Manual Segunda Edicion de Inmunologia

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE INMUNOLOGA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA E INMUNOLOGA
DIRECTORIO
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO
Rector
Dr. Juan Ramn de la Fuente
Secretario General
Lic. Enrique del Val Blanco
Secretario Administrativo
Mtro. Daniel Barrera Prez
Secretario de Servicios a la Comunidad Universitaria
Lic. Alberto Prez Blas
Abogada General
Dra. Arcelia Quintana Adriano
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

Director
Dr. Luis Alberto Zarco Quintero
Secretario General
Dr. Jorge Crdenas Lara
Jefe de la Divisin de Estudios Profesionales
Dr. Alfonso Baos Crespo
Jefe del Departamento de Microbiologa e Inmunologa
Dr. Antonio Verdugo Rodrguez
Responsables de la publicacin: Laura Cobos Marn y Alfredo Castaeda Ramrez

Colaboradores: Myrna Alicia Vicencio Malln y Daniel Martnez Gmez.
Segunda Edicin
Ciudad Universitaria, Coyoacn, Mxico, D. F.
II
Febrero del 2005.
NDICE
INTRODUCCIN .................................................................................................................................................IV
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO ...................................................................................................... V
NORMATIVIDAD, BIOSEGURIDAD Y MANEJO DE MATERIALES EN EL LABORATORIO ............... 1
REGLAMENTO GENERAL DEL LABORATORIO DE PRCTICAS DE VIROLOGA E
INMUNOLOGA ..................................................................................................................................................... 5
DILUCIONES ......................................................................................................................................................... 7
MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO Y VAS DE INOCULACIN ........................................... 22
OBTENCIN Y MANEJO DE MUESTRAS SANGUNEAS......................................................................... 39
MECANISMOS MOLECULARES DE RESISTENCIA EN EL SUERO ...................................................... 53
PRECIPITACIN ................................................................................................................................................. 61
ELECTROFORSIS E INMUNOELECTROFORESIS .................................................................................. 71
AGLUTINACIN DIRECTA I: DIAGNSTICO DE SALMONELOSIS AVIAR, ISOERITROLISIS
NEONATAL EN EQUINOS Y PRUEBAS CRUZADAS. ............................................................................... 83
AGLUTINACIN DIRECTA II.- DIAGNSTICO DE BRUCELOSIS ANIMAL.......................................... 93
PRUEBA DE FIJACIN DE COMPLEMENTO DIRECTA ......................................................................... 103
INMUNOENSAYO ENZIMATICO (ELISA) .................................................................................................... 111
PRUEBA DE LA TUBERCULINA .............................................................................................................. 12323
III
INTRODUCCIN
Desde el siglo XVI con Edward Jenner y el siglo XVII con Louis Pasteur, el desarrollo
de las ciencias biomdicas y especialmente la inmunologa, no haban tenido un
avance como el que han experimentado en los ltimos 30 aos. Esto nos obliga a
mantenernos vigentes en las tcnicas y procedimientos utilizados en la investigacin
y el diagnstico en la inmunologa aplicada a la medicina veterinaria, de manera que
seamos capaces de preservar la salud animal y humana dentro de parmetros
compatibles con el bienestar y la vida.
Este manual ha sido desarrollado con el objetivo de proporcionar los conceptos
tericos y los procedimientos que nos ayuden a comprender mejor los temas
analizados en el curso terico de Inmunologa y a conocer con detalle las
caractersticas de las pruebas aplicadas al diagnstico y la investigacin en esta rea
de la Medicina Veterinaria.
OBJETIVO GENERAL DE LAS PRCTICAS:

El alumno describir la importancia del laboratorio de inmunologa en dos aspectos:
a. En la demostracin de algunos principios tericos de la Inmunologa.
b. En su aplicacin en la prctica profesional, principalmente como
mtodo de diagnstico.
IV
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Elvia Lazo Garca
Myrna A. Vicencio Malln
Irasema J. Yela Miranda
OBJETIVO GENERAL
El alumno comprender los conceptos bsicos de seguridad como parte fundamental de su
formacin acadmica para hacerlo ms idneo con la problemtica actual de nuestro pas y los cada
vez ms estrictos sistemas de seguridad en la industria y en centros de trabajo.
OBJETIVOS ESPECFICOS
1. El alumno aplicar las reglas bsicas de seguridad dentro del laboratorio de Inmunologa.
INTRODUCCIN
El concepto de bioseguridad debe entenderse en forma amplia y generalmente comprende
tres aspectos. En primer lugar la proteccin a los humanos que concurren a participar en cualesquiera
de los niveles de trabajo involucrados en un laboratorio, ya sean investigadores, estudiantes,
intendentes, etc. La proteccin entendida tambin en sentido amplio, respecto a la preservacin de la
vida humana como prioridad permanente, pero tambin respecto a la salvaguarda de las condiciones
de trabajo que garanticen a corto y largo plazo la salud y an la comodidad de los humanos que
concurren o trabajan en los laboratorios o sus alrededores.
En segundo lugar, el concepto de bioseguridad se refiere a la proteccin del medio ambiente,
entendiendo ste como el espacio inmediato, mediato y an remoto con respecto al laboratorio donde
se trabaja; espacio ambiental que los humanos compartimos con otras especies biolgicas. Debe
considerarse que casi todos los agentes qumicos, microbiolgicos y radionclidos que se manejan
cotidianamente en los laboratorios, son potencialmente peligrosos o incompatibles con la vida
humana, animal o vegetal. Por lo anterior el manejo de los desechos de los laboratorios deber recibir
atencin especial.
En tercer lugar, tambin se incluye en este concepto de bioseguridad, el salvaguarda del
equipo, los materiales y las instalaciones que se utilizan en los laboratorios. Es por esta razn que
adquieren suma importancia las labores de prevencin, supervisin, mantenimiento
preventivo/correctivo y de almacenamiento por personal calificado, pues la consecucin de los fines
de seguridad integral en los laboratorios depende de las buenas condiciones de las instalaciones, del
buen funcionamiento del equipo, de su uso correcto y del estado real del material utilizado.
La finalidad de esta seccin es evitar accidentes en los laboratorios mediante el uso de reglas
preestablecidas, induciendo una cultura de seguridad integral en el alumno de modo tal que toda
actividad tienda a preservar la vida humana, animal y vegetal, el medio ambiente y el laboratorio
mismo donde se trabaja. Esta informacin propone al personal que trabaja en el laboratorio para su
beneficio propio, el desarrollo de actitudes y disposiciones favorables a la consecucin de los fines de
seguridad anteriormente mencionados, y an ms, el desarrollo de una manera de pensar que
destierre la improvisacin y el descuido que induce a los malos hbitos conductuales y mentales.
Quin es responsable de la bioseguridad? CADA UNO DE NOSOTROS.
El riesgo de contraer enfermedades infecciosas no slo se restringe al personal de salud. Se
ha demostrado que el riesgo de adquirir una infeccin en el entorno de un laboratorio en donde un
agente patgeno es manipulado, es mayor que en un lugar alejado del mismo. La adquisicin de
infecciones no slo afecta al personal que labora con los microorganismos, sino tambin las posibles
infecciones ocasionadas a terceros.
Los factores involucrados en estas infecciones incluyen, principalmente, el mecanismo de

transmisin, la ruta y fuente de infeccin, y el ambiente que rodea al laboratorio (ventilacin, equipo,
procedimientos usados).
Dentro de un laboratorio las vas ms frecuentes son los accidentes con objetos
punzocortantes, las picaduras y mordeduras de animales de experimentacin, la inhalacin de los
aerosoles que se producen en las manipulaciones, el contacto de las membranas mucosas con
material contaminado, y la ingestin accidental.
En estudios epidemiolgicos existentes sobre enfermedades adquiridas en laboratorios, se
demuestra toda una gama de infecciones, entre las que frecuentemente se encuentran hepatitis,
tuberculosis, brucelosis y salmonelosis.
LA MEJOR FORMA DE COMBATIR ACCIDENTES ES PREVENIRLOS
Clasificacin de los riesgos biolgicos. La clasificacin del riesgo biolgico asociada a cada
microorganismo depende de factores mltiples, como son: su patogenicidad, sus vas de transmisin,
su estabilidad, la posibilidad de prevenir o tratar la infeccin provocada, las consecuencias
epidemiolgicas ligadas a sta, el tipo y complejidad de manipulaciones que se realizan con el agente
biolgico, etc.
Por otra parte la patogenicidad de un microorganismo no es un concepto simple, ya que en
ella se encuentran involucrados diferentes factores tales como sus caractersticas morfolgicas
asociadas a sus factores de virulencia, su rango de huspedes, los tejidos y compartimientos
biolgicos que afecta, su capacidad de adaptacin e interaccin con el medio ambiente, entre otros.
As pues, de acuerdo con sus caractersticas, los agentes biolgicos se encuentran agrupados
en los siguientes niveles de riesgo biolgico:
Nivel 1. Agentes que presentan un riesgo de infeccin mnimo, tanto para el trabajador como
para la comunidad. No existe enfermedad causada por ellos, o ha sido raramente descrita. Los
microorganismos se clasifican como raramente patgenos. Dentro de este grupo se encuentra todo
agente bacteriano, parsito, hongo o virus no incluido en los niveles de riesgo superiores. Ver cuadro
1: Clasificacin de microorganismos segn su riesgo biolgico.
Nivel 2. Agentes que presentan un riesgo moderado para el trabajador. La enfermedad resulta
de autoinoculaciones, ingestiones o exposiciones de membranas mucosas, o bien debido a
inmunodepresin. Su diseminacin en el medio ambiente es poco probable y existen tratamientos o
medidas preventivas contra la infeccin generada. Algunos ejemplos son: Bacillus anthracis,
Leptospira spp, Salmonella spp. (Ver cuadro 1).
Nivel 3. Agentes que producen enfermedad seria o potencialmente letal como resultado de su
infeccin. Presenta un riesgo de transmisin elevado para el trabajador, pero bajo para la comunidad.
Los agentes son patgenos estrictos. Algunos ejemplos son: Brucella spp, Mycobacterium spp. (Ver
cuadro 1).
Nivel 4. Agentes que presentan un riesgo de infeccin elevado y frecuentemente mortal, tanto
para el trabajador como para la comunidad. Se transmiten por va area. Generalmente no se dispone
de tratamientos contra la infeccin. Actualmente no existen bacterias clasificadas dentro de este nivel,
algunos ejemplos son principalmente virus.
Nivel 5. Agentes que significan un riesgo para mayor para el medio ambiente que para el
humano. La introduccin de productos de riesgo est prohibida por leyes fitozoosanitarias y
ambientales.
Para cada uno de los cuatro primeros niveles de riesgo biolgico mencionados anteriormente,
se han definido reglas que permiten al trabajador manipular los agentes patgenos en condiciones de
seguridad. Estas reglas corresponden a cuatro niveles de seguridad biolgica.
VI
INFRAESTRUCTURA, EQUIPOS Y PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO SEGN NIVELES DE

SEGURIDAD
Para cada nivel de seguridad biolgica, se presentan cuatro elementos de reglamentacin,
dos de los cuales se refieren a la infraestructura del laboratorio y los dos restantes describen las
buenas prcticas dentro del mismo.
A continuacin se presentan una serie de cuadros con los aspectos ms relevantes para cada
nivel de riesgo biolgico.
VII
Seguridad Biolgica Nivel 1

Instalaciones:
Diseadas para fcil
limpieza.
Contar con un
lavamanos.
Las mesas de trabajo
deben ser
impermeables y
resistentes a
solventes.
Los accesos al
laboratorio no deben
estar obstaculizados.
Equipo Especial
Procedimientos
estndares:
Procedimientos especficos:
No se requiere.
Adems de las reglas
bsicas de seguridad:
Acceso controlado.
Reducir al mnimo la
produccin
de
aerosoles.
Los desechos slidos o
lquidos
debern
descontaminarse
por
mtodos
fsicos
o
qumicos
antes
de
eliminarse.
Debe
existir
un
programa de fumigacin
peridica.
Todo material contaminado

que
deba
salir
del
laboratorio
para
su
descontaminacin
(por
autoclave o incineracin),
debe ser colocado dentro
de
bolsas
especiales
debidamente cerradas y
etiquetadas. Una cinta
testigo
deber
ser
colocada como indicativo
de esterilizacin.
Seguridad Biolgica Nivel 2:

Instalaciones:
Diseadas para fcil
limpieza.
Contar
con
un
lavamanos.
deben
ser
impermeables
y
resistentes a solventes.
Los
accesos
al
Si
hay
ventanas
abiertas, stas deben
estar
cubiertas
con
mosquiteros.
Contar con un mtodo
para descontaminacin
de desechos cerca del
laboratorio
(como
autoclave
o
incineradores).
Equipo especial:
Procedimientos
estndares:
Gabinetes de seguridad
biolgica tipo II.
Centrfugas con rotores
con
canastillas
hermticamente
cerradas.
Proteccin facial: lentes,
mscaras, cubrebocas.
Indispensable el uso de
bata, cofia uniformes
los
cuales
debern
esterilizarse antes de
ser
enviados
a
lavandera.
Guantes: no deben ser
usados nunca fuera del
laboratorio. No deben
ser
lavados
ni
reutilizados.
Adems de las reglas

Acceso controlado.
Reducir al mximo la
produccin
de
aerosoles.
Los desechos slidos o
lquidos con material
biolgico
deben
descontaminarse
por
mtodos
fsicos
o
qumicos
antes
de
eliminarse.
Debe
existir
un
programa
de
fumigacin peridica.
Procedimientos
especficos:
El jefe del laboratorio
debe
designar
al
personal autorizado para
realizar los diferentes
procedimientos,
as
como responsabilizarse
de
su
correcta
capacitacin.
Cuando se requieran
precauciones especiales
dentro del laboratorio a
causa
del
tipo
de
manipulacin que se
realiza, debe colocarse
en la puerta de entrada
un aviso con el smbolo
internacional de riesgo
biolgico,
indicando adems, el tipo

de manipulacin, de
microorganismo, nombre
del
responsable
del
laboratorio
y
los
requerimientos
para
entrar al mismo.
Todo
material
contaminado que deba
salir del laboratorio para
su
descontaminacin
(por
autoclave
o
incineracin), debe ser
colocado
dentro
de
bolsas
especiales
debidamente cerradas y
etiquetadas. Una cinta
testigo
deber
ser
VIII
colocada como indicativo

de esterilizacin.
IX

Instalaciones:
Diseadas para fcil
limpieza.
Debe estar separado del
resto de las reas.
Acceso controlado a
travs de un mnimo de
2 puertas, dicha zona
funciona como vestidor.
Las
superficies
de
paredes, pisos y techos
deben tener pintura
resistente
al
agua.
Todas las hendiduras o
agujeros debern estar
hermticamente
sellados.
deben ser impermeables
y
resistentes
a
solventes.
Los
accesos
al
Contar
con
lavabo
automtico y lava ojos.
Las ventanas deben
estar
cerradas
y
selladas.
Las puertas de acceso
deben
cerrar
automticamente.
Debe haber un sistema
de
ventilacin
con
direccin desde las
reas no contaminadas
hacia aquellas en donde
se
realizan
experimentos (presin
negativa), esto se logra
manteniendo
depresiones
baromtricas dentro del
laboratorio
y
del
vestidor, que pueden
ser verificadas mediante
manmetros.
El aire no debe ser
recirculado hacia otras
reas del edificio sino al
exterior previa filtracin
por
medio
de
membranas de alta
eficiencia y lejos de la
circulacin de personas
o animales.
Equipo especial:
Procedimientos
estndares:
Gabinetes
de
seguridad biolgica tipo
II III.
El autoclave debe ser
de uso exclusivo del
laboratorio.
Equipo de proteccin
personal:
trajes
especiales, mascarilla,
respiradores, guantes.
Proteccin
facial:
lentes,
caretas,
cubrebocas.
Proteccin respiratoria:
mascarillas con filtros
de alta eficiencia.
Batas
de
frente
cerrado,
cofias
o
uniformes de cuerpo
entero.
Centrfugas
con
rotores con canastillas
de cierre hermtico.
Adems de las reglas

Acceso
controlado,
prohibida la entrada a
menores de 16 aos.
Debe colocarse en la
puerta de entrada un
aviso con el smbolo
biolgico,
Indicando adems, el
tipo de manipulacin,
de
microorganismo,
nombre
del
responsable
del
laboratorio
y
los
requerimientos para
entrar al mismo.
Los desechos slidos
o lquidos con material
biolgico as como el
material contaminado
debern
colocarse
dentro
de
bolsas
especiales
debidamente cerradas
y etiquetadas. Deben
descontaminarse
dentro del laboratorio,
por mtodos fsicos o
qumicos antes de
que salgan para su
eliminacin. Una cinta
testigo deber ser
colocada
como
indicativo
de
esterilizacin.
El
equipo
e
instrumentos son de
uso exclusivo del
laboratorio,
slo
saldrn
si
estn
previamente
descontaminados.
Debe
existir
un
programa
de
fumigacin peridica.
Procedimientos especficos:
Las puertas debern
permanecer cerradas.
debe
designar
al
personal
autorizado
para
realizar
los
diferentes
procedimientos,
as
como responsabilizarse
de
su
correcta
capacitacin.
Los
individuos en proceso
de
aprendizaje
no
podrn entrar solos al
laboratorio.
El personal que vaya a
laborar
dentro
del
laboratorio
deber
realizarse un examen
mdico previo.
Todo
el
material
biolgico
infectivo
deber
trabajarse
dentro del gabinete de
seguridad y no sobre
las mesas.
La superficie de trabajo
seguridad
deber
descontaminarse.
Es importante asegurar
la descontaminacin de
los
gabinetes
de
seguridad antes de
cualquier reparacin o
mantenimiento.

Instalaciones:
Construccin monoltica
en un edificio que quede
aislado y completamente
sellado.
Estar separado del resto
de las reas, provisto de
un vestidor interno y uno
externo separados por
un cuarto con regadera.
Diseadas para fcil
limpieza.
Las
superficies
de
paredes, pisos y techos
deben
tener
pintura
resistente
al
agua.
Todas las hendiduras o
agujeros debern estar
hermticamente
sellados.
Cualquier
salida
de
desage deber contar
con
un
reservorio
especial para asegurar
la
descontaminacin
mediante procedimientos
qumicos o calor antes
de pasar a los afluentes
generales de desecho.
Deben
estar
acondicionadas con un
sistema de doble filtro de
alta eficiencia.
deben ser impermeables
y
resistentes
a
solventes.
Los
accesos
al
El lavabo debe ser
automtico por medio de
pedal.
Las ventanas deben ser
irrompibles, cerradas y
selladas.
Las puertas de acceso
deben
cerrar
automticamente.
El autoclave debe ser de
doble compuerta y de
uso
exclusivo
del
laboratorio.
Debe haber un sistema
de
ventilacin
con
direccin
desde
las
reas no contaminadas
hacia aquellas en donde
se realizan experimentos
(presin negativa), esto
se logra manteniendo
depresiones
baromtricas dentro del
laboratorio y del vestidor,
que
pueden
ser
verificadas
mediante
manmetros.
Equipo especial:
Procedimientos
estndares:
Gabinetes
de
seguridad biolgica tipo
III tipo II combinado
con traje hermtico de
una pieza.
Todo el equipo de
proteccin
adicional
deber dejarse en el
vestidor interno.
Adems de las reglas

Acceso restringido y
limitado.
Debe colocarse en la
puerta de entrada un
aviso con el smbolo
biolgico,
indicando adems, el
tipo de manipulacin,
de
microorganismo,
nombre
del
responsable
del
laboratorio
y
los
requerimientos
para
entrar al mismo.
Los desechos slidos
o lquidos con material
biolgico as como el
material contaminado
debern
colocarse
dentro
de
bolsas
especiales
debidamente cerradas
y etiquetadas. Deben
descontaminarse
dentro del laboratorio,
por mtodos fsicos o
qumicos antes de que
salgan
para
su
eliminacin. Una cinta
testigo
deber
ser
colocada
como
indicativo
de
esterilizacin.
Debe
existir
un
programa
de
fumigacin peridica.
XI
Procedimientos
especficos:
Las
puertas
deben
permanecer cerradas.
debe designar al personal
autorizado para realizar
los
diferentes
procedimientos, as como
responsabilizarse de su
correcta capacitacin. Los
individuos en proceso de
aprendizaje no podrn
entrar solos al laboratorio.
El personal que vaya a
laborar
dentro
del
laboratorio
deber
realizarse un examen
mdico previo.
Todo el personal deber
estar inmunizado en lo
posible,
contra
los
microorganismos que se
trabajan.
Todo el material biolgico
infectivo
deber
trabajarse
dentro
del
gabinete de seguridad y
no sobre las mesas.
La superficie de trabajo
seguridad
deber
descontaminarse.
Es importante asegurar la
descontaminacin de los
gabinetes de seguridad
antes
de
cualquier
reparacin
o
mantenimiento.
CUADRO 1. CLASIFICACIN DE MICROORGANISMOS SEGN SU RIESGO BIOLGICO

Agentes de clase 2:
Bacterias
Parsitos
Hongos
Virus
-
Acinetobacter
calcoaceticus
Actinomicetos (incluye
todas las especies de
Nocardia, Actinomyces y
Arachnia propionica).
Aeromonas hydrophila
Bacillus anthracis
Bordetella spp. Todas las
especies
Chlamidophyla psittaci
Clostridium botulinum
C. tetani
Corynebactrium
diphteriae
Escherichia coli. Todas
las cepas
enteropatognicas,
enterotxicas,
enteroinvasivas y
aquellas que portan el
antgeno K1.
Klebsiella spp. Todas las
especies y todos los
serotipos.
Legionella pneumophila
Leptospira spp. Todas
las serovariedades
patgenas.
Lymphogranuloma
venereum
Listeria spp. Todas las
especies
Mycobacterium spp.
Todas las especies
excepto las mencionadas
en la clase 3.
Neisseria gonorrhoeae.
N. meningitidis
Pasteurella spp. Todas
las especies excepto las
enlistadas en la clase 3.
Salmonella spp. Todas
las especies y serotipos.
Shigella spp. Todas las
especies y serotipos.
Fusobacterium
necrophorum.
Staphylococcus aureus
Streptococcus
pneumoniae
Treponema pallidum
Vibrio cholerae
Entamoeba histolytica
Leishmania spp.
Naegleria gruberi
Schistosoma mansoni
Taenia solium
(huevecillos)
Toxoplasma gondii
Toxocara canis
Trichinella spiralis
Trypanosoma cruzi
- Blastomyces
dermatitidis
- Cryptococcus
neoformans
- Paracoccidioides
brasiliensis
- Sporothrix schenkii
- Adenovirus humanos.
Todos los tipos
- Coronavirus
- Coxackie virus A y B
- Herpes virus. Todos los
serotipos excepto Herpes
virus simiae
- Papilloma virus
- Parainfluenza virus.
Todos los tipod excepto
Parainfluenza virus 3,
cepa SF4, que pertenece
a la clase 1.
- Poxvirus. Todos los tipos
excepto varicela de
Alastrum y viruela
blanca.
- Poliovirus. Todos los
tipos silvestres y
atenuados.
- Reovirus. Todos los tipos
- Rhinovirus. Todos los
tipos
- Vaccinia virus
- Virus de la influenza.
Todos los tipos excepto
A/PR8/34, que es de la
clase 1
- Virus de
inmunodeficiencia
humana (en flebotoma).
- Virus de la
encfalomiocarditis
(EMC)
- Virus de la Hepatitis (tipo
A,B,C,D, y E)
- Virus de la Varicela
- Virus de la Rabia. Todas
las cepas excepto el
virus de la rabia callejera
que pertenece a la clase
3
- Virus del sarampin
- Virus del dengue
(1excepto en
experimentacin con
animales, que es nivel 3)
Modificado de: Castellanos BC, Lpez ML, Rosales LR, Ladrn de Guevara O, V. Osorio A, Garduo SG. Bioseguridad para los laboratorios
Biomdicos. Lineamientos, prevencin y proteccin. Mxico. Instituto de Investigaciones Biomdicas, UNAM, 1999.
XII
CUADRO 1. CLASIFICACIN DE MICROORGANISMOS SEGN SU RIESGO BIOLGICO

(CONTINUACIN)
Agentes de clase 3:
Bacterias
- Bartonella spp. Todas las
especies.
- Brucella spp. Todas las
especies.
- Franciscella tularensis.
- Mycobacterium avium.
- M. Boris.
- M. tuberculosis.
- Orden Rickettsiales. Todas
las especies, excepto Vole
rickettsia.
- Pasteurella multocida tipos B
y E (bfalo y otras cepas
virulentas).
- Burkholderia mallei.
- Pseudomonas pseudomallei.
Parsitos
Ninguno
Hongos
- Coccidioides immitis.
- Histoplasma capsulatum.
- H. capsulatum var.
Duboisii.
Virus
-
Arbovirus. Todas las cepas

excepto las incluidas en las
clases 2 y 4.
Virus del dengue. En
experimentos con animales.
Viruela del mono. En
experimentos in vitro.
Virus de Inmunodeficiencia
humana. En experimentos in
vitro y de biologa
molecular.
Virus de la fiebre amarilla.
Tipo silvestre, en
experimentos in vitro.
Virus de la rabia callejera.
Agentes de clase 4:
Bacterias
Ninguna
Parsitos
Ninguno
Hongos
Ninguno
Virus
-
Agentes que producen fiebres

hemorrgicas: Crimean
(Congo), Junin y virus de
Machupo y otros no
completamente definidos.
Herpesvirus simiae (virus del
simio B).
Virus de la encefalitis equina
venezolana. Cepas
epidmicas usadas para
transmisin o experimentos
con animales.
Virus de la encefalitis
transmitida por garrapata
Virus de la fiebre amarilla.
Cepa silvestre, experimentos
de inoculacin en animales.
Virus de la fiebre del bola
Virus de Lassa
- Virus de Marburgo
Modificado de: Castellanos BC, Lpez ML, Rosales LR, Ladrn de Guevara O, V. Osorio A, Garduo SG. Bioseguridad para los laboratorios
Biomdicos. Lineamientos, prevencin y proteccin. Mxico. Instituto de Investigaciones Biomdicas, UNAM, 1999.
XIII
9REGLAS BSICAS DE BIOSEGURIDAD

1. Orden, limpieza y respeto personal.
2. Evitar distracciones y juegos.
3. Es indispensable el uso de bata (100% algodn) dentro del laboratorio. La bata puede ser un
vehculo de contaminacin (fomite) por lo que se prohbe salir del laboratorio con ella puesta.
4. Confinar el cabello largo (sujetado o con cofia).
5. No fumar, no comer, ni maquillarse dentro del laboratorio y en general, no llevarse objetos a la
boca.
6. Queda estrictamente prohibido almacenar alimentos dentro del laboratorio.
7. Lavarse las manos despus de manipular material biolgico y antes de salir del laboratorio.
8. Nunca pipetear con la boca, usar siempre pipeteador automtico (propipeta).
9. No lavarse la piel con solventes orgnicos (cloro, alcohol, fenol, etc.), ya que predisponen a
infecciones e irritaciones.
10. No encender mecheros cerca de lugares en donde se manipulen solventes.
11. Siempre rotular el material utilizado en un experimento.
12. En caso de identificar con etiquetas, nunca utilice la lengua para remojar el engomado de la
misma.
13. No desechar solventes al drenaje (tarja), deben neutralizarse previamente.
14. No utilizar el equipo si desconoce su funcionamiento.
15. Descontaminar las reas de trabajo una vez al da as como despus de cualquier derrame de
material biolgico.
16. Conocer la localizacin y uso de los extintores.
17. Conocer la localizacin, uso del equipo y material de seguridad para controlar derrames de
substancias txicas.
18. Seguir ordenadamente las instrucciones y protocolos para el desarrollo de un experimento o
tcnica.
19. Planificar el trabajo y reportarlo en una bitcora.
20. Reportar toda condicin insegura al Responsable del rea.
21. Conocer en su totalidad los sealamientos de seguridad, utensilios, botiquines y salidas de
emergencia.
CLAVE DE COLORES Y FORMAS DE SEGURIDAD
A continuacin se presentan algunas tablas sobre el uso de los colores y las formas geomtricas en
materia de seguridad (vase NOM-026-STPS-1989 (revisar diario oficial13/10/98); NOM-027-STPS.
DOF, mayo 27, 1994; NOM-O28-STPS. DOF, mayo 24, 1994 y la norma ISO-R-508-1966).
NOM-026-STPS-1998
Colores y seales de seguridad e higiene, e identificacin de

riesgos por fluidos conducidos en tuberas (cancela a la NOM-027STPS-1993 y a la NOM-028-STPS-1993)
XIV
13/10/1998
COLORES DE SEGURIDAD, SU SIGNIFICADO E INDICACIONES Y PRECISIONES COLOR DE

SEGURIDAD SIGNIFICADO INDICACIONES Y PRECISIONES
COLOR DE
SEGURIDAD
SIGNIFICADO
PARO
Alto y dispositivos de desconexin para emergencias.
PROHIBICIN
ROJO
MATERIAL, EQUIPO Y
SISTEMAS PARA COMBATE DE
INCENDIOS
ADVERTENCIA DE PELIGRO
DELIMITACION DE REAS
AMARILLO
VERDE
ADVERTENCIA DE PELIGRO
POR RADIACIONES
IONIZANTES
CONDICIN SEGURA
AZUL
INDICACIONES Y PRECISIONES
OBLIGACIN
Sealamientos para prohibir acciones especficas.

Identificacin y localizacin.
Atencin, precaucin, verificacin. Identificacin de fluidos

peligrosos.
Lmites de reas restringidas o de usos especficos.
Sealamiento para indicar la presencia de material radiactivo.
Identificacin de tuberas que conducen fluidos de bajo riesgo.

Sealamientos para indicar salidas de emergencia, rutas de
evacuacin, zonas de seguridad y primeros auxilios, lugares de
reunin, regaderas de emergencia, lavaojos, entre otros.
Sealamientos para realizar acciones especficas.
Colores contrastantes
Cuando se utilice un color contrastante para mejorar la percepcin de los colores de seguridad, la
seleccin del primero debe ser de acuerdo a lo establecido. El color de seguridad debe cubrir al
menos 50 % del rea total de la seal, excepto para las seales de prohibicin, segn se establece.
COLOR DE SEGURIDAD
COLOR CONTRASTANTE
ROJO
BLANCO
AMARILLO
NEGRO
AMARILLO
MAGENTA*
VERDE
BLANCO
AZUL
BLANCO
* Nota: El magenta debe ser el color contrastante del amarillo de seguridad, nicamente en el caso de
la seal utilizada para indicar la presencia de radiaciones ionizantes, segn lo establecido en el
apndice E.
XV
LETRAS DE IDENTIFICACIN DEL EQUIPO DE PROTECCIN PERSONAL

Letra de
identificacin
Equipo
Anteojos de seguridad
Anteojos de seguridad y guantes
Anteojos de seguridad, guantes y mandil
D
E
F
G
H
I
J
K
X
Careta, guantes y mandil

Anteojos de seguridad, guantes y respirador para polvos
Anteojos de seguridad, guantes, mandil y respirador para polvos
Anteojos de seguridad, guantes y respirador para vapores
Goggles para salpicaduras, guantes, mandil y respirador para vapores
Anteojos de seguridad, guantes y respirador para polvos y vapores
Goggles para salpicaduras, guantes, mandil y respirador para polvos y vapores
Capucha con lnea de aire o equipo SCBA, guantes, traje completo de proteccin y botas
Consulte con el supervisor las indicaciones especiales para el manejo de estas sustancias
Nota: Se pueden utilizar una o ms letras de identificacin.

TIPO DE RIESGO
SALUD
INFLAMABILIDAD
REACTIVIDAD
RIESGOS ESPECIALES/ EQUIPO
DE PROTECCIN PERSONAL
COLOR DEL ROMBO

AZUL
ROJO
AMARILLO
BLANCO
Riesgo de salud
4 Fatal
3 Extremadamente
Riesgoso
2 Riesgoso
1 Ligeramente
Riesgoso
0 Material Normal
C
Equipo de Proteccin
Anteojos
s, Guantes
C Bata
s, Guantes, Mascarilla
D Bata
Riesgos de Incendio
4 Extremadamente inflamable
3 Inflamable
2 Calentamiento moderado Lo
que puede inflamar
1 Combustible si se calienta
0 No se quema
A Bata
B Bata
COLOR Y NUMEROS Y LETRAS

BLANCO
BLANCO
NEGRA
NEGRO
Anteojo
Anteojo
Anteojo
XVI
Reactividad
4 Puede detonar
3 Puede detonar con
golpe o calor
2 Cambio qumico
violento
1 Inestable si se
calienta
0 Estable
FORMAS GEOMTRICAS PARA SEALES DE SEGURIDAD E HIGIENE Y SU SIGNIFICADO

FORMA GEOMTRICA
SIGNIFICADO
DESCRIPCIN DE
UTILIZACIN
FORMA GEOMTRICA
Crculo con banda circular y banda
diametral oblicua a 45 con la
horizontal, dispuesta de la parte
superior izquierda a la inferior
derecha
PROHIBICIN
OBLIGACIN
Crculo
Prohibicin de una accin

susceptible de provocar un riesgo
Descripcin de una accin

obligatoria
Tringulo equiltero, la base deber Advierte de un peligro

ser paralela a la horizontal
PRECAUCIN
Cuadrado o rectngulo, la base

Proporciona informacin para
medir entre una a una y media
casos de emergencia
veces la altura y deber ser paralela
a la horizontal
INFORMACIN
COLORES DE SEGURIDAD PARA TUBERIAS Y SU SIGNIFICADO

COLOR DE SEGURIDAD
ROJO
AMARILLO
VERDE
SIGNIFICADO
IDENTIFICACIN DE TUBERIAS CONTRA INCENDIO
IDENTIFICACIN DE FLUIDOS PELIGROSOS
IDENTIFICACIN DE FLUIDOS DE BAJO RIESGO
XVII
Para definir si un fluido es peligroso se debern consultar las hojas de datos de seguridad conforme a
lo establecido en la NOM-114-STPS-1994.
Tambin se clasificarn como fluidos peligrosos aquellos sometidos a las condiciones de presin o
temperatura siguientes:
Condicin extrema de temperatura: cuando el fluido est a una temperatura mayor de 50C o a baja
temperatura que pueda causar lesin al contacto con ste.
Condicin extrema de presin: cuando la presin manomtrica del fluido sea de 686 kPa, equivalente
a 7 kg/cm2 o mayor.
El color de seguridad debe aplicarse en cualquiera de las formas siguientes:
Pintar la tubera a todo lo largo con el color de seguridad correspondiente.
Pintar la tubera con bandas de identificacin de 100 mm de ancho como mnimo, incrementndolas
en proporcin al dimetro de la tubera se ajustar a lo establecido de tal forma que sean claramente
visibles.
Colocacin de etiquetas indelebles con las dimensiones mnimas que se indican, para las bandas de
identificacin; las etiquetas de color de seguridad deben cubrir toda la circunferencia de la tubera.
La disposicin del color amarillo para la identificacin de fluidos peligrosos, se permitir mediante
bandas con franjas diagonales amarillas y negras a 45. El color amarillo de seguridad debe cubrir por
lo menos el 50% de la superficie total de la banda de identificacin y las dimensiones mnimas de
dicha banda se ajustarn a lo establecido. La informacin complementaria debe cumplir con lo
dispuesto en el apartado 9.2.4 (NOM-026-STPS-1998).
XVIII
LEYENDAS PARA FLUIDOS PELIGROSOS

TXICO
INFLAMABLE
EXPLOSIVO
IRRITANTE
CORROSIVO
REACTIVO
RIESGO BIOLGICO
ALTA TEMPERATURA
BAJA TEMPERATURA
ALTA PRESIN
SEALES DE PROHIBICIN
Se establecen las seales para denotar prohibicin de una accin susceptible de provocar un riesgo.
Estas seales deben tener forma geomtrica circular, fondo en color blanco, bandas circular y
diagonal en color rojo y smbolo en color negro.
A.1
A.2
A.3
INDICACIN
CONTENIDO DE IMAGEN DEL

SMBOLO
PROHIBIDO FUMAR
Cigarrillo encendido
PROHIBIDO GENERAR LLAMA

ABIERTA E INTRODUCIR
OBJETOS INCANDESCENTES
Cerillo encendido
PROHIBIDO EL PASO
Silueta humana caminando
XIX
EJEMPLO
SEALES DE OBLIGACIN
Se establecen las seales de seguridad e higiene para denotar una accin obligatoria a cumplir. Estas
seales deben tener forma circular, fondo en color azul y smbolo en color blanco segn se establece.
INDICACIN
CONTENIDO DE IMAGEN
DEL SMBOLO
B.1
INDICACIN GENERAL DE
OBLIGACIN
Signo de admiracin
B.2
USO OBLIGATORIO DE CASCO
Contorno de cabeza humana

portando casco
B.3
USO OBLIGATORIO DE
PROTECCIN AUDITIVA

portando proteccin auditiva
B.4
USO OBLIGATORIO DE
PROTECCIN OCULAR

portando anteojos
B.5
USO OBLIGATORIO DE
CALZADO DE SEGURIDAD
Un zapato de seguridad
B.6
USO OBLIGATORIO DE
GUANTES DE SEGURIDAD
Un par de guantes
XX
EJEMPLO
SEALES DE PRECAUCIN
Se establecen las seales para indicar precaucin y advertir sobre algn riesgo presente. Estas
seales deben tener forma geomtrica triangular, fondo en color amarillo, banda de contorno y
smbolo en color negro.
INDICACIN

SMBOLO
C.1
INDICACIN GENERAL DE
PRECAUCIN
Signo de admiracin
C.2
PRECAUCIN, SUSTANCIA
TXICA
Crneo humano de frente con dos

huesos largos cruzados por detrs
C.3
PRECAUCIN, SUSTANCIAS
CORROSIVAS
Una mano incompleta sobre la

que una probeta derrama un
lquido, en este smbolo puede
agregarse una barra incompleta
sobre la que otra probeta derrama
un lquido
C.4
PRECAUCIN, MATERIALES
INFLAMABLES Y
COMBUSTIBLES
Imagen de flama
C.5
OXIDANTES Y COMBURENTES
Corona circular con una flama
C.6
CON RIESGO DE EXPLOSIN
Una bomba explotando
XXI
EJEMPLO
C.7
ADVERTENCIA DE RIESGO
ELCTRICO
Flecha quebrada en posicin

vertical hacia abajo
C.8
RIESGO POR RADIACIN

LASER
Lnea convergiendo hacia una

imagen de resplandor
C.9
ADVERTENCIA DE RIESGO
BIOLGICO
Circunferencia y tres medias lunas
SEALES DE INFORMACIN
Se establecen las seales para informar sobre ubicacin de equipo contra incendio y para equipo y
estaciones de proteccin y atencin en casos de emergencia.
SEALES DE INFORMACIN PARA EQUIPO CONTRA INCENDIO
Estas seales deben tener forma cuadrada o rectangular, fondo en color rojo y smbolo y flecha
direccional en color blanco. La flecha direccional podr omitirse en el caso en que el sealamiento se
encuentre en la proximidad del elemento sealizado.
INDICACIN
D.1.1
UBICACIN DE UN EXTINTOR
D.1.2
UBICACIN DE UN HIDRANTE

SMBOLO
Silueta de un extintor con flecha

direccional
Silueta de un hidrante con flecha

direccional
XXII
EJEMPLO
SEALES DE INFORMACIN PARA SALIDAS DE EMERGENCIA Y PRIMEROS AUXILIOS

Estos sealamientos deben tener forma geomtrica rectangular o cuadrada, fondo en color verde y
smbolo y flecha direccional en color blanco. La flecha direccional podr omitirse en el caso en que el
sealamiento se encuentre en la proximidad del elemento sealizado, excepto en el caso de la seal
de ubicacin de una salida de emergencia, la cual deber contener siempre la flecha direccional.
INDICACIN
CONTENIDO DE IMAGEN
DEL SMBOLO
Silueta humana avanzando

hacia una salida de
emergencia indicando con
flecha direccional el sentido
requerido
D.2.1
UBICACIN DE UNA SALIDA

DE EMERGENCIA
D.2.2
UBICACIN DE UNA
REGADERA DE EMERGENCIA
Silueta humana bajo una

regadera y flecha
direccional
D.2.3
UBICACIN DE ESTACIONES
Y BOTIQUN DE PRIMEROS
AUXILIOS
Cruz griega y flecha

direccional
D.2.4 UBICACIN DE UN LAVAOJOS
Contorno de cabeza
humana inclinada sobre un
chorro de agua en un
lavamanos y flecha
direccional
XXIII
EJEMPLO
SEAL DE SEGURIDAD E HIGIENE RELATIVA A RADIACIONES IONIZANTES

Las caractersticas de las seales de seguridad e higiene que deben ser utilizadas en los centros de
trabajo para advertir la presencia de radiaciones ionizantes son:
a) Forma geomtrica:
Cuadrada
b) color de seguridad:
Amarillo
c)color contrastante:
Magenta
d) smbolo:
El color del smbolo debe ser el magenta; este smbolo debe cumplir con la forma y
dimensiones que se muestran en la figura
e) texto:
Opcional, siempre y cuando cumpla con lo establecido en el apartado 8.5.1 (NOM-O26STPS. 1993)
LITERATURA DE CONSULTA
Castellanos BC, Lpez ML, Rosales LR, Ladrn de Guevara O, V. Osorio A, Garduo SG.
Bioseguridad para los laboratorios Biomdicos. Lineamientos, prevencin y proteccin. Mxico.
Instituto de Investigaciones Biomdicas, UNAM, 1999.
Categorization of biological agents according to hazard and categories of containment. HSE books,
4th. ISBN 0717610381,1995.
Gallardo RR. Manual de bioseguridad para laboratorios de biolgicos. Mxico. Secretara de Salud,
1994.
NOM-087-ECOL-1995. Requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin,
transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos que se
generan en establecimientos que presenten atencin mdica.
Santos E. Cruz-Gaviln I. Manual de procedimientos de bioseguridad en los laboratorios de la UNAM.
Mxico. DGIRE. 2, 2002.
XXIV
PRACTICA 1
NORMATIVIDAD, BIOSEGURIDAD Y MANEJO DE MATERIALES EN EL
LABORATORIO
Humberto Vega Dehesa
OBJETIVOS GENERALES:
Que el alumno:
1. Conozca los lineamientos de evaluacin del laboratorio.
2. Conozca las reglas bsicas de bioseguridad en el laboratorio.
3. Identifique y maneje adecuadamente el material e instrumento del laboratorio
que utilizar durante el semestre.
OBJETIVOS PARTICULARES:
Que el profesor:
1. Especifique los lineamientos para aprobar el laboratorio
2. Indique que es requisito indispensable aprobar el laboratorio para poder
aprobar la parte terica.
3. Indique el material que los alumnos debern presentar para la realizacin de
las prcticas.
4. Junto con los alumnos revise el reglamento del laboratorio.
5. Seale las reglas bsicas de seguridad que deben observarse en el
laboratorio y que son indispensables para evitar accidentes.
Que el alumno:
1. Identifique el siguiente material:
Pipetas serolgicas terminales y no terminales
Perillas de seguridad (propipetas)
Micropipetas
Microplacas de fondo plano y en U
Tubos de ensaye estriles con tapn de algodn
Mecheros para trabajar en forma estril
Gradillas y tubos de ensaye

2. Realice diversos ejercicios de medicin de volumen utilizando las pipetas
serolgicas y sus perillas.
INTRODUCCIN.
Como en todas las actividades en las que se encuentra presente el riesgo, es
menester la correcta aplicacin de normas de seguridad.
El trabajo en un laboratorio en el que se manejan reactivos biolgicos no es la
excepcin. La posibilidad de: Contraer, transmitir o diseminar una enfermedad puede
acarrear lamentables consecuencias.
El trmino BIOSEGURIDAD engloba las normas encaminadas a la correcta
aplicacin de las diversas actividades que se realizan en laboratorio que maneja
reactivos biolgicos.
Algunas de estas normas se encuentran incluidas en el reglamento del laboratorio
de virologa e inmunologa. A continuacin se explican algunos puntos que siendo
de los ms simples, no por eso son los menos importantes.
La exigencia de una bata de algodn blanca, abotonada, que cubra por debajo
de la rodilla y se guarde en una bolsa de plstico al finalizar la prctica; tiene
motivos muy simples.
1 La bata correctamente cerrada, permite proteger la ropa de posibles grmenes en
los bancos o mesas de trabajo.
Tome en cuenta que en algunas prcticas se emplean animales de laboratorio o

se procesan muestras de rganos y tejidos y por si fuera poco, en otras prcticas
se trabaja con virus. Si bien todos estamos comprometidos a desinfectar nuestra
rea de trabajo, nadie puede asegurar que el 100% de los grmenes fue
destruido.
El empleo de la bata durante la prctica y el guardarla en una bolsa de plstico al

finalizar, disminuye notablemente el riesgo de diseminacin de grmenes al salir
del laboratorio.
2 La bata blanca debe sumergirse en cloro para su desinfeccin.
El cloro es uno de los mejores desinfectantes y no daa una bata blanca.
3 La bata de algodn disminuye el riesgo de explosin.
Los materiales sintticos generan energa que pude liberarse en forma de una
chispa.
El laboratorio cuenta con tomas de gas y en algunas prcticas se emplea
cloroformo para anestesiar animales. Ambos productos son flamables y
explosivos en presencia de una chispa.
4 Los objetos personales colocados en los mdulos debajo de la mesa evitan su
contaminacin.
De esta manera quedan lejos de un derrame o salpicadura de algn
contaminante.
5 Desinfectar el rea de trabajo reduce el riesgo de contaminacin al siguiente
usuario del lugar
Desinfectar nuestra rea de trabajo representa una actitud responsable para con
nuestros compaeros.
6 El material daado o descompuesto debe reponerse por un producto igual y

entregar la factura correspondiente.
La necesidad de entregar un documento que ampare la compra evita la
posibilidad de robo de material en otros laboratorios.
DESARROLLO DE LA PRCTICA
1. El profesor mencionar los lineamientos del encuadre de evaluacin de las
prcticas y el reglamento de laboratorio.
2. El profesor revisar y comentar la importancia de las medidas de
bioseguridad y el reglamento del laboratorio.
3. Los alumnos realizarn en forma prctica ejercicios de medicin de diferentes
volmenes utilizando correctamente las pipetas serolgicas y propipetas.
REGLAMENTO GENERAL DEL LABORATORIO DE PRCTICAS DE VIROLOGA

E INMUNOLOGA
EL ALUMNO:
1. Deber presentarse con bata blanca de algodn, limpia, cerrada con botones,
con mangas largas y
de largo a la rodilla, en caso contrario, NO se le
permitir el acceso al laboratorio.

2. mantendr una actitud responsable evitando distraer a los compaeros.
3. Colocar todos los objetos personales en los mdulos de la mesa de trabajo,
quedando sobre la mesa solo lo indispensable.
4. Al llegar y salir se lavar las manos con jabn antisptico
5. Desinfectar su rea de trabajo con las soluciones que le proporciones para
este fin.
6. Deber dar un buen uso al material, equipo e instalaciones del laboratorio; en
caso contrario, deber reponer o reparar el dao y entregar al asesor la
factura correspondiente
7. Encender el mechero nicamente en el momento de utilizacin.
8. Usar la propipeta para medir y transferir lquidos.
9. Informar a su asesor cualquier anomala, falla o desperfecto en las
instalaciones el equipo y los materiales.
10. Avisara de inmediato al asesor en caso de accidentes como cortaduras,
picaduras, quemaduras, roturas, derrames, salpicaduras, para tomar las
medidas pertinentes. Posteriormente el asesor informar y registrar el tipo de
accidente al jefe de departamento.
11. Al finalizar la prctica, deber:
Entregar y colocar el material que utiliz donde el asesor lo indique,
como material contaminado, punzocortante, sucio, para esterilizar, para
refrigerar, para incubacin u otros, mismo que ser procesado de
acuerdo a la normatividad para no afectar el ecosistema.
Dejar el banco en su lugar.
Limpiar y desinfectar la mesa de trabajo.
Colocar su bata en una bolsa plstica para evitar diseminar posibles

contaminantes.
POR SU SEGURIDAD:
12. El laboratorio es de acceso y circulacin restringidos. Queda prohibida la
entrada a nios, animales y personas ajenas a la prctica. Queda
estrictamente prohibido fumar, beber e introducir alimentos.
EL ASESOR:
Al finalizar la prctica revisar las instalaciones, el equipo y los materiales,
verificando la limpieza y el orden.
PRACTICA 2
DILUCIONES
Laura Cobos Marn
Myrna Vicencio Malln.
OBJETIVO GENERAL:
Que el alumno:
1. explique el concepto de dilucin, sus formas de expresin e interpretacin.
2. explique la aplicacin de las diluciones en el diagnstico as como en la
prctica de la medicina veterinaria.
3. realice diluciones seriadas, nicas, en pasos y porcentuales.
Que el alumno:
1. distinga los siguientes tipos de diluciones: nicas, seriadas, en pasos y
porcentuales, as como sus formas de expresin.
2. realice las operaciones matemticas necesarias para calcular las diferentes
diluciones.
3. realice en forma prctica diversos ejercicios de diluciones nicas, seriadas, en
pasos y porcentuales con diferentes volmenes.
4. examine los resultados obtenidos en las diluciones realizadas y fundamente
las diferencias observadas.
INTRODUCCIN:
Diluir es la accin de disminuir la concentracin de una sustancia (soluto) en otra
(solvente), a sta en Inmunologa se le llama diluente. Cuando el soluto se disuelve
en el diluente, a la mezcla se le denomina solucin por ejemplo cuando agregamos
cloruro de sodio (soluto) en agua (diluente); por el contrario, si el soluto no se
disuelve en el diluente entonces se obtiene una suspensin, por ejemplo al agregar
glbulos rojos (soluto) en solucin salina (diluente).
En una solucin, el soluto y el diluente pueden ser un slido, un lquido o un gas; sin
embargo, en Inmunologa el diluente normalmente se encuentra en estado lquido, y
el soluto puede ser un slido (por ejemplo glucosa) o un lquido (alcohol).
Las diluciones suelen expresarse en proporciones, as una dilucin 1/4 (1:4) nos
indica las partes de soluto y las partes totales que tiene una dilucin, en donde:
1
___
4
Corresponde a las partes de soluto

Corresponde a las parte totales
(soluto + diluente)
Por lo tanto, una dilucin 1/4 contiene 1 parte de soluto, 3 partes de diluente y la
suma de ambas da las partes totales: 4; de la misma manera una dilucin 1/7
contiene 1 parte de soluto, 6 partes de diluente y la suma de ambas partes da 7
partes totales.
Las diluciones pueden ser:
1. Diluciones nicas:
Se denominan nicas cuando solamente se requiere sa dilucin.
Para realizar una dilucin nica se necesita:
1) Saber la dilucin y el volumen requeridos
2) Calcular el volumen de soluto y diluente necesarios
Si queremos preparar una dilucin 1/4, en 2 mililitros (ml). Sabemos que se requiere
una parte de soluto y tres partes de diluente; como el volumen es 2ml, entonces:
Para calcular el volumen de soluto se tiene que dividir 2 ml (vol. Requerido) 4 = 0.5
ml y lo que falte para los 2 ml corresponde al diluente: 2ml 0.5m =1.5 ml
Si necesitamos preparar una dilucin 1/10 en 5 ml, el soluto equivale a la dcima

parte de 5 ml: 5ml 10 = 0.5ml y las nueve partes restantes corresponden al
diluente: 5ml 0.5ml = 4.5 ml; sumando el soluto y el diluente obtenemos 5 ml que
corresponde a las partes totales (10).
2. Diluciones seriadas:
Las diluciones seriadas son la disminucin de un soluto en un diluente en forma
gradual y sistemtica, para lograr reducir su concentracin en una secuencia
ordenada y con ello cuantificar su actividad biolgica.
Por ejemplo, si nosotros queremos saber cuantos anticuerpos hay en el suero de un
animal (ttulo del suero), podemos ir disminuyendo su concentracin a la mitad, y a la
mitad, y as sucesivamente hasta llegar a un punto en el que ya no detectemos estos
anticuerpos. Arbitrariamente podemos decir que el ltimo tubo en el que todava
encuentro anticuerpos es el inverso a la cantidad de anticuerpos (ttulo) que tiene el
suero concentrado.
Existen diferentes tipos de diluciones seriadas, pero las ms utilizadas en
Inmunologa y Virologa son las diluciones dobles seriadas, las quntuples seriadas y
las dcuples seriadas. Se llaman dobles cuando lo que se esta haciendo es diluir a
la mitad, quntuples cuando se est diluyendo a la quinta parte o dcuples cuando
se est diluyendo a la dcima parte la concentracin del soluto.
Todas las diluciones seriadas comienzan con una dilucin inicial, misma que se
obtiene exactamente igual que si fuera una dilucin nica. Puedo hacer una dilucin
seriada partiendo de una dilucin inicial cualquiera, lo importante es tener en mente
que la concentracin inicial se va a ir disminuyendo a la mitad, o a la dcima parte,
etc.
2.1 Diluciones dobles seriadas:
Para realizar una dilucin doble necesito saber:
1) La dilucin inicial (que no necesariamente es 1/2, sino que puede ser

cualquier otra)
2) El volumen inicial
3) El nmero de tubos requerido en mi serie de diluciones
Por ejemplo, si necesito cuantificar los anticuerpos de un suero contra H. somnus y
para ello debo realizar una dilucin doble seriada, iniciando con una dilucin 1/5
en un volumen de 1ml, en 4 tubos; los clculos para hacer esta dilucin seran:
a) En el primer tubo se realizan los mismos pasos descritos para las diluciones
nicas: para saber cuntos ml corresponden al soluto, divido mi volumen
inicial entre 5 (1ml5 = 0.2ml) y el resto es de diluente (1ml 0.2ml = 0.8ml).
b) Como la dilucin es doble, quiere decir que en el siguiente tubo debo
disminuir la concentracin a la mitad, por lo que debo transferir del tubo 1
al 2, la mitad del volumen inicial: 1ml2= 0.5ml (volumen de transferencia),
sta cantidad la recibo en la otra mitad del volumen: 1ml-0.5ml= 0.5 ml de
diluente (volumen de recepcin), para complementar el volumen inicial (1
ml). Como se indic anteriormente, en una dilucin seriada se repiten los
pasos sistemticamente de un tubo a otro, as debo transferir del tubo 2 al 3 el
volumen de transferencia (0.5 ml) y recibirlo en el volumen de recepcin
(0.5ml), esto se repite tantas veces como tubos sean necesarios.
Del ltimo tubo hay que desechar el volumen correspondiente al volumen de
transferencia, para que todos lo tubos queden con el mismo volumen.
10
A continuacin se muestra un esquema de cmo se realiza la dilucin seriada de

nuestro ejemplo:
Las diluciones que quedan en cada tubo al terminar la dilucin seriada corresponden
a:
1
2
0.5ml
volumen
final
Dilucin inical
1/5
X 1/2
dilucin
doble
seriada
3
0.5ml
volumen
final
0.5ml
volumen
final
X 1/2
1/10
dilucin
doble
seriada
0.5ml
volumen
final
X 1/2
1/20
dilucin
doble
seriada
1/40
NOTA: Como se podr notar, el volumen final en todos los tubos corresponde a la
mitad del volumen inicial (0.5 ml). Si quisiramos que los tubos queden con 1 ml de
volumen final, tendramos que iniciar la dilucin con el doble del volumen (2 ml).
Para hacer una dilucin doble seriada, iniciando con una dilucin 1/8 en un volumen
inicial de 4 ml en 5 tubos se necesita:
11
Dilucin inicial (tubo1):

Cantidad de soluto: 4ml (volumen inicial) 8 (dilucin inicial 1/8) = 0.5 ml
Cantidad de diluente: 4ml 0.5 ml (soluto) = 3.5 ml
Dilucin seriada (tubos 2 a 5)
Volumen de transferencia: 4ml (volumen inicial) 2 (dilucin doble seriada)=
2ml
Volumen de recepcin: 4ml (volumen inicial) - 2ml (volumen de
transferencia)=2 ml
Dilucin final obtenida en cada tubo:
Tubo 1 = 1/8
Tubo 2 = 1/16 (1/8 X 1/2)
Tubo 3 = 1/32 (1/16 X 1/2)
Tubo 4 = 1/64 (1/32 X 1/2)
Tubo 5 = 1/128 (1/64 X 1/2)
Los datos obtenidos se pueden resumir en el siguiente cuadro:
# TUBO
Dilucin obtenida
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
Vol. de soluto
0.5ml
Vol. de diluente
3.5ml
2ml
2ml
2ml
2ml
Vol. de transferencia
2ml
2ml
2ml
2ml
2ml
Vol. final
2ml
2ml
2ml
2ml
2ml
12
2.2
Diluciones dcuples seriadas:
En las diluciones dcuples seriadas (1/10) se deber transferir una dcima parte del
volumen del tubo que estamos trabajando y recibirla en nueve partes de diluente.
Estas diluciones suelen expresarse en forma logartmica (10 -1)
Al igual que en las diluciones dobles, para realizar una dilucin dcuple necesito
saber:
1) La dilucin inicial (que no necesariamente es
1/10, sino que puede ser
cualquier otra)
2) El volumen inicial
3) El nmero de tubos requerido en mi serie de diluciones
Supongamos que queremos realizar una dilucin dcuple seriada en 5 tubos,
partiendo de una dilucin inicial 1/8 en un volumen de 4ml; los clculos para hacer
esta dilucin seran:
a) En el primer tubo se realizan los mismos pasos descritos para las diluciones
nicas: para saber cuntos ml corresponden al soluto, divido mi volumen inicial
entre 8 (4ml8 = 0.5ml) y el resto es de diluente (4ml 0.5ml = 3.5ml).
b) Como la dilucin es dcuple, quiere decir que en el siguiente tubo debo
disminuir la concentracin a la dcima parte, por lo que debo transferir del
tubo 1 al 2, la dcima parte del volumen inicial: 4ml10= 0.4ml (volumen de
transferencia), sta cantidad la recibo en las nueve dcimas partes restantes:
4ml-0.4ml= 3.6ml de diluente (volumen de recepcin), para complementar el
volumen inicial (4ml). Como se indic anteriormente, en una dilucin seriada se
repiten los pasos sistemticamente de un tubo a otro, as debo transferir del
tubo 2 al 3 el volumen de transferencia (0.4ml) y recibirlo en el volumen de
recepcin (3.6ml), esto se repite tantas veces como tubos sean necesarios.
13
A continuacin se muestra un esquema de cmo se realiza la dilucin seriada de

nuestro ejemplo:
Las diluciones que quedan en cada tubo al terminar la dilucin seriada corresponden
a:
2
3.6ml
volumen
final
Dilucin inical
X 1/10
1/8
dilucin
dcuple
seriada
4
3.6ml
volumen
final
3.6ml
volumen
final
dilucin
dcuple
seriada
3.6ml
volumen
final
X 1/10
X 1/10
1/80
1/800
14
dilucin
dcuple
seriada
5
3.6ml
volumen
final
X 1/10
1/8000
dilucin
dcuple
seriada
1/80000
Para hacer una dilucin decuple seriada, iniciando con una dilucin 1/2 en un
volumen inicial de 5 ml en 4 tubos se necesita:
Dilucin inicial (tubo1):
Cantidad de soluto: 5ml (volumen inicial) 2 (dilucin inicial 1/2) = 2.5ml
Cantidad de diluente: 5 ml 2.5 ml (soluto) = 2.5ml
Dilucin seriada (tubos 2 a 4)
Volumen de transferencia: 5 ml (volumen inicial) 10 (dilucin decuple
seriada) = 0.5 ml
Volumen de recepcin: 5 ml (volumen inicial) 0.5 ml (volumen de
transferencia) = 4.5 ml
Dilucin final obtenida en cada tubo:
Tubo 1 = 1/2
Tubo 2 = 1/20 (1/2 X 1/10)
Tubo 3 = 1/200 (1/20 X 1/10)
Tubo 4 = 1/2000 (1/200 X 1/10)
# TUBO
Dilucin obtenida
1/2
1/20
1/200
1/2000
Vol. de soluto
2.5ml
Vol. de diluente
2.5ml
4.5ml
4.5ml
4.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
Vol. final
4.5ml
4.5ml
4.5ml
4.5ml
15
3. Diluciones en pasos:
Cuando se requiere hacer una dilucin alta, no siempre es factible o conveniente
hacerla directamente, por lo que es necesario empezar con una dilucin ms
concentrada que la que necesitamos y a partir de sta, realizar una o mas diluciones
hasta llegar a la dilucin que queremos obtener.
Si queremos preparar una dilucin 1/3500, podemos partir de una mas sencilla: por
ejemplo 1/100. Lo que necesitamos es calcular la dilucin restante o intermedia, esto
se puede obtener dividiendo la dilucin final (1/3500) entre la dilucin inicial (1/100):
3500100 = 35
Este nmero (35) representa la segunda dilucin requerida (dilucin intermedia), es
decir: necesitamos diluir 35 veces la dilucin inicial (1/100) para obtener la dilucin
requerida (1/3500). Dicho de otra forma: para hacer la dilucin 1/3500 debo hacer
una dilucin 1/100 y a partir de sta, una dilucin 1/35 en el volumen requerido. Es
importante mencionar que el soluto necesario para la dilucin 1/35 deber tomarse
de la dilucin 1/100:
SOLUTO
DILUENTE
Dilucin inical
1/100
X 1/35
dilucin
intremedia
Dilucin final
1/3500
El volumen de la dilucin inicial se obtiene arbitrariamente, lo nico importante es:

o utilizar el menor volumen de soluto (sobretodo si es un reactivo caro a hay poca
disponibilidad del mismo)
o tener el volumen suficiente para cubrir el volumen de la segunda dilucin (dilucin
intermedia)
16
Una forma de hacer los clculos para la dilucin en pasos podra ser:
Dilucin inicial 1/100 en un volumen de 1ml:
Soluto: 1ml 100 = 0.01ml
Diluente: 1ml 0.01 ml = 0.99ml
Segunda dilucin (intermedia) 1/35 en un volumen de 7ml:
Soluto: 7 35 = 0.2ml
Diluente: 7 0.2 = 6.8ml
La dilucin se realzara de la siguiente forma:
Vol. de
transferencia
0.2ml
SOLUTO
0.01ml
1
DILUENTE
0.99ml
1ml
0.01ml
soluto
+
0.99ml
diluente
7ml
0.2ml
soluto
+
6.8ml
diluente
Vol. de
recepcin 6.8ml

# TUBO
Dilucin obtenida
1/100
1/3500
(1/100X1/35)
17
Vol. de soluto
0.01ml
Vol. de diluente
0.99 ml
6.8ml
0.2ml
0.2ml
7.0ml
Vol. final
4. Soluciones Porcentuales:
Como se indic al inicio de la prctica, una dilucin puede expresarse en forma
porcentual. La expresin tanto por ciento, por ejemplo 8%, quiere decir que de cada
100 partes totales, 8 corresponden al soluto y el resto (92) al diluente.
Para preparar una solucin porcentual necesito saber:
1) a que concentracin la quiero,
2) que cantidad o volumen necesito preparar.
Si deseo preparar 40ml de una suspensin de glbulos rojos al 3%, quiere decir que
cada 100 ml de esta suspensin tendrn 3 ml de glbulos rojos. Si requiero un
volumen de 40 ml, entonces debo hacer una regla de tres:
3 ml de glbulos rojos son para 100ml, cuntos ml de glbulos rojos (X) son para
40ml totales?, entonces: 3 :100 :: x : 40,
ml de
ml totales
glbulos rojos
3____________100
X_____________40
3 X 40 = 120
120/100= 1.2 ml
18
Necesito 1.2ml de glbulos rojos (soluto) y 38.8 ml de solucin salina como diluente
(40ml -1.2ml= 38.8ml)
Si deseo preparar una solucin salina al 0.85%, quiere decir que cada 100 ml de esta
solucin tendrn 0.85 gr de NaCl. Si requiero un volumen de 30ml, entonces debo
hacer una regla de tres:
0.85g son para 100ml, cuntos gramos (X) son para 30ml?: 0.85 :100 :: x : 30
gramos
ml totales
de NaCl
0.85_______100
X _________ 30
30 x 0.85= 25.5
25.5/100= 0.255 gr
Para esta solucin necesito poner 0.255gr de NaCl (soluto); en este caso no pueden
restarse los gramos de NaCl al volumen total por lo que debo usar una probeta para
aforar al volumen deseado; es decir, agregar diluente cuanto baste para (c.b.p.)
30ml.
19
MATERIAL POR SECCIN:

1 Pipeta automtica con capacidad de 50 a 200 l.
1 Pipeta automtica con capacidad de 1000 l
Puntas para pipetas automticas con capacidad de 200 l y 1000 l
MATERIAL POR ALUMNO:

1 Gradilla
Tubos de ensaye
Paquete con pipetas de plstico terminales y no terminales, de diferentes volmenes
y graduaciones.
1 Perilla de seguridad (propipeta)
Microplacas de fondo en U
1 Frasco con agua (diluente)
1 Frasco con una solucin de dicromato de potasio (soluto).
DESARROLLO DE LA PRCTICA:
1. Hacer los clculos matemticos necesarios para realizar diferentes diluciones
nicas, seriadas y en pasos.
2. Indicar el manejo y forma de medir adecuado de las pipetas serolgicas, haciendo
la diferencia con las pipetas automticas
3. Realizar en forma prctica diferentes diluciones con el dicromato de potasio,
utilizando pipetas serolgicas y tubos de ensaye y micropipetas y placas en fondo en
U
4. Discutir los resultados obtenidos.
PREGUNTAS:
1. Defina los trminos soluto y diluente.
2. Defina que es una dilucin
3. Explique cul es la finalidad de diluir el suero de un animal.
4. Que finalidad tienen las diluciones seriadas?
5. Cundo utilizamos las diluciones en pasos?
20
EJERCICIOS:
a) Esquematice las diluciones que realiz durante la prctica junto con los clculos
de cada una de ellas.
b) Al finalizar la prctica se dejar una serie de ejercicios para desarrollar en casa
en los que se debern resolver los siguientes puntos:
1. Para cada una de las diluciones iniciales calcular la cantidad de soluto y diluente
necesarios.
2. Para cada una de las diluciones (dobles, quntuples, dcuples, etc.) seriadas
calcule:
a) Cantidad de soluto y diluente de la dilucin inicial.
b) Volumen de recepcin.
c) Volumen de transferencia.
d) Dilucin correspondiente en cada tubo.
21
PRACTICA 3
MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO Y VAS DE INOCULACIN
Laura Cobos Marn
El alumno deber presentarse a la prctica con los siguientes conocimientos:
Definicin de los siguientes conceptos:
Animales convencionales
Animales condicionados
Animales altamente condicionados
OBJETIVO GENERAL:
Que el alumno:
1. mencione la utilidad de los animales de laboratorio.
2. mencione las vas de inoculacin en aves, conejos, cuyes y ratones.
3. practique la sujecin en aves, conejos, cuyes y ratones.
Que el alumno:
1. mencione la utilidad de los animales de laboratorio en inmunologa.
2. mencione la clasificacin de los animales de laboratorio.
3. realice la sujecin del ratn, cuye, ave y conejo.
4. mencione las vas de inoculacin en ratn, cuye, ave y conejo.
5. individualmente inocule por va intramuscular, subcutnea e intraperitoneal al
ratn.
6. realice la inoculacin intramuscular y subcutnea en el ave, el conejo y el
cuye.
INTRODUCCION:
En la investigacin y la docencia de todas las ciencias biomdicas es comn la
utilizacin de las diferentes especies animales. Entre los animales ms comnmente
22
usados en los laboratorios tenemos a los ratones, las ratas, los gerbos, los hmsters,
los conejos y los pollos. Sin embargo, cualquier especie animal puede ser
considerada como un animal de laboratorio; as, cuando empleamos las grandes
especies
domsticas
(caballos,
cerdos,
bovinos,
etc.)
para
estudiar
sus
caractersticas anatomo-fisiolgicas, sus necesidades nutricionales o su forma de

reaccin hacia las enfermedades, estamos haciendo en realidad, un trabajo de
investigacin con animales de laboratorio.
El trmino "Animales de laboratorio" se ha usado en forma tradicional por la
relacin que existe entre el laboratorio y los animales que se utilizan en l, durante
una investigacin en particular; sin embargo, sera ms aceptado utilizar el trmino
"Animales para experimentacin" ya que hay ciertas especies animales que son
difciles de mantener en condiciones adecuadas dentro de un laboratorio. Es muy
importante tener siempre en mente que existe una obligacin por parte del
investigador, en cuanto al cuidado de los animales para experimentacin. El
investigador debe reducir al mnimo el dolor y la incomodidad as como evitar el uso
innecesario de estos animales (NOM).
Los animales de experimentacin pueden utilizarse como substituto del
hombre o de otras especies animales cuando por razones prcticas, econmicas o
morales, las investigaciones no pueden llevarse a cabo directamente en el animal
que queremos estudiar. A continuacin se enlistan algunos de los usos que se les da
a los animales para experimentacin en el laboratorio de Inmunologa:
Produccin de antisueros.
Obtencin de complemento.
Obtencin de glbulos rojos.
Propagacin de antgenos.
Diagnstico de enfermedades infecciosas.
Realizacin de pruebas de seroneutralizacin.
Pruebas de viabilidad, potencia e inocuidad en vacunas y otros
productos biolgicos.
Los animales que son utilizados para experimentacin se pueden clasificar de la
siguiente forma:
23
a) ANIMALES CONVENCIONALES: son animales que se han criado bajo

requisitos mnimos de higiene, pero sin ningn cuidado especial en cuanto a su
origen gentico, deficiencias metablicas, si sufren o no de parasitosis, con carga
microbiana desconocida, etc. Este tipo de animales generalmente son criados bajo
condiciones de cuartos "abiertos" (sin barreras).
b) ANIMALES CONDICIONADOS: son aquellos animales que se han criado bajo
condiciones ms rigurosas de higiene, llevando un control de desparasitacin y
proporcionndoles una dieta balanceada de acuerdo a las necesidades de la
especie y de su estado fisiolgico. Al igual que en los convencionales, no se tiene
ningn cuidado en cuanto a su seleccin u origen gentico.
c) ANIMALES ALTAMENTE CONDICIONADOS: son animales en los que hay un
estricto control gentico, medioambiental y nutricional; dentro de este grupo
podemos encontrar los siguientes:
1. Libres de patgenos especficos (SPF del ingls specific pathogen free).
Estos animales poseen una microflora considerada como "normal" para la
especie y no han sido infectados con microorganismos o virus patgenos. El
uso de embriones de pollo SPF, es muy comn en la elaboracin de diversas
vacunas.
2. Animales axnicos o libres de grmenes (a= sin, xenos= extrao). Animales
obtenidos por cesrea dentro de un ambiente estril en los cuales no se
puede detectar ningn microorganismo o virus.
3. Animales gnotobiticos (gnotos= conocido, bios= vida). Son animales,
previamente axnicos, a los cuales se les han inoculado uno o ms
microorganismos o virus conocidos.
4. Animales singnicos o de lneas puras consanguneas. Son animales
resultantes de la cruza endogmica (entre hermano y hermana, o entre madre
e hijos o padre e hijos) de por lo menos 20 generaciones. Estos animales son
genticamente homogneos en ms de un 98% y por ello resultan muy tiles
en investigacin, pues prcticamente no existen variaciones en la respuesta
entre un individuo y otro. Los animales singnicos mas comnmente utilizados
24
son los ratones, sin embargo tambin existen, cuyes, hamsters, conejos y
aves singnicos.
5. Animales transgnicos. Son animales a los que por manipulacin gentica in
ovo se les integra algn gen nuevo en su cromosoma; despus del
nacimiento, aquellos animales que expresan el gen son cruzados entre s,
para que sus cras continen expresando el nuevo gen. Estos animales son
muy tiles en inmunologa, para estudiar la funcin de alguna molcula en
particular.
6. Animales Knock-out. Son animales a los que, contrariamente a los
transgnicos, se les ha eliminado un gen determinado; tambin son muy
utilizados en inmunologa, para estudiar la funcin de distintas molculas.
I. Manejo de animales:
1. Conejo: Para levantar y transportar a un conejo se deben utilizar las dos
manos (NUNCA CARGUE A UN CONEJO SUJETANDOLO DE LAS
OREJAS). Debe tomarse la piel laxa del dorso con una mano y con la otra
soportar el peso del animal tomndolo por la regin sacra (figura 1). Para el
sangrado intracardiaco se le coloca sobre la mesa de trabajo presionando su
cuerpo contra el cuerpo del operador, utilizando para esto el antebrazo
derecho. A continuacin se debe colocar el dedo cordial entre las orejas
sujetando la mano derecha del conejo con los dedos ndice y pulgar, y la
izquierda con el anular y el meique. Posteriormente se debe pasar la palma
de la mano izquierda por la parte ventral del animal, desde el esternn hasta
la articulacin de la cadera (extremo proximal del fmur y el acetbulo),
sujetando con esta mano la cadera de animal, de forma tal que queden los
miembros posteriores extendidos. Luego se debe girar al animal, tomando
como eje el antebrazo derecho del operador, hasta que el conejo quede en
una posicin decbito dorsal (figura 2).
25
FIGURA 1. Sujecin de un conejo para

su transporte en distancias cortas.
FIGURA 2. Sujecin de un conejo en posicin decbito dorsal para el

sangrado por puncin cardiaca.
26
2. Ratn: Para transportarlo de un lugar a otro cercano (por ejemplo de una caja
a otra) se puede sujetar al animal por la cola (figura 3). Para sujetarlo con
fines de inoculacin o toma de muestras, se debe tomar con los dedos pulgar
e ndice la punta de la cola del ratn; a continuacin se debe detener con los
dedos cordial, anular y meique el resto de la cola lo ms cercano a la base.
Esta accin permite utilizar los dedos pulgar e ndice para tomar la piel del
dorso, cuello y orejas y as sujetar firmemente al animal para que no pueda
mover la cabeza (figura 4). Esta maniobra se realiza ms fcilmente si se
coloca al ratn sobre una superficie donde este se pueda agarrar con las uas
(por ejemplo la tapa de la jaula).
Figura 3. Sujecin de un ratn por la cola

para transportarlo a lugares cercanos.
Figura 4. Sujecin de un ratn para el

27
3. Cuye (cuyo, cobayo, conejillo de indias o cerdo de guinea): Para transportarlo

o sujetarlo para la toma de muestras sanguneas, primero se debe arrinconar
al animal y colocar la palma de la mano sobre su dorso. A continuacin se
debe colocar el dedo cordial entre las orejas sujetando la mano derecha del
cuye con los dedos ndice y pulgar, y la izquierda con el anular y el meique
Posteriormente se debe pasar la palma de la mano izquierda por la parte
ventral del animal, desde el esternn hasta la articulacin de la cadera
(extremo proximal del fmur y el acetbulo), sujetando con esta mano la
cadera de animal, de forma tal que queden los miembros posteriores
extendidos. Luego se debe girar al animal, tomando como eje el antebrazo
derecho del operador, hasta que el cuye quede en una posicin decbito
dorsal (figura 7).
Figura 7. Sujecin de un cuye para el

4. Ave: Para transportar a un ave se le puede sujetar teniendo al animal con la

cabeza de frente al operador poniendo la palma de la mano en la quilla con los
dedos dirigidos hacia la cola y sujetando a continuacin las patas y las alas
(ayudndose con la otra mano) entre los dedos pulgar e ndice y anular y
meique (figura 8).
28
Figura 8. Sujecin de una gallina para su transporte en distancias cortas.
Figura 9. Sujecin de un ave para el sangrado por puncin cardiaca y en la vena radial del ala.
Para sujetarla y tomar las muestras sanguneas del corazn, con una mano fijar
las alas dirigindolas hacia el dorso del animal y con la otra mano sujetar las
patas. Colocar al ave sobre la mesa de forma que el lado derecho de la pared del
trax quede sobre la mesa (figura 9).
29
5. Rata: TRATE POR TODOS LOS MEDIOS DE EVITAR SUJETAR A UNA

RATA POR LA COLA. Para transportarla o sujetarla para la toma de muestras, la
palma de la mano se coloca sobre el dorso del animal y los dedos pulgar e ndice
se pasan alrededor del trax, inmediatamente atrs de los miembros anteriores
(figura 5). El resto del cuerpo se levanta con los otros dedos y si la rata es muy
grande se puede uno ayudar con la otra mano (figura 6).
Figuras 5 y 6. Sujecin de una rata para

el sangrado por puncin cardiaca.
5. Hamster: Para transportarlos distancias muy cortas se pueden sostener por la

piel laxa del dorso con una mano. Para sujetarlo con fines de inoculacin o
toma de muestras, con la mano derecha se fija la piel laxa del cuello, del dorso
y del cuerpo con los dedos pulgar, ndice y medio. Con los dedos anular y
meique se aprisiona una pierna empujndola hacia adelante (figura 10).
30
Figura 10. Sujecin de un hmster para el sangrado por puncin cardiaca.
VAS DE INOCULACIN: En las investigaciones y diagnstico que se llevan a cabo

en el Laboratorio de Inmunologa es necesario inocular diferentes sustancias en los
animales en experimentacin; es importante mencionar la Norma Oficial Mexicana
indica que: cualquier procedimiento que cause mayor dolor o molestia en los
animales, que la producida por inyeccin o marcaje en orejas, requerir el uso de
tranquilizantes, analgsicos o anestsicos. Si es necesario efectuar un procedimiento
doloroso sin el uso de anestesia, analgsicos, o tranquilizantes, porque su uso
afectara los resultados del experimento, stos debe ser aprobado previamente
(NOM).
31
A continuacin se describen las vas de inoculacin mas comnmente empleadas en

inmunologa:
AVE:
INOCULACIN INTRAMUSCULAR
1. Sujetar al ave, con el mtodo descrito anteriormente (ver figura 9).
2. Desinfectar la zona con una torunda con alcohol.
3. Colocar la punta de la aguja en la cara lateral del msculo pectoral, con el
bisel hacia arriba y dando una inclinacin de 30 grados con respecto a la piel.
4. Introducir la jeringa con un movimiento firme hasta la insercin en la masa
muscular.
5. Depositar el inculo lentamente y retirar la jeringa.
6. Presionar con una torunda el sitio de la inoculacin.
NOTA. Convencionalmente la inoculacin intramuscular en aves se hace en la
pechuga, para no afectar la calidad de la carne; sin embargo, para fines de
laboratorio puede utilizarse el muslo ya que ese animal no ser destinado para
consumo humano.
INOCULACIN SUBCUTNEA
1. Sujetar al ave, con el mtodo descrito anteriormente (ver figura 9) con la
diferencia de sujetar la cabeza dejando libre la base del cuello.
3. Introducir la aguja por debajo de la piel de. la regin cervical y depositar el
inculo. No debe formarse ppula en el sitio de inoculacin.
4. Retirar la aguja y dar un pequeo masaje.
CONEJO:
INOCULACION SUBCUTANEA:
1. Dado que la zona de inoculacin para esta va es el dorso del animal, un
ayudante debe sujetar al conejo colocndolo sobre una mesa en posicin
32
decbito ventral, con una mano se debe inmovilizar la cabeza y con la otra
sujetar la cadera en forma firme para evitar que se mueva.
2. Elegir la(s) zona(s) de inoculacin (en algunos casos se recomienda cortar el
pelo del animal con tijeras) y limpiar con una torunda con alcohol.
3. Levantar ligeramente la piel del dorso del conejo e introducir aproximadamente
una tercera parte de la aguja, teniendo cuidado de que el bisel de la misma
est hacia arriba.
4. Depositar el inculo y retirar la aguja.
5. Dar un ligero masaje en el sitio de la inoculacin, no debe haber formacin de
ppula.
INOCULACIN INTRAMUSCULAR:
1. Un ayudante debe sujetar al conejo para inmovilizarlo como se describe en el
mtodo anterior.
2. La persona que vaya a inocular debe extender hacia l uno de los miembros
posteriores y desinfectar el rea a inocular con una torunda con alcohol.
3. Colocar la punta de la aguja en la cara interior del muslo (donde la piel es ms
delgada, sobre todo en conejos adultos), con el bisel hacia arriba y dando una
inclinacin de 30 grados con respecto a la piel.
4. Introducir la aguja en la masa muscular y depositar el material de inoculacin
en forma lenta.
5. Extraer la aguja.
6. Presionar con una torunda el sitio de la inoculacin..
CUYE:
INOCULACIN INTRAMUSCULAR
1. Sujetar al cuye, como se describi anteriormente (ver figura 7).
2. Desinfectar con alcohol uno de los miembros posteriores.
3. Colocar la punta de la aguja en la cara interior del muslo, con el bisel hacia
arriba y dando una inclinacin de 30 grados con respecto a la piel.
33

muscular.
INOCULACIN SUBCUTNEA
1. Sujetar al cuye, con el mtodo descrito anteriormente (ver figura 7)
3. Introducir la aguja por debajo de la piel de. la regin inguinal o axilar y
depositar el inculo. No debe formarse ppula en el sitio de inoculacin.
4. Retirar la aguja y dar un pequeo masaje en la zona.
RATN:
INOCULACIN INTRAMUSCULAR:
1. Sujetar al ratn, como se describi anteriormente (ver figura 4).
2. Desinfectar con alcohol uno de los miembros posteriores.
3. Colocar la punta de la aguja en la cara exterior del muslo, con el bisel hacia
arriba y dando una inclinacin de 30 grados con respecto a la piel.
muscular.
INOCULACIN SUBCUTANEA:
1. Sujetar al ratn, con el mtodo descrito anteriormente (ver figura 4) con la
diferencia de sujetar la cabeza por detrs de la orejas (piel del dorso).
3. Introducir la aguja por debajo de la piel del dorso que qued entre los dedos
del manipulador y depositar el inculo. No debe formarse ppula en el sitio de
inoculacin.
4. Retirar la aguja.
34
INOCULACIN INTRAPERITONEAL:
1. El ratn debe sujetarse como se describi anteriormente (ver figura 4) y
posteriormente debe colocarse en forma inclinada, con la cabeza hacia abajo,
para que desciendan las vsceras del abdomen por gravedad.
2. Desinfectar la zona abdominal con una torunda con alcohol.
3. Retraer uno de los miembros posteriores hacia el manipulador y colocar la
punta de la aguja con el bisel hacia arriba y dando una inclinacin de 30
grados con respecto a la piel del abdomen.
4. Manteniendo la jeringa en esta posicin, introducir la punta de la aguja en el
abdomen.
5. Depositar el inculo.
6. Extraer la aguja.
7. Presionar con una torunda con alcohol el sitio de inoculacin.
35
TABLA 1. Principales vas de inoculacin de algunos animales de laboratorio

ESPECIE
INOCULACIN
Ave
oftlmica
s.c. Pliegue del ala y debajo de la piel del dorso
i.m. Msculos pectorales y de los muslos
i.v. vena radial
Conejo
s.c. Debajo de la piel del dorso
i.m. Msculos de los miembros posteriores
i.v. Vena marginal o central de la oreja
Cuye
s.c. Regin inguinal y axilar.
i.m. Parte interna de los msculos de los miembros posteriores.
i.v. vena femoral, peniana*, safena, sublingual* y yugular*
Hmster
i.p. Parte media inferior del abdomen
i.v. yugular*
Rata
s.c. Regin inguinal y axilar.
i.m. Parte interna de los msculos de los miembros posteriores.
i.p. Parte media inferior del abdomen.
i.v. vena caudal, femoral, peniana*, safena, sublingual* y
yugular*
Ratn
i.p. Parte media inferior del abdomen
i.v. Vena de la cola
*previa anestesia o sedacin
(Benjamn, 1985; NOM).
s.c. = subcutneo, i.m. = intramuscular, i.p. = intraperitoneal, i.v. = intravenoso
TABLA 2. Calibres recomendados para la inoculacin de algunos animales

ANIMAL
Ratn
Cuye
Conejo
Gallina
VAS DE
INOCULACION
Intravenosa
Subcutnea
Intramuscular
Intraperitoneal
Intramuscular
Subcutnea
Intravenosa
Subcutnea
Intramuscular
Intravenosa
Intramuscular
Subcutnea
36
CALIBRE DE LA
AGUJA
27
27
27
27
21 - 22
21 - 22
27
20 - 22
20 - 22
22
20 - 22
20 - 22

2 conejos
2 cuyes
2 aves
1 frasco con torundas en alcohol
jeringas desechables de diferentes volmenes
1 juego de agujas de diferentes calibres
frascos con solucin salina fisiolgica (SSF) estril
1 ratn
1 jeringa desechable de insulina
1. Manejar correctamente al conejo, ratn, cuye y ave.
2. Indicar la forma de medir adecuadamente con las jeringas de insulina para la
inoculacin del ratn.
3. Inocular por va intramuscular, subcutnea e intraperitoneal al ratn; utilizando
las regiones descritas en la tabla 1 y siguiendo las indicaciones del asesor.
4. Algunos alumnos realizarn la inoculacin intramuscular y subcutnea en el
ave, el conejo y el cuye.
PREGUNTAS:
1. Cul es la utilidad de los animales de laboratorio en inmunologa?
2. Mencione las diferencias entre un animal condicionado y un animal altamente
condicionado.
3. Mencione las diferencias entre un animal axnico, un gnotobitico y un S.P.F.
4. Mencione las diferencias entre un animal Knock- out y un transgnico.
5. Mencione las regiones anatmicas en las que se puede inocular por va
intramuscular a las especies animales manejadas en la prctica.
37
LITERATURA DE CONSULTA:
1. Benjamn, M. M.: Manual de Patologa Clnica, Limusa, Mxico, pp. 9-20,
1985.
2. Goldsby R. A., Kindt T.J., Osborne B.A. and Kuby J. Immunology. 5th ed. W.H
Freeman And Co. 2003.
3. NOM-062-ZOO-1999. Especificaciones tcnicas para la produccin, cuidado y
uso de los animales de laboratorio.
4. Olgun, F. R.: Los animales de laboratorio, Importancia, Cuidados y Manejo.
Material de consulta, F.M.V.Z., UNAM, 1982.
5. Coates, M. E.: The Germ Free Animal in Research. Academic Press, USA,
1968.
38
PRACTICA 4
OBTENCIN Y MANEJO DE MUESTRAS SANGUNEAS
Laura Cobos Marn
Myrna Vicencio Malln
OBJETIVO GENERAL:
Que el alumno:
1. identifique las diferentes vas de sangrado en animales de laboratorio
2. obtenga muestras sanguneas de aves, conejos y ratones.
Que el alumno:
1. mencione las vas de sangrado en ratn, rata, hmster, ave y conejo.
2. realice el sangrado de ave y conejo.
3. realice individualmente el sangrado del ratn.
4. observe la separacin de los elementos de una muestra de sangre obtenida
con anticoagulante despus de centrifugarla y mencione su importancia en
inmunologa.
5. mencione los pasos para realizar el lavado de glbulos rojos.
6. realice los clculos para hacer una suspensin de glbulos rojos.
7. prepare una suspensin de glbulos rojos.
8. mencione los pasos para obtener el suero de un animal.
9. mencione la forma en la que se debe enviar al laboratorio el suero de un
animal.
INTRODUCCION:
En la prctica de la Inmunologa es comn la obtencin de muestras sanguneas ya
sea para obtener plasma, suero o clulas. En un animal, el volumen total de sangre
corresponde aproximadamente al 10% de su peso corporal; normalmente se
39
considera que se puede obtener hasta un 10% del volumen sanguneo, sin poner en
riesgo su vida.
Obtencin de Sangre completa: si se desean obtener eritrocitos o leucocitos, la
muestra deber tomarse con anticoagulante para evitar la formacin de un cogulo; a
una muestra sangunea tomada con anticoagulante normalmente se les denomina
sangre completa y est constituida por los siguientes elementos:
a) Plasma (lquido transparente o amarillento): El plasma est formado por un
90% de agua y un 10% de sales, vitaminas, minerales, hormonas, lpidos,
carbohidratos y protenas, stas ltimas corresponden a fibringeno, albmina
y , y globulinas.
b) Elementos figurados: stos son las plaquetas, glbulos blancos o leucocitos y
glbulos rojos o eritrocitos.
Si se centrifuga una muestra de sangre completa los elementos que la forman se
separan de la siguiente manera:
plasma
capa flogstica (glbulos blancos y plaquetas)
glbulos rojos
Las muestras de sangre completa generalmente se usan para la elaboracin de

suspensiones de eritrocitos, que se emplean en pruebas como la fijacin del
complemento, la hemoaglutinacin o la inhibicin de la hemoaglutinacin. La sangre
completa tambin puede utilizarse para hacer pruebas con cultivos de leucocitos;
stos se emplean en ensayos de activacin, proliferacin citotoxicidad, que son
pruebas empleadas en la evaluacin de la respuesta celular.
40
Los anticoagulantes ms comnmente empleados se muestran en la siguiente tabla:

Anticoagulante:
Alsever (citratos)
Efecto
Forman sales con el calcio, adems
sirve como conservador pues
contiene glucosa
Secuestra calcio
EDTA (cido etilen

diaminotetractico)
Heparina
Interfiere en la conversin de
protrombina en trombina
Proporcin para su uso
1:1
1:9
1%
Los eritrocitos que se emplean en las distintas pruebas de laboratorio deben de

lavarse para eliminar el anticoagulante, leucocitos y plasma. El proceso de lavado de
glbulos rojos se lleva a cabo siguiendo los pasos que a continuacin se describen:
1.
La sangre obtenida debe mezclarse perfectamente y con suavidad con el

anticoagulante. Posteriormente debe centrifugarse a 1500 r.p.m. durante 15
minutos, a 3000 r.p.m. durante 5 minutos.
2.
Una vez separada la muestra se debe eliminar el sobrenadante, que es el

lquido de color amarillento formado por el plasma y el anticoagulante. En el
fondo del tubo se encontrar el paquete de glbulos rojos y la capa flogstica.
En algunas pruebas, como en la de fijacin de complemento es necesario
eliminar la capa flogstica por lo que sta deber removerse con ayuda de una
jeringa con aguja de punta chata.
3.
El paquete de glbulos rojos debe mezclarse suavemente con SSF a una

proporcin de 1:10 (una parte de soluto o glbulos rojos, por nueve partes de
diluente o SSF y centrifugarse nuevamente a 1500 r.p.m. durante 15 minutos,
a 3000 r.p.m. durante 5 minutos.
4.
Este paso deber repetirse una dos veces ms, hasta que el sobrenadante sea
totalmente transparente.
41
Los glbulos rojos lavados pueden emplearse a diferentes concentraciones. Los

clculos para preparar una suspensin de glbulos rojos se hacen como se
mencion en la prctica de diluciones:
Para preparar una solucin porcentual necesito saber:
1. a que concentracin se requiere,
2. que cantidad o volumen se necesita preparar.
Si se desea preparar 10ml de una suspensin de glbulos rojos al 2%, cada 100 ml
de esta suspensin tendr 2 ml de glbulos rojos. Si requiero un volumen de 10ml,
entonces debo hacer una regla de tres:
2 ml de glbulos rojos son para 100ml, cuantos ml de glbulos rojos (X) son para
10ml totales, entonces:
ml de
glbulos rojos
ml totales
2____________100
X_____________10
2 X 10 = 20, 20/100= 0.2 ml
Necesito 0.2ml de glbulos rojos (soluto) y 9.8 ml de solucin salina como diluente
(10ml -0.2ml= 9.8ml)
Obtencin de suero: Si se desea obtener el suero del animal, la muestra deber
tomarse sin anticoagulante, el liquido que se desprende despus de formado el
cogulo se denomina suero y contiene los mismos elementos que el plasma sin
fibringeno (pues este se emple en la formacin del cogulo).
42
Las muestras de suero son empleadas para la titulacin de anticuerpos mediante el

uso de diversas pruebas serolgicas. Algunos de los aspectos importantes para la
obtencin de suero son:
La muestra debe tomarse preferentemente en tubos vacutainer sin anticoagulante,
stos tienen la ventaja de estar esterilizados lo que se traduce en una menor
probabilidad de contaminacin de la muestra. Si la muestra es tomada y
transportada al laboratorio en jeringas, bolsas de plstico o frascos, tendr un alto
riesgo de contaminacin, lo que puede dar resultados falsos.
Es importante que al momento de tomar la muestra la sangre se deslice por las
paredes del tubo, para evitar la hemlisis o ruptura de los glbulos rojos. La
hemlisis es una condicin no adecuada ya que puede provocar que las pruebas
den resultados falsos.
Una vez tomada la muestra es conveniente inclinar el tubo para que al formarse el
cogulo, ste se pegue al tapn del mismo y se pueda desprender ms fcilmente.
Durante el tiempo de coagulacin los tubos que contienen la sangre, deben
mantenerse en un lugar fresco.
El transporte de las muestras al laboratorio debe realizarse en refrigeracin (48C) dentro de cajas de unicel con refrigerantes o hielo; el unicel es un material
que permite mantener la temperatura en el interior de la caja por un perodo
aproximado de 6 horas siempre y cuando sta se encuentre perfectamente bien
cerrada y sellada. Las muestras NO deben tener contacto directo con los
refrigerantes o el hielo ya que stos se encuentran a una temperatura cercana a
los 0 C y los glbulos rojos se lisan o rompen a esta temperatura; para evitarlo se
puede colocar papel peridico o viruta de madera alrededor de los tubos
vacutainer.
43
Es conveniente que la muestra llegue lo antes posible al laboratorio despus que

fue tomada; una muestra con el cogulo puede permanecer en condiciones
aceptables hasta 3 das, posteriormente empezar a hemolizarse. Un suero
normal presenta una coloracin que va desde amarillo claro hasta naranja,
dependiendo del grado de hemlisis ste cambiar de un rojo translcido hasta un
rojo intenso semejante al del vino tinto. En el laboratorio se evala el grado de
hemlisis, si ste es alto la muestra se rechaza, por lo que es necesario realizar
un nuevo muestreo, lo que implica un gasto de tiempo, dinero y esfuerzo.
Si la muestra va a tardar ms de 3 das en llegar al laboratorio es recomendable
quitarle el cogulo y dejar que los glbulos rojos que quedaron en la muestra se
sedimenten. Auxiliados de una jeringa con aguja, debe tomarse el suero sin
sedimento y pasarlo a otro tubo lo ms limpio posible colocndole un tapn (puede
ser otro tubo vacutainer). Bajo estas condiciones puede congelarse y enviarse al
laboratorio. Entre un suero y otro es importante enjuagar la jeringa y la aguja con
agua limpia (hervida de preferencia) para evitar mezclar los sueros. NOTA: una
muestra de suero con cogulo NUNCA debe congelarse pues se hemolizar.
VAS DE SANGRADO: cualquier procedimiento que cause mayor dolor o molestia
en los animales, que la producida por inyeccin o marcaje en orejas, requerir el uso
de tranquilizantes, analgsicos o anestsicos. Si es necesario efectuar un
procedimiento doloroso sin el uso de anestesia, analgsicos, o tranquilizantes,
porque su uso afectara los resultados del experimento, ste debe ser aprobado
previamente (NOM).
En la tabla uno se mencionan las principales vas de sangrado utilizadas en
inmunologa. A continuacin se describen algunas de ellas:
44
AVE:
PUNCIN CARDIACA
1. Sujetar al ave utilizando el mtodo descrito en la prctica 3: Manejo de
animales de laboratorio y vas de inoculacin.
2. Localizacin del latido cardiaco: colocar el dedo pulgar de la mano izquierda
sobre la punta de la quilla y el dedo medio en la entrada del trax; el latido del
corazn deber buscarse en la zona donde se encuentra nuestro dedo ndice.
3. Desinfectar el rea con una torunda con alcohol, teniendo cuidado de no
friccionar la piel ya que esta es muy sensible y se producen petequias por esta
accin.
4. Introducir la aguja perpendicularmente con respecto a la mesa, atravesando
los msculos de los espacios intercostales.
5. Succionar lentamente el mbolo de la jeringa para observar la salida de
sangre, si sta no fluye, la punta de la aguja est fuera del corazn, ya sea
porque no entr o porque lo atraves. (VER NOTA AL FINAL DEL TEXTO)
6. Extraer la jeringa del ave teniendo cuidado de no seguir succionando.
VENA RADIAL:
1. Sujetar al ave utilizando el mtodo descrito en la prctica 3: Manejo de
animales de laboratorio y vas de inoculacin.
2. Extender el ala para localizar los ligamentos que se encuentran en la
articulacin de la misma (en caso necesario quitar las plumas presentes en el
rea).
4. El sangrador debe depositar el ala sobre los dedos medio, anular y meique, y
sujetar el ala entre los dedos ndice y pulgar de la mano izquierda.
5. Introducir lentamente la punta de la aguja con el bisel hacia arriba por debajo
del ligamento de la articulacin, dirigindola hacia la bifurcacin de la vena.
6. Introducir en la vena y sostener tanto al ave como el ala con firmeza ya que
esta vena es muy delgada y si el animal se mueve se produce un gran
hematoma inutilizando esta ala para seguir el proceso de sangrado.
45
7. Succionar lentamente la sangre ya que de lo contrario la vena tiende a

colapsarse y las probabilidades de la formacin de un hematoma aumentan.
8. Colocando una torunda con alcohol sobre la aguja, sacar sta lentamente a la
vez que se produce presin en el sitio con el dedo pulgar de la mano izquierda
del manipulador.
CONEJO:
PUNCIN CARDIACA
1. Anestesiar al conejo
2. Un ayudante debe tomar al conejo firmemente siguiendo el mtodo descrito en
la prctica 3: Manejo de animales de laboratorio y vas de inoculacin.
3. Localizar la apfisis xifoides.
4. Limpiar con una torunda la zona del trax.
5. Por debajo de la apfisis xifoides introducir la aguja con el bisel hacia arriba,
en direccin al corazn, es importante concentrar la atencin en la mano que
sostiene la jeringa ya que cuando se est en la cavidad cardiaca es posible
sentir el latido del corazn. Manteniendo la jeringa en sta posicin, succionar
lentamente con el mbolo de la jeringa.
6. Una vez terminado el sangrado, extraer la aguja.
7. Cuando el volumen deseado es superior al volumen de la jeringa, no debe
retirarse la aguja del corazn, la jeringa debe ser desconectada de la aguja y
sustituida por otra lo ms rpido posible.
VENA AURICULAR
1. Un ayudante debe sujetar al conejo sobre una mesa colocndolo en posicin
decbito ventral; con una mano se debe inmovilizar la cabeza y con la otra
sujetar la cadera en forma firme para evitar que se mueva, tambin puede
utilizarse un contenedor en donde quede la cabeza fuera del mismo.
2. Localizar la vena central o marginal de la oreja, desinfectar la oreja con una
torunda con alcohol, de ser necesario se puede rasurar o depilar la zona.
46
3. Dilatar la vena por medio de masaje o a travs del uso de un vasodilatador

como el Xilol, ste se aplica en la zona a puncionar colocando pequeas
cantidades por medio de una torunda humedecida en l, es importante no
friccionar ya que esta accin causa irritacin de la zona. Posteriormente se
dan pequeos golpes con el dedo medio sobre la vena para ayudar a la
vasodilatacin. Es importante retirar el Xilol de la piel inmediatamente despus
de realizado el sangrado, lavando de la zona con agua destilada ya que puede
provocar irritacin e incluso necrosis.
4. Sostener la oreja con la palma de la mano izquierda y el dedo pulgar.
5. Tomar la lanceta y pinchar perpendicularmente la vena con un movimiento
rpido, una vez que salga la sangre, recolectarla cuidando que sta se deslice
por las paredes del tubo de ensaye para evitar hemlisis. Si es necesario
colectar cantidades mayores de sangre (hasta 5 ml), se puede puncionar la
vena directamente con una aguja del nm. 27 embrocada a una jeringa de 5
ml. Succionar lentamente para evitar colapsar la vena. En ambos casos es
importante no doblar demasiado la oreja desde su base ya que con esto se
corta la circulacin sangunea.
6. Una vez obtenida la cantidad necesaria de sangre, presionar el sitio de
puncin con una torunda de algodn seca para provocar hemostasis por
presin.
CUYE:
PUNCIN CARDIACA
1. Anestesiar al animal.
2. Un ayudante debe tomar al cobayo firmemente siguiendo el mtodo descrito
en la prctica 3: Manejo de animales de laboratorio y vas de inoculacin.
3. Se utiliza la va lateral, con desinfeccin previa de la zona.
4. Con el dedo medio localizar el latido cardiaco.
5. Introducir la aguja con el bisel hacia arriba perpendicularmente con respecto a
la piel del animal, atravesando los espacios intercostales y uno de los
pulmones para llegar al corazn.
47
6. Succionar lentamente con el mbolo de la jeringa.

RATN:
PUNCIN CARDIACA
1. Anestesiar al animal introducindolo en una cmara de anestesia con ter.
2. Introducir al ratn en la cmara de anestesia, bastan solo unos segundos para
que el animal pierda la conciencia. El ratn debe sacarse tan pronto como
caiga de lo contrario puede morir por sobredosis de anestsico.
3. La persona que va a sangrar debe sujetar al ratn con la mano izquierda,
siguiendo el mtodo descrito en la prctica 3: Manejo de animales de
laboratorio y vas de inoculacin.
4. Desinfectar la zona con alcohol.
5. Localizar la apfisis xifoides.
6. Por debajo de la apfisis xifoides introducir la aguja con el bisel hacia arriba,
en direccin al corazn.
7. Manteniendo la jeringa en sta posicin, succionar lentamente con el mbolo
de la jeringa. Si la sangre no fluye, es porque la punta de la aguja est fuera
del corazn (no entr o lo atraves).
NOTA 1: En el caso de puncin cardiaca (en todas las especies), para cambiar la
direccin de la aguja deber sacarla (no totalmente) e
introducirla nuevamente
buscando la direccin correcta. NUNCA SE DEBE MOVER LA AGUJA DENTRO DE

LA CAVIDAD TORCICA, YA QUE SE CORRE EL RIESGO DE DESGARRAR EL
TEJIDO CARDIACO Y/O PULMONAR OCASIONANDO LA MUERTE DEL ANIMAL.
NOTA 2: Si la muestra fue tomada con anticoagulante: Quitar la aguja de la jeringa y
deslizar la sangre por las paredes del tubo lentamente para evitar la hemlisis de los
glbulos rojos.
Si la muestra fue tomada sin anticoagulante: Dejar que se forme el cogulo en la
jeringa y posteriormente obtener el suero quitando el mbolo y decantndolo en un
tubo.
48
TABLA 1. Principales vas de sangrado de algunos animales de laboratorio

ESPECIE
Ave
SANGRADO
Puncin cardiaca*
Vena radial
Conejo
Puncin cardiaca*
Vena auricular
Cuye
Puncin cardiaca*
Hmster
Puncin cardiaca*
Puncin del seno orbital*
Rata
Puncin cardiaca*
vena caudal
Vena femoral
Ratn
Puncin cardiaca*
Vena caudal
*previa anestesia o sedacin
(Benjamn, 1985; NOM).
49

2 conejos
2 aves
5 jeringas de 3ml
5 jeringas de 5ml
3 frascos con anticoagulante (Alsever)
5 tubos de ensaye
3 frascos con torundas en alcohol
1 frasco con torundas en xilol
1 cmara de anestesia por seccin
4 lancetas y 4 agujas
2 frascos con solucin salina fisiolgica (SSF)
1 centrfuga
2 pipetas serolgicas de 5ml
1 ratn
1 jeringa de insulina
1 tubo de sangre con anticoagulante (para cada dos alumnos)
1 tubo de sangre sin anticoagulante (para cada dos alumnos)
1 pipeta de transferencia de plstico
1 tubo de ensaye 13x100.
1. Algunos alumnos sangrarn las dos aves por vena radial utilizando
anticoagulante y los dos conejos por vena o arteria auricular sin
anticoagulante.
2. Observar la forma en que el asesor centrifuga el tubo vacutainer que contiene
sangre con anticoagulante para apreciar la separacin de los elementos que la
forman.
3. Observar la forma en que el asesor realiza el lavado de glbulos rojos.
50
4. El alumno preparar una suspensin de glbulos rojos utilizando el tubo de

sangre con anticoagulante que se le proporcion.
5. El alumno separar el suero del cogulo del tubo de sangre sin anticoagulante
que se le proporcion y observar que no contenga eritrocitos.
6. El alumno sangrar a un ratn por va intracardiaca sin anticoagulante.
PREGUNTAS:
1. Con que finalidad se aade o no anticoagulante al tomar una muestra sangunea?
2. Qu diferencias hay entre plasma y suero?
3. Delimite anatmicamente la(s) va(s) de sangrado de cada una de las especies
animales utilizadas durante la prctica.
4. Con que finalidad se realiza el lavado de los glbulos rojos.
5. Realice los clculos para preparar 10ml de una suspensin de glbulos rojos al
3%.
51
LITERATURA DE CONSULTA:
1. Benjamn, M. M.: Manual de Patologa Clnica, Limusa, Mxico, pp. 9-20, 1985
2. Kuby, J. Immunology. 4th ed, USA. Freeman and Company, 2000.
3. NOM-062-ZOO-1999. Especificaciones tcnicas para la produccin, cuidado y
uso de los animales de laboratorio.
4. Olgun, F. R.: Los animales de laboratorio, Importancia, Cuidados y Manejo.
Material de consulta. F.M.V.Z., UNAM, 1982.
52
PRACTICA 5
MECANISMOS MOLECULARES DE RESISTENCIA EN EL SUERO
Alfredo Castaeda Ramrez
El alumno deber presentarse a la prctica con los siguientes conocimientos:

Diferencias entre inmunidad innata (resistencia) y especfica.
Concepto de resistencia a nivel anatomo-fisiolgico, celular y molecular.
Diferencia estructural entre una bacteria Gram positiva y una Gram negativa
OBJETIVO GENERAL:
Que el alumno:
1. Mencione tres mecanismos moleculares de resistencia presentes en el suero.
2. Compruebe la actividad bactericida de dos mecanismos moleculares de
resistencia (lisozima y complemento) presentes en el suero sanguneo.
3. Explique la diferencia entre el efecto de la lisozima y el complemento sobre
bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Que el alumno:
1. demuestre el efecto bactericida de un suero normal en contra de Salmonella
gallinarum.
2. demuestre el efecto de la temperatura en la actividad bactericida del
complemento en contra de la misma bacteria.
INTRODUCCION
Los mecanismos que intervienen inicialmente cuando un agente patgeno (bacterias,
virus y parsitos) entra en contacto con el hospedador, son los mecanismos de
defensa inespecficos o innatos. En comparacin con los especficos o respuesta
53
inmune, estos tienen accin casi inmediata, no incrementan en un segundo contacto

con el mismo agente (no presentan memoria) y un individuo los posee desde su
nacimiento.
Cuadro 1. RESUMEN DE LAS FASES DE LA RESPUESTA INMUNE
Inmediata
0-4 h
Tipo
Innata
Molculas Complemento
clave
Histamina, etc.
Clulas
clave
Macrfagos
Clulas cebadas
Neutrfilos
Temprana
4-96 h
Innata inducible
Complemento
IL-1, TNF, IL12
IFN /, MBP,
CRP
Macrfagos
Neutrfilos
Clulas NK
Tarda
>96 h
Especfica
Anticuerpos IgM e
IgG, IL-2, IL-4, IL-12,
IFN
Linfocitos T
Linfocitos B
Macrfagos
Clulas dendrticas
Los mecanismos innatos o inespecficos se pueden dividir en tres categoras:

1.- Anatomo-fisiolgicos. Los mecanismos anatomo-fisiolgicos se refieren a todos
aquellos tejidos u rganos que forman barreras o, por su funcin, indirectamente
impiden el establecimiento de agentes patgenos. Dentro de stos tenemos a la piel,
mucosas, plumas, lgrimas, cornetes, miccin, descamacin, etc.
2.- Moleculares. Estos mecanismos incluyen una serie de substancias que impiden el
desarrollo de las bacterias, virus y protozoarios. Una de las substancias de mayor
importancia dentro de esta clasificacin es la lisozima. Esta enzima de 129
aminocidos fue descubierta por Alexander Fleming en 1922 clasificndola como una
muramidasa (1,4-beta-N-acetilmuramidasa) por romper el enlace 1-4 entre el cido
N-acetil-murmico (NAM) y la N-acetilglucosamida (NAG), presente en la pared
bacteriana. La accin de esta enzima es mayor en las bacterias Gram positivas ya
que su pared celular presenta mas capas de peptidoglicano, debido a su mayor
presin osmtica intracelular. En las bacterias Gram negativas la pared celular es
ms delgada, ya que su presin osmtica intracelular es menor, adems de
54
encontrarse protegida por la membrana externa bacteriana, por lo que son menos
sensibles al efecto de la enzima.
El complemento, un conjunto de ms de 30 protenas plasmticas, es otro de los
principales mecanismos moleculares de resistencia. Su activacin se puede llevar a
cabo por 3 vas; clsica (activada por reacciones ag-ac), de las lectinas (activada por
este grupo de protenas con capacidad de unirse a polisacridos bacterianos) y la
alterna (activada por polisacridos bacterianos y estabilizada por la protena
properdina). La primera se considera una activacin inmune y las dos restantes vas
de activacin inespecfica. Algunas de las protenas del complemento son
termolbiles, es decir que pierden su actividad biolgica cuando son sometidas a
temperaturas elevadas (560C/30 min).
3.- Celulares. Se refieren a las clulas que participan en el proceso inflamatorio como
los neutrfilos, que por su prematura aparicin en el sitio de la lesin son
considerados como la primera lnea de defensa celular, los macrfagos, clulas
cebadas y los eosinfilos. Dentro de este grupo tambin se incluyen la fagocitosis y
las clulas K naturales (NK).
55
Cuadro 2. PRINCIPALES SUBSTANCIAS BACTERICIDAS LOCALIZADAS EN FLUIDOS Y

TEJIDOS DEL ORGANISMO.
GRUPO
NOMBRE
ENZIMA
-Lisozima
PEPTIDOS
CATIONICOS
-Beta lisina
-defensinas
-protegrinas
-histatinas
-indolicinas
-bactenecinas
-transferrina
-lactoferrina
-Complemento
PROTENAS QUE
FIJAN AL HIERRO
COMPONENTES
DEL COMPLEMENTO
AMINAS BSICAS
MECANISMOS DE
DESCOMPOSICIN
DEL PERXIDO
-Espermina
-Espermidina
-Lactoperoxidasa
-Mieloperoxidasa
-Xantinooxidasa
-Tiocianato
INTERFERONES
-IFN-
-IFN-
CIDOS GRASOS
-Saturados
-Insaturados
PRINCIPAL
ORIGEN Y/O
LOCALIZACIN
-Suero y leucocitos
-secreciones
(saliva, lgrimas)
-Suero
-Neutrfilos
-Macrfagos
-Plaquetas
-Suero
-Leucocitos y leche
Macrfagos,
hepatocitos, bazo,
rin y suero.
-Pncreas, rin y
prstata
-Leche
-Neutrfilos
-Macrfagos
-Suero, saliva y
leche
Todas las clulas
excepto
los
neutrfilos
en
bovinos (*)
Glndulas
sebceas
* Tizard 2001.
56
ACCIN
COFACTOR
-Gram+, menos eficaz

en Gram-. Previene
fijacin de virus a los
receptores celulares.
Contra Gram+ y GramHongos
Virus (virus envueltos)
Protozoarios
-Gram+
-Gram-Bacterias,
virus,
parsitos y hongos.
Gram+
GramBacterias,
parsitos
virus
Virus,
bacterias
parsitos.
Hongos
Gram+
pH cido
++
Ca
++
y Mg .
MATERIAL POR ALUMNO

1 Gradilla
1 Tubo de ensaye de 12 x 75 con un cultivo de Salmonella gallinarum de 18 horas
3 Tubos de ensaye estriles de 12 x 75 con tapn de algodn
3 Pipetas serolgicas de 1 ml 1/100, estriles
1 pipeta serolgica de 5 10 ml 1/10 estril
3 Cajas de Petri de 60 mm con agar triptosa envasadas estrilmente.
1 Frasco con 20 ml de solucin salina fisiolgica (SSF), estril
1 Frasco con capacidad de 10 ml, vaco y estril
1 Frasco con capacidad de 5 ml, vaco y estril
1 Frasco con suero normal (SN)
1 Frasco con suero calentado (a 56oC/30 min) (SC)
1 Tira de cinta adhesiva
1. Realizar los clculos para hacer una dilucin en pasos 1/5000 en 5ml. Como
diluente se utilizar la SSF estril y como soluto un cultivo de Salmonella gallinarum.
-Dilucin inicial 1/100 en 10 ml
-Dilucin intermedia 1/50 en 5 ml
2. Rotular los dos frascos estriles y los tubos de ensaye estriles de la siguiente
forma:
RECIPIENTES
ROTULO
Frasco con capacidad de 10 ml
1/100
Frasco con capacidad de 5 ml
1/5000
Tres tubos de ensaye estriles
SC, SN y control respectivamente
Tres cajas de Petri
SC, SN y control respectivamente

Nombre del alumno
*SC: suero calentado, SN; suero normal.
57
3. Esta prctica debe trabajarse en condiciones de esterilidad, por lo que es

importante mantener el mechero prendido y trabajar en un rea de 15cm de dimetro
de distancia de ste.
4. Con una pipeta estril de 5 10 ml aadir 9.9 ml de SSF estril al frasco rotulado
1/100 y 4.9 ml al frasco rotulado 1/5000.
5. Con una pipeta de 1 ml estril, aadir 0.25 ml de SSF estril al tubo de ensaye
rotulado como control.
6. Con la misma pipeta aadir 0.1 ml de cultivo de S. gallinarum (cultivo de 18 horas),
previamente homogeneizado, al frasco con capacidad de 10 ml. Homogeneizar
perfectamente y transferir 0.1 ml de esta dilucin (1/100) al frasco con capacidad de
5 ml, rotulado 1/5000.( ver esquema)
58
6. Homogeneizar perfectamente con la pipeta y transferir 0.25 ml de esta dilucin a

cada uno de los tubos de ensaye estriles previamente rotulados: SN, SC y control.
7. Con una segunda pipeta estril aadir 0.25 ml de suero normal al tubo de ensaye
rotulado SN y con una tercera pipeta estril aadir 0.25 ml de suero calentado al tubo
rotulado SC.
8. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
9. Vaciar todo el contenido de los tubos rotulados SN, SC y control en las
respectivas cajas de Petri previamente rotuladas.
10.
Incubar a 37C durante 24 horas y hacer la lectura.
RESULTADOS
1.- Esquematizar los resultados obtenidos. Si los resultados obtenidos no
concuerdan con los esperados explique las posibles causas.
PREGUNTAS
1.- Esquematizar los resultados obtenidos en las mezclas S. gallinarum + SSF, S.
gallinarum + SN y S. gallinarum + SC, y compararlos con los resultados esperados.
2.- Explique por qu es menos eficaz la lisozima en bacterias Gram negativas.
3.- Explique por qu cuando el suero se calienta a 56 oC por 30 min, pierde su efecto
contra S. gallinarum
59
1. Bach, J. F. Inmunologa, Limusa, Mxico, p. 371-373, 1985.
2. Cooper, N. R.: El sistema del complemento. En: Stites, D. P., Stobo, J. D.,
Fudenberg, H. H. y Wells, J. V.: Inmunologa Bsica y Clnica. . Manual Moderno,
Mxico, 5a. edicin, p. 119, 1985.
3. Herbert, W. J.: Inmunologa Veterinaria. Acribia, Captulo 3, 1972.
4. Werb, Z. y Goldstein, I. M.: Clulas fagocticas: Funciones quimiotcticas y
efectoras de los macrfagos y los granulocitos. En: Stites, D. P., Stobo, J. D.,
Fudenberg, H. H. y Wel15, J. V.: Inmunologa Bsica y Clnica. Manual Moderno,
Mxico, 5a.edicin p.103, 1985.
5. Wood, W. B. and Davis, B. D.: Host-Parasite relations in bacterial infections. In:
Davis, B. D., Dulbecco, R., Eisen, H. N. and Ginsberg, H. S.: Microbiology. Harper
and Row Publishers, U.S.A., 3th. edition, chapter 24. 1980.
6. Hancock, R, E, W, and Diamond, Gill. The role of cationic antimicrobial peptides in
innate host defenses. Trends Microbiol 8(9): 402-410, 2000.
7. Tizard, I. Inmunologa Veterinaria. 6 ed, Interamericana, 2001.
60
PRACTICA 6
PRECIPITACIN
El alumno deber presentarse a la prctica con el siguiente material:
Una muestra de carne cruda (de aproximadamente 5 cm3) de cualquier
especie
Pinzas y tijeras
Que el alumno:
1. explique el fundamento y mencione las caractersticas que debe tener un
antgeno para la prueba de precipitacin.
2. mencione las diferentes pruebas de precipitacin que existen.
3. identifique una lnea de precipitacin
4. identifique las diferentes lneas de identidad que puede haber y las
esquematice.
5. explique los fenmenos de zona
6. mencione tres aplicaciones de la precipitacin en la medicina veterinaria.
Que el alumno:
1. elabore el antgeno para la prueba de doble difusin en agar.
2. realice una prueba de doble difusin en agar para la tipificacin de carnes.
3. identifique e interprete las lneas de identidad
INTRODUCCION
Al mezclar una solucin de antgenos no particulados (es decir molculas) con sus
anticuerpos correspondientes se producir la unin antgeno y anticuerpo. Si la
proporcin de estos dos elementos es equivalente se formarn complejos inmunes
61
insolubles dando como resultado una lnea de precipitacin observable a simple

vista.
Este fenmeno fue descubierto por Krauss (1897) en Austria al observar que filtrados
de cultivos de Pasteurella pestis y Vibrio cholerae precipitaban en presencia de
antisueros especficos. A los anticuerpos que jugaban un papel en este fenmeno se
les llam precipitinas y a los antgenos precipitgenos.
Para que se produzca el fenmeno de precipitacin es necesario que exista una
proporcin ptima de antgeno as como de los anticuerpos. Ahora bien, si queremos
hacer esta prueba en medios lquidos, tendremos que encontrar previamente la
proporcin que se requiere del antgeno o del anticuerpo para que se produzca este
fenmeno. Por ejemplo, si queremos titular el antgeno, en una serie de tubos
aadiremos cantidades crecientes de ste a cada uno, as como una cantidad
constante de antisuero especifico a todos los tubos.
antgeno 0.062 0.125 0.250 0.5 1.0 2.0 4.0
antisuero <-------------- 1.0 -------------Al finalizar el periodo de incubacin notaremos que en los primeros tubos no se
produce un precipitado (prozona) ya que existe un exceso de anticuerpos y por lo
tanto no existe la proporcin adecuada de los elementos. Al ir aumentando la
cantidad de antgeno se ir alcanzando la proporcin adecuada de los dos elementos
hasta llegar a un mximo donde se formar el precipitado (zona de equivalencia). Al
continuar aadiendo antgeno existir un exceso de ste volvindose a perder la
proporcin ptima disminuyendo progresivamente el precipitado (postzona) (ver
grfica 1).
En las pruebas de precipitacin en medios semislidos (gel) no se requiere titular el
antgeno o el suero previamente ya que la proporcin adecuada de estos elementos
se producir al difundirse ambos en el agar. Estas pruebas tienen la gran ventaja de
62
que permiten identificar varios antgenos o sueros sospechosos a la vez en una sola
prueba. Las pruebas de precipitacin en gel fueron descritas en un principio en 1905
y han sufrido una serie de modificaciones introducidas por Oudin, Ouchterloney y
Eleck, y Oakley y Fulthorpe. A estas tcnicas tambin se les conoce como de
inmunodifusin y a los precipitados que se forman en ellas se les llama lneas o
bandas de precipitacin.
Grfica 1. La grfica nos muestra el resultado que se obtiene al mezclar

cantidades crecientes de antgeno con una cantidad constante de
anticuerpos.
USOS
1. Diagnstico de enfermedades infecciosas: Influenza Aviar, Gumboro, Anemia
Infecciosa Equina (Prueba de Coggins), Tricomoniasis, Piroplasmosis, Triquinelosis,
Candidiasis, Aspergilosis, Brucelosis ovina (B. ovis).
2. Identificacin de carnes y embutidos (adulteracin).
3. Determinacin cuantitativa de inmunoglobulinas y otras protenas sricas (p.ej.
complemento).
TCNICAS DE PRECIPITACIN
La pruebas de precipitacin son pruebas serolgicas de fijacin secundaria, que
poseen una sensibilidad de 3-15g de N de anticuerpo por cada mililitro de suero y
63
pueden realizarse en medios lquidos y semislidos. Para que se efecte la reaccin

es necesaria la presencia de electrolitos (NaCl al 0.85 %) y el pH debe mantenerse
entre 7.2 y 8.6 (NaOH, cido brico).
1. Medios lquidos:
Prueba de Ascoli Utilizada para el diagnstico de ntrax.
En esta prueba se aaden sin mezclar cantidades iguales del antgeno y el antisuero
en un pequeo tubo de ensaye. Al cabo de una hora de incubacin a 37 C se lleva
acabo la lectura. Un resultado positivo sera la formacin de una lnea de
precipitacin.
Prueba de Lancefield.
Esta prueba se realiza en tubo capilar y es muy til cuando la muestra es escasa ya
que para hacerla se requieren pequeas cantidades de antgeno y antisuero (figura
1).
2. Medios semislidos:
Prueba de Oudin (difusin simple). En sta se mezcla el antisuero con el agar
fundido distribuyendo esta mezcla en tubos de ensaye dejndolo solidificar. Sobre el
agar se deposita el antgeno incubando a 37C o a temperatura ambiente durante 4 a
5 das. Al difundirse el antgeno en la mezcla agar-antisuero si el resultado es
positivo se formaran lneas de precipitacin. Si el antgeno es una sustancia pura
solamente se formar una lnea de precipitacin. Ahora bien, si la preparacin
antignica est integrada por ms de un componente antignico se formar una lnea
de precipitado correspondiente a cada uno de los antgenos presentes, como
consecuencia del diferente ritmo de difusin de los mismos.
Prueba de Ouchterloney (difusin doble). Esta prueba se realiza en cajas de Petri,
una placa de vidrio o un portaobjetos. En el agar ya solidificado con un sacabocados
se hacen pozos en los que se colocan el antgeno y los antisueros. Radialmente se
difunden a travs del agar y si corresponden se formarn lneas del precipitado. El
64
nmero de estas lneas corresponder a los diferentes complejos antgenoanticuerpo existentes. Las lecturas patrn en esta prueba de inmunodifusin doble se
esquematizan en las figuras 2 a 6.
Figura 1. Prueba de Lancefield o prueba de precipitacin en tubo capilar. (a)

Tubo capilar con el antgeno y el antisuero. (b) y (c) Precipitado (barra negra).
El precipitado se puede observar en la interfase (b) o bien sedimentarse (c).
Figura 2. LINEA DE IDENTIDAD TOTAL

Las lneas de precipitacin que se
forman entre el antisuero anti-A y los
antgenos A se fusionan en un punto
indicando que estos dos antgenos
tienen epitopos idnticos.
Figura 3. LINEA DE NO IDENTIDAD

El antisuero distingue 2 epitopos (uno en
cada antgeno) que no son compartidos
por los antgenos A y B, por lo que se
producen
lneas
de
precipitacin
independientes que se cruzan en un
punto.
65
Figura 4. LINEA DE NO INDENTIDAD Y DE IDENTIDAD

TOTAL. Presentacin de dos reacciones, no identidad (entre
el antgeno A y el antgeno B) e identidad total (entre los
antgenos A), en la misma prueba.
Figura 5. LINEA DE IDENTIDAD PARCIAL

(entre el antgeno AB y el antgeno A)
Esta lnea de precipitacin es muy similar
a la lnea de identidad total. Sin embargo,
en este caso el antisuero distingue un
epitopo ms sobre el antgeno AB, el
epitopo B que no comparte con el antgeno
A y que precipita con el antisuero anti B.
Este epitopo produce una pequea lnea
llamada "espoln", que emerge de la lnea
de precipitacin entre el antisuero anti A y
el eptopo A.
66
Figura 6. LINEAS DE PRECIPITACION

(de los antgenos A y C)
Las dos lneas de precipitacin que se
forman entre los Antgenos A y C y su
antisuero correspondiente son dos
lneas independientes por lo tanto los
antgenos son diferentes. Con el
antgeno D no se forma lnea ya que
no existe el antisuero correspondiente.
Prueba de Mancini
Tambin conocida como Prueba de inmunodifusin radial nica. En esta tcnica se
coloca una capa de la mezcla agar-antisuero especfico sobre una laminilla de vidrio
o caja de Petri en la que se hacen unos pozos donde se aadir el antgeno. Esta
prueba se utiliza para hacer determinaciones cuantitativas de antgenos (figura 7).
Figura 7. Prueba de Mancini. El agar

contiene anticuerpos especficos
para el antgeno D. Las diluciones
seriadas del antgeno D, (1/2, 1/4 y
1/8) se aaden en los pozos
correspondientes (ver dibujo). El
antgeno se difunde en forma radial
hasta formar un anillo o halo de
precipitacin alrededor de cada pozo.
Este anillo delimita la zona en que se
alcanzaron las proporciones ptimas
de reacciones antgeno-anticuerpo
para la formacin de la malla
(precipitado). El dimetro del anillo
formado es directamente
proporcional a la cantidad de
antgeno colocado en el pozo.
67
MATERIAL POR SECCIN

1 Frasco con antisuero contra carne de ave y jeringa de insulina identificada con
ANTISUERO AVE.
1 Frasco con antisuero contra carne de bovino y jeringa de insulina identificada con
ANTISUERO BOVINO.
1 Frasco con antisuero contra carne de cerdo y jeringa de insulina identificada con
ANTISUERO CERDO.
1 Frasco con antisuero contra carne de equino y jeringa de insulina identificada con
ANTISUERO EQUINO.
1 Frasco con antisuero contra carne de perro y jeringa de insulina identificada con
ANTISUERO PERRO.
1 Frasco con antisuero contra carne de rata y jeringa de insulina identificada con
ANTISUERO RATA.
MATERIAL POR ALUMNO
1 Mortero con pistilo
1 pipeta de 5 ml 1/10
1 Frasco con 5 ml de S.S.F.
1 Tubo de ensaye 13 x 100
1 Papel filtro de medio poro de 6 cm x 6 cm
1 Jeringa de 1 ml
1 caja de Petri con agar noble y perforaciones de 3 mm de dimetro.
1 Gradilla
1 Frasco con arena estril
1. Pesar 0.5 gr de la muestra y macerar en el mortero aadiendo poco a poco SSF,
hasta tener una dilucin 1:10.
2. Filtrar el sobrenadante con un papel filtro recibindolo en un tubo de ensaye.
3. Identificar la caja con su nombre, muestras y antisueros
68
4. Rellenar el pozo central con el (los) antisuero (s) a utilizar y los pozos externos
con los filtrados (Ag)
NOTA: El alumno que as lo desee podr poner el pozo central una mezcla de
hasta 2 antisueros y en los pozos perifricos diferentes filtrados (Ag) o una
mezcla de hasta dos de ellos.
5. Incubar en cmara hmeda durante 24 a 48 horas.
6. Realizar la lectura a las 24 horas utilizando una lmpara de fondo oscuro.
RESULTADOS
1. Esquematice y explique los resultados obtenidos en la prueba.
2. Con base en estos resultados cules son sus conclusiones?
PREGUNTAS
1. Mencione las caractersticas de los antgenos utilizados en las pruebas de
precipitacin.
2. Explique como es que se lleva a cabo el fenmeno de precipitacin.
3. Dibuje los patrones de precipitacin en la prueba de Ouchterloney de identidad
total, parcial y no identidad.
4. Mencione 3 usos de las pruebas de precipitacin enfocados a la Medicina
Veterinaria.
69
1. Coogins, L. and Norcross, N. L. Immunodiffusion reaction in equine infectious
anemia. Cornell Vet 60: 330-335 (1970).
2. Ferguson, M. and Schild, G. C. A single-radial-immunodiffusion technique for the
assay of rabies glycoprotein antigen: application for potency tests of vaccines against
rabies. J Gen Virol, 59: 197-201, (1982).
3. Gillespie, J. H. and Timoney, J. F.: Hagan and Bruner s, Infectious diseases of
domestic animals, 7 th ed. Cornell University Press, London, 1981.
4. Gordon, S. L.: Lo esencial de la inmunologa, 2. ed. El Manual Moderno, Mxico,
1981.
5. Kabat, E. A. and Mayer, M. M.: Experimental immunochemestry, 2nd ed. Charles
C. Thomas Publisher, USA, 1971.
6. Merchant, I. A. y Packer, R. A.: Bacteriologa y Virologa Veterinarias, 3 a ed.
Acribia, Zaragoza, Espaa, 1980.
7. Preece, T. F.: Immunological techniques in mycology. In: Norris, J. R. and Ribbons,
D. W. Methods in microbiology, vol. 4. Academic Press, London, 1971.
8. Stites, D. P.: II. Pruebas inmunolgicas de laboratorio. Mtodos clnicos de
laboratorio para la deteccin de antgenos y anticuerpos. En: Stites, D. P., Stobo, J.
D., Fudenberg, H. H. and Wells, J. V.: Inmunologa bsica y clnica, 5 a ed. El Manual
Moderno. Mxico, D.F., 1985.
70
PRACTICA 7
ELECTROFORSIS E INMUNOELECTROFORESIS
Daniel Martnez Gmez
Que el alumno:
1. explique el fundamento de la electroforesis
2. compruebe el proceso de separacin de protenas cuando son sometidas a un
campo elctrico
3. mencione por lo menos tres aplicaciones de la electroforesis en la medicina
veterinaria.
Que el alumno:
1. describa la tcnica de electroforesis aplicada a la identificacin de las
protenas del suero y a la separacin de molculas de DNA.
2. realice una prueba de electroforesis zonal en acetato de celulosa con un suero
problema.
3. identifique las diferentes fracciones del suero de acuerdo al patrn
electroforetico que presenta.
4. interprete las diferencias en el patrn electroforetico de tres sueros distintos.
5. mencione los medios de soporte para realizar una prueba de electroforesis
INTRODUCCIN
La separacin de molculas basada en su migracin en un campo electromagntico
se denomina electroforesis.
El movimiento de partculas en un campo elctrico es un fenmeno conocido desde
hace ms de dos siglos, cuando Ferdinand Frederik Reuss describi el fenmeno en
1809. Con el diseo de un ingenioso aparato, Arnie Tiselius desarrolla la
71
electroforesis libre en 1937 y ms tarde, en los aos 1960s, Hjertn describe los
principios de la electroforesis zonal que es usada hasta nuestros das.
Para entender este fenmeno, es necesario tener en cuenta que algunas molculas
contienen grupos funcionales cidos y bsicos. Las protenas, por ejemplo, tienen
adems grupos extrafuncionales debido a que algunos aminocidos poseen grupos
cidos o bsicos que no estn involucrados en la formacin de los enlaces
peptdicos. Si se colocara una protena en una solucin con pH bajo (cido), estas
obtendrn una carga positiva, debido a que los iones de hidrgeno saturarn sus
grupos funcionales, en cambio si se colocara a un pH alto (bsico o alcalino) la carga
que adquirirn ser negativa, porque los iones de hidrgeno sern sustrados de
dichos grupos, en vez de saturarlos.
Otro aspecto que se debe de considerar, en la electroforesis es que las partculas,
iones y molculas con carga, conducen corriente en soluciones cuando se aplica un
campo electromagntico. En consecuencia, las protenas cargadas tendern a
desplazarse hacia el electrodo con carga opuesta.
Cuando se realiza este fenmeno en un medio lquido se le denomina electroforesis
libre, la desventaja es que se produce un movimiento al azar con el desplazamiento
de las molculas. Por el contrario, si se realiza en un medio slido como un gel o en
una matriz tal como el papel filtro o el acetato de celulosa, el movimiento al azar se
reduce, predomina la migracin elctrica y las protenas separadas quedan
inmovilizadas en el soporte al retirar la corriente elctrica. Debido a esto se le
denomina electroforesis zonal.
Por otro lado, el pH en el cual la carga neta de la protena es de cero se denomina el
punto isoelctrico y la diferencia entre la carga neta de la protena, con sus iones
fuertemente asociados, y la carga de la solucin en la que se encuentra se denomina
potencial zeta. Puesto que los aminocidos tienen una composicin diferente y las
protenas tienen una composicin diferente de aminocidos, prcticamente todas las
72
protenas tienen un punto isoelctrico distinto. Esas diferencias son las que permiten
la separacin de protenas de una mezcla para su anlisis individual, como ocurre
con la separacin de las protenas del suero.
Las protenas del suero tienen diferentes velocidades de migracin al paso de la
corriente elctrica y en condiciones optimizadas se puede obtener su separacin en
forma de bandas cuando el desplazamiento de la muestra sobre el soporte adecuado
es lineal.
Lo fundamental entonces, consiste en utilizar el soporte sobre el cual se obtenga una
separacin neta de las protenas, que esta separacin sea rpida y al mismo tiempo
se produzca un calentamiento escaso del sistema a fin de evitar la desnaturalizacin
de estas macromolculas, adems, tambin debe permitir una fcil lectura y
reproduccin. El soporte de acetato de celulosa rene estas condiciones. Este
sistema conocido como microzona permite el uso de pequeas cantidades de
muestra, con tiempos de separacin de unos 20 a 30 minutos.
Puesto que las protenas separadas por electroforesis no se pueden observar porque
no poseen color, es necesario teirlas utilizando colorantes como azul de Coomasie,
azocarmn, colorante de Ponceau o tincin de plata. Sin embargo, la tincin de
Ponceau se considera la ms idnea pues favorece la decoloracin del soporte y la
posterior lectura de la tira de acetato de celulosa por medio de un fotodensitmetro
que a la vez dibuja un trazado de la absorbancia permitiendo obtener una curva (ver
figura 1)
En el caso del humano, en esta curva aparece primero un gran pico alto y agudo que
corresponde a la albmina, a veces precedido de un pequeo pico; la prealbmina.
Luego siguen varios picos que por orden se etiquetaron como: alfa 1 (alfa 1antitripsina, alfa 1-glicoprotena cida), alfa 2 (haptoglobina, alfa 2-microglobulina,
ceruloplasmina), beta 1, beta 2 (stas formadas por transferrina, beta 2microglobulinas, C3), y gamma (formadas por IgA, IgG, IgM, IgE, IgD).
73
Figura 1. Trazo en el densitmetro, del corrimiento electofretico de un suero normal

de humano.
A continuacin se muestra un cuadro con las fracciones observadas en el suero de
algunas especies animales:
Cuadro 1. Fracciones observadas en la ELECTROFORESIS de sueros de diferentes
especies animales a un pH de 8.6
ESPECIE
Caballo
Vaca
Borrego
Cerdo
Perro
Gato
Cabra
Mono
Albmina
Albmina
Albmina
Albmina
Albmina
Albmina
Albmina
Albmina
74
La electroforesis de protenas en geles con una matriz de poliacrilamida,

comnmente denominada electroforesis en poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide gel
electrophoresis') es, sin duda alguna, una de las tcnicas ms ampliamente usada
para caracterizar mezclas complejas de protenas (ver figura 2). La electroforesis en
poliacrilamida es un mtodo conveniente, rpido y econmico a nivel de muestra,
pues se requieren slo cantidades del orden de microgramos de protena para su
anlisis. Adems, la migracin de las protenas no slo es proporcional a la carga
neta sino tambin al tamao y forma de las mismas. Una ventaja importante de los
geles de poliacrilamida es que son qumicamente inertes, transparentes y estables
en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza inica.
La electroforesis tambin se utiliza para la separacin de fragmentos de DNA de
acuerdo a su tamao. De la misma forma que a las protenas, el campo elctrico a
los que son sometidos impulsan a estos fragmentos a migrar en un gel. Las
molculas de DNA migran normalmente del polo negativo al positivo debido a la
carga negativa neta de los grupos fosfato de la cadena de DNA. Estas molculas
son forzadas a pasar a travs del gel, que a escala molecular se parece mucho a una
red intrincada e irregular, haciendo que las molculas de mayor tamao migren ms
lento y las pequeas mas rpido. Una vez que se completa la migracin los
fragmentos de DNA de diferente tamao se pueden observar al teirse con un
colorante fluorescente especfico para el DNA como el bromuro de etidio. El gel
mostrar diferentes bandas que corresponden a diferentes molculas de DNA con un
peso molecular distinto. La tcnica de electroforesis de DNA ms comn es la
electroforesis en geles de agarosa. Tambin se pueden usar otras tcnicas como la
electroforesis en geles de poliacrilamida (que se utiliza para protenas pero que es
muy til para fragmentos muy pequeos de DNA) y la electroforesis capilar.
75
Figura 2. Determinacin del peso molecular de una protena. Se observa la distancia que recorren
diferentes protenas en un gel de poliacrilamida, la grafica de estas distancias en protenas de pesos
conocidos permite establecer un patrn lineal a partir del cual es posible conocer el peso molecular
aproximado de protenas de las cuales se desconozca.
Usos
1. Es til en la deteccin de gammopatas o alteraciones en los niveles de
gammaglobulinas (anticuerpos) causadas por enfermedades metablicas, mielomas
o linfosarcomas y en animales jvenes con deficiencias en inmunoglobulinas sricas
debidas a un inadecuado consumo de calostro.
2. Para la determinacin de marcadores bioqumicos (protenas localizadas en el
plasma y en el interior de los eritrocitos) tales como las hemoglobinas, transferrinas,
haptoglobulinas, albuminas, pre-albuminas, post-albuminas, anhidrasa carbnica,
esterasas, fosfatasas cidas, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, etc., que son tiles
para:
a. Determinacin de la paternidad.
b. Determinacin de la pureza de raza.
c. Determinacin del grado de consanguinidad.
d. Identificacin de los individuos.
e. Seleccin gentica.
76
3. En la separacin de mezclas proteicas como el suero y las hemoglobinas

4. En el estudio del lquido cefalorraqudeo, por ejemplo para detectar pacientes con
esclerosis mltiple.
5. Para la separacin de componentes de bajo peso molecular tales como
aminocidos, azcares, lpidos, nucletidos y cidos nucleicos.
6. Separacin de virus o clulas as como componentes moleculares de los mismos.
INMUNOELECTROFORESIS
Existen una serie de variantes de la electroforesis que combinan la separacin
electrofortica y la precipitacin de las protenas, entre las que se hallan las
siguientes:
1. Prueba de electroinmunodifusin unidimensional doble (tambin conocida
como inmunoelectroforesis por contra corriente,
contrainmunelectroforesis y
electroprecipitacin) (ver figura 3).
Figura 3. Electroinmunodlfusin
unidimensional doble.
El principio bsico del mtodo implica
la electroforesis, simultnea y en
direcciones opuestas, en un medio
semislido (gel), del antgeno y el
anticuerpo a partir de pozos
separados. Al encontrarse se
produce una lnea de precipitacin.
77
2. Prueba de electroinmunodifusin nica unidimensional (tambin conocida

como "electroforesis en cohete" o prueba de Laurell) (figura 4).
Figura 4. Electroforesis en cohete.

EI antgeno es colocado en pozos
numerados del 1 al 4, en
cantidades progresivamente
decrecientes. Se efecta la
electroforesis y el antgeno
precipita con el antisuero que
contiene el agar. El patrn de
precipitado formado tiene el
contorno de la estela de un cohete.
La cantidad de antgeno es
directamente proporcional a la
longitud de la estela.
3. Inmunoelectroforesis o electroinmunodifusin. En esta tcnica se utiliza

una laminilla cubierta con agar. Se excava una depresin larga y estrecha para el
antisuero y un pozo para el antgeno con un sacabocado. Primero se deposita el
antgeno y se somete a electroforesis. Una vez terminada la separacin se coloca
el antisuero en la depresin o ranura. Se deja incubar en cmara hmeda durante
24 horas para que se presenten las lneas de precipitacin. Se formar una lnea
de precipitacin para cada antgeno (figura 5).
Figura 5. Tcnica de electroinmunodifusin.

(a) El agar se ha vertido sobre una laminilla
de vidrio y se han excavado un pozo para
depositar el antgeno y una ranura para
depositar el antisuero. (b) En este caso se
detectan 3 antgenos con diferente
migracin electrofortica: el antgeno A, el B
y el C.
78
MATERIAL POR SECCIN

1 Cmara de electroforesis
1 Fuente de poder
1 Juego de electrdos
1 Aplicador
2 Pinzas de diseccin
4 Tiras de magitel para puentear
1 Frasco de suero normal de bovino adulto con jeringa
1 Frasco de suero fetal bovino con jeringa
1 Frasco con la fraccin gama del suero con jeringa
1 Frasco con antisuero anti bovino con jeringa
500 ml de buffer para electroforesis pH 8.6
1 Frasco de colorante de Ponceau S
1 Frasco con solucin lavadora de cido actico al 5% en agua destilada
1 Tira de acetato de celulosa en solucin conservadora (metanol al 30%)
2 Portaobjetos con 5 ml de agarosa
Guantes
1 tina
1 caja de Petri con agua destilada
Toallas de papel secante
3 tiras de acetato de celulosa con 3 sueros distintos transparentadas
2 laminillas con agar previamente corridas por inmunoelelctroforesis con distintos
sueros
1. Llenar la cmara de electroforesis con buffer y colocar las tiras de celulosa o
cellogel en la cmara con la cara porosa hacia arriba.
2. Activar las tiras de acetato de celulosa depositndolas en el buffer por lo menos 10
minutos
79
3. Eliminar el exceso de buffer de las tiras, colocndolas entre dos hojas de papel
filtro sin llegar a secarlas. Es importante que la tira se mantenga hmeda durante
toda la prueba.
4. Colocar una gota de la muestra en un portaobjetos y con el aplicador colocarla a
dos centmetros del borde ms cercano de la tira al ctodo (polo negativo); colocar el
resto de las muestras guardando una distancia de aproximadamente 3 mm entre
cada una. Tapar la cmara para evitar la evaporacin.
5. Conectar la cmara a la fuente de poder aplicando el voltaje y tiempo requerido
NOTA: PELIGRO EL ALTO VOLTAJE PUEDE SER MORTAL.
7. Pasado el tiempo requerido desconectar la fuente de poder, para retirar las tiras y
las laminillas.
8. Depositar las tiras de acetato en el colorante de Ponceau durante 5 minutos (usar
los guantes).
9. Pasado este tiempo lavar las tiras en la solucin lavadora.
10. Revisar las tiras visualmente comparndolas con un patrn (resultado cualitativo)
y revisar las tiras transparentadas previamente elaboradas
11. Quitar el agar de las laminillas para aplicar el antisuero correspondiente
12. Observar las lneas de precipitacin en las laminillas previamente elaboradas
RESULTADOS
Resuma los resultados obtenidos en la prctica.
PREGUNTAS
I. Defina que es electroforesis.
2. Defina punto isoelctrico
3. Que importancia tiene el pH para que migre una protena al someterla a un
campo elctrico?
4. Defina: nodo, ctodo, anin y catin.
5. Que es una solucin buffer?
80
6. Dibuje una grfica de un suero hiperinmune y un suero con agammaglobulinemia

identificando cada una de las espigas y explicando las diferencias encontradas al
compararlos con un suero normal.
7. Mencione por lo menos cinco usos de la prueba de electroforesis.
81
1. Atkins, P. W.: Fisicoqumica. Fondo Educativo Interamericano pp. 741-742.
Mxico, 1985.
2. Ariza, C. A.: Las tranferrinas como marcadores genticos en caballos. Arch de
Zoot, 28(109): 51-58 (1979).
3. Azuara, B. P.: Seleccin gentica del ganado criollo mediante la determinacin de
sus grupos sanguneos solubles. Tesis de Licenciatura. F.M.V.Z., UNAM, Mxico,
1982.
4. Basurto, A. F. J.: Elaboracin y estandarizacin del almidn hidrolizado de papa
(Solanum tuberosum) para determinar marcadores bioqumicos sanguneos en
animales. Tesis de licenciatura, F.M.V.Z., UNAM, Mxico, 1984.
5. Ohemetron, Co.: Cellogel electrophoresis and immunotechniques (methods,
material and accesories), Chemetron tR., Milano, Italy.
6. Barvey, J. S., Cremer, N.E. and Sussdorf, D.H.: Methods in immunology, 3th
edition. W.A. Benjamin, Inc., USA, 1976.
7., Kabat, E. A. and Mayer, M. M.: Experimental immunochemestry, 2nd edition.
Charles C. and Thomas Publishers, USA, 1971.
8. Kiddy, A. C.: A review of research on genetic variations in physiological
characteristics related to performance in dairy cattle. J Dairy Science,62:818-824,
(1979).
9. Lehninger, A. L.: Bioqumica. 5a. edicin. Editorial Omega. Espaa, 1972.
10. Stites, D.F.: II. Pruebas inmunolgicas de laboratorio. Mtodos clnicos de
laboratorio para la deteccin de antgenos y anticuerpos. En: Stites, D.F., Stobo, J.
O., Fudenberg, H. H. y Wells, J. V.: Inmunologa Bsica y Clnica. 5a. edicin, El
Manual Moderno, Mxico, pp. 316-357, 1985.
11. Thorpe, H. V., Bray, H. G. y James. S. P.: Fisicoqumica. Compaa Editorial
Continental, S.A., Mxico, 1976.
12. Vergara, O. J. R.: Comprobacin de la paternidad en equinos por determinacin
electrofortica de 6 sistemas de grupos sanguneos solubles. Tesis de licenciatura,
F.M.V.Z., UNAM, Mxico, 1975.
82
PRACTICA 8
AGLUTINACIN DIRECTA I: DIAGNSTICO DE SALMONELOSIS AVIAR,
ISOERITROLISIS NEONATAL EN EQUINOS y PRUEBAS CRUZADAS.
Laura Cobos Marn
Rosa Elena Miranda M
Que el alumno:
1. explique el fundamento y mencione las caractersticas que debe tener el
antgeno para las pruebas de aglutinacin directa
2. mencione tres aplicaciones de la aglutinacin directa en la medicina
veterinaria.
Que el alumno:
1. realice una prueba de aglutinacin directa para el diagnstico de salmonelosis
aviar e identifique un resultado positivo y uno negativo.
2. realice una prueba para el diagnstico de isoeritrolisis neonatal en equinos e
interprete los resultados de la prueba.
3. realice una prueba de aglutinacin directa para evaluar donadores para
transfusiones sanguneas en equinos e interprete los resultados de la prueba.
INTRODUCCIN:
En general las bacterias y otras clulas se aglutinan cuando se mezclan con
antisueros especficos. Los principios implicados son fundamentalmente los mismos
que los descritos para las reacciones de precipitacin; la diferencia entre una
reaccin de precipitacin y una de aglutinacin es que los antgenos de precipitacin
son solubles y no particulados, es decir molculas; mientras que los que aglutinan
son antgenos particulados, es decir clulas completas que estn en suspensin.
83
El primer estudio sistemtico sobre aglutinacin fue hecho por Gruber y Durham en
1896, en ste se sugiri la posibilidad de utilizar esta reaccin como una prueba de
diagnstico; pocos meses despus, Widal y Sicard la utilizaron para el diagnstico de
la tifoidea.
Las bacterias u otro tipo de clulas preparadas como antgenos para la reaccin de
aglutinacin, deben ser capaces de permanecer en suspensin uniforme durante
cierto periodo. Cuando la suspensin celular antignica se mezcla con anticuerpos
especficos stos se combinan con los determinantes antignicos de la superficie
celular y a medida que establecen contacto ms clulas entre si, se forma una malla
que se aprecia a simple vista por la formacin de grumos.
El antgeno utilizado en la prueba de aglutinacin debe cubrir determinados
requisitos:
a) Ser particulado o celular y en consecuencia:
b) Encontrarse en suspensin.
Una de las ventajas que presentan las pruebas de aglutinacin adems de ser fciles
de realizar e interpretar, es su sensibilidad, ya que pueden detectar 0.05 g de
nitrgeno proteico por mililitro.
La aglutinacin se usa ampliamente como un mtodo rpido y simple para identificar
distintas bacterias y grupos sanguneos eritrocticos. A la inversa cuando se usan
clulas conocidas este mtodo ofrece una prueba simple para detectar anticuerpos
especficos en el suero de un animal. Las inmunoglobulinas con mayor capacidad de
aglutinacin son la IgM y la IgG, de stas, siendo la IgM la ms eficiente ya que tiene
ms sitios de enlace para el antgeno que la IgG.
84
NOTA: Se llama aglutinacin directa cuando el antgeno que se est utilizando tiene
per se la capacidad de formar grumos (es decir se trata de una clula); si deseamos
aglutinar antgenos no particulados, como por ejemplo los virus, es necesario
acoplarlos a la superficie de partculas de ltex o glbulos rojos para que adquieran
las caractersticas necesarias para que se lleve a cabo la reaccin de aglutinacin, a
esto se le llama aglutinacin pasiva o indirecta.
Las aplicaciones ms comunes de la aglutinacin directa son:
1. Diagnstico de enfermedades infecciosas bacterianas de los animales, como
brucelosis, salmonelosis, micoplasmosis, leptospirosis, pasteurelosis.
2. Determinacin de grupos sanguneos eritrocticos.
3. Realizacin de pruebas cruzadas para la seleccin de donadores antes de
proceder a una transfusin sangunea y para el diagnstico de la isoeritrolisis
neonatal.
4. Serotipificacin
de bacterias como
Salmonella
spp,
Brucella
spp
Haemophilus paragallinarum, entre otras.

En general las pruebas de aglutinacin directa se pueden realizar buscando la
presencia de anticuerpos en el suero (elemento desconocido), por medio de un
antgeno conocido, como es el caso del diagnstico de brucelosis, salmonelosis,
micoplasmosis, leptospirosis, pasteurelosis. As por ejemplo la leptospirosis se
diagnostica a travs de una prueba de aglutinacin microscpica, esta reaccin tiene
la particularidad de que para su observacin se requiere de un microscopio de
campo oscuro, adems del uso de organismos vivos como antgeno.
En las aves es comn realizar algunas pruebas de aglutinacin a nivel de granja, por
lo que stas han sido adaptadas para detectar la presencia de anticuerpos en sangre
completa como en el diagnstico de la salmonelosis aviar.
85
En la salmonelosis aviar, la OIE (Organizacin Mundial de Sanidad Animal) establece

que las pruebas de diagnstico ptimas para determinar el estado sanitario de los
animales son la aglutinacin rpida y la identificacin del agente patgeno. Es as
que la Norma Oficial Mexicana (NOM) establece el uso del antgeno K polivalente
aprobado para la Campaa contra la salmonelosis aviar, que incluye a los dos
especies bacterianas Salmonella pullorum y Salmonella gallinarum.
Por otro lado las pruebas de aglutinacin directa se pueden realizar buscando la
presencia del antgeno (elemento desconocido) a travs de anticuerpos conocidos,
como en la serotipificacin bacteriana o en la determinacin de grupos sanguneos
eritrociticos.
La isoeritrolisis neonatal equina es una enfermedad que se presenta en potrillos
recin nacidos, sta es mediada por una reaccin de hipersensibilidad tipo II en
donde la madre genera anticuerpos contra los antgenos eritrociticos de su cra y se
los transfiere mediante el calostro. Los grupos sanguneos eritrciticos que con
mayor frecuencia participan en la enfermedad son el A y el Q. El problema se
presenta cuando una yegua es Aa negativa Qa negativa y es sensibilizada por
alguno de estos antgenos, ya sea por transfusiones sanguneas o gestaciones
previas. Si en una gestacin posterior, su cra es Aa Qa positivo, la yegua le
transferir anticuerpos (IgG) contra estos antgenos por inmunidad pasiva a travs
del calostro (ya que no puede transferirlos por va placentaria) y estos destruirn sus
eritrocitos.
La isoeritrolisis neonatal suele presentarse en yeguas despus del segundo o tercer
parto. Los potros nacen sanos, pero una horas despus de mamar calostro
comienzan a manifestar ictericia y debilidad; los signos se agravan a los dos o tres
das presentndose anemia, hemoglobinuria, taquicardia, postracin y en casos
severos la muerte.
86
El diagnstico de la enfermedad se hace por serologa, buscando anticuerpos

maternos contra la sangre del potrillo. Las dos pruebas usadas son:
a) el ensayo hemoltico en el que se enfrentan el suero de la yegua, la sangre del
potrillo y complemento
b) las tcnicas de aglutinacin, como la prueba de Coombs que utiliza la sangre
del potrillo, el suero o calostro de la yegua y anticuerpos anti inmunoglobulinas
de caballo o las pruebas cruzadas en las que se enfrena el suero o calostro de
la yegua a los eritrocitos de potrillo, sta ltima tiene la ventaja de que puede
ser empleada en el campo.
Las pruebas hemolticas y de aglutinacin tambin pueden ser empleadas:
a) para escoger un semental adecuado para montar una yegua (aquel que tenga
el mismo tipo sanguneo, o aquel que posea eritrocitos hacia los cuales la
yegua no tenga anticuerpos).
b) para prevenir la isoeritrolisis neonatal, determinando la presencia de
anticuerpos en el suero de la yegua gestante siete das antes del parto.
c) para la determinacin de grupos sanguneos en diferentes especies.
d) antes de hacer una transfusin sangunea, para determinar si la sangre del
donador es compatible con la de su receptor. (Pruebas Cruzadas).
Pruebas cruzadas:
Estas pruebas se hacen en dos etapas la primera es llamada Fase Mayor y sirve
para determinar que el receptor no tenga anticuerpos contra los eritrocitos del
donador (por lo tanto se enfrenta suero del receptor contra la sangre del donador). Si
en esta fase se presenta aglutinacin la donacin no podr realizarse
En la segunda etapa, llamada Fase Menor, se busca que el donador no tenga
anticuerpos contra los eritrocitos del receptor (por lo tanto se enfrenta suero del
donador contra la sangre del receptor). Si en esta prueba hay aglutinacin se podr
realizar la transfusin de eritrocitos lavados para eliminar los anticuerpos presentes
en el plasma.
87
En el siguiente diagrama se muestra como interpretar los resultados de la prueba:
Sangre Donador
FASE MAYOR
Rechazar
Positivo
Donador
Suero Receptor
Negativo
Donador en reserva
Suero Donador
FASE MENOR
Positivo
Sangre Receptor
Negativo
Acepta
eritrocitos
lavados
del
donador
Acepta sangre completa
Diagrama 1. Interpretacin de las Pruebas Cruzadas.
88

Diagnstico de salmonelosis aviar:
1 Frasco con sangre completa de un ave positiva
1 Frasco con sangre completa de un ave negativa
1 Frasco con antgeno K polivalente elaborado con Salmonella gallinarum y
Salmonella pullorum
3 Jeringas de insulina
Pruebas cruzadas:
3 Frascos con eritrocitos del receptor, en una suspensin al 2%
3 Frascos con eritrocitos del donador, en una suspensin al 2%
3 Frascos con suero del receptor
3 Frascos con suero del donador
12 Jeringas de insulina (sin aguja)
Diagnstico de salmonelosis aviar:
2 portaobjetos
2 palillos de madera
Diagnstico de isoeritrolisis neonatal:
1 Frasco con solucin salina fisiolgica (SSF)
5 tubos de ensaye de 13 X 100
1 pipeta serolgica de 1ml (1/100)
1 Frasco con suero de yegua (madre)
1 Frasco con sangre del potrillo (hijo).
1 pipeta de transferencia
Pruebas cruzadas:
4 tubos de ensaye de 13 x 100
89
1.
Realizar la prueba de aglutinacin directa para el diagnstico de salmonelosis

aviar:
2.
En un portaobjetos agregar una gota de sangre completa (positiva) y una gota

del antgeno K polivalente y homogeneizarlas con ayuda del palillo de madera,
hacer lo mismo con la sangre negativa (utilizando el otro portaobjetos y el otro
palillo de madera) e identificar las diferencias.
Interpretacin de la prueba.
Reaccin positiva: la aglutinacin es suave o fuerte, aparece entre los cero y
noventa segundos.
Reaccin sospechosa: la aglutinacin aparece entre 90 y 120 segundos.
Reaccin negativa: la aglutinacin aparece despus de 120 segundos.
3.
Realizar las pruebas de aglutinacin directa para el diagnstico de isoeritrolisis

neonatal en equinos:
Hacer una dilucin doble seriada del suero de la yegua, en cinco tubos, con una
dilucin inicial 1:2 y un volumen final de 0.5ml:
Agregar 0.5ml de solucin salina a todos los tubos
Con la misma pipeta agregar 0.5ml del suero de la yegua y hacer la
dilucin doble, desechando 0.5ml del ltimo tubo.
Agregar 1 gota de sangre del potrillo a cada tubo
Agitar suavemente e incubar 30 minutos a temperatura ambiente.
Si el ttulo de aglutinacin es mayor o igual a 1:16, la prueba se considera
positiva (el portillo tiene isoertirtolisis neonatal).
4.
Realizar la Prueba Cruzada para transfusiones sanguneas:

Identificar los cuatro tubos de ensaye con los siguientes rtulos: Fase Mayor
(MY), Fase Menor (mn), Control eritrocitos donador (ED), Control eritrocitos
receptor (ER).
Fase Mayor:
Al tubo identificado como MY aadirle: 2 gotas del suero del receptor y una
gota de eritrocitos del donador, al tubo identificado como ED aadirle dos
90
gotas de SSF y una gota de eritrocitos del donador. Agitar suavemente e

incubar 30 minutos a temperatura ambiente.
Fase Menor:
Al tubo identificado como mn aadirle: 2 gotas del suero del donador y una
gota de eritrocitos del receptor, al tubo identificado como ER aadirle dos
gotas de SSF y una gota de eritrocitos del receptor. Agitar suavemente e
incubar 30 minutos a temperatura ambiente.
Ambos controles ED y ER, debern de presentar sedimentacin, de lo contrario la
prueba no ser vlida. Ver el diagrama 1 para la interpretacin de resultados
PREGUNTAS:
1. Explique cmo se lleva cabo el fenmeno de aglutinacin.
2. Qu caractersticas debe cubrir el antgeno para que pueda llevarse a cabo
la aglutinacin?
3. Cuales son los usos ms comunes de las pruebas de aglutinacin?
4. Esquematice una prueba de aglutinacin positiva.
5. Por qu se emplea sangre completa en el diagnstico de salmonelosis aviar?
6. Cul es el elemento desconocido y cual el conocido en el diagnstico de
salmonelosis aviar?
7. Cmo se realiza la prueba de aglutinacin para el diagnstico de isoeritrolisis
neonatal?
8. Cmo observara el resultado de las pruebas de aglutinacin, en un potrillo
que esta padeciendo de isoeritrolisis neonatal?
9. Con que finalidad enfrento el suero del donador con la sangre del receptor,
en las pruebas cruzadas?
10. Cmo esperara el resultado de las pruebas cruzadas, con un donador y
receptor compatibles?
91
1. Davis, E.D., Dulbecco, R., Eisen, H. N., Ginsberg, H. S. y Wood, W.B.: Tratado
de Microbiologa. 2 ed., Salvat, Espaa, 1978.
2. Giles, C.L. y Thoen, C.H. (1993) Pathogenesis of bacterial infections in
animals. 2da. Ed. Iowa state University Press/ Ames. 331 p.
3. McClure J: Neonathal isoeritrolysis, in: Current Therapy in Equine Medicine.
4ed, Robinson E.N., Saunders Co, 1997.
4. Merchant, I.A. y Packer, R.A.: Bacteriologa y Virologa Veterinarias. 3 ed.
Acribia, Espaa, 1980.
5. Norma Oficial Mexicana NOM-005-ZOO-1993. Campaa Nacional contra la
salmonelosis aviar.
6. OIE. Organizacin Mundial de Sanidad Animal. Normas Zoosanitarias
Internacionales. Pruebas de diagnstico preescritas y de sustitucin para las
enfermedades de la lista A y B. (2003).
Anexo 3.1.1. Bajado el 14 de
noviembre de 2003.
7. Parslow, M; Stites, D., Terr, A and, Imboden, J. Inmunologa Bsica y Clnica.
10 ed, Mxico. El Manual Moderno, 2002.
92
PRACTICA 9
AGLUTINACIN DIRECTA II.- DIAGNSTICO DE BRUCELOSIS ANIMAL
Laura Cobos Marn
Que el alumno:
1. mencione las pruebas oficiales para el diagnstico serolgico de brucelosis.
2. explique el fundamento terico de las pruebas que se utilizan en el diagnstico
serolgico de brucelosis.
3. indique los criterios de interpretacin oficiales de las pruebas que se utilizan
en el diagnstico serolgico de brucelosis.
Que el alumno:
1. mencione la secuencia de pruebas serolgicas a las que se debe someter un
suero, para el diagnstico de brucelosis en bovinos, ovinos y caprinos, con
base en la norma que rige la Campaa Nacional de erradicacin de la
brucelosis de los animales (NOM-041-ZOO-1995).
2. realice una prueba de anillo en leche para el diagnstico de brucelosis en
bovinos, e identifique un resultado positivo y uno negativo.
3. realice una prueba de tarjeta al 8% para el diagnstico de brucelosis en
bovinos, e identifique un resultado positivo y uno negativo.
4. realice una prueba de rivanol para el diagnstico de brucelosis en bovinos, e
identifique un resultado negativo y un positivo indicando el ttulo del suero.
5. indique el criterio que se debe tomar para considerar a un animal como reactor
o como negativo integrando los resultados obtenidos en las pruebas
realizadas
93
INTRODUCCIN
La Brucelosis, tambin conocida como enfermedad de Bang, Fiebre ondulante,
Fiebre de Malta o Aborto contagioso, es una enfermedad infectocontagiosa que
afecta a los animales (domsticos y silvestres) y al hombre por lo que se considera
una zoonosis. Es causada por bacterias del gnero Brucella, el cual est constituido
por seis especies que son B. abortus, B. melitensis, B. ovis, B. suis, B. canis y B.
neotomae.
En las hembras causa principalmente aborto en el ltimo tercio de la gestacin
adems de retencin placentaria, infertilidad que se manifiesta con el aumento de los
das entre partos (hembras repetidoras), mastitis y disminucin hasta en un 30% de
la produccin lctea, entre otros; en machos ocasiona inflamacin de los testculos
(orquitis) as como del epiddimo (epididimitis) lo que se traduce en infertilidad. En
casos crnicos puede presentarse inflamacin de las articulaciones.
Esta enfermedad tiene gran importancia tanto desde el punto de vista econmico
como de Salud Pblica dada la infeccin en el humano, por lo que la SAGARPA ha
implementado la Campaa Nacional de Erradicacin de la Brucelosis en los
Animales la cual se orienta de manera prioritaria a las especies bovina, ovina y
caprina, adems en machos ovinos se refiere a la deteccin de Brucella ovis como
causante de la epididimitis ovina.
El propsito de la campaa consiste en el control y erradicacin de la enfermedad a
nivel nacional a travs de una serie de programas y subprogramas los cuales
incluyen la vacunacin de los animales, control de la movilizacin de los mismos,
monitoreo en rastros y la realizacin de pruebas de laboratorio para la deteccin de
animales reactores a la enfermedad entre otras acciones.
Existen dos tipos de diagnstico de laboratorio que son:
a) Diagnstico Bacteriolgico: consiste en aislar al agente causal tanto de fetos
abortados como de placenta, secreciones vaginales, leche y semen. A pesar de ser
94
el diagnstico definitivo, tiene el inconveniente de que las bacterias pertenecientes al

gnero Brucella son muy exigentes para crecer o desarrollarse en los medios
sintticos del laboratorio de modo tal que, el no aislarla no es indicativo de que el
animal no posea al agente. Adems es importante mencionar que para realizar este
tipo de diagnstico se requiere de aproximadamente 5 11 semanas, tiempo durante
el cual la enfermedad puede estar afectando hasta el 80% de los animales expuestos
en el hato.
b) Diagnstico Inmunolgico: se basa en la deteccin de anticuerpos anti-brucela
presentes en el suero o en la leche de los animales. Este tipo de diagnstico es ms
seguro ya que si un animal ha estado en contacto con el agente, desarrollar
anticuerpos contra l, los cuales pueden ser detectados por una serie de pruebas
diseadas y consideradas como OFICIALES para este fin. Algunas de estas pruebas
tienen la ventaja de poderse realizar a nivel de campo, requieren de menos tiempo y
son altamente sensibles, tal es el caso de la prueba de Tarjeta y la prueba del Anillo
en leche, tambin se cuenta con pruebas que necesariamente deben realizarse los
laboratorios aprobados, como la prueba de Rivanol, Fijacin de complemento e
Inmunodifusin doble.
Es importante remarcar que aunque existen pruebas seguras y confiables para el
diagnstico, la forma en que se toma la muestra as como las condiciones en que
se enva al laboratorio, son determinantes para que el diagnstico sea lo ms
confiable y verdico posible.
Una herramienta muy importante para el laboratorio es la historia clnica, en ella
deben incluirse los datos referentes al propietario, direccin (incluyendo estado y
municipio), especie animal, raza, sexo, edad y propsito (produccin de leche,
produccin de carne, reproduccin, etc.), as como el registro de la aplicacin de la
vacuna contra Brucella (fecha de aplicacin y tipo de vacuna). Todos estos datos
ayudan al laboratorio para la interpretacin de los resultados.
95
Las pruebas oficiales indicadas en la Norma Oficial Mexicana (NOM), se basan en la

deteccin de anticuerpos (en suero o leche) anti-brucella, mediante una reaccin de
aglutinacin. Estas pruebas se resumen en el siguiente cuadro:
Cuadro 1. PRUEBAS PARA EL DIAGNSTICO SEROLGICO DE BRUCELOSIS

(Brucella abortus /Brucella melitensis)
PRUEBAS DE MONITOREO
DE HATO
Prueba de Anillo en leche
(bovinos)
PRUEBAS TAMIZ
Prueba de Tarjeta al 8%
(bovinos)
Prueba de Tarjeta al 3%
(ovinos y caprinos)
PRUEBAS CONFIRMATORIAS
Prueba de Rivanol (bovinos)

Prueba de Fijacin de
Complemento (bovinos,
ovinos y caprinos
Para bovinos:
La prueba de Anillo en leche se realiza al momento de la ordea y tiene como
finalidad la deteccin de anticuerpos anti-brucela presentes en la leche. Est
considerada como prueba de monitoreo en aquellos hatos que han adquirido el
certificado de hato libre. Esta prueba consiste en mezclar leche bronca con el
antgeno (Brucella abortus cepa 1119-3, a una concentracin del 4%, teida con
hematoxilina y a un pH de 0 4.3)
Si la muestra posee anticuerpos contra brucela, stos se unirn al antgeno
formando una malla que ser arrastrada hacia la superficie por lo glbulos de
grasa de la leche, observndose un anillo coloreado (reaccin positiva); en este
caso debern realizar pruebas individuales en los animales del hato.
96
Cuando la muestra no posee anticuerpos contra brucela, la leche permanecer

sin cambios, es decir, se observar la columna de leche coloreada y el anillo
superior blanco (reaccin negativa).
PRUEBA POSITIVA
PRUEBA NEGATIVA
La prueba de Tarjeta al 8% est considerada como prueba tamiz debido a su alta

sensibilidad, consiste en mezclar el suero problema con el antgeno de Tarjeta
(Brucella abortus cepa 1119-3, a una concentracin del 8%, teido con rosa de
bengala y a un Ph de 3.65). Esta prueba proporciona dos tipos de resultados:
positivo si la muestra posee anticuerpos anti-brucela en donde se observar
aglutinacin, y negativo si la muestra no los tiene. Cuando el resultado es positivo
el suero deber someterse a una segunda prueba para determinar si los
anticuerpos detectados son realmente debidos a una infeccin por Brucella spp.
La prueba de Rivanol est considerada como prueba confirmatoria porque permite
determinar si los anticuerpos encontrados en la prueba de Tarjeta son debidos a
la infeccin, adems de proporcionar la concentracin de los mismos. En esta
prueba primero se mezcla el suero con el reactivo conocido como Rivanol, el cual
elimina a los anticuerpos del tipo IgM; posteriormente se ponen cantidades
variables de suero equivalentes a las diluciones 1/25, 1/50, 1/100, 1/200 y 1/400,
y a cada dilucin se le agrega el antgeno de Rivanol (Brucella abortus cepa 11193, a una concentracin del 4%, teido con cristal violeta y verde brillante).
Dependiendo de la, o las diluciones que reaccionen con el antgeno, se determina
el ttulo de anticuerpos anti-brucela presentes en el suero y por lo tanto la
condicin del animal.
97
Segn la Norma Oficial Mexicana, los resultados se interpretan de la siguiente

manera:
Todos los sueros de bovinos no vacunados que presenten reaccin positiva en
cualquiera de las diluciones (desde 1:25 hasta 1:400) se consideran positivos.
Todos los sueros de bovinos vacunados, que presenten reaccin positiva en una
dilucin igual o mayor a 1:50 se consideran positivos.
- La prueba de Fijacin de complemento, que es la ms sensible, est considerada
como prueba confirmatoria. Debern someterse a esta prueba: los sueros de bovinos
con ttulos menores o iguales a 1:50 en la prueba de Rivanol y los sueros de ovinos y
caprinos que den positivos a la prueba de tarjeta.
Para Caprinos y Ovinos (ambos sexos):
-
La prueba de Tarjeta al 3% es semejante a la prueba descrita para

bovinos, siendo la nica diferencia la concentracin del antgeno.
Tambin proporciona dos tipos de resultados: positivo y negativo. Los
sueros positivos son sometidos a la prueba de Fijacin de
complemento, bajo las mismas condiciones ya descritas.
Ovinos macho:
Debido a la importancia reproductiva que tiene B. ovis como causante de la
Epididimitis Ovina, la prueba oficial utilizada para detectar anticuerpos en suero es la
Inmunodifusin Doble, la cual proporciona dos tipos de resultados: positivo y
negativo.
98

- Antgeno para la prueba de Tarjeta
- Antgeno para la prueba de Rivanol
- Antgeno para la prueba del Anillo en leche
- Pipeta automtica para aplicar el antgeno, ajustada a 30 l
- Puntillas para pipeta automtica con capacidad de 200 l

- 1 placa de vidrio o 2 portaobjetos
- 2 Tubos de ensaye 13 x 100
- 2 tubos de ensaye 12 x 75
- 3 pipetas serolgicas de 1 ml 1/100.
- 2 pipetas serolgicas de 5 o 10 ml 1/10
- 2 frascos con sueros problema de bovino
- 1 frasco con solucin de Rivanol
- 1 frasco con leche positiva
- 1 frasco con leche negativa
- 2 palillos de madera
- 1 trozo de cinta adhesiva
Prueba del Anillo en leche:
1. Con una pipeta serolgica de 5 o 10 ml, depositar en un tubo de 13 x 100, 1 ml de
la leche positiva e identificar el tubo
2. Con otra pipeta serolgica de 5 o 10 ml, depositar en un tubo de 13 x 100, 1 ml de
la leche negativa e identificar el tubo
3. Utilizando la micropipeta agregar 30 l de antgeno para la prueba del anillo en
leche, a cada uno de los tubos
4. Homogeneizar mediante agitacin cada tubo
5. Incubar a 37C, durante 30 minutos y hacer la lectura
99
Prueba de Tarjeta:
1. Sobre la placa de vidrio colocar 0.03 ml de cada suero problema, utilizar una
pipeta serolgica de 1 ml 1/100 para cada suero.
2. Utilizando la micropipeta agregar a un lado de ambos sueros, 30 l del antgeno
para la prueba de Tarjeta.
3. Mezclar con un extremo del palillo cada gota de suero con su respectivo antgeno,
haciendo un crculo de aproximadamente 2 cm de dimetro.
4. Observar durante 4 minutos y leer.
Prueba de Rivanol:
1. Depositar en un tubo de 12 x 75, 0.4 ml de cada suero problema e identificar el
tubo con el nmero de suero correspondiente, utilizar la misma pipeta serolgica
de 1 ml 1/100 que se us para cada suero de la prueba de tarjeta.
2. Con otra pipeta serolgica de 1 ml 1/100, depositar 0.4 ml de la solucin de
Rivanol a cada uno de los tubos conteniendo los sueros problema
3. Homogeneizar por medio de agitacin
4. Incubar a temperatura ambiente durante 15 - 30 minutos
5. Centrifugar ambos tubos a 3000 rpm durante 5 minutos
6. Sobre la placa de vidrio colocar las siguientes cantidades del sobrenadante de
cada uno de los tubos: 0.08, 0.04, 0.02 y 0.01 ml. Utilizar una pipeta serolgica de
1 ml 1/100 para cada sobrenadante
7. Utilizando la micropipeta agregar a un lado de cada cantidad de suero, 30 l del
antgeno para la prueba de Rivanol.
8. Mezclar con un extremo del palillo cada gota de suero con su respectivo antgeno,
haciendo un crculo de aproximadamente 2 cm de dimetro, iniciando de la mayor
dilucin a la menor.
9. Observar durante 12 minutos y leer
100
RESULTADOS
Esquematice los resultados que obtuvo en las pruebas realizadas en la prctica.
A continuacin se muestra un esquema indicando como se hace el seguimiento de
una muestra de suero, para el diagnstico de brucelosis:
DIAGRAMA DE FLUJO DEL DIAGNSTICO SEROLGICO DE

BRUCELOSIS
(Brucella abortus /Brucella melitensis)
Prueba Tamiz
ovinos y caprinos ( y )
bovinos ( y )
Suero de bovino, ovino y

caprino ( y )
Aglutinacin
negativa
Negativo a
Brucelosis
Aglutinacin
positiva
PRUEBAS CONFIRMATORIAS
Bovinos: Prueba de Rivanol
Ovinos y caprinos
Ttulos de:
1:25
1:50
1:100
1:200
1:400
Prueba de Fijacin de
Complemento
Prueba de
Fijacin de
Complemento
Positivo a
Brucelosis
PREGUNTAS
1. Explique brevemente como se realizan las pruebas Tarjeta y Rivanol
2. Esquematice una prueba del anillo en leche positiva.
3. Esquematice como observara un suero que en la prueba de Rivanol dio un
titulo 1/50.
101
1. Norma Oficial Mexicana NOM-041-ZOO-1995. Campaa Nacional contra la
Brucelosis en los animales, publicada el 20 de agosto de 1996.
2. Alton, G.G., Jones, L.M. y
ites, D.E.: Las tcnicas de laboratorios en la brucelosis.
FAO/OMS, Ginebra, 1976.

3. E. Daz, L. Hernndez, G. Valero, B. Arellano. Diagnstico de Brucelosis Animal.
Ed. MMI, 1 ed, Mxico, 2001
4. CEB Comit mixto FAO/OMS de expertos en brucelosis. 5 Informe, Ginebra, 1970.
102
PRACTICA 10
PRUEBA DE FIJACIN DE COMPLEMENTO DIRECTA
Laura Cobos Marn
OBJETIVO GENERAL:
Que el alumno:
1. explique el fundamento de la prueba de fijacin de complemento directa.
2. mencione por lo menos tres enfermedades animales cuyo diagnstico se
realice por esta prueba.
Que el alumno:
1. realice una prueba de fijacin de complemento directa para el diagnstico de
toxoplasmosis, utilizando un suero problema
2. identifique el material necesario para cada paso.
3. diferencie un resultado positivo de uno negativo
4. interprete el resultado de la prueba indicando el ttulo del suero
INTRODUCCIN:
El sistema del complemento es un grupo de ms de 30 protenas presentes tanto en
el suero normal de todos los mamferos y aves as como en la superficie de
diferentes clulas. Estas protenas normalmente se encuentran inactivas y una vez
que se activan pueden tener diferentes funciones biolgicas como son: opsonizacin,
quimiotaxis, lisis celular, favorecer la reaccin inflamatoria as como participar en la
remocin de complejos inmunes.
En 1893 Buchner estudi el efecto bacterioltico del suero sanguneo y observ que
calentndolo perda su efecto. Posteriormente, en 1894 Pfeiffer e Isaeff demostraron
103
la lisis bacteriana en ausencia de fagocitos y ms tarde, en 1895, Bordet demostr

que la lisis celular requera de dos factores: uno que denomin sensibilizador
(anticuerpo) y otro que llam alexina (complemento). Finalmente, en 1901 Bordet y
Gencou establecieron los principios generales de esta prueba. El termino
Complemento fue acuado por Paul Ehrlich definindolo como la actividad del suero
sanguneo que complementa la accin de los anticuerpos.
Existen dos tipos de pruebas de fijacin de complemento: la directa y la indirecta. La
prueba indirecta se utiliza cuando el suero sospechoso proviene de un ave ya que
sus anticuerpos no tienen la capacidad de fijar complemento de mamferos. La
sensibilidad de la prueba de fijacin de complemento es muy alta pues detecta
menos de 1ng de protena
Generalidades de la prueba:
La prueba de fijacin del complemento directa se fundamenta en la activacin de
ste por la va clsica, en donde es necesaria la presencia de una reaccin antgeno
anticuerpo para iniciar la reaccin. Los elementos que participan en esta prueba son:
Suero sospechoso, al cual deber inactivrsele el complemento incubndolo en
bao Mara a 60C durante 30 minutos.
Antgeno (no particulado) previamente titulado.
Complemento: generalmente se utiliza suero normal de cuye como fuente de
complemento ya que ste es el que tiene mayor actividad hemoltica. ste debe estar
previamente titulado y estandarizado
Sistema indicador o sistema hemoltico, que est formado por:
Hemolisina: que son anticuerpos contra glbulos rojos de ovino. Estos deben
estar previamente titulados y estandarizados.
Glbulos rojos de ovino: previamente lavados y preparados en una suspensin
del 2 al 3%
104
La prueba consta de dos fases:

Fase invisible: en la fase invisible se trabaja con un primer sistema antgenoanticuerpo, enfrentando el suero sospechoso (elemento desconocido), el antgeno
especfico (elemento conocido) y el complemento.
Fase visible: se agrega un segundo sistema antgeno-anticuerpo o sistema
indicador (el sistema hemoltico), formado por los glbulos rojos de ovino y la
hemolisina (anticuerpos contra glbulos rojos de ovino).
Cuando el resultado es positivo, en la fase invisible habr una reaccin antgeno
anticuerpo y el complemento se unir a esta reaccin Ag-Ac-C. Como el C se uni a
la primera fase, no se unir al sistema hemoltico y se observar sedimentacin de
los glbulos rojos.
Cuando el resultado es negativo, no habr una reaccin antgeno anticuerpo en la
fase invisible y el complemento quedar libre, pudiendo unirse al segundo sistema
antgeno-anticuerpo o sistema hemoltico, observndose hemlisis.
Existen dos modalidades de la tcnica de Fijacin del Complemento: la tcnica de
hemlisis al 100%, en la que se utilizan 2 unidades de complemento y 2 unidades de
hemolisina; y la tcnica de hemlisis al 50%, en la que se toman 5 unidades de
complemento y 4 de hemolisina al 50%.
En esta prctica se utilizar la tcnica de hemlisis al 100% por lo que se utilizarn 2
unidades de complemento, entendindose como una unidad de complemento la
mnima cantidad de ste, capaz de hemolizar al 100% de una suspensin de
glbulos rojos diluidos al 2%; y 2 unidades de hemolisina, siendo una unidad de
hemolisina la mnima cantidad de sta capaz de unirse (sensibilizar) a la totalidad de
eritrocitos al 2%.
Cuando se necesita saber el titulo de anticuerpos que tiene un suero, se hacen
diluciones dobles seriadas de ste, buscando la mxima dilucin en donde los
glbulos rojos del sistema indicador (sistema hemoltico) se sedimenten en un 100%.
105
Como en cualquier prueba serolgica, en la prueba de fijacin de complemento se

realizan una serie de controles para determinar si los elementos que se estn
utilizando funcionan correctamente, estos controles se trabajan al mismo tiempo que
la prueba. En la prctica se utilizarn los siguientes:
a) Control de complemento: sirve para detectar si ste posee las unidades
hemolticas requeridas.
b) Control de sistema indicador (sistema hemoltico): sirve para determinar si el
sistema indicador presenta alteraciones y se lisa por s solo o por fallas en el
lavado del material (residuos de jabn).
Usos:
La prueba de fijacin de complemento se utiliza en el diagnstico de enfermedades
bacterianas (brucelosis, muermo, durina, etc.), virales (fiebre aftosa), parasitarias
(toxoplasmosis, piroplasmosis) y micticas (coccidioidomicosis, histoplasmosis,
aspergilosis y esporotricosis).
106
MATERIAL POR GRUPO:

Bao mara
1 Gradilla
10 Tubos de ensaye
4 Pipetas serolgicas de 1 ml (1/100)
Solucin salina fisiolgica (SSF)
Suero sospechoso de gato inactivado
Antgeno (Toxoplasma gondii)
Complemento
Sistema indicador
Maskin tape
A continuacin se enlistan los pasos a seguir para hacer la prueba de fijacin de
complemento. Consulte la siguiente figura:
DILUCION
1/5
1/10 1/20
1/40
1/80 1/160 1/320 1/640
S.S.F.
0.4
0.2
SUERO
0.1
Dilucin doble seriada transferir 0.2
ANTGENO
0.2
COMPLEMENTO
0.2
Testigo
A*
0.4
Testigo
B**
0.6
0.2
Mezclar e incubar a 37oC durante 15 minutos en bao Mara

SISTEMA
0.4
INDICADOR
Mezclar e incubar a 37oC durante 15 a 30 minutos en bao Mara
*Testigo de complemento
**Testigo de sistema indicador
107
1. Con una pipeta de 1 ml (1/100) aadir la SSF a todos los tubos incluyendo a los
controles.
2. Con la misma pipeta aadir 0.1ml del suero al primer tubo y hacer las diluciones
dobles seriadas (desechar 0.1ml del tubo 1).
3. Con una segunda pipeta aadir el antgeno.
4. Con una tercera pipeta aadir el complemento, incluyendo al tubo control A.
5. Incubar en bao mara a 37C durante 15 minutos.
6. Con una cuarta pipeta aadir el sistema indicador, incluyendo a los dos tubos
controles A y B.
7. Incubar en bao mara a 37C durante 15 a 30 minutos.
8. Hacer la lectura.
RESULTADOS
Los resultados se considerarn vlidos siempre y cuando los controles proporcionen
los resultados correctos.
En la siguiente grfica se esquematiza la lectura de un suero cuyo ttulo se observa
en la dilucin 1/80. Tambin se esquematiza el orden y proporcin de los
componentes de la prueba:
108
Ttulo
de
suero
suero
antgeno
complemento
Sistema indicador
1/5
1/10
1/20
1/40
Hay suficientes anticuerpos para

formar R-Ag-Ac-Cen la fase invisible.
El sistema indicador en la fase visible
se sedimenta al no haber Clibre
1/80
1/160
1/320
1/640
No hay suficientes anticuerpos para

formar R-Ag-Ac-Cen la fase invisible.
El sistema indicador en la fase visible
se una al Clibre y causa hemlisis
PREGUNTAS:
1. Defina el trmino complemento.
2. Qu utilidad tiene la prueba de fijacin de complemento en la medicina
veterinaria?
3. Mediante un esquema explique una prueba de fijacin de complemento realizada
en 10 tubos, en la que el suero sospechoso nos da un ttulo de 1/640. Explique
detalladamente que sucedi en la fase invisible y visible de todos los tubos.
4. Por que cree usted que el suero sospechoso se deba inactivar?
5. Defina el trmino hemolisina.
6. Qu sensibilidad tiene esta prueba, comparada con las pruebas de aglutinacin
y precipitacin?
7. Defina unidad de complemento y de hemolisina.
8. En qu casos se utiliza la prueba indirecta del complemento y por qu?
109
1. Alton, G.G., Jones, L.M. y Pietz, D.E.: Las tcnicas de laboratorios en la
brucelosis. FAO/OMS, Ginebra, 1976.
2. E. Daz, L. Hernndez, G. Valero, B. Arellano. Diagnstico de Brucelosis Animal.
Ed. MMI, 1 ed, Mxico, 2001
110
PRACTICA 11
INMUNOENSAYO ENZIMATICO (ELISA)
Daniel Martnez Gmez
Ma. Grisel Anaya Santilln
OBJETIVO GENERAL
Que el alumno:
1. explique el fundamento de las pruebas de ELISA
2. puntualice las diferencias entre las tcnicas de ELISA directa, indirecta,
competitiva y Sndwich por medio de un esquema.
3. mencione por lo menos cinco enfermedades animales cuyo diagnstico se
realice por esta prueba.
OBJETIVOS PARTICULARES
Que el alumno:
1. realice una prueba de ELISA indirecta para el diagnstico de Mycoplasma
hyopneumoniae utilizando sueros problema
2. identifique el material necesario para cada paso.
3. diferencie un resultado positivo de uno negativo
4. interprete el resultado de la prueba
INTRODUCCIN
Las tcnicas inmunoenzimticas, tal como se conocen hoy, comenzaron a
desarrollarse a partir de los trabajos de Avrameas y Uriel (1966) que concibieron la
idea de marcar antgenos y anticuerpos con enzimas (conjugados) para su uso en
tcnicas serolgicas convencionales.
Engvall y Permann describieron por primera vez en 1972, el denominado mtodo de
ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), para titular inmunoglobulinas. En
111
este primer ensayo se utilizaron tubos de poliestireno como inmunoadsorbente e

indicaron que este mtodo tena una sensibilidad comparable a radioinmunoensayo.
En el mismo ao Van Weenem uso conjugados antgeno-enzima y hapteno-enzima
en ensayos serolgicos.
Voller en 1974 pusieron a punto la realizacin de esta tcnica en microplacas de
poliestireno y sugirieron su uso para titular anticuerpos inducidos por enfermedades
infecciosas ilustrando las posibilidades del ensayo con malaria.
Finalmente en 1975 Ruiterberg y col aplicaron por primera vez el mtodo de ELISA
en patologa animal para la deteccin de anticuerpos especficos contra Trichinella
spiralis.
Las tcnicas inmunoenzimaticas forman parte de aquellas reacciones serolgicas de
unin primaria que utilizan conjugados. El ensayo enzimatico ELISA, se basa en el
uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tienen actividad enzimtica. Al estar uno de los componentes
(antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoadsorbente) el complejo antgeno-anticuerpo quedar inmovilizado y por
tanto, podr fcilmente ser revelado mediante la adicin de un sustrato especfico
que al actuar con la enzima, producir un color observable a simple vista y
cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o colormetro para placas de
ELISA. La utilizacin de esta tcnica ha aumentando considerablemente con la venta
de sistemas comerciales para el diagnstico empleando esta tcnica.
Aspectos prcticos sobre la prueba de ELISA
Fase slida:
Se han utilizado diferentes tipos de materiales para fijar antgenos o anticuerpos
como polivinil, polipropileno o poliestireno, de los cuales el ltimo result ser el ms
prctico y econmico.
112
Para realizar la prueba se necesita una placa sensibilizada (fase slida). La

sensibilizacin es adherir antgeno o anticuerpo a la placa, diluido en buffer de
carbonato/bicarbonato con un pH de 9.8. Una vez adherido el antgeno o el
anticuerpo, se lava con PBS-tween para retirar lo que no se uni y se adiciona
albmina srica bovina para bloquear los sitios libres.
Lavados:
La finalidad de los lavados es eliminar el exceso de los reactivos despus de cada
perodo de incubacin. Se utiliza una solucin amortiguadora de fosfatos (PBS) que
contiene tween 20. El tween 20 es un detergente que evita la adhesin de factores
inespecficos que se encuentran en las muestras (suero, plasma, saliva, heces, etc.).
La placa debe lavarse cuando menos 3 veces y escurrirla bien entre cada paso de la
tcnica.
Aunque la prueba es muy especfica, debe evitarse la utilizacin de sueros
hemolizados o contaminados.
Conjugados:
Un conjugado es la unin de un antgeno o anticuerpo con un marcador (enzima en
el caso de ELISA). Existe una gran variedad de enzimas para marcar, las cuales
deben ser estables tanto libres como conjugadas, altamente reactivas, disponibles,
puras econmicas y seguras. Un requisito de una buena conjugacin es que el
producto mantenga estables sus propiedades inmunolgicas y enzimticas.
Algunos ejemplos de enzimas que se pueden utilizar en esta prueba son:
-
Acetil colinesterasa
Citocromo C
-D galactosidasa
Glucoamilasa
Glucosa oxidasa
Tirosinasa
-D glucoronidasa
113
Lactato deshidrogenasa
Lactoperoxidasa
Fosfatasa alcalina
Peroxidasa de rbano.
Cromgenos:
Los cromgenos deben ser solubles, econmicos, seguros y de fcil manejo. Dentro
de los ms utilizados estn:
-
ABTS (sal diamino del cido 2-2-azino-di-(3 etil benzotiazolinsulfnico-6)
TMB(3-3-5--tetrametilbenzidina)
OPD (o-fenilendiamina)
Tolidina
5 AS (cido 5 amino-saliclico)
o-dianisidina
3-3-diaminobenzidina
3-amino 9-etilcarboxol.
USOS:
Las tcnicas de ELISA se emplean para la cuantificacin de una gran variedad de
antgenos y anticuerpos. En Medicina Veterinaria se usan para el diagnstico de
diversas enfermedades infecciosas tales como:
AVES
Enfermedad de Gumboro.
Bronquitis infecciosa aviar
Enfermedad de Newcastle
Reovirus aviar
Encefalitis aviar
Leucosis aviar subgrupo A, B y J
Anemia infecciosa aviar
Reticuloendoteliosis
Salmonella enteritidis
Pasteurella multocida
Mycoplasma gallisepticum
Mycoplasma synoviae
Mycoplasma meleagridis
Influenza aviar
Rinotraqueitis aviar
Ornithobacterium rhinotracheale
BOVINOS
Brucella abortus
Rinotraquetis infecciosa bovino
Leucosis enzotica bovina
Neospora caninum
Mycobacterium paratuberculosis
Diarrea viral bovina
114
PORCINOS
Efermedad de Aujeszky
Sndrome respiratorio y reproductor porcino
Influenza porcina
Mycoplasma hyopneumoniae
Fiebre porcina clsica
EQUINOS
Anemia infecciosa equina
CLASIFICACIN DE LAS PRUEBAS INMUNOENZIMTICAS
Existen diversas variantes en esta tcnica, clasificndose en trminos generales en
Directa, Indirecta, Sndwich y Competitiva
ELISA DIRECTA. Se llama directa cuando el conjugado es conocido e interacta sin
intermediarios con el antgeno desconocido. Debido al desarrollo de tcnicas ms
verstiles, esta variante prcticamente no es utilizada en la actualidad.
ELISA INDIRECTA. En esta variante se busca la identificacin de anticuerpos contra

un antgeno conocido empleando una segunda reaccin antgeno-anticuerpo con una
antiglobulina contra los anticuerpos de la especie animal en estudio. Consta de las
etapas siguientes:
1.
Fijacin de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio.

Lavado para eliminar aquellos antgenos fijados deficientemente o no fijados.
2.
Adicin
del
suero
problema.
Sus
inmunoglobulinas
reaccionarn
especficamente con los antgenos fijados. Lavado para eliminar aquellos

anticuerpos que no se hayan reaccionado.
115
3.
Adicin
de
anti-inmunoglobulinas
conjugadas
con
una
enzima.
Estas
reaccionarn con las inmunoglobulinas o anticuerpos especficos aadidos en la

etapa 2, que se encontrarn fijados a los antgenos. Lavado para eliminar las
anti-inmunoglobulinas marcadas que no haya reaccionado.
4.
Adicin de un sustrato sobre el cual sea capaz de actuar la enzima marcadora.

Paralizacin de la reaccin.
5.
Lectura visual o espectrofotomtrica al producto final coloreado.
ELISA SANDWICH o puente de anticuerpos. En esta variante se utilizan anticuerpos

contra antgenos especficos de dos clases; 1) sin marcar y fijados a la placa y 2)
marcados y sin fijar. La prueba puede usarse para la cuantificacin de antgenos y
consta de las siguientes etapas:
1.
Fijacin de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado

para eliminar los anticuerpos deficientemente fijados y los no fijados.
2.
Adicin de la muestra (sobrenadante de macerado de tejido), objeto de estudio.

El agente patgeno de estudio (antgeno) si est presente, reaccionar con los
anticuerpos especficos, quedando fijado en la placa. Lavado para eliminar los
restos de la muestra no fijados y los antgenos que no hayan reaccionado.
3.
Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar conjugados o

marcados con una enzima. Estos anticuerpos marcados reaccionarn eh donde
116
exista el antgeno previamente insolubilizado. Lavado para eliminar los

anticuerpos marcados con la enzima que no hayan reaccionado.
4.
Adicin del sustrato sobre el cual sea capaz de actuar la enzima marcadora.
5.
Lectura visual o espectrofotomtrica al producto final coloreado.
ELISA COMPETITIVO. Al igual que la anterior, esta tcnica tambin sirve para la
deteccin y medicin de antgenos. Los anticuerpos especficos (conocidos y
obtenidos a partir de sueros hiperinmunes) son adheridos a la fase slida. En la
muestra problema se est buscando el antgeno, por lo que sta se coloca junto con
un antgeno marcado con una enzima. Ambos antgenos competirn por adherirse a
los anticuerpos previamente fijados en la placa; despus de agregar el sustrato, los
pozos que tengan coloracin indican que la muestra es negativa. La inhibicin del
color es proporcional a la cantidad de antgeno presente en la muestra. Consta de las
siguientes etapas:
1.
Fijacin de anticuerpos contra el agente patgeno que se desea cuantificar.

Lavado para eliminar los que no se hayan fijado o lo hayan hecho
deficientemente.
2.
Aadir una mezcla en concentracin conocida, de antgenos homlogos al

antisuero utilizado en la fase 1 marcados con una enzima y antgenos
desconocidos objeto de estudio.
3.
Aadir el sustrato para que acte la enzima.
117
4.
Cuantificar en un colormetro el producto coloreado de la prueba y de su

paralela, comparar los resultados. La intensidad de la coloracin es
inversamente proporcional a la concentracin de antgeno.
118

3 frascos GOTERO con solucin de sustrato-cromgeno
3 frascos con suero control negativo
3 frascos con suero control positivo
Una microplaca para ELISA por alumno
1 frasco con solucin PBS- 0.5% de Tween 20.
Dos frascos de sueros problema de cerdo
2 tubos de ensaye 13 X 100
4 pipetas serolgicas de 1ml (1/100)
1 pipeta de transferencia de plstico
1 tubo eppendorf con conjugado (para cada dos alumnos)
Toallas de papel
1. Realizar una dilucin 1/100 de ambos sueros, en 2ml:
Con una pipeta serolgica de 1 ml 1/100, depositar 1.98 ml de PBS-Tween en
ambos tubos de 13 x 100
Depositar 0.02 ml de cada suero problema e identificar el tubo con el nmero de
suero correspondiente, utilizar una pipeta serologica de 1 ml 1/100 para cada
suero
2. Con las pipetas serolgicas que utiliz para hacer las diluciones, agregar 0.05
ml de los sueros problema (diluidos 1/100) en los pozos correspondientes. A1, A2 y
B1, B2 (ver esquema). Utilizando dos pipetas serolgicas limpias agregar 0.05 ml
de los sueros control en los pozos correspondientes D1, D2 y E1, E2 (ver
esquema).
119
SUERO PROBLEMA 1
SUERO PROBLEMA 2
A1
A2
B1
B2
D1
D2
E1
E2
CONTROL NEGATIVO
CONTROL POSITIVO
POZO VACO (NO AGREGAR NADA)
3. Incubar la placa 15 minutos a temperatura ambiente

4. Lavar la placa 3 veces con PBS-Tween, con ayuda de la pipeta de
transferencia: llenar cada pozo evitando desbordamientos, posteriormente voltear la
placa y eliminar el lquido de los pozos con sacudidas firmes. Asegurndose de
retirar toda la solucin golpeando tres veces la placa sobre la toalla de papel.
5. Utilizando la misma pipeta de transferencia que us en los lavados, agregar una
gota del Conjugado (anti IgG porcina marcada con peroxidasa) a todos los pozos.
EL CONJUGADO EST EN CONGELACIN Y DEBER DE SACARSE AL
MOMENTO DE SER UTILIZADO
6. Incubar la placa 15 minutos a temperatura ambiente
7. Lavar nuevamente con solucin PBS-Tween como se indic en el paso 4
8. Con el frasco gotero agregar una gota de la solucin sustrato-cromgeno a
todos los pozos.
9. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente y realizar la lectura.
10. Determinar si los sueros problema son: negativos o positivos comparndolos
con los controles correspondientes.
120
PREGUNTAS
1. Explique las caractersticas que tiene el conjugado empleado en la prueba de
ELISA.
2. Explique detalladamente los eventos que ocurren el una prueba de ELISA tipo
sndwich.
3. Cuales son las enzimas ms comnmente utilizadas en el marcaje de
anticuerpos para la prueba e ELISA?
121
1. Goldsby R. A., Kindt T.J., Osborne B.A. and Kuby J. Immunology. 5th ed., W.H
Freeman And Co. 2003.
122
PRACTICA 12
PRUEBA DE LA TUBERCULINA
Que el alumno:
1. explique el fundamento terico de las pruebas de intradermoreaccin (IDR)
para el diagnstico de tuberculosis.
2. mencione las pruebas oficiales para el diagnstico de tuberculosis bovina en
Mxico.
3. realice e interprete una prueba oficial para el diagnstico de tuberculosis
bovina.
4. indique
los
criterios
de
interpretacin
oficiales
de
las
pruebas de
intradermoreaccin (IDR) para el diagnstico de tuberculosis bovina.

Que el alumno:
1. mencione la secuencia de las pruebas de intradermoreaccin (IDR) para el
diagnstico de tuberculosis, con base en la norma que rige la Campaa
Nacional de erradicacin de la tuberculosis bovina (NOM-031-ZOO-1995).
2. utilice adecuadamente el vernier y mida correctamente diferentes espesores
3. realice la prueba doble comparativa en un bovino
4. indique el criterio que se debe tomar para considerar a un animal como
negativo, sospechoso o positivo, utilizando la tabla de interpretacin de
resultados.
INTRODUCCION
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crnica causada por bacterias cido
resistentes del gnero Mycobacterium. El Mycobacterium bovis es la causa principal
de la tuberculosis en el ganado bovino, sin embargo el humano, las cabras y los
123
cerdos tambin son susceptibles a esta especie. La principal va de transmisin entre

animales es la aergena, aunque la infeccin al hombre se da principalmente por va
oral, a travs de la leche as como cualquier producto lcteo crudo o mal
pasteurizado. Esta enfermedad, ocasiona grandes prdidas econmicas en la
industria pecuaria, ya que la capacidad productiva de los animales disminuye en un
10 a 25 %.
El descubrimiento por Koch de la reaccin de la tuberculina en 1890 aport un
instrumento til para el diagnstico y control epidemiolgico de esta enfermedad.
Posteriormente se pudo demostrar esta es una expresin de la inmunidad mediada
por clulas que desempea el principal mecanismo de defensa contra muchos de los
microorganismos intracelulares obligados como lo es el Mycobacterium.
La respuesta tipo tuberculina o de intradermorreaccin (IDR) es una respuesta
inmune mediada por clulas que se clasifica como hipersensibilidad de tipo IV.
Despus de la reaccin antgeno-linfocito sensibilizado, este ltimo produce una
serie de factores biolgicamente activos llamados linfocinas. Estas inducen cambios
funcionales en los linfocitos T y los macrfagos, clulas que intervienen en la
respuesta celular de tipo tuberculina. La reaccin a la tuberculina alcanza su mayor
intensidad a las 72 horas post-inoculacin observndose macroscpicamente una
inflamacin caracterizada por eritema y engrosamiento de la piel debido a la
vasodilatacin y al aumento en la permeabilidad vascular pero, sobretodo, a una
intensa migracin celular. Microscpicamente la poblacin celular que infiltra el tejido
corresponde principalmente a clulas mononucleares (macrfagos y linfocitos).
El antgeno que se utiliza para esta prueba se le conoce con el nombre de
tuberculina (de ah su nombre). Antiguamente se utilizaron la tuberculina vieja de
Koch (TV) y una tuberculina concentrada por calor (HCSM). La primera se prepara
cultivando el Mycobacterium en un medio de cultivo al que se le aade carne.
Despus de que haya crecido la bacteria, el cultivo con o sin ellas, se concentra
aproximadamente 10 veces en un bao de vapor, eliminando los residuos por
124
filtracin para, posteriormente, aadirle glicerol como estabilizador. La segunda es

similar a la OT pero el germen es cultivado en un medio sinttico, evitando as la
presencia de tejidos animales en el medio de cultivo. Para su preparacin solo se
utilizan los productos metablicos del Mycobacterium cultivado.
Actualmente se utiliza un producto denominado Derivado Proteico Puro (PPD"Purified protein derivative"-), una tuberculina similar a la HCSM pero cuyo grado de
purificacin es mayor. El PPD se prepara principalmente a partir de los productos de
secrecin del Mycobacterium crecido en un medio sinttico simple. Estos son
precipitados varias veces con sulfato de amonio saturado al 50% o con cido
tricloroactico. El PPD es el antgeno oficial de la Campaa Nacional Contra la
Tuberculosis Bovina (CNCTB) y tiene las siguientes caractersticas de acuerdo a la
NOM-031-ZOO-1995:
a) PPD bovino: es elaborado con Mycobacterium bovis cepa AN5, que se utilizar en
la prueba caudal, cervical comparativa y cervical simple.
b) PPD aviar: es elaborado con Mycobacterium avium cepa D4, que ser utilizada en
la prueba cervical comparativa.
La tuberculina de PPD aviar debe contener como colorante el rojo de Ponceau, para
distinguirla de la de PPD bovino que no lleva colorante.
c) Las tuberculinas deben ser transportadas y conservadas en fro a una temperatura
de 4 a 8C y protegidas de la luz solar directa durante el trabajo de campo, debe
verificarse el lote y fecha de caducidad del producto. Una vez utilizado el antgeno,
deber desecharse el resto del contenido del envase si no se va a utilizar el mismo
da.
Puesto que, la base del esquema de erradicacin de tuberculosis de la CNCTB es la
prueba de la tuberculina, es necesario un conocimiento exacto de las ventajas y
desventajas que ofrece esta prueba de diagnstico as como todas las variantes de
la misma.
125
Las pruebas de intradermoreaccin o de la tuberculina aceptadas por la CNCTB y

descritas en la NOM-031-ZOO-1995 son:
Prueba en el pliegue caudal o intradrmica nica (IDU). Se aplica 0.1 ml. de PPD
bovinO en el pliegue anocaudal, previamente desinfectado y examinado para
detectar cualquier anormalidad que pudiera confundir la prueba. La lectura se realiza
a las 72 horas ( 6 horas) despus de la inoculacin y la reaccin se considerar
positiva cuando sea visible y/o palpable cualquier engrosamiento, rubor, calor, dolor
o necrosis en el sitio de aplicacin. Ser negativa cuando no se observe ni se palpe
algn cambio en la piel del sitio de aplicacin. En Latinoamrica sta es la prueba
ms utilizada, en Estados Unidos adems de inocular en el pliegue anocaudal, se
aplica al mismo tiempo en el labio de la vulva en la unin mucocutnea, mientras que
en Inglaterra se aplica en la piel del cuello.
De acuerdo a la NOM-031-ZOO-1995
es la prueba bsica operativa de rutina,
cuando se desconoce la situacin zoosanitaria del hato en materia de tuberculosis;

en estos casos deber ser aplicada por un Mdico Veterinario certificado o, cuando
la SAGARPA lo determine, ser realizada por un Mdico Veterinario oficial.
Prueba doble comparativa. En esta prueba se utilizan los dos tipos de tuberculina,
el PPD bovino y el PPD aviar. El PPD aviar se utiliza para permitir la diferenciacin
de
la reaccin por una infeccin con M. bovis e infecciones por M. avium, M.
paratuberculosis (incluyendo vacunacin), Nocardia farcinicus (muermo bovino), as

como por micobacterias atpicas (fotocromgenas, ectocromgenas, no cromgenas
y de crecimiento rpido) que llegan a ser habitantes habituales del suelo y que, por
su parentesco, llegan a producir reacciones inespecficas.
En la prueba doble comparativa se inyecta simultneamente las tuberculinas aviar y
bovina en dos lugares diferentes del mismo lado del cuello y la lectura se realiza
despus de 72 horas ( 6 horas). Se inocula ms comnmente en la tabla del cuello
126
porque se ha observado que la piel de este es ms sensible que la piel del pliegue
ano-caudal.
De acuerdo a la NOM-031-ZOO-1995 Esta es la nica prueba autorizada para
confirmar o descartar animales reactores a la prueba de pliegue caudal. Se podr
efectuar por nica vez dentro de los 10 das naturales siguientes a la lectura de la
prueba caudal; o bien, despus de transcurridos 60 das naturales, debindose
aplicar por un Mdico Veterinario oficial o aprobado, se aplica en hatos o regiones
con presencia de Mycobacterium paratuberculosis y/o Mycobacterium avium.
Prueba cervical simple. En esta prueba tambin se realiza la inoculacin

intradrmica en la tabla del cuello, en la regin media a 10 cm de la cresta, de 0.1 ml
de PPD bovino y realizando la lectura el mismo Mdico Veterinario que aplic la
prueba mediante la observacin y palpacin del sitio en donde se practic, a las 72
6 horas posteriores a su inoculacin.
Las reacciones que se observan son:
Negativa: Cuando no se observe ni se palpe ningn cambio en la piel del sitio de
aplicacin.
Reactor: Cuando sea visible y/o palpable cualquier engrosamiento, rubor, calor, dolor
o necrosis en el sitio de aplicacin.
Esta prueba se emplea para inspeccionar hatos en los que se conoce la existencia
de M.bovis; o bien para examinar ganado que estuvo expuesto directa o
indirectamente con hatos infectados con M. bovis.
Las reacciones a las pruebas de la tuberculina intradrmicas o no, pueden producir
reacciones falsas positivas y falsas negativas.
Las reacciones falsas negativas se observan ms comnmente en:
127
1.- Estados avanzados de la enfermedad.

2.- Animales en los ltimos estadios de la gestacin o recin paridos.
3.- Animales tratados con corticoesteroides.
4.- Animales que se han tuberculinizado recientemente.
5.- Animales muy viejos (anergia).
Se observan reacciones falsas positivas:
1.- Por el contacto de los animales con bacterias relacionadas con el M. bovis como
el M. avium, M. paratuberculosis, bacterias del gnero Nocardia, as como otras
micobacterias atpicas.
2.- En animales recientemente tuberculinizados.
3.- Animales que hayan adquirido inmunidad natural activa contra la tuberculosis.
Para el diagnstico de tuberculosis, otras de las pruebas para determinar la
inmunidad celular que pueden ser utilizadas son:
a) La prueba de MIF, que es un ensayo in vitro con el que se determina la
produccin o no del factor inhibidor de la migracin de los macrfagos (MIF).
El MIF es una linfocina liberada por los linfocitos sensibilizados al entrar en
contacto con antgenos del Mycobacterium.
b) La prueba de interfern gama, desarrollada por Wood en 1990. sta tambin
es una prueba in vitro y tiene la ventaja de poderse realizar sin necesidad de
esperar intervalos de 45 a 60 das entre una prueba y otra. La prueba se
realiza obteniendo una muestra de sangre perifrica con anticuagulante, la
cual se cultiva en tres formas: con PPD aviar, PPD bovino y sin PPD; a las 16
a 24 horas de incubacin se obtiene el sobrenadante y se determina por la
tcnica de ELISA- sandwich, la cantidad de interfern gama producida en
cada caso. Cuando las clulas cultivadas con PPD bovino producen una
mayor cantidad de IFN
que las cultivadas con PPD aviar y el control
negativo, se considera que la prueba es positiva.
128
Aunque para el diagnstico de la tuberculosis podemos utilizar estas y otras

pruebas, para dar un resultado definitivo se requiere del aislamiento del agente
etiolgico, que es la prueba inequvoca de la causa de la enfermedad.
129
MATERIAL POR ANIMAL A PROBAR

2 Jeringas de 1 ml con aguja del No. 24 al 26 y de 0.5 a 1 cm de largo
1 Jabn
1 Recipiente para agua
1 Rastrillo
1Toalla de papel
1 Vernier o cutmetro
1 Frasco con torundas de alcohol
Navajas o rastrillo
MATERIAL POR GRUPO
4 Frascos con 10 ml cada uno de PPD aviar
4 Frascos con 10 ml cada uno de PPD bovino
Toallas de papel
1 vernier grande
La prueba se realiza en el tercio medio de la tabla del cuello a 10 centmetros por
debajo de la cruz. Se rasura el pelo de un rea de 8 centmetros de dimetro
aproximadamente y 13 centmetros hacia la porcin ventral se rasura una segunda
rea del mismo dimetro (ver figura).
130
Posteriormente se mide el grosor de la piel de cada una de las zonas rasuradas con
un cutmetro o vernier. A continuacin se desinfecta e inocula 0.1 ml de PPD aviar en
la primer rea depilada y 0.1 ml de PPD bovino en la segunda, ambas por va
intradrmica, insertando la aguja paralelamente a la piel (la formacin de una ppula
en el sitio de inoculacin indica que sta se realiz correctamente).
A las 72 horas despus de la inoculacin la misma persona que hizo la lectura antes
de aplicar la tuberculina medir nuevamente el grosor de la piel en cada sitio de
inoculacin.
Interpretacin
Una vez obtenidas las mediciones del grosor de la piel en la lectura inicial y a las 72
horas post-inoculacin se har lo siguiente:
1. Lectura PPD aviar: restar a la lectura post-inoculacin la lectura inicial.
2. Lectura PPD bovina: restar a la lectura post-inoculacin la lectura inicial.
3. Una vez obtenidas estas diferencias utilizar la grfica de interpretacin segn sea
el caso.
Ejemplo: Lecturas correspondientes a un bovino perteneciente a un hato afectado
por tuberculosis (interpretacin severa).
Lectura inicial
Lectura
post-inoculacin
PPD aviar
PPD bovino
4 mm
4 mm
(72 10 mm
7 mm
horas)
Diferencia
6 mm
3 mm
Con estos dos resultados llevar a cabo la interpretacin en la grfica. Si el resultado

es sospechoso se deber repetir la prueba 60 das despus.
131
RESULTADOS
Con las lecturas realizadas durante la prctica, interprete la prueba y explique cul es
el procedimiento a seguir con ese animal en caso que perteneciera a un hato
afectado por tuberculosis.
132
PREGUNTAS
1. Cules son las pruebas in vivo e in vitro que se pueden llevar a cabo para el
diagnstico de tuberculosis?
2. Cuntos tipos de tuberculina se conocen?
3. Explique las ventajas que tiene llevar a cabo la prueba de tuberculina doble
comparativa con respecto a las dems pruebas.
4. Cul es la va de inoculacin utilizada en la prueba doble comparativa?
5. Cunto tiempo se necesita esperar despus de inocular para poder observar una
reaccin positiva a la tuberculina?
6. De cada una de las reacciones falsas positivas y falsas negativas enlistadas en la
prctica explique los mecanismos por los cuales se pueden presentar.
133
1. Acha, P. N. y Szifres, E. Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes a
hombre y a los animales. Organizacin Mundial de la Salud (OMS), Publicacin
Cientfica. No.354, 1977.
2 Wood, P.R., L.A. Corner y P. Plackett. 1990. Development of a simple, rapid in vitro
cellular assay for bovine tuberculosis based on the production of
interferon. Res.
Vet. Sci. 49: 46-49.

3. Hagan, W. A. and Bruner, D. W. Infectious diseases of domestic animals, 7th
edition, Cornell Universitv Press, Ithaca, USA, 1981.
4. K ay, B. M. M.: Envejecimiento y declinacin de la respuesta inmunitaria. En:
Fudenberg, H. H., Stites, D. P., Cadwell, J. L. y Wells, J. V. Inmunologa Clnica, 3 a
edicin, El. Manual Moderno. Mxico 1982.
5. Lesslie, I. W. y Hebert, C. N. Comparison of the specificity of human and bovine
tuberculin PPD for testing cattle. Vet Rec 96: 338-341, 1975.
6. Roswurm, J. D., Kantor, I. N., Marchevsky, N., Spinelli, R. y Spath, E. Sensibilidad
de las pruebas tuberculnicas en ganado bovino con Mvcobacterium bovis en
Argentina. Bol Of Sanit Pan 86(5): 420-431, 1979.
8. Lee E, Holzman RS. Evolution and current use of the tuberculin test. Clin Infect
Dis. 34(3):365-370, 2002.
9.
http://www.michigan.gov/emergingdiseases/0,1607,7-186-25804_25810-74334--
,00.html
10. http://www.ucd.ie/vetmed/html/research/summary/interferon.htm
11. Slovis BS, et al. The case against anergy testing as a routine adjunct to tuberculin
skin testing. JAMA, 283:2003-7, 2000.
12. Norma Oficial Mexicana NOM-031-ZOO-1995, Campaa Nacional contra la
Tuberculosis Bovina (Mycobacterium bovis). Publicada en el Diario Oficial de la
Federacin el 8 de marzo de 1996. Modificacin 27 de agosto de 1998.
13. Castaeda-Ramrez, A. Heterogeneidad del derivado protico purificado (DPP)
utilizado en la prueba de tuberculina que se emplea en la repblica mexicana. Tesis
de Licenciatura. Fac.Med. Vet. Y Zoot. UNAM, 1987.
134

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FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

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Responsables de la publicacin: Laura Cobos Marn y Alfredo Castaeda Ramrez

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Nota: Se pueden utilizar una o ms letras de identificacin.

COLOR DEL ROMBO

COLOR Y NUMEROS Y LETRAS

FORMAS GEOMTRICAS PARA SEALES DE SEGURIDAD E HIGIENE Y SU SIGNIFICADO

Prohibicin de una accin

Descripcin de una accin

Tringulo equiltero, la base deber Advierte de un peligro

Cuadrado o rectngulo, la base

COLORES DE SEGURIDAD PARA TUBERIAS Y SU SIGNIFICADO

LEYENDAS PARA FLUIDOS PELIGROSOS

CONTENIDO DE IMAGEN DEL

PROHIBIDO GENERAR LLAMA

Silueta humana caminando

USO OBLIGATORIO DE CASCO

Contorno de cabeza humana

Contorno de cabeza humana

Contorno de cabeza humana

CONTENIDO DE IMAGEN DEL

Crneo humano de frente con dos

Una mano incompleta sobre la

Corona circular con una flama

Una bomba explotando

Flecha quebrada en posicin

RIESGO POR RADIACIN

Lnea convergiendo hacia una

Circunferencia y tres medias lunas

CONTENIDO DE IMAGEN DEL

Silueta de un extintor con flecha

Silueta de un hidrante con flecha

SEALES DE INFORMACIN PARA SALIDAS DE EMERGENCIA Y PRIMEROS AUXILIOS