensayo idéntico en el mismo laboratorio por el mismo operador empleando el 14NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 mismo equipo dentro de un intervalo corto de tiempo, en el 5 % de los casos no podra ser mayor a 0,006 % 6.8.3 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo tinico, obtenida con el mismo método en material de ensayo idéntico en diferentes laboratorios con diferentes operadores empleando diferente equipo, en el 5 % de los casos no podra ser mayor a 0,0077 %. 6.9 INFORME DEL ENSAYO El informe del ensayo debe especificar: - toda la informacién requerida para la completa identificacién de la muestra; - _ elmétodo de muestreo empleado, si se conoce; - el método empleade, citando esta norma; - todos los detalles de operacién no especificados en la presente norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el (los) resultado(s); - el (los) resultado(s) de ensayo obtenidos; - los resultados finales obtenidos, si se ha verificado la repetibilidad; - los resultados finales obtenidos, si la recuperacién ha sido verificada 7. PARTE 3. DETERMINACION DEL CONTENIDO DE NITROGENO NO PROTEICO 7.4 PRINCIPIO Se precipitan las proteinas de una muestra para ensayo mediante la adicién de solucién de Acido tricloroacético, tal que la concentracién final de dicho dcido en la mezcla sea aproximadamente del 12 %, Se remueve la proteina lactea precipitada mediante filtracién; el filtrante restante contiene los componentes de nitrégeno no proteico. Se determina el contenido de nitrégeno del filtrado mediante el procedimiento descrito en la parte 1 6 2 de la presente norma, Nota. Cuando el contenido total de nitrogeno de la muestra de leche se ha determinado previamente, el contenido real de nitrgeno proteico puede calcularse como la diferencia entre el contenido total de nitrégeno y el contenido de ritrégeno no proteico. 7.2. TOMA DE MUESTRAS La toma de muestras no hace parte del método especificado en la presente norma. En la NTC 666: 1996 (ISO 707) se ofrece un método de muestreo recomendado. Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no se haya dafiado o alterado durante el transporte o almacenamiento. 15NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 7.3. PREPARACION DE LA MUESTRA PARA ENSAYO Se calienta la muestra a 38 °C + 1 °C mediante el bafio de agua (véase el numeral 4.1). Se mezcla con suavidad la muestra inmediatamente antes de pesar la muestra para ensayo (véase el numeral 8.4.1), 7.4 PROCEDIMIENTO 7.41 Muestra para ensayo Se pipetean 10,0 ml + 0,1 ml de la muestra de ensayo preparada (véase el numeral 8.3), en un matraz cénico 0 Erlenmeyer previamente pesado (véase el numeral 4.16). Se vuelve a pesar el matraz y su contenido registrando los pesos con aproximacién a 0,1 mg. 7.4.2. Determinacién 74.2.1 Precipitacién y filtracién, Se adicionan 40 ml + 0,5 ml de solucién de dcido tricloroacético (véase el numeral 4.11) al matraz cénico. Se pesa el matraz y su contenido de nuevo con aproximacién a 0,1 mg. Se mezcla con movimientos circulares y se deja el matraz verticalmente durante cerca de 5 min para permitir que el precipitado sedimente. Se filtra el contenido de! matraz mediante un papel de filtro (véase el numeral 4.19). Se recoge todo el filtrado entero en un matraz cénico limpio y seco (véase el numeral 4.16). El filtrado debe ser claro y estar libre de material particulado, de lo contrario, se repite el proceso de precipitacién y filtracion. 7.4.2.2 Porcién filtrada. Se agita con movimientos el filtrado para asegurar una buena mezcla. Se pipetean 20 mi del fltrado en un vaso de precipitados de 50 mi (véase el numeral 4.20) y se pesa. Se vierte el fltrado desde el vaso de precipitados al matraz Kjeldahl (véase el numeral 4.2) 0 al tubo de digestién (4.12) que contenga la cantidad apropiada de reguladores de ebullicién (véase el numeral 4.4), sulfato de potasio (véase el numeral 4.1) y solucién de sulfato de cobre (véase el numeral 4.2) de la manera especificada en la parte 1 (procedimiento Kjeldahl) 6 Parte 2 (procedimiento de digestion de bloque) de esta norma. De inmediato se vuelve a pesar el vaso de precipitados vacio, 7.4.2.3 Digestién y destilacién. Se adiciona la cantidad apropiada de Acido sulfiirico (véase el numeral 4.3) especificada en la Parte 1 6 Parte 2 al contenido del matraz Kjeldahl 0 tubo de digestién (véase el numeral 4.12) Se continua con el procedimiento de digestion y destilacion mediante el procedimiento descrito en la Parte 1 6 Parte 2 de esta norma. 7.4.2.4 Digestién y titulacién, Se emplea la solucién de Acido clorhidrico 0,01 moll (véase el numeral 4.7) para titular el amoniaco liberado (en vez de la solucién de acido clorhidrico 0,1 mi! de la forma como se emplea en la parte 1 6 2 de esta norma. 7.5 ENSAYO DEL BLANCO Se digiere, destila y titula un blanco que contenga cerca de 0,1 g de sacarosa y 16 ml + 0,5 ml de solucién de Acido tricloroacético (véase el numeral 4.11) Siempre se titulan los blancos con la misma solucién que se emplea para las muestras de ensayo. Se mantiene un registro de los valores de los blancos. Si éstos cambian, se identifica la causa. 16NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 7.6 CALCULO Y EXPRESION DE RESULTADOS 7.6.1 Calculo Se calcula el contenido de nitrégeno, expresado como porcentaje en masa, mediante la siguiente ecuacién: Donde: es el contenido de nitrogeno de la muestra, expresado como porcentaje en masa; V.= es el valor numérico del volumen de la solucién volumétrica esténdar de acido clothidrico empleada en la determinacién (véase el numeral 7.4.2.4), en ml, expresados por lo menos con aproximacién a 0,05 ml; Vp= es el valor numérico del volumen de la solucién volumétrica estandar de acido empleado en el ensayo blanco (véase el numeral 8.5), en mi, expresado con aproximacién a 0,05 ml; M,= es el valor numérico de la molaridad exacta de la solucién de Acido (4.7), expresado con cuatro decimales; W,= es el valor numérico de la masa del fltrado de 20 ml (véase el numeral 7.4.2.2) en g, expresado con aproximacién de 0,1 mg, es el valor numérico de a masa de la muestra para ensayo de leche (véase el numeral 7.4.1), en g, expresado con aproximacién de 0,1 mg es el valor numérico de la masa de la muestra para ensayo de leche mas 40 ml de la solucién de dcido tricloroacético (véase el numeral 4.11) en g, expresada con aproximacién a 0,1 mg. Nota. E! factor 0,065 en el denominador hace suponer que la leche contiene cerca del 3,5 % de grasa y 3,0 % de proteina verdadera (por tanto 0,035 + 0,030), Puede requerirse ajustar el factor para atros productos lacteos liquidos. 7.6.1.1. Expresién de resultados.Se expresa el contenido de nitrdgeno con cuatro decimales. 7.6.2 Calculo de contenido de nitrégeno no proteico EI contenido de nitrégeno no proteico, expresado como porcentaje por masa, se obliene mediante la multiplicacién del contenido de nitrégeno (véase el numeral 8.6.1.1) por 6,38. 7.6.3 Expresién de resultados Se expresan los resultados de ensayo con 3 decimales. 7NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 7.7 PRECISION 7.7.1 Ensayo interlaboratorio Los valores para la repetibilidad y reproducibilidad se derivaron de los resultados de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la norma ISO 5725". En las referencias [2,3] del Anexo B (Informative) se han reportado estos resultados. 7.7.2. Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de un ensayo tinico obtenidos con el mismo método sobre material de ensayo idéntico en el mismo laboratorio por el mismo operador, empleando el mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo, en el 5 % de los casos no serd inferior a 0,0025 % del contenido de nitrégeno no proteico de la muestra 7.7.3, Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo tinico, obtenida con el mismo método en material de ensayo idéntico en diferentes laboratorios con diferentes operadores empleando diferente equipo, en el 5 % de los casos no sera mayor al 0,0052 % del contenido de nitrégeno no proteico de la muestra 7.8 INFORME DEL ENSAYO El informe del ensayo debe especificar: - toda la informacién requerida para la completa identificacién de la muestra; - el método de muestreo empleado, si se conoce; - el método empleade, citando esta norma; - todos los detalles de operacién no especificados en la presente norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el (los) resultado(s); = el (los) resultado(s) de ensayo obtenidos; - si se ha verificado la repetibilidad los resultados finales obtenidos; 8. PARTE 4: DETERMINACION DEL CONTENIDO DE NITROGENO PROTEICO 8.1 PRINCIPIO Precipitacién de proteinas de una muestra para ensayo mediante la adicion de solucién de Acido tricloroacético tal que la concentracién final de éste en la mezcla sea de aproximadamente el 12 %. Separacién del precipitado de proteina mediante filtracién (el fitrado contendré los componentes de nitrégeno no proteico), Determinacién del contenido de nitrégeno del precipitado mediante el procedimiento descrito en la parte 1 6 2 de la presente norma. 8NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 82 MUESTREO El muestreo no hace parte del método especificado en la presente norma. En la NTC 606 (ISO 707) se ofrece un método de muestreo recomendado. Es importante que el laboratorio reciba una muestra verdaderamente representativa y que no se haya deteriorado durante el transporte o almacenamiento, 83 PREPARACION DE LA MUESTRA DE ENSAYO Se calienta la muestra a 38 °C + 1 °C mediante el bafio de agua (véase el numeral 6.1). Se mezcla con suavidad la muestra inmediatamente antes de pesar la porcién de ensayo (véase el numeral 8.1). 8.4 PROCEDIMIENTO 8.4.1 Muestra para ensayo Se pesan 5 ml-+ 0,1 ml, con aproximacién a 0,1 mg, de la muestra de ensayo preparada (véase el numeral 8.3), en un matraz Kjeldahl (véase el numeral 4.2) 0 en un tubo de digestién (véase el numeral 4.12), Inmediatamente se adicionan 5 ml + 0,1 ml de agua al matraz Kjeldahl (véase el numeral 4.2) 0 en el tubo de digestién (véase el numeral 4.12), enjuagando cualquier cantidad de leche que haya en el cuello del matraz 0 en el tubo hasta el fondo del mismo. 8.4.2 Determinacién 84.2.1 Precipitacién y filtracién. Se adicionan 40 ml + 0,5 ml de solucién de dcido tricloroacético (véase el numeral 4.11) al matraz 0 al tubo y se agita con movimientos circulares. hasta mezclar bien el contenido. Se deja el matraz o tubo verticalmente durante aproximadamente 5 min para permitir que el precipitado se sedimente. Se pasa la mezcla del matraz Kjeldahl o del tubo de digestién por el papel de filtro (véase el numeral 4.19) y se recoge el filtrado. Una parte del precipitado permaneceré en el matraz Kjeldahl o en el tubo de digestién y otra parte se recoge en el papel de filtro. No es necesario retirar todo el precipitado del matraz o tubo. Inmediatamente después de filrar la mezcla y de manera que no se seque ningtin precipitado en el cuello del matraz Kjeldahl o del tubo de digestién, se adicionan mediante una pipeta automatica (véase el numeral 4.22), 10 ml de la solucién de dcido tricloroacético (véase el numeral 4.11). Se usa también la solucién de Acido tricloroacético para enjuagar cualquier precipitado que se encuentre en el cuello del matraz o del tubo y se pasa todo al papel de filtro. Se revuelve hasta mezclar el contenido, Se agita la mezola del matraz o del tubo por medio del mismo papel de filtro, recogiendo el fllrado sobre el recolectado previamente. Inmediatamente se enjuaga de nuevo el cuello del matraz o el tubo con una cantidad adicional de 10 ml de solucién de acido tricloroacético (véase el numeral 4.11). Se revuelve hasta mezclar el contenido y nuevamente se vierte la mezcla del matraz 0 del tubo por medio del mismo papel de filtro, adicionando el fitrado al recogido previamente. El filtrado debe ser claro y encontrarse libre de materia particulada. Nota, En este punto, ya no se requiere mas del fltrado y se puede desechar de manera apropiada, 19NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 8.4.2.2 Precipitado. Con cuidado y usando guantes se retira el papel de filtro del embudo y se dobla el papel a fin de encerrar el precipitado. Si queda algtin precipitado (véase el numeral 8.4.2.1) ya sea en el borde interno o externo del matraz Kjeldahl o del tubo de digestién, se frota con el papel de filtro doblado de modo que no se adhiera el precipitado al papel y luego se deja caer el papel de filtro dentro de! matraz Kjeldahl o el tubo de digestién 8.4.2.3. Digestion y destilacién, Se adiciona la cantidad apropiada de reguladores de ebullicién (véase el numeral 4,4), sulfato de potasio (véase e! numeral 4.1), solucién de sulfato de cobre II (véase el numeral 4.2) y acido sulfiirico (véase el numeral 4.3) como se especifica en la parte 1 (procedimiento Kjeldahl) 6 en la parte 2 (procedimiento de digestién de bloque) de la presente norma. Se determina el contenido de nitrégeno del precipitado y del papel de filtro ya sea mediante el procedimiento descrito en la parte 1 6 parte 2 de esta norma, 8&5 ENSAYO DEL BLANCO Se realiza un ensayo para un blanco. Se cambia la muestra para ensayo por un papel de filtro (véase el numeral 4.19) lavado con solucién de Acido tricloroacético (véase el numeral 4.11). Se mantiene un registro de los valores blancos. Si éstos cambian, se identifica la causa. 8.6 CALCULO Y EXPRESION DE RESULTADOS. 8.6.1 Calculo Se calcula el conteni la siguiente ecuacién: io de nitrégeno proteico, expresado como porcentaje en masa, mediante Donde: €8 el contenido de nitrégeno proteico de la muestra, expresado como porcentaje por masa; es el valor numérico del volumen de la solucién volumétrica esténdar de dcido empleada en la determinacién, en militros, expresados por lo menos con aproximacién a 0,05 mi: V,= es el valor numérico del volumen de la solucién volumétrica estandar de acido empleado en el ensayo blanco, en millitros, expresado con aproximacién a 0,05 mi; M= es el valor numérico de la molaridad exacta de la solucién volumétrica estandar de Acido, expresado con cuatro decimales; es el valor numérico de la masa de la porcién de ensayo, en gramos, expresada con aproximacién a 0,1 mg, 8.6.1.1. Expresién de resultados. Se expresa el contenido de nitrégeno con cuatro decimales. 20NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 8.6.2 Calculo del “equivalente de proteina” EI contenido de nitrégeno proteico, expresado como “equivalente de proteina’, se obtiene mediante la multiplicacién del contenido de nitrégeno proteico (véase el numeral 8.6.1.1) por 6,38. Esto corresponde al contenido proteico verdadero de la leche. 8.6.3 Expresién de resultados Se expresan los resultados de ensayo con 3 decimales. 8.7 PRECISION 8.7.1 Ensayo interlaboratorio Los valores para la repetibilidad y reproducibilidad se derivaron de los resultados de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con la norma ISO 5725. En la referencia [2,3] se han reportado estos resultados. 8.7.2. Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de un ensayo Unico obtenidos con el mismo método sobre material de ensayo idéntico en el mismo laboratorio, por el mismo operador, empleando el mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo, en el 5 % de los casos no sera mayor de 0,0038 %. 8.7.3 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo Unico, obtenida mediante el mismo método en material de ensayo idéntico en diferentes laboratorios con diferentes operadores empleando diferente equipo, en el 5 % de los casos no debe ser mayor al 0,0092 %. 88 — INFORME DEL ENSAYO El informe del ensayo debe especificar: - toda la informacién requerida para la completa identificacién de la muestra; - el método de muestreo empleade, si se conoce; - el método empleado, citando esta norma; - todos los detalles de operacién no especificados en la presente norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el (los) resultado(s); - el (los) resultados) de ensayo obtenidos; - si se ha verificado la repetibilidad los resultados finales obtenidos; 21NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 9. NORMAS QUE DEBEN CONSULTARSE Las siguientes normas contienen disposiciones que, a través de la referencia en este texto, constituyen disposiciones de la presente norma. Dichas publicaciones no se aplican para referencias fechadas, subsecuentes enmiendas o actualizaciones. No obstante, se invita a las. partes que lleguen a acuerdos con base en la presente norma a indagar sobre la posibilidad de aplicar las ediciones mas recientes de las normas indicadas a continuacién, Para referencias no fechadas, se aplica la ultima edicién de la norma referenciada. NTC 2175: 1986, (Reaprobada 1999) Material de vidrio para laboratorio. Buretas. Requisitos generales. (ISO 385-1:1984, Laboratory glassware — Burettes — Part 1: General requirements) NTC 666: 1996, Leche y productos ldcteos. Gula para muestreo, (ISO 707:1997, Milk and milk products - Guidance on sampiing) NTC 3529-1: 1999, Precisién de los métodos de medicién y de los resultados. Principios generales y definiciones. (ISO 5725-1:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results, Part 1: General principles and definitions) NTC 3529-2: 1999, Exactitud (veracidad y precisién) de métodos de medicién y resultados. Parte 2, Método basico para la determinacién de repetibilidad y reproducibilidad en un método normalizado de medicién. (ISO 5725-2:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 2: A basic method for the determination of repeatability and reproductibility of a standard measurement method) 10, | DOCUMENTOS DE REFERENCIA INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Milk. Determination of Nitrogen Content. Part 1: Kjeldahl Method. Switzerland, ISO, 1998. 9 p. (ISO/DIS 8968-1). INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Milk. Determination of Nitrogen Content. Part 2: Block Digestion Method (Macro Method). Switzerland, ISO, 1998. 7 p. (ISO/DIS 8968-2) INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Milk. Determination of Nitrogen Content. Part 4: Determination of Non-Protein Nitrogen Content. Switzerland, ISO, 1998. 6 p. (ISO/DIS 8968-4), INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Milk, Determination of Nitrogen Content. Part 5: Determination of Protein Nitrogen Content Switzerland, SO, 1998. 6 p. (ISO/DIS 8968-5) 22NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 ‘Anexo A (informativo) de otros productos lacteos cuando no existe una norma separada para dicho producto AO — INTRODUCCION El procedimiento descrito en la parte 1 de la presente norma se ha optimizado y su desempefio se ha evaluado para el andlisis de leche de bovino. Es probable que el analista desee emplear el mismo procedimiento, con una leve modificacién, para la determinacién del contenido de nitrégeno de una serie de productos ldcteos. Cuando no existe una norma separada para dichos productos, se debe observar, sin embargo, que el procedimiento y su desempefio no se han validado para los usos indicados. AA PROCEDIMIENTO Se pesa, con aproximacién a 0,1 mg, la masa requerida de muestra para ensayo, tomado de una muestra para ensayo preparada en forma adecuada, como se describe a continuacién. Se procede con la determinacién del contenido de nitrégeno empleando el método descrito en los numerales del 6.1 al 6.4. Las cantidades de Acido sulfurico (véase el numeral 3.3) y la solucién de hidréxido de sodio (véase el numeral 3.4) empleadas en los procesos de digestion y destilacin no deben cambiar. A\ cambiar la proporcién de dcido con respecto a otros componentes mediante el incremento de la cantidad de Acido disminuye el punto de ebullicién inicial de la mezcia en la digestion, lo cual no es recomendable. Se aconseja emplear un tamafio de muestra adecuado con respecto al material de ensayo, con los reactivos de la manera como se especifica en la Parte 1 0 en la Parte 2. El tamafio de la muestra adecuado para cualquier material puede calcularse de la siguiente manera: La cantidad éptima de proteina por matraz se encuentra entre 0,15 g y 0,30 g para cualquier muestra, Por tanto, si una muestra de queso Cheddar promedio contiene 24,00 % de proteina, entonces la cantidad de muestra de queso Cheddar deberia estar entre 0,625 g y 1,25 g. La decisién de emplear pesos de muestra que se promedien en el extremo inferior o superior de la serie depende de cuanto dcido consumira el remanente de componentes de la muestra (es decir, grasa y carbohidrato) durante la digestidn. En el método descrito en la parte 1, el analista comienza con 25 mi (aprox. 46 g) de dcido suffirico. Al finalizar la digestion se deben dejar cerca de 15 g de Acido sulfirico en el matraz Kjeldahl para retener todo el nitrégeno, La crema con contenido graso del 40 % es un ejemplo de producto dificil. En este caso el contenido de proteina o nitrégeno de la muestra es bajo y el contenido de grasa es alto. Se asume que una muestra de crema promedio contiene cerca del 40 % de grasa, 1,9 % de proteina y 2,9 % de lactosa. Para lograr 0,15 g de proteina en el matraz, seria necesario emplear una muestra de crema de 7,89 g. Esta muestra contendria 3,16 g de grasa y la grasa sola consumiria 56,8 g (aproximadamente, 30,9 mil) de cido sulfirico en la digestion. En estos casos debe reducirse la cantidad de muestra para permitir que una cantidad adecuada de acido sulfiirico permanezca al finalizar la digestion. En el caso del material de muestra como la crema, también seria mejor emplear un titulante que cuente con una concentracién inferior (por ejemplo 0,01 mol). La cantidad de sacarosa requerida para un blanco o para normas de recuperacién para productos diferentes a la leche de bovino puede determinarse de la siguiente manera: 23NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 Primero se requiere un cdlculo del contenido aproximado de grasa, proteina y carbohidratos para el tipo de material de muestra y el tamafio de muestra aproximado por emplearse en la digestion. En segundo lugar, durante la digestion, 1 g de grasa consumira cerca de 18 g de dcido sulfurico, 1 g de proteina consumiré cerca de 9 g de Acido suifiico y 1 g de carbohidrato consumira cerca de 7 g de Acido sulfirico. Con base en esta informacién se puede caloular la cantidad de dcido consumido por una muestra y la cantidad de sacarosa requerida para consumir la misma cantidad de 4cido durante la digestion. Esta cantidad de sacarosa deberia emplearse para el blanco y la norma de recuperacién de sulfato de amonio. Para la norma de recuperacién de nitrégeno aminodcido (véase el numeral 6.6), se reduce la cantidad de sacarosa mediante la cantidad de acido que va a consumir (calculada como proteina) el clorhidrato de lisina 0 triptéfano. Se asume que la recuperacién de nitrégeno en la digestién del aparato empleado es la misma para productos diferentes a la leche, sin realizar experimentos de recuperacién con el fin de producir condiciones que logren niveles similares de Acido sulfirico residual al finalizar la digestion. Para los productos deshidratados, o en polvo se pesan 2 g con precisién de 0,1 mg, en el material volumétrico de 50 mi, y se disuelven directa en el material volumétrico de 50 ml, con 20 ml de agua a 40 °C, se agita la mezola bien y se deja enfriar a 20 °C. Luego se aplica el procedimiento para la determinacién de nitrégeno. 24NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 ‘Anexo B (Informativo) Bibliografia 1 BARBANO, D.M., Clark J.L., Dunhais, C.E., Fleming, J.R, (1990) J. Assoc., Off, Anal, Chemistry 73, 849-859 2. SERTL, D. and MALONE, W.J.A.0.A.C. Int. 76: 711-719 (1993) 3. AOAC, Official Methods of Analysis (1990) 15" ed., 4" Supplement (1993), Method Nr. 992,22 25NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 ‘Anexo C (Informative) Otras normas internacionales sobre el mismo tema Nota. Las normas citadas a continuacién se relacionan Gnicamente para informacién; se invita a consular las respectivas ediciones vigentes. Organismo | Numero norma Tema Principio Norma ISO internacional relacionada 150 TSO 5642.1984 | Leche, Determinacion dat = Confirmada 2000 | contenido de proteina, Método del colorante negro” ‘amido (Método de rutina) 150 130 9622:1088 | Leche entera. = Determinacién del contenido de grasa lactea, proteina y lactosa, Gula sobre la foperacién de instrumentos ‘en medio infrarroj. INTERNATIONAL [IDF Standard 20[Leche Determinacion del Parte 1, Titulacion| SO/DIS 8968-1 DIARY Brt993 contenido de nitrégeno. | ~ kjeldahl ISODIS 8968-2 FEDERATION, Parte 1: Método Kjeldahl | Parte 2. Digestién| ISO/DIS 8968-3 IDF Parte 2: Método de digestién en bloque | ISO/DIS 8968-4 de bloques (método marco) | ttulacién kjeldah! | ISO/DIS 8968-5 Parte 3: Método de digestion | Parte 3. Digestion de bloques (método deen bloque (método tutina semi-micro-rapido, | rapido), —titulacion Parle 4: Determinacién del | kjeldahl ‘contenido de nitrégeno no| Parte 4. titulacién proteico. Kjeldahl, despues Parte 5: Determinacién del|de la liminacion contenido de nitrégeno —| de las proteinas, proteico. Parte 5, titulacién Kjeldahl sobre: procipitado do. proteina INTERNATIONAL |IOF Standard 68 Leche, Deferminacion del [Método Gal] (SO 64D TORT DIARY A1985, contenido de proteina.|colorante negro FEDERATION, Método del colorante negro | amido IDE ‘amido (método de rutina) [Oficial Methods of [AOAC Official | Nitrogeno total en crema | Titulacion =[eer20 Analysis of AOAC, | Method 920.108 jeldahi 17TH Ezition, 2000. [Oficial Methods of [AOAC Official |Niogano en Teche (Total) | Tiulacion Kjeldan, | [SO/DIS 6968-7 Analysis of AOAC, |Method 991,20 | Método Kjeldahl 17TH Edition, 2000, [Oficial Methods of AOAC Oficial |NiOgeno no proteico en] Titulacion Kjeldahi, | ISO/DIS 6988-4 [Analysis of AOAC, | Method 991.21 leche enteral después de la 17TH Ezition, eliminacién de las 2000. proteinas. Continia 26NORMA TECNICA COLOMBIANA —_NTC 5025 (Final) Organismo internacional Namere norma Tema Principio Norma ISO rolacionada [Oficial Methods of Analysis of AOAC ‘KORG Offcar Method 991.22 Contenido de nitrageno proteico en leche Titulaaion Wjeldaht sobre precipitado de proteina TSOIDIS 8968-5 [Oficial Mathods of Analysis of AAC ‘ORG ___Offcar Method 991,23 Cantenida de nirageno proteico en leche Diferencia enire Ta determinacién de nitrégeno totaly nitrégeno no. proteico [Oficial Methods of [AOAC Official Protein in milk. Dye binding | Método eal [Analysis of AOAC, | Method 967.12 | Method | colorante negro 17TH Edition, amido con 2000. espectrofotometria © colorimetro fotosléctrico, [Oficial Methods of [AOAC Official [Protein in milk. Dye binding | Espectrofotometia | ISO 5542-1984 [Analysis of AOAC, | Method 975.17 | Method II © colorimetro| (2000) 17TH Edition, fotocléctrico IDF Standard 98 2000, 1985, [Oficial Methods of Analysis of AOAC, 17 TH Edition, 2000. AOAC __ Offical Method 975.18 Micsintrared Spectroscopic Method 80 9622:1909, 27